CN114805385A - 一种基于分子探针技术制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于分子探针技术制备乳清蛋白‑咖啡酸结合物的方法。本发明利用咖啡酸小分子探针与乳清蛋白结合，通过生物素探针‑链霉亲和素磁珠***富集、纯化蛋白组，经聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白组进行快速筛选，结果表明活性探针泳道出现特异性条带，可利用小分子探针钓取出乳清蛋白‑咖啡酸的结合物，对咖啡酸与乳清蛋白构效关系的深度研究及二者营养价值的精准把控具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于分子探针技术制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法。
背景技术
多酚是水果、蔬菜、茶和咖啡中的主要植物化学物质，具有许多有益的功能特性，如抗氧化、抗炎症、抗过敏性、预防癌症和神经退行性疾病等作用。将多酚引入食品体系，二者的相互作用影响着食品的结构和口感，被视为赋予和提高食品抗氧化性质和生物功能特性的有效途径之一，而蛋白质因具有结合多酚的性质也被视为多酚加入食品体系的良好载体。多酚可以与蛋白质进行非共价相互作用，包括疏水相互作用、氢键和静电相互作用。此外，多酚还可以通过醌、多酚氧化产物和蛋白质侧链或肽链上的亲核残基(硫醇、氨基、胍或咪唑)之间的相互作用与蛋白质进行共价相互作用。
咖啡酸是咖啡饮品中一种重要的酚酸，在抗氧化、预防慢性炎症和心血管疾病等方面发挥重要作用。乳清蛋白是乳制品中重要的蛋白质，不仅具有良好的氨基酸分布和功能性质，还有参与调解人体血糖和脂质代谢、刺激免疫***等多种生物学活性。目前乳制品及咖啡饮品已成为人类重要的膳食组分，有研究表明，咖啡酸与乳清蛋白结合有效提高了咖啡酸在胃肠道环境中的稳定性，增强了其在人体内的抗氧化活性，同时咖啡酸对乳清蛋白的三维结构具有修饰作用，有望作为降低乳清蛋白致敏性的理想方法，二者的协同作用有助于调节人体生理功能、促进吸收代谢。
然而，尽管咖啡酸与乳清蛋白结合表现出较好的生物学活性，但二者结合物快速有效的调取方法目前尚未有报道，从而极大限制了咖啡酸与乳清蛋白构效关系的深度研究及对二者营养价值的精准把控。因此设计与合成具有生物活性的小分子探针，对进一步研究咖啡酸与乳清蛋白的相互作用具有重要意义。生物素作为一种常见的标记基团，目前未见报道咖啡酸和生物素连接形成咖啡酸-生物素小分子探针，并钓取咖啡酸与乳清蛋白结合物的研究。本研究利用合成的小分子探针，通过聚丙烯凝胶电泳技术，形成了一种制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法，为咖啡酸与乳清蛋白相互作用的深度研究提供了有效手段。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种基于分子探针技术制备乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法，以克服现有的乳清蛋白-咖啡酸结合物钓取研究的不足。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明的第一个目的是提供一种咖啡酸-生物素小分子探针，所述小分子探针的结构如式1所示，
本发明的第二个目的是提供前述咖啡酸-生物素小分子探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将式2所示化合物、式3所示化合物溶于有机溶剂A中；
室温下加入有机溶剂B、有机溶剂C，反应搅拌；将反应液加入到甲基叔丁基醚中析出中间产物A，用硅胶柱纯化，再用二氯甲烷和石油醚重结晶得到式4所示化合物；
式2所示化合物为
式3所示化合物为
式4所示化合物为
S2：将式4所示化合物溶于二氯甲烷；冰浴下加入盐酸-甲醇溶液，反应搅拌；浓缩反应液得到式5所示化合物；
式5所示化合物为
S3：将式5所示化合物、式6所示化合物溶于有机溶剂A中；室温下加入有机溶剂B、有机溶剂C，反应搅拌；将反应液加入到甲基叔丁基醚中析出中间产物B；用硅胶柱纯化，再用二氯甲烷和乙酸乙酯重结晶得到式1示化合物；
式6示化合物为
式1示化合物为
进一步的，S1、S2、S3反应搅拌时间为12-16h，优选的，S1、S2、S3反应搅拌时间为15h；
进一步的，S1中所述式2所示化合物与式3所示化合物的质量比为7.5：6.5-10.5：9.5，优选的，S1中所述式2所示化合物与式3所示化合物的质量比为9：8。
进一步的，S1、S3中，所述有机溶剂A为二甲基甲酰胺(DMF)；
进一步的，所述式2所示化合物在有机溶剂A中的浓度为70.5-73.5mg/mL，优选的，所述式2所示化合物在有机溶剂A中的浓度为72mg/mL；
进一步的，甲基叔丁基醚与式2所示化合物的比例为54.1-57.1mL/g；优选的，甲基叔丁基醚与式2所示化合物的比例为55.6mL/g；
进一步的，式5所示化合物在有机溶剂A中的浓度为42.5-45.5mg/mL，优选的，式5所示化合物在有机溶剂A中的浓度为44mg/mL；
进一步的，式6所示化合物在有机溶剂A中的浓度为46.5-49.5mg/mL，优选的，式6所示化合物在有机溶剂A中的浓度为48mg/mL；
进一步的，所述有机溶剂B为碳二亚胺盐酸盐(EDCI)；
进一步的，S1中有机溶剂B与式2所示化合物的质量比为1.7：1.5-4.7：4.5，优选的，S1中有机溶剂B与式2所示化合物的质量比为3.2：3；
进一步的，S1中有机溶剂B与式3所示化合物的质量比为4.5：3.5-7.5：6.5，优选的，S1中有机溶剂B与式3所示化合物的质量比为6：5；
进一步的，S3中有机溶剂B与式5所示化合物的质量比为3.3：4-6.3：7，优选的，S3中有机溶剂B与式5所示化合物的质量比为4.8：5.5；
进一步的，S3中有机溶剂B与式6所示化合物的质量比为2.5：3.5-5.5：6.5，优选的，S3中有机溶剂B与式6所示化合物的质量比为4：5；
进一步的，所述有机溶剂C为4-二甲氨基吡啶(DMAP)；
进一步的，S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.4：8.79-0.82：9.21，优选的，S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.61：9；
进一步的，S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.4：7.79-0.82：8.21，优选的，S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.61：8；
进一步的，S3中有机溶剂C与式5所示化合物的质量比为0.4：10.79-0.82：11.21，优选的，S3中有机溶剂C与式5所示化合物的质量比为0.61：11
进一步的，S3中有机溶剂C与式6所示化合物的质量比为0.4：11.79-0.82：12.21，优选的，S3中有机溶剂C与式6所示化合物的质量比为0.61：12。
进一步的，S1中，所述硅胶柱试剂体积比为二氯甲烷：甲醇＝20:1；
进一步的，S3中，所述硅胶柱试剂体积比为二氯甲烷：甲醇＝10：1；
进一步的，S2中，盐酸-甲醇溶液中盐酸和甲醇的用量为4mmol/mL。
进一步的，式4所示化合物在二氯甲烷中的浓度为62.5-65.5mg/mL；优选的，式4所示化合物在二氯甲烷中的浓度为64mg/mL；
进一步的，S3中所述式5所示化合物与式6所示化合物的质量比为1.1：1.2。
本发明的第三个目的是提供前述的咖啡酸-生物素小分子探针在钓取乳清蛋白-咖啡酸结合物中的应用。
乳清蛋白中含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、β-乳球蛋白二聚体、乳铁蛋白、免疫球蛋白，等多种活性成分。将所述的咖啡酸-生物素小分子探针氧化后，加入乳清蛋白，小分子探针中的咖啡酸能够与乳清蛋白中的β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白等蛋白结合，从而钓取出乳清蛋白-咖啡酸结合物，了解咖啡酸的蛋白作用靶点。
本发明的第四个目的是提供前述的咖啡酸-生物素小分子探针在定性和/或定量检测乳清蛋白-咖啡酸结合物中的应用。
乳清蛋白-咖啡酸结合物中所述乳清蛋白为β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白中的一种或多种。
本发明的第五个目的是提供一种用于定性和/或定量检测乳清蛋白-咖啡酸结合物的组合物，所述组合物包括式1所述的咖啡酸-生物素小分子探针。
乳清蛋白-咖啡酸结合物中所述乳清蛋白为β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白中的一种或多种。
进一步的，所述组合物还包括：链霉亲和素标记磁珠、SDS-PAGE Sample Loadingbuffer、MP102蛋白Marker、考马斯亮蓝染色液。
本发明的第六个目的是提供前述的咖啡酸-生物素小分子探针或前述组合物在制备定性和/或定量检测乳清蛋白-咖啡酸结合物的试剂盒中的应用。
进一步的，所述应用为将咖啡酸-生物素小分子探针氧化后与乳清蛋白混合，通过链霉亲和素磁珠富集、纯化蛋白组，经聚丙烯酰胺凝胶电泳对能够与咖啡酸结合的乳清蛋白组进行快速筛选，实现乳清蛋白-咖啡酸结合物的定性和/或定量检测。
在某个特殊的实施例中，所述氧化为将咖啡酸-生物素小分子探针溶于溶剂后，调节至pH＝9，暗环境氧化1h，得到氧化型探针。
乳清蛋白-咖啡酸结合物中所述乳清蛋白为β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白中的一种或多种。
本发明的有益效果是：
1.合成了以烷烃作为连接链、生物素作为报告基团的新型咖啡酸小分子探针。
2.该咖啡酸-生物素小分子探针具有良好的水溶性和对乳清蛋白靶点识别的作用，将本发明的咖啡酸-生物素小分子探针与乳清蛋白混合后，能够钓取出乳清蛋白中能够与咖啡酸结合的蛋白，如β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白，形成相应的乳清蛋白-咖啡酸结合物，对天然多酚类化合物与食品蛋白质相互作用机制的研究具有重要的学术研究价值和应用前景。
3.本发明合成方法路线简短、操作简便、反应条件温和、选择性高，为复杂天然产物分子探针设计提供了更好的方法。
4.本发明的探针为特异性钓取出咖啡酸-乳清蛋白结合物，为咖啡酸与乳清蛋白相互作用的深度研究提供了有效手段，也对营养价值的精准把控具有重要意义。
附图说明
图1为式1所示咖啡酸-生物素小分子探针的质谱图。
图2为式1所示咖啡酸-生物素小分子探针的核磁共振波谱图；
图3为式1所示咖啡酸-生物素小分子探针与乳清蛋白相互作用后聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中M为：MP102蛋白Marker，泳道1为乳清蛋白标准品；2为磁珠处理的乳清蛋白标准品；3为磁珠处理的240μmol/g咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物样品、4为磁珠处理的480μmol/g咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物样品、5为磁珠处理的960μmol/g咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物样品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1：咖啡酸-生物素小分子探针(1)的合成
S1：将化合物2(1.8g，1eq)，化合物3(1.6g，1.1eq)溶于DMF(25ml)。室温下加入EDCI(1.92g，1eq)，DMAP(122mg，0.1eq)，反应搅拌15小时。将反应液加入到甲基叔丁基醚(100ml)中析出黄色固体，即中间产物A。用硅胶柱纯化(20:1＝二氯甲烷：甲醇)，再用二氯甲烷和石油醚重结晶得到产物4，1.6g，为黄色固体，产率为50％。
S2：将化合物4(1.6g，1eq)溶于二氯甲烷(25ml)。冰浴下加入盐酸甲醇溶液(25ml)，盐酸-甲醇溶液中盐酸和甲醇的用量为4mmol/mL，反应搅拌15小时。浓缩反应液得到产物5，1.1g，为黄色油状物，产率为99％。
S3：将化合物5(1.1g，1eq)，化合物6(1.2g，1eq)溶于DMF(25ml)。室温下加入EDCI(960mg，1eq)，DMAP(61mg，0.1eq)，反应搅拌15小时。将反应液加入到甲基叔丁基醚(100ml)中析出黄色固体，即中间产物B。用硅胶柱纯化(10:1＝二氯甲烷：甲醇)，再用二氯甲烷和乙酸乙酯重结晶即得到终产物式1示化合物，600mg，为浅黄色固体，产率为28％。
所制得的式1示化合物的谱图数据解析如下：
1H NMR(DMSO-D6，300MHz)1.25(m,2H)1.55(m,2H)1.58(m,2H)2.13(t,2H)3.10(d,2H)3.27(m,1H)3.42(t,2H)3.66(t,2H)4.50(d,1H)4.60(d,1H)6.46(s,1H)6.67(d,1H)6.82(d,1H)7.06(s,1H)7.32(s,1H)8.01(t,1H)8.41(t,1H)9.48(d,1H)10.86(d,1H)ppm。
实验例1
实验设计：咖啡酸-生物素小分子探针与乳清蛋白结合，通过咖啡酸-生物素小分子探针-链霉亲和素磁珠***富集、纯化小分子探针结合的蛋白组，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，探究本发明咖啡酸-生物素小分子探针具有相互作用的乳清蛋白，并对本发明咖啡酸-生物素小分子探针“钓取”出乳清蛋白与咖啡酸的结合物的能力进行测试
1.实验材料与试剂：乳清蛋白(来源：美国Hilmar公司)，咖啡酸(来源：sigma)，链霉亲和素磁珠(厂家：上海优宁维生物科技股份有限公司，型号：5947S)，SDS-PAGE SampleLoading buffer、MP102蛋白Marker、考马斯亮蓝染色液。
2.仪器：超净工作台、离心机、旋转混合仪、化学通风橱、垂直电泳槽。
3.样品的配制：取本发明实施例1制备得到的咖啡酸-生物素小分子探针，使用去离子水溶解至不同浓度：240μmol/g蛋白、480μmol/g蛋白、960μmol/g蛋白，利用0.1MNaOH调至ph＝9，放于旋转混合仪上暗环境氧化1h，乳清蛋白使用去离子水溶解至浓度为1mg/mL。氧化后的咖啡酸-生物素小分子探针与乳清蛋白溶液混合，25℃下黑暗中进行60min，分别使用0.1MHCl或0.1MNaOH将pH值调节为7.0，所得3个浓度的咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物样品溶液在-20℃中保存。
4.具体实验方法为：称取20μL链霉亲和素磁珠，磁性分离后加入样品溶液(样品溶液为：乳清蛋白标准样品、3中制备的3个浓度的咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物样品)，旋转混匀1h，磁性分离后弃上清，加入40μL去离子水清洗沉淀，磁性分离后弃上清，重复加入40μL去离子水重悬沉淀，分别得到磁珠处理的乳清蛋白标准品、磁珠处理的3个浓度的咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物样品待用。将乳清蛋白标准品、磁珠处理的乳清蛋白标准品、磁珠处理的3个浓度的咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物样品溶液与SDS-PAGE SampleLoading buffer以4：1体积比混合，涡旋振荡，95℃下加热5min，14000rpm下微量离心1min，取上清，将MP102蛋白Marker与样品溶液点入泳道，设置对照组，后使用考马斯亮蓝染色，拍照成像。实验结果如图3所示。
5.实验结果：由图3可以看出，未经磁珠处理的蛋白标准品泳道1条带清晰，说明蛋白样品不存在问题，且相应蛋白条带对应；经磁珠处理的蛋白标准品泳道2未出现条带，说明链霉亲和素磁珠对蛋白标准品不产生作用；经磁珠处理的咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物泳道3(240μmol/g蛋白)，泳道4(480μmol/g蛋白)，泳道5(960μmol/g蛋白)随咖啡酸浓度增大，特异性条带逐渐清晰，说明探针-生物素-链霉亲和素体系能够钓取出乳清蛋白中的β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白，标记到的特异性蛋白条带位于18.3kDa及35-80kDa之间，可进一步探究钓取出的结合物的结构，应用于咖啡酸与乳清蛋白作用机制的深度研究。
实验例2
根据实验例1所钓取出的乳清蛋白条带，利用quantity one进行灰度值测定。结果表明，咖啡酸-生物素小分子探针有效钓取出240μmol/g咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物处理组中15％的β-乳球蛋白-α-乳白蛋白，26％的乳铁蛋白；480μmol/g咖啡酸-生物素-乳清蛋白复合物处理组中78％的β-乳球蛋白-α-乳白蛋白，56％的乳铁蛋白，实现了乳清蛋白-咖啡酸结合物的定量检测。
综上所述，本发明所述的咖啡酸-生物素小分子探针与乳清蛋白混合后，能够钓取出乳清蛋白中能够与咖啡酸结合的蛋白，如β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白，形成相应的咖啡酸-生物素-乳清蛋白结合物。本研究利用合成的小分子探针，通过聚丙烯凝胶电泳技术，形成了一种定性和/或定量检测乳清蛋白-咖啡酸结合物的方法，为咖啡酸与乳清蛋白相互作用的深度研究提供了有效手段。
Claims (14)
1.一种咖啡酸-生物素小分子探针，其特征在于，所述小分子探针的结构如式1所示，
2.权利要求1所述咖啡酸-生物素小分子探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将式2所示化合物、式3所示化合物溶于有机溶剂A中；
室温下加入有机溶剂B、有机溶剂C，反应搅拌；将反应液加入到甲基叔丁基醚中析出中间产物A，用硅胶柱纯化，再用二氯甲烷和石油醚重结晶得到式4所示化合物；
优选的，甲基叔丁基醚与式2所示化合物的比例为54.1-57.1mL/g；
进一步优选的，甲基叔丁基醚与式2所示化合物的比例为55.6mL/g；
式2所示化合物为
式3所示化合物为
式4所示化合物为
S2：将式4所示化合物溶于二氯甲烷；冰浴下加入盐酸-甲醇溶液，反应搅拌；浓缩反应液得到式5所示化合物；式5所示化合物为
优选的，式4所示化合物在二氯甲烷中的浓度为62.5-65.5mg/mL；
进一步优选的，式4所示化合物在二氯甲烷中的浓度为64mg/mL；
S3：将式5所示化合物、式6所示化合物溶于有机溶剂A中；室温下加入有机溶剂B、有机溶剂C，反应搅拌；将反应液加入到甲基叔丁基醚中析出中间产物B；用硅胶柱纯化，再用二氯甲烷和乙酸乙酯重结晶得到式1示化合物；
式6示化合物为
式1示化合物为
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S1中所述式2所示化合物与式3所示化合物的质量比为7.5：6.5-10.5：9.5，优选的，S1中所述式2所示化合物与式3所示化合物的质量比为9：8。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S1、S3中，所述有机溶剂A为二甲基甲酰胺(DMF)，
所述式2所示化合物在有机溶剂A中的浓度为70.5-73.5mg/mL，优选的，所述式2所示化合物在有机溶剂A中的浓度为72mg/mL；
式5所示化合物在有机溶剂A中的浓度为42.5-45.5mg/mL，优选的，式5所示化合物在有机溶剂A中的浓度为44mg/mL；
式6所示化合物在有机溶剂A中的浓度为46.5-49.5mg/mL，优选的，式6所示化合物在有机溶剂A中的浓度为48mg/mL；
所述有机溶剂B为碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，
S1中有机溶剂B与式2所示化合物的质量比为1.7：1.5-4.7：4.5，优选的，S1中有机溶剂B与式2所示化合物的质量比为3.2：3；
S1中有机溶剂B与式3所示化合物的质量比为4.5：3.5-7.5：6.5，优选的，S1中有机溶剂B与式3所示化合物的质量比为6：5；
S3中有机溶剂B与式5所示化合物的质量比为3.3：4-6.3：7，优选的，S3中有机溶剂B与式5所示化合物的质量比为4.8：5.5；
S3中有机溶剂B与式6所示化合物的质量比为2.5：3.5-5.5：6.5，优选的，S3中有机溶剂B与式6所示化合物的质量比为4：5；
所述有机溶剂C为4-二甲氨基吡啶(DMAP)，
S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.4：8.79-0.82：9.21，优选的，S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.61：9；
S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.4：7.79-0.82：8.21，优选的，S1中有机溶剂C与式2所示化合物的质量为0.61：8；
S3中有机溶剂C与式5所示化合物的质量比为0.4：10.79-0.82：11.21，优选的，S3中有机溶剂C与式5所示化合物的质量比为0.61：11
S3中有机溶剂C与式6所示化合物的质量比为0.4：11.79-0.82：12.21，优选的，S3中有机溶剂C与式6所示化合物的质量比为0.61：12。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述硅胶柱试剂体积比为二氯甲烷：甲醇＝20:1；S3中，所述硅胶柱试剂体积比为二氯甲烷：甲醇＝10：1。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S2中，盐酸-甲醇溶液中盐酸和甲醇的用量为4mmol/mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S3中所述式5所示化合物与式6所示化合物的质量比为1.1：1.2。
8.权利要求1所述的咖啡酸-生物素小分子探针在钓取乳清蛋白-咖啡酸结合物中的应用。
9.权利要求1所述的咖啡酸-生物素小分子探针在定性和/或定量检测乳清蛋白-咖啡酸结合物中的应用。
10.一种用于定性和/或定量检测乳清蛋白-咖啡酸结合物的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的咖啡酸-生物素小分子探针。
11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括链霉亲和素标记磁珠、SDS-PAGE Sample Loading buffer、MP102蛋白Marker、考马斯亮蓝染色液。
12.权利要求1所述的咖啡酸-生物素小分子探针或权利要求9所述组合物在制备定性和/或定量检测乳清蛋白-咖啡酸结合物的试剂盒中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述应用为将咖啡酸-生物素小分子探针氧化后与乳清蛋白混合，通过链霉亲和素磁珠富集、纯化蛋白组，经聚丙烯酰胺凝胶电泳对能够与咖啡酸结合的乳清蛋白组进行快速筛选，实现乳清蛋白-咖啡酸结合物的定性和/或定量检测。
14.根据权利要求8、权利要求9或权利要求12所述的应用，其特征在于，所述乳清蛋白为β-乳球蛋白-α-乳白蛋白、乳铁蛋白中的一种或多种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220729 |