CN114796257B - 一种药物化合物在治疗实体瘤中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药技术领域,具体涉及一种药物化合物在治疗实体瘤中的新用途。特别是S‑(5′‑腺苷)‑L‑甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途。本发明S‑(5′‑腺苷)‑L‑甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途,增加了实体瘤治疗用药物可选范围,特别是对于肺癌的防治作用显著,相较于传统化疗药物更具有针对性,对于肺癌的抑制率更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物化合物在制备治疗实体瘤肺癌药物中的应用,特别是S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐(SAM)的制药新用途,更具体的包括SAM在小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)治疗中的应用,属于生物医药领域。
背景技术
肺癌是中国致死率领先的恶性肿瘤,每年有超过70万的新增病例,5年生存率低于17%。肺癌大体可以根据其病理特征分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC是具有神经内分泌特性的一类肺癌,占所有肺癌的15%。SCLC因为在早期就有极强的转移能力,通常不进行手术治疗。初诊的SCLC往往对放化疗敏感,目前通常使用1980年代以来推行的依托泊苷+顺铂(EP)的化疗方案。但大多数患者很快复发耐药。最新的免疫治疗的效果也十分有限。
发明内容
本发明的目的在于:针对现有技术存在的肺癌致死率高,传统害化疗药物复发率高的问题,提供一种药物化合物在治疗肺癌中的新用途。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途。
进一步,所述实体瘤是肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌。优选地,所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。特别是针对小细胞肺癌作用较好。
进一步,所述S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物是S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐。
优选地,所述S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的结构式如下:
S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的CAS号为86867-01-8;
其分子式为C15H23ClN6O5S·2HCl。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
1、发明人通过细胞实验和动物实验,验证确认了S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物对于肺癌细胞或肺癌组织的高效率抑制作用,确定S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物对于肺癌细胞具有显著抑制作用,并且细胞毒性可控,具有全新治疗肺癌的药物开发潜力。特别是对于肺癌细胞转移情具有抑制作用,防治肺癌疗效显著。
2、本发明S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途,增加了实体瘤治疗用药物可选范围,特别是对于肺癌的防治作用显著,相较于传统化疗药物更具有针对性,对于肺癌的抑制率更高。
附图说明
图1A是S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的化学结构式。
图1B是利用不同浓度的SAM药物处理小鼠小细胞肺癌类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
图1C是0.02mM SAM作用后小细胞肺癌类器官形态发生改变,药物作用后突触变少。
图1D是药物作用后带有突触的类器官的比例。
图2是体内验证SAM对小鼠小细胞肺癌的生长和转移具有抑制作用结果图。其中,(A)利用荧光素酶活体成像***检测给药组和溶剂组小鼠肺部的荧光信号强度;(B)流式分析两组小鼠循环肿瘤细胞比例;(C)两组小鼠循环肿瘤细胞比例统计图;(D)给药组和溶剂组小鼠肝转移对比图;(E)肝脏转移灶统计图;(F)肝脏切片HE染色。
图3A是利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20200923类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
图3B是利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20201103类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。本发明使用的试剂除特殊说明均为商业购买获得。
简要说明本发明实验方法如下:获取新鲜的小鼠小细胞肺癌组织,采用胶原酶消化为单细胞,与基质胶混合构建3D培养环境,在包含FGF10、RSPO1、Wnt3a等生长因子的条件培养基中于37℃,5%CO2培养箱中培养小细胞肺癌类器官。采用原位移植技术进行类器官移植,通过小动物荧光素酶活体成像监测肿瘤形成,通过H&E染色、免疫荧光染色对肿瘤进行病理分析,该模型的成功构建为体内外药物试验提供了新方法。该模型可被应用于药物筛选、药物毒性试验、免疫治疗试验等。
具体而言,本发明细胞实验、动物实验技术方案按照以下实施例1-3共计三个部分进行试验分析。
实施例1
体外验证S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对小鼠小细胞肺癌类器官的
生长具有抑制作用
利用基质胶(BD Matrixgel)和多种细胞因子体外3D培养小鼠小细胞肺癌类器官。在96孔板中,用多个浓度梯度的SAM药物进行处理,浓度为0.0,0.1,0.5,2.5mM。利用显微镜拍照统计类器官数量,以溶剂组为对照,计算每个孔的相对类器官数量。统计带有突触的类器官的数量,计算其比例,以此评价小细胞肺癌细胞的转移能力。
具体地,实验方法包括以下步骤:
(1)取小鼠新鲜小细胞肺癌组织冰上剪碎。
(2)胶原酶(1mg/mL胶原酶I和0.5mg/mL胶原酶IV)重悬剪碎的组织块置于50mL离心管中,用10mL移液枪吹打以促进组织块的裂解。剪碎的组织块量为1~2克,胶原酶的用量为10mL。
(3)将装有胶原酶和组织块的50mL离心管置于37℃摇床,速度220rpm,消化10min,再取出用移液枪吹打,使组织细胞充分分散开来。
(4)置于摇床消化10min,再取出用移液枪吹打。
(5)将步骤(4)处理好的含有小鼠肺癌细胞的液体用100μm细胞筛网过滤细胞。
(6)过滤后,室温,1500rpm,5min离心处理去除上清液。
(7)加入5ml DMEM/F12(Gibco,GREF#C11330500BT)重悬,室温,1500rpm,5min离心,去除上清。
(8)细胞计数后,约每10000个细胞混合30μL Martrigel,滴于48孔板孔的正中。
(9)转移至37℃、5%CO2的培养箱,凝固Martrigel,凝固时间为10-20min。
(10)每孔加入150μL细胞培养基,在细胞培养箱中培养。
(11)培养2-3天后,将孔里的培养基去除,用TrypLE将细胞重悬到离心管中,在37摄氏度水浴锅中水浴10min。中途取出吹打一次。
(12)室温,1500rpm,5min离心,去除上清。细胞计数后,约每3000个细胞混合10μLMartrigel,滴于96孔板孔的正中。
(13)24h后,将细胞的培养基换成含有SAM药物的培养基,浓度梯度为0.0,0.1,0.5,2.5mM。
(14)分别在药物作用48h、72h、96h和120h后,利用显微镜拍照统计类器官数量。
(15)与溶剂对照组相比,计算每个孔的相对类器官数量。计算方法:以SAM孔为例,相对类器官数量=(SAM孔的类器官数量)/(溶剂孔加药前的类器官数量)。
实验结果如图1B、图1C、图1D所示,可见,体外验证SAM对小鼠小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用实验结果显示SAM浓度为2.5mM,在给药后48小时肺癌类器官生长完全受到抑制;SAM浓度为0.1mM时,作用96小时后肺癌类器官存活率基本为零。
图1B显示利用不同浓度的SAM药物处理小鼠小细胞肺癌类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
图1C显示0.02mM SAM作用后小细胞肺癌类器官形态发生改变,药物作用后突触变少。
图1D显示药物作用后带有突触的类器官的比例。
实施例2
体内验证S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对小鼠小细胞肺癌的生长和
转移具有抑制作用
将小鼠小细胞肺癌细胞原位移植到小鼠肺部。10天后,通过荧光素酶活体成像***检测小鼠肿瘤负荷,并开始灌胃给药。给药剂量为100mg/kg。连续给药14天,在给药过程中通过荧光素酶活体成像***检测小鼠肿瘤负荷。同时经小鼠眼眶采集外周血,利用流式分析循环肿瘤细胞的比例。给药完成后剖解小鼠,统计肺部原位肿瘤的大小以及其它器官的转移情况。
具体而言,细胞实验方法包括以下步骤:
(1)用Trpl E消化小鼠肺癌组织,消化成单细胞。
(2)取约1*105个细胞,用25μLPBS重悬细胞,再加入25μL Matrigel,吹打混匀。
(3)利用胰岛素针将细胞悬液原位移植到小鼠左肺。
(4)移植后10天通过荧光素酶活体成像***对小鼠体内的肿瘤进行检测。检测方法如下:小鼠腹腔内给予150mg/kg D-荧光素钾盐(Biovision,Cat#7903-10PK),注射10-15分钟后在IVIS光谱体内成像***(PerkinElmer)上成像。
(5)根据荧光信号将小鼠分为给药组和溶剂组,每组3只小鼠,初始荧光信号值相似的两只为一对。
(6)小鼠采用灌胃方式给药,每天一次,给药组的给药量为100mg/kg,连续给药14天。
(7)在开始给药后7天和14天通过荧光素酶活体成像***对小鼠体内的肿瘤进行检测。同时经小鼠眼眶采集外周血,利用流式分析循环肿瘤细胞的比例。
(8)给药完成后剖解小鼠,统计肺部原位肿瘤的大小以及肝、***、肾脏等器官的转移情况。
实验结果如图2所示,实验结果表明给药组比对照组的肿瘤负荷更小,流式分析显示循环肿瘤细胞明显减少。将小鼠剖解后发现,给药组比对照组肝转移数明显减少。
图2显示SAM对小鼠小细胞肺癌的生长和转移具有抑制作用。图2中,(A)利用荧光素酶活体成像***检测给药组和溶剂组小鼠肺部的荧光信号强度;(B)流式分析两组小鼠循环肿瘤细胞比例;(C)两组小鼠循环肿瘤细胞比例统计图;(D)给药组和溶剂组小鼠肝转移对比图;(E)肝脏转移灶统计图;(F)肝脏切片HE染色。
实施例3
体外验证S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对人小细胞肺癌类器官的生
长具有抑制作用
体外验证SAM对人小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用。取小细胞肺癌病人胸水,收集肿瘤细胞,体外培养形成类器官。在类器官的培养基中加入SAM药物,浓度为0.0,0.1,0.5,2.5mM。利用显微镜拍照统计类器官数量,以溶剂组为对照,计算每个孔的相对类器官数量。
具体而言,细胞实验方法包括以下步骤:
(1)取小细胞肺癌病人胸水,用100μm细胞筛网过滤。
(2)过滤后,室温,1500rpm,5min离心处理,去除上清液。
(3)用红细胞裂解液重悬细胞沉淀,冰上裂解红细胞3分钟,1500rpm,3min离心,去除上清。
(4)加入5ml DMEM/F12重悬,室温,1500rpm,5min离心,去除上清,收集肿瘤细胞。
(5)细胞计数后,约每3000个细胞混合10μL Martrigel(BD,Cat#354230),滴于96孔板孔的正中。
(6)24h后,将细胞的培养基换成含有SAM药物的培养基,浓度梯度为0.0、0.1、0.5、2.5mM。
(7)分别在药物作用48h、72h、96h和120h后,利用显微镜拍照统计类器官数量。
(8)与溶剂对照组相比,计算每个孔的相对类器官数量。计算方法:以SAM孔为例,相对类器官数量=(SAM孔的类器官数量)/(溶剂孔加药前的类器官数量)。
实验结果如图3A和图3B所示,实验结果表明在0.1mM、0.5mM、2.5mM的SAM作用下,病人小细胞肺癌类器官的生长被显著抑制,且具有剂量依赖性。其中,图3A显示利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20200923类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。图3B显示利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20201103类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
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