CN114807254B - 非特异性过氧合酶GmaUPO的高效表达方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种非特异性过氧合酶GmaUPO的高效表达方法及应用。本发明对GmaUPO发酵过程的诱导条件进行了优化，在最优发酵条件时，7L发酵罐中毕赤酵母产GmaUPO酶活力最高为17.81U/L，相比摇瓶发酵酶活力提高124倍，实现了GmaUPO在毕赤酵母工程菌中的高效表达。其次，探究GmaUPO催化饱和直链脂肪酸羟基化反应研究，结果显示，GmaUPO对C10‑C16链长的饱和直链脂肪酸有催化效果，且优于同等反应条件下MroUPO的催化效果。本发明的研究为GmaUPO的工业化生产及其在羟基脂肪酸高效合成工业中的应用提供重要的理论指导。

Description

非特异性过氧合酶GmaUPO的高效表达方法及应用
技术领域
本发明属于生物催化领域，特别涉及非特异性过氧合酶GmaUPO的高效表达方法及应用。
背景技术
羟基脂肪酸(HFAs)是化学结构中含有一个或多个羟基的脂肪酸，广泛分布在动物、植物和微生物体内。根据羟基在脂肪酸链上的不同位置，羟基脂肪酸可分为羧基端羟基脂肪酸(α～β)、链内羟基脂肪酸(ω-1，ω-2，ω-3……)、末端脂肪酸(ω)。羟基脂肪酸是合成香料、抗生素、增塑剂，表面活性剂，润滑油等的起始物质。此外羟基脂肪酸及其衍生物还具有抗糖尿病、抗炎、抗癌等活性，在调节宿主能量代谢方面也发挥着重要作用。链内和末端羟基脂肪酸可用于内酯类香精香料的生产，如大环麝香内酯、δ-己内酯、γ-己内酯等。羟基脂肪酸中羟基的位置决定了其应用的领域，因此，脂肪酸特定碳原子上的羟基化反应对于有机合成、化学工业及医药领域具有重要意义。
现有报道中，可催化脂肪酸加羟基的酶主要集中在水合酶类和氧化酶类。其中水合酶催化效率较高且产物单一，但其只能羟化不饱和脂肪酸的双键，催化底物范围较窄。而P450单加氧酶在反应过程中需要添加昂贵的辅酶因子NAD(P)H，或需要与辅因子再生体系联用，反应路线相对复杂。高昂的反应和设备成本极大地限制了P450单加氧酶在羟基脂肪酸工业化生产中的应用。因此，水合酶和P450单加氧酶均难以满足食品与日化工业对羟基脂肪酸产品的极大需求。
非特异性过氧合酶(Unspecific Peroxygenases，UPOs)是一类来源于真菌的氧化酶，属于血红素氧化酶家族。可以高效催化脂肪酸进行羟基化反应。与目前研究报道较多的油酸水合酶和P450单加氧等氧化酶相比，UPOs的底物范围更广，且催化过程直接以过氧化氢(H2O2)或有机氢过氧化物(R-OOH)的形式利用部分还原的O2，无需复杂的电子传递链等；此外，大多数UPOs对pH值、有机溶剂和其他物理化学因素表现出较好的鲁棒性。因此，UPO代表着高效合成羟基脂肪酸的新一代生物催化剂。
GmaUPO是一种来源于纹缘盔孢伞菌(Galerina marginata)的非特异性过氧合酶。但目前的研究中其表达量及酶活力依然很低，发酵过程控制是毕赤酵母高效表达GmaUPO的关键技术，现阶段毕赤酵母的发酵技术日趋成熟，但对于不同外源蛋白的生产要求，培养条件依旧存在显著差异。若能增加表达量，提高酶活力，实现大批量发酵及工业化生产，未来将有望取代P450单加氧酶，成为香精香料合成、医药中间体合成、农副产品生物加工、环境治理等领域重要的一类氧化还原酶。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种非特异性过氧合酶GmaUPO的应用。
本发明的另一目的在于，提供非特异性过氧合酶GmaUPO的高效表达方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种非特异性过氧合酶GmaUPO的应用，用于催化羟基化反应。
所述的应用中催化羟基化反应的底物为脂肪族化合物或芳香族化合物、优选为脂肪族化合物。
所述的应用中的脂肪族化合物为脂肪酸中的至少一种；优选为C10～C16链长的脂肪酸中的至少一种；更优选为C10～C16链长的饱和直链脂肪酸中的至少一种；进一步优选为癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸和十六酸中的至少一种。
所述的应用中催化羟基化反应的具体步骤为：
在反应体系中加入GmaUPO、氯化胆碱、胆碱氧化酶和底物进行催化反应得到产物。
所述的应用中的反应体系还包含缓冲溶液，优选为磷酸盐缓冲溶液。
所述的应用中的胆碱氧化酶为源自烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)的胆碱氧化酶AnChOx。
所述的应用中的氯化胆碱、胆碱氧化酶和反应底物的浓度的比为：
100～150mM:5～10μM:1mM、优选为100mM:5μM:1000mM。
所述的应用中的GmaUPO的浓度与底物的浓度的比为：
10～15U/L：1mM。
所述的应用中的催化反应的条件为28～30℃温度下，搅拌400～600rpm，反应22～24h；优选为30℃温度下，搅拌500rpm，反应24h。
一种非特异性过氧合酶GmaUPO的高效表达方法，包括以下步骤：
(1)制备种子液；
(2)甘油分批培养
将种子液接种至甘油分批培养基BSM中，发酵至培养基中甘油耗尽；
(3)甘油流加培养
在步骤(2)中的培养基中流加补料生长培养基，发酵至培养基中甘油耗尽；
(4)诱导培养
在步骤(3)中的培养基中流加补料诱导培养基，诱导培养结束得到产物。
步骤(1)中所述的制备种子液的具体步骤为：
挑取菌株划线活化于活化培养基YPG中，28～30℃避光培养2～3d；
挑取上述平板上的单菌落接种到一级种子培养基，28～30℃，220～240rpm振荡培养22～24h；
将上述培养基按2～3％接种量转接至二级种子培养基，28～30℃，230～250rpm振荡培养12～14h至OD600＞10，得到种子液。
所述的菌株为GmaUPO-X33。
步骤(2)中所述的甘油分批培养基BSM的配方为：26.7mL H3PO4，1.176g CaSO4，18.2g K2SO4，14.9g MgSO4·7H2O，4.347g KOH，40g甘油，4.35mL PTM1，pH5.0。
步骤(2)中所述的发酵的条件为温度28～30℃，pH 4.8～5.2，转速600～800rpm，通气量8～15L/min，时间20～24h。
步骤(3)中所述的补料生长培养基的配方为：700g甘油，12mL PTM1。
步骤(3)中所述的流加的流速为10～14mL/(L·h)。
步骤(3)中所述的发酵的条件为温度28～30℃，pH 4.8～5.2，转速600～800rpm，通气量8～15L/min，时间2～6h。
步骤(4)中所述的补料诱导培养基的配方为：1000mL甲醇，12mL PTM1。
所述的PTM1的配方为：6.0g CuSO4·5H2O，0.08g NaI，3.0g MnSO4·H2O，0.2gNa2MoO4·2H2O，0.02g H3BO3，0.5g CoCl2，20.0g ZnCl2，65.0g FeSO4·7H2O，0.2g维生素B7，5.0ml浓H2SO4。
步骤(4)中所述的诱导培养的条件为控制培养基中的溶解氧含量为10～40％，优选为40％。
步骤(4)中所述的诱导培养的条件为pH值4.5～7.0，优选为5.5。
步骤(4)中所述的诱导培养的条件为温度22～30℃，优选为22℃。
步骤(4)中所述的诱导培养的时间为144～168h，优选为168h。
步骤(4)中所述的诱导培养还包括如下步骤：
每培养12～48h添加终浓度为45μM的5-氨基乙酰丙酸；优选为每培养24h添加终浓度为45μM的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明对GmaUPO发酵过程的诱导条件(溶氧、pH和5-ALA添加量)进行了优化，在维持溶氧40％，诱导pH5.5，每24h添加终浓度为45μM 5-ALA条件下，诱导168h时，7L发酵罐中毕赤酵母产GmaUPO酶活力最高为17.81U/L，相比摇瓶发酵酶活力提高124倍，实现了GmaUPO在毕赤酵母工程菌中的高效表达，为GmaUPO的工业化生产提供了理论依据。其次，探究GmaUPO催化饱和直链脂肪酸羟基化反应研究，结果显示，GmaUPO对C10-C16链长的饱和直链脂肪酸有催化效果，且优于同等条件下MroUPO的催化效果，此外GmaUPO倾向于在脂肪酸ω-1和ω-2位置发生羟基化反应。本研究为GmaUPO的工业化生产及其在在羟基脂肪酸高效合成工业中的应用提供重要的理论指导。
附图说明
图1是溶氧百分比对GmaUPO-X33表达GmaUPO的影响结果图。
图2是pH值对GmaUPO-X33表达GmaUPO的影响结果图。
图3是5-ALA添加量对GmaUPO-X33表达GmaUPO的影响结果图。
图4是7L发酵罐中GmaUPO-X33表达GmaUPO的SDS-PAGE电泳分析图。
图5是GmaUPO催化脂肪酸产物色谱结果图。
图6是GmaUPO(A)和MroUPO(B)催化系列饱和脂肪酸羟基化色谱定量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1.GmaUPO的高效工业发酵合成方法
本发明所使用的菌株为GmaUPO-X33，一种毕赤酵母工程菌，制备方法和来源参照专利CN112961791A，该菌株即专利CN112961791A中所述的X-33/pPICZαA-SPGma-GmaUPO重组工程菌。
本发明中的GmaUPO是一种来源于纹缘盔孢伞菌(Galerina marginata)的非特异性过氧合酶，其氨基酸序列可参照专利CN112961791A中的SEQ ID NO：1。
培养基配制
1、活化培养基YPG：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％甘油，2％琼脂粉，120℃灭菌20min，倒平板前加入终浓度为100μg/mL的博来霉素。
2、一级种子培养基YPG：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％甘油，倒平板前加入终浓度为100μg/mL的博来霉素。。
3、二级种子培养基YPG：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％甘油。
4、PTM1微量元素：6.0g CuSO4·5H2O，0.08g NaI，3.0g MnSO4·H2O，0.2gNa2MoO4·2H2O，0.02g H3BO3，0.5g CoCl2，20.0g ZnCl2，65.0g FeSO4·7H2O，0.2g生物素，5.0ml浓H2SO4，115℃灭菌20min。
5、甘油分批培养基BSM：26.7mL H3PO4，1.176g CaSO4，18.2g K2SO4，14.9g MgSO4·7H2O，4.347g KOH，40g甘油，4.35mL PTM1，用氨水调至pH5.0，121℃灭菌30min。
6、补料生长培养基：700g甘油，12mL PTM1，灭菌20min。
7、补料诱导培养基：1000mL甲醇，12mL PTM1。
种子液制备
1、菌种的活化：在超净工作台中挑取GmaUPO-X33甘油保藏菌划线活化于活化培养基YPG中，30℃避光培养3d。
2、一级种子液的制备：挑取上述平板上的单菌落接种到50mL一级种子培养基，30℃，240rpm振荡培养24h。
3、二级种子液的制备：将一级种子液按3％接种量转接至350mL二级种子培养基，30℃，250rpm振荡培养约14h至OD600＞10，得到二级种子液。
甘油分批培养(0～20h)
将二级种子液按10％接种量转接至含3L甘油分批培养基BSM的7L发酵罐中，发酵温度30℃，罐压0.05MPa，自动流加氨水控制pH 5.0，调节转速和通气量使溶氧维持30％，转速700rpm，通气量10L/min。发酵培养20h，甘油耗尽(DO值陡升)进行甘油流加培养。
甘油流加培养(20～24h)
以12mL/(L·h)的流速流加补料生长培养基，发酵条件与甘油分批培养相同，调节转速和通气量使DO(溶解氧含量)维持30％，待湿重达到180g/L时停止补料，待发酵液中甘油耗尽继续空耗0.5h，之后进行诱导培养。(空耗时调整发酵温度为22℃)。
诱导培养
诱导温度22℃，控制转速700rpm，pH 6.0，控制通气量10L/min，通过流加补料诱导培养基、调节转速和通气量使DO维持30％，随着生物量的增加逐渐调整流加速度，每12h细胞湿重的增量控制在30g/L。
实施例2.最佳溶氧条件实验
种子液制备和发酵过程同实施例1，区别在于诱导培养方法不同。
诱导培养方法：诱导温度22℃，控制转速700rpm，控制通气量10L/min，每48h添加终浓度为45μM的5-ALA(5-氨基乙酰丙酸盐酸盐)，诱导pH为5，分四个实验组，分别控制串联“转速-通气量-溶氧”使溶氧维持在10％、20％、30％、40％，随着生物量的增加逐渐提高培养基流速，每12h细胞湿重的增量控制在30g/L，诱导时间168h，诱导过程中每12h取样测定OD600、细胞湿重、蛋白质含量和酶活力。
取样测定方法：
蛋白质浓度的测定(参考文献：王孝平,邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009(3):40-42.)
采用Braford试剂盒测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白(BSA)标准品制备蛋白质标准曲线，配置系列浓度BSA标准品溶液。在酶标板孔中依次加入10μL BSA标准溶液和200μLBradford染液，反应5min后，于595nm测吸光值，以蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，将待测溶液稀释直至吸光值在标准曲线线性范围内，然后计算待测溶液的蛋白浓度。所有实验均进行三次平行实验。
湿重测定
吸取2mL发酵液至一已称重的2mL离心管中，12000rpm离心3min，倒去上清液，吸干残余液体，称量并计算细胞湿重。所有实验均进行三次平行实验。
OD600测定
将所得发酵将稀释适当倍数，使用紫外分光分光光度计测定600nm处的吸光值，所有实验均进行三次平行实验。
如公式所示:OD 600＝读数×稀释倍数
酶活测定
采用NBD(3,4-亚甲基二氧基硝基苯)法测定非特异性过氧合酶GmaUPO酶活力。所有实验均进行三次平行实验。具体方法可参考文献：Poraj-Kobielska M.,Kinne M.,Ullrich R.,et al.A spectrophotometric assay for the detection of fungalperoxygenases[J].Analytical Biochemistry,2012,421(1):327-329.
结果如图1所示：
图1(A)为本发明实施例3提供的不同溶氧条件下诱导时间与OD600之间的关系曲线；图1(B)为本发明实施例3提供的不同溶氧条件下诱导时间与细胞湿重之间的关系曲线；图1(C)为本发明实施例3提供的不同溶氧条件下诱导时间与蛋白含量之间的关系曲线；图1(D)为本发明实施例3提供的不同溶氧条件下诱导时间与GmaUPO酶活力之间的关系曲线。
图1(D)表明，诱导阶段维持溶氧为40％，诱导144h时，GmaUPO酶活力最高为12.39±0.10U/mL，相比维持溶氧30％提高了32.37％。图1(B)表明，维持溶氧40％，诱导168h，细胞湿重最大为466.50g/L，提高了20.70％。
高密度发酵过程中，需要通过控制补料使溶氧维持在一定范围内，降低补料流速可维持溶氧较高，但会导致细胞缺乏营养，致使细胞生长缓慢，溶氧过低往往是因为甲醇补料过多，细胞快速生长并老化，比生长速率过大。两种情况都会导致外源蛋白表达量下降。因此，发酵过程中维持适合的溶氧和细胞生长速率能实现目的蛋白的高效表达。
实施例3.最佳诱导pH实验
种子液制备和发酵过程同实施例1，区别在于诱导培养方法不同。
诱导培养方法：诱导温度22℃，控制转速700rpm，控制通气量10L/min，每48h添加终浓度为45μM的5-ALA，串联“转速-通气量-溶氧”使溶氧维持在40％，分六个实验组，分别通过自动流加氨水或硫酸控制发酵液的pH值恒定为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，随着生物量的增加逐渐提高培养基流速，每12h细胞湿重的增量控制在30g/L，诱导时间144h，诱导过程中每12h取样测定OD600、细胞湿重、蛋白质含量和酶活力，测定方法参考实施例2。
结果如图2所示：
图2(A)为本发明实施例4提供的不同诱导pH条件下诱导时间与OD600之间的关系曲线；图2(B)为本发明实施例4提供的不同诱导pH条件下诱导时间与细胞湿重之间的关系曲线；图2(C)为本发明实施例4提供的不同诱导pH条件下诱导时间与蛋白含量之间的关系曲线；图2(D)为本发明实施例4提供的不同诱导pH条件下诱导时间与GmaUPO酶活力之间的关系曲线。
实验结果表明，在诱导pH 5.5条件下，诱导132h时，酶活力达到最高为15.78±0.16U/L，相比pH 5.0提高了33.39％。
实施例4.5-ALA加量实验
种子液制备和发酵过程同实施例1，区别在于诱导培养方法不同。
诱导培养方法：诱导温度22℃，控制转速700rpm，控制通气量10L/min，串联“转速-通气量-溶氧”使溶氧维持在40％，通过自动流加氨水控制发酵液的pH值恒定为5.5，分别每12h、24h、36h、48h添加终浓度为45μM的5-ALA，以不添加5-ALA的发酵批次作为对照组，随着生物量的增加逐渐提高培养基流速，每12h细胞湿重的增量控制在30g/L，诱导时间168h，诱导过程中每12h取样测定OD600、细胞湿重、蛋白质含量和酶活力，测定方法参考实施例2。
结果如图3所示：
图3(A)为本发明实施例5提供的5-ALA不同添加量下诱导时间与OD600之间的关系曲线；图3(B)为本发明实施例5提供的5-ALA不同添加量下诱导时间与细胞湿重之间的关系曲线；图3(C)为本发明实施例5提供的5-ALA不同添加量下诱导时间与蛋白含量之间的关系曲线；图3(D)为本发明实施例5提供的5-ALA不同添加量下诱导时间与GmaUPO酶活力之间的关系曲线。
实验结果表明，每24h添加终浓度为45μM 5-ALA条件下，诱导168h时，酶活力最高达17.81±0.11U/L，相比每48h添加终浓度为45μM 5-ALA提高了25.66％。此时OD600值和细胞湿重最低分别为600和356.50g/L，说明在此条件下，碳代谢流更倾向于合成GmaUPO蛋白，从而分配给维持细胞生长代谢的能量较少，大大提高了生产效率。
使用12.5％变性丙烯酰胺彩色凝胶快速制备试剂盒制备SDS-PAGE电泳胶，SDS-PAGE电泳图如图4所示；泳道M：Marker；泳道1-14分别为最优条件下诱导12,24,26,48,60,72,84,96,108,120,133,144,156,168h的发酵上清液。
综合实施例1～4的实验结果，本发明对GmaUPO发酵过程的诱导条件(溶氧、pH和5-ALA添加量)进行了优化，在维持溶氧40％，诱导pH5.5，每24h添加终浓度为45μM 5-ALA条件下，诱导168h时，7L发酵罐中毕赤酵母产GmaUPO酶活力为17.81±0.11U/L。
作为对比，参照invitrogen EasySelectTM Pichia Expression Kit提供的毕赤酵母发酵手册使用GmaUPO-X33进行摇瓶发酵，得到的发酵液浓缩70倍后参照实施例2的方法测定GmaUPO酶活力，测得其酶活力为10U/L。本发明最优发酵条件得到的GmaUPO酶相较摇瓶发酵所得到的酶活力提高了124倍，实现了GmaUPO在毕赤酵母工程菌中的高效表达，为GmaUPO的工业化生产提供了理论依据。
实施例5.GmaUPO催化脂肪族化合物羟基化反应
为了鉴定非特异性过氧合酶(UPOs)的羟基化催化能力，选择C6-C19链长饱和直链脂肪酸作为底物进行催化实验，具体种类见表2，实验步骤如下：
磷酸缓冲液的配制：称取6.08g磷酸二氢钾溶解于超纯水当中，并定容至1L；称取11.41g三水合磷酸氢二钾溶解于超纯水当中，并定容至1L；用两种溶液相互混合调制pH调至7.0，4℃冰箱保存备用。
在4mL实心盖螺口样品瓶中进行1mL体积的催化反应。反应体系包括磷酸盐缓冲溶液(310μL，50mM，pH 7)，实施例4中制备得到的GmaUPO(500μL，终浓度12U/L)，氯化胆碱ChCl(100μL，终浓度100mM)，胆碱氧化酶AnChOx(50μL，终浓度5μM)(来源于烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)的胆碱氧化酶，具体制备方法可参考文献“李咏如.天然低共熔溶液中非特异性过氧合酶催化芳环类物质选择性氧化的研究[D].华南理工大学”)和底物(40μL，终浓度1mM)，30℃条件下，反应24h后加入100μL HCl(3mM)并在500rpm和室温下孵育5min以淬灭过量的酶和H2O2来停止反应。底物及其产物用甲基叔丁基醚(MTBE，1mL)萃取，Na2SO4干燥后用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(99％BSTFA+1％TMCS)衍生，GC-MS检测分析。空白组用磷酸盐缓冲溶液代替酶液，其余条件相同，所有实验均是三次平行实验的结果。
实施例6.MroUPO催化脂肪族化合物羟基化反应
作为对比，使用轮纹担子菌(Marasmius rotula)来源的非特异性过氧合酶(MroUPO)进行羟基化反应测试其催化效率，所使用的底物与实施例5相同，具体步骤同实施案例5，只需将GmaUPO(12U/L)替换成MroUPO(12U/L)即可。MroUPO源于轮纹担子菌(Marasmius rotula)，该酶的分离纯化方法可参照文献Grbe G,RenéUllrich,Pecyna M J,et al.High-yield production of aromatic peroxygenase by the agaric fungusMarasmius rotula[J].AMB Express,2011,1，本专利中使用的MroUPO即该文献中的MroAPO，酶活测定方法参考实施例2。
实施例7.反应底物和产物的测定
采用岛津TQ 8050气相色谱质谱联用仪(Shimadzu Technologies,Japan)，装载岛津SH-Rxi-5Sil MS色谱柱(30m×0.25mm,I.D.0.25μm)进行分析。氦气作为载气，载气流量0.8mL min-1，进样体积为1μL，进样口温度为280℃，分流比为100:1，离子源温度230℃，接口温度300℃，溶剂延迟时间4min。初始温度50℃，保持2min，然后以20℃每分钟升至250℃，保留12min。通过标准品质量碎片法鉴定化合物，并将其质谱与Wiley和NIST文库的质谱进行比较。使用外标法建立外部标准曲线和相同或类似化合物的摩尔响应因子从总离子峰区域获得定量。
表1脂肪酸物质的气相色谱-质谱保留时间
GmaUPO催化脂肪酸结果表明：如图6所示，在所测试脂肪酸类底物中，十三烷酸催化效果最好，在GmaUPO酶活12U/L、ChCl 1μM、AnChOx为5μM、30℃、pH7，底物十三烷酸1mM条件下反应24h，产物羟基脂肪酸浓度为0.331mM。转化率为33.10％。此外，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、十七酸、十八酸、十九酸未观察到产物，所以图中未显示。
将GmaUPO与MroUPO催化脂肪酸羟基化效果进行对比，结果显示：GmaUPO与MroUPO均对中长链饱和直链脂肪酸有催化效果；GmaUPO更倾向于催化C10-C16链长的饱和直链脂肪酸在ω-1和ω-2位置发生羟基化反应，而MroUPO则更倾向于与C11-C15链长饱和脂肪酸的ω和ω-1位发生反应。(C15链长脂肪酸只观察到ω-1羟基脂肪酸)，同样反应条件下，GmaUPO催化脂肪酸生成羟基脂肪酸产物浓度高于MroUPO产物浓度，即GmaUPO催化脂肪酸效果优于MroUPO，表明GmaUPO对脂肪酸底物较MroUPO具有偏好性。
具体数据如下：
表2羟基化催化产物色谱定量测定结果
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种非特异性过氧合酶GmaUPO的应用，其特征在于：
用于催化脂肪族化合物的羟基化反应；
所述的脂肪族化合物为癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸和十六酸中的至少一种；
所述的催化脂肪族化合物的羟基化反应的具体步骤为：
在反应体系中加入GmaUPO、氯化胆碱、胆碱氧化酶和底物进行催化羟基化反应得到产物；
所述的反应体系还包含磷酸盐缓冲溶液；
所述的胆碱氧化酶为源自烟草节杆菌的胆碱氧化酶AnChOx；
所述的催化羟基化反应的条件为28～30℃温度下，搅拌400～600rpm，反应22～24h；
所述的应用中的氯化胆碱、胆碱氧化酶和反应底物的浓度的比为100～150mM:5～10μM:1mM；
所述的非特异性过氧合酶GmaUPO的氨基酸序列为：
FPAYGSLAGLTREQLDEILPTLEIREPGKPPGPLKDTSAKLVNDKAHPWKPVAPADIRGPCPGLNTLASHGWLPRNGIASPSEIITAVQEGFNMDNGLAIFVTYAAHLVDGNILTDKLSIGGKTGLTGPNPPAPAIVGGLNTHAVFEGDTSMTRGDFFFGNNHDFNETLFDEFVDFSNRFGAGKYNLTVAGEFRWQRIQDSIATNPEFSFVSPRFFTAYAESTFPINFFIDGRQTDGQLDLTVARGFFQNSRMPDDFHRANGTRGTEGIDLVAEAHPIEPGSNVGGVNNYVVDPTSADFSTFCLLYENFVNKTVKGLYPNPTGALRKALNTNLGFFFSGISDSGCTQVFPYGK。
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