CN114796257B - 一种药物化合物在治疗实体瘤中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药技术领域，具体涉及一种药物化合物在治疗实体瘤中的新用途。特别是S‑（5′‑腺苷）‑L‑甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途。本发明S‑（5′‑腺苷）‑L‑甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途，增加了实体瘤治疗用药物可选范围，特别是对于肺癌的防治作用显著，相较于传统化疗药物更具有针对性，对于肺癌的抑制率更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物化合物在制备治疗实体瘤肺癌药物中的应用，特别是S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐(SAM)的制药新用途，更具体的包括SAM在小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)治疗中的应用，属于生物医药领域。
背景技术
肺癌是中国致死率领先的恶性肿瘤，每年有超过70万的新增病例，5年生存率低于17％。肺癌大体可以根据其病理特征分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC是具有神经内分泌特性的一类肺癌，占所有肺癌的15％。SCLC因为在早期就有极强的转移能力，通常不进行手术治疗。初诊的SCLC往往对放化疗敏感，目前通常使用1980年代以来推行的依托泊苷+顺铂(EP)的化疗方案。但大多数患者很快复发耐药。最新的免疫治疗的效果也十分有限。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的肺癌致死率高，传统害化疗药物复发率高的问题，提供一种药物化合物在治疗肺癌中的新用途。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途。
进一步，所述实体瘤是肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌。优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。特别是针对小细胞肺癌作用较好。
进一步，所述S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物是S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐。
优选地，所述S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的结构式如下：
S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的CAS号为86867-01-8；
其分子式为C15H23ClN6O5S·2HCl。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、发明人通过细胞实验和动物实验，验证确认了S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物对于肺癌细胞或肺癌组织的高效率抑制作用，确定S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物对于肺癌细胞具有显著抑制作用，并且细胞毒性可控，具有全新治疗肺癌的药物开发潜力。特别是对于肺癌细胞转移情具有抑制作用，防治肺癌疗效显著。
2、本发明S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物在制备治疗实体瘤的药物中的用途，增加了实体瘤治疗用药物可选范围，特别是对于肺癌的防治作用显著，相较于传统化疗药物更具有针对性，对于肺癌的抑制率更高。
附图说明
图1A是S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的化学结构式。
图1B是利用不同浓度的SAM药物处理小鼠小细胞肺癌类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
图1C是0.02mM SAM作用后小细胞肺癌类器官形态发生改变，药物作用后突触变少。
图1D是药物作用后带有突触的类器官的比例。
图2是体内验证SAM对小鼠小细胞肺癌的生长和转移具有抑制作用结果图。其中，(A)利用荧光素酶活体成像***检测给药组和溶剂组小鼠肺部的荧光信号强度；(B)流式分析两组小鼠循环肿瘤细胞比例；(C)两组小鼠循环肿瘤细胞比例统计图；(D)给药组和溶剂组小鼠肝转移对比图；(E)肝脏转移灶统计图；(F)肝脏切片HE染色。
图3A是利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20200923类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
图3B是利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20201103类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明使用的试剂除特殊说明均为商业购买获得。
简要说明本发明实验方法如下：获取新鲜的小鼠小细胞肺癌组织，采用胶原酶消化为单细胞，与基质胶混合构建3D培养环境，在包含FGF10、RSPO1、Wnt3a等生长因子的条件培养基中于37℃，5％CO2培养箱中培养小细胞肺癌类器官。采用原位移植技术进行类器官移植，通过小动物荧光素酶活体成像监测肿瘤形成，通过H&E染色、免疫荧光染色对肿瘤进行病理分析，该模型的成功构建为体内外药物试验提供了新方法。该模型可被应用于药物筛选、药物毒性试验、免疫治疗试验等。
具体而言，本发明细胞实验、动物实验技术方案按照以下实施例1-3共计三个部分进行试验分析。
实施例1
体外验证S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对小鼠小细胞肺癌类器官的
生长具有抑制作用
利用基质胶(BD Matrixgel)和多种细胞因子体外3D培养小鼠小细胞肺癌类器官。在96孔板中，用多个浓度梯度的SAM药物进行处理，浓度为0.0，0.1，0.5，2.5mM。利用显微镜拍照统计类器官数量，以溶剂组为对照，计算每个孔的相对类器官数量。统计带有突触的类器官的数量，计算其比例，以此评价小细胞肺癌细胞的转移能力。
具体地，实验方法包括以下步骤：
(1)取小鼠新鲜小细胞肺癌组织冰上剪碎。
(2)胶原酶(1mg/mL胶原酶I和0.5mg/mL胶原酶IV)重悬剪碎的组织块置于50mL离心管中，用10mL移液枪吹打以促进组织块的裂解。剪碎的组织块量为1～2克，胶原酶的用量为10mL。
(3)将装有胶原酶和组织块的50mL离心管置于37℃摇床，速度220rpm，消化10min，再取出用移液枪吹打，使组织细胞充分分散开来。
(4)置于摇床消化10min，再取出用移液枪吹打。
(5)将步骤(4)处理好的含有小鼠肺癌细胞的液体用100μm细胞筛网过滤细胞。
(6)过滤后，室温，1500rpm，5min离心处理去除上清液。
(7)加入5ml DMEM/F12(Gibco,GREF#C11330500BT)重悬，室温，1500rpm，5min离心，去除上清。
(8)细胞计数后，约每10000个细胞混合30μL Martrigel，滴于48孔板孔的正中。
(9)转移至37℃、5％CO2的培养箱，凝固Martrigel，凝固时间为10-20min。
(10)每孔加入150μL细胞培养基，在细胞培养箱中培养。
(11)培养2-3天后，将孔里的培养基去除，用TrypLE将细胞重悬到离心管中，在37摄氏度水浴锅中水浴10min。中途取出吹打一次。
(12)室温，1500rpm，5min离心，去除上清。细胞计数后，约每3000个细胞混合10μLMartrigel，滴于96孔板孔的正中。
(13)24h后，将细胞的培养基换成含有SAM药物的培养基，浓度梯度为0.0，0.1，0.5，2.5mM。
(14)分别在药物作用48h、72h、96h和120h后，利用显微镜拍照统计类器官数量。
(15)与溶剂对照组相比，计算每个孔的相对类器官数量。计算方法：以SAM孔为例，相对类器官数量＝(SAM孔的类器官数量)/(溶剂孔加药前的类器官数量)。
实验结果如图1B、图1C、图1D所示，可见，体外验证SAM对小鼠小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用实验结果显示SAM浓度为2.5mM，在给药后48小时肺癌类器官生长完全受到抑制；SAM浓度为0.1mM时，作用96小时后肺癌类器官存活率基本为零。
图1B显示利用不同浓度的SAM药物处理小鼠小细胞肺癌类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
图1C显示0.02mM SAM作用后小细胞肺癌类器官形态发生改变，药物作用后突触变少。
图1D显示药物作用后带有突触的类器官的比例。
实施例2
体内验证S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对小鼠小细胞肺癌的生长和
转移具有抑制作用
将小鼠小细胞肺癌细胞原位移植到小鼠肺部。10天后，通过荧光素酶活体成像***检测小鼠肿瘤负荷，并开始灌胃给药。给药剂量为100mg/kg。连续给药14天，在给药过程中通过荧光素酶活体成像***检测小鼠肿瘤负荷。同时经小鼠眼眶采集外周血，利用流式分析循环肿瘤细胞的比例。给药完成后剖解小鼠，统计肺部原位肿瘤的大小以及其它器官的转移情况。
具体而言，细胞实验方法包括以下步骤：
(1)用Trpl E消化小鼠肺癌组织，消化成单细胞。
(2)取约1*105个细胞，用25μLPBS重悬细胞，再加入25μL Matrigel，吹打混匀。
(3)利用胰岛素针将细胞悬液原位移植到小鼠左肺。
(4)移植后10天通过荧光素酶活体成像***对小鼠体内的肿瘤进行检测。检测方法如下：小鼠腹腔内给予150mg/kg D-荧光素钾盐(Biovision，Cat#7903-10PK)，注射10-15分钟后在IVIS光谱体内成像***(PerkinElmer)上成像。
(5)根据荧光信号将小鼠分为给药组和溶剂组，每组3只小鼠，初始荧光信号值相似的两只为一对。
(6)小鼠采用灌胃方式给药，每天一次，给药组的给药量为100mg/kg，连续给药14天。
(7)在开始给药后7天和14天通过荧光素酶活体成像***对小鼠体内的肿瘤进行检测。同时经小鼠眼眶采集外周血，利用流式分析循环肿瘤细胞的比例。
(8)给药完成后剖解小鼠，统计肺部原位肿瘤的大小以及肝、***、肾脏等器官的转移情况。
实验结果如图2所示，实验结果表明给药组比对照组的肿瘤负荷更小，流式分析显示循环肿瘤细胞明显减少。将小鼠剖解后发现，给药组比对照组肝转移数明显减少。
图2显示SAM对小鼠小细胞肺癌的生长和转移具有抑制作用。图2中，(A)利用荧光素酶活体成像***检测给药组和溶剂组小鼠肺部的荧光信号强度；(B)流式分析两组小鼠循环肿瘤细胞比例；(C)两组小鼠循环肿瘤细胞比例统计图；(D)给药组和溶剂组小鼠肝转移对比图；(E)肝脏转移灶统计图；(F)肝脏切片HE染色。
实施例3
体外验证S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐对人小细胞肺癌类器官的生
长具有抑制作用
体外验证SAM对人小细胞肺癌类器官的生长具有抑制作用。取小细胞肺癌病人胸水，收集肿瘤细胞，体外培养形成类器官。在类器官的培养基中加入SAM药物，浓度为0.0，0.1，0.5，2.5mM。利用显微镜拍照统计类器官数量，以溶剂组为对照，计算每个孔的相对类器官数量。
具体而言，细胞实验方法包括以下步骤：
(1)取小细胞肺癌病人胸水，用100μm细胞筛网过滤。
(2)过滤后，室温，1500rpm，5min离心处理，去除上清液。
(3)用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上裂解红细胞3分钟，1500rpm，3min离心，去除上清。
(4)加入5ml DMEM/F12重悬，室温，1500rpm，5min离心，去除上清，收集肿瘤细胞。
(5)细胞计数后，约每3000个细胞混合10μL Martrigel(BD，Cat#354230)，滴于96孔板孔的正中。
(6)24h后，将细胞的培养基换成含有SAM药物的培养基，浓度梯度为0.0、0.1、0.5、2.5mM。
(7)分别在药物作用48h、72h、96h和120h后，利用显微镜拍照统计类器官数量。
(8)与溶剂对照组相比，计算每个孔的相对类器官数量。计算方法：以SAM孔为例，相对类器官数量＝(SAM孔的类器官数量)/(溶剂孔加药前的类器官数量)。
实验结果如图3A和图3B所示，实验结果表明在0.1mM、0.5mM、2.5mM的SAM作用下，病人小细胞肺癌类器官的生长被显著抑制，且具有剂量依赖性。其中，图3A显示利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20200923类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。图3B显示利用不同浓度的SAM药物处理小细胞肺癌病人HX20201103类器官后在48h、72h、96h、120h的相对类器官数量。
Claims (1)
1.S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐在制备治疗小细胞肺癌的药物中的用途；
所述S-(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸氯化物二盐酸盐的结构式如下：
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Publications (2)
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