CN114788559A - 一种发酵荞麦粉的制备方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵荞麦粉的制备方法及其产品，涉及食品技术领域。所述制备方法包括：将植物乳杆菌和副干酪乳杆菌接种于荞麦粉和水的混合物中，经固态发酵后，烘干，粉碎，得到所述发酵荞麦粉。本发明公开的制备方法，利用植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对荞麦粉进行固态发酵，该方法操作简单、成本低、环保、易于工业化生产。利用该方法可以实现荞麦粉改性的目的，可以提升荞麦粉的总黄酮含量，并且发酵的荞麦粉气味丰郁，具有优于未发酵荞麦粉的抗氧化活性，富含抗氧化物质多酚，更加利于消化和利用。

Description

一种发酵荞麦粉的制备方法及其产品
技术领域
本发明涉及食品技术领域，特别是涉及一种发酵荞麦粉的制备方法及其产品。
背景技术
荞麦(Fagopyrum escμLentum Moench)又称花麦、三角麦，为一年生蓼科荞麦属植物，荞麦属植物共21种，其中在我国栽培种有2种，分别为普通荞麦(甜荞麦)和苦荞麦。甜荞麦较苦荞麦果形大，棱角分明，呈棕黑色，具有生长期短、抗逆性强等特点。荞麦营养丰富，富含膳食纤维、抗性淀粉、多不饱和脂肪酸以及其他谷物所缺乏的赖氨酸，具有较高的食用价值。传统中医利用荞麦治疗痢疾、清热祛湿和促进消化等。现代医学表明，荞麦中的生物活性物质，如芦丁、槲皮素等，对糖尿病、高血压、高血脂等慢性疾病的治疗与预防具有积极作用。
目前荞麦的药品研发以苦荞麦中芦丁为主要原料，主要的有荞麦胶囊、抗癌药品、生物类黄酮胶囊等。国内市场上的甜荞产品主要以初级加工为主，人们常通过直接食用或磨粉制成面食，常见的有荞麦面、荞麦碗托、荞麦片和荞麦凉粉等。
荞麦是生产功能性食品和特医食品的良好原料，含有丰富的的营养成分和功能性物质，特别是多酚黄酮类物质，但荞麦作为功能性食品的加工原料，存在加工性能差、风味不佳、消化性不良等缺点，因此需要将其进行改性或复配，以解决上述问题，更适宜人群食用。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵荞麦粉的制备方法及其产品，以解决上述现有技术存在的问题，本发明利用植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对荞麦粉进行固态发酵，提升了荞麦粉的总黄酮含量，并改善了荞麦粉的风味。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种发酵荞麦粉的制备方法，包括：将植物乳杆菌和副干酪乳杆菌接种于荞麦粉和水的混合物中，经固态发酵后，烘干，粉碎，得到所述发酵荞麦粉。
进一步地，所述植物乳杆菌和副干酪乳杆菌分别发酵培养后，分别稀释成浓度为107cfu/mL的菌液，再接种于荞麦粉和水的混合物中，进行固态发酵。
进一步地，所述植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的菌液的接种比例为1:1；所述植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的菌液的接种总量为所述水的体积的1.5％；所述固态发酵的发酵时间为47h。
本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的发酵荞麦粉。
本发明还提供一种荞麦混合面粉，包括玉米粉和上述的发酵荞麦粉和玉米粉，所述发酵荞麦粉和所述玉米粉的质量比例为7：8。
本发明还提供一种荞麦饼干，所述荞麦饼干的原料包括以下成分：上述的发酵荞麦粉、玉米粉、黄油和鸡蛋液。
进一步地，所述荞麦饼干的原料还包括红枣粉、山药粉和芝麻粉。
进一步地，按重量份计，所述荞麦饼干的原料包括：权利要求6所述的发酵荞麦粉28份、玉米粉32份、红枣粉18份、山药粉6份、芝麻粉10份、黄油35份和鸡蛋液25份
本发明还提供一种上述的荞麦饼干的制备方法，包括：上述的发酵荞麦粉与玉米粉、红枣粉、山药粉、芝麻粉、黄油和鸡蛋液混合，揉搓，得到面团，之后塑形，焙烤，得到所述荞麦饼干。
本发明还提供上述的发酵荞麦粉或荞麦混合面粉在制备低GI的食品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明探明了酵母菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌三个菌种两两复配联合发酵不同形态荞麦(带壳荞麦粒、去皮荞麦米和荞麦粉)对荞麦中黄酮多酚含量提升的效果。获得了一套利用植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对荞麦粉进行固态发酵的工艺，该工艺操作简单、成本低、环保、易于工业化生产。利用该工艺可以实现荞麦粉改性的目的，可以提升荞麦粉的总黄酮含量，并且发酵的荞麦粉气味丰郁，具有优于未发酵荞麦粉的抗氧化活性，富含抗氧化物质多酚，更加利于消化和利用。
(2)本试验中采用电子鼻和GC-IMS，定性和定量相结合的方法探明了发酵前后荞麦粉中差异性气味物质的变化，结论更加可靠、科学。
(3)采用氨基酸互补方法以发酵荞麦粉和玉米粉为主要原料，芝麻粉、山药粉、红枣粉等为辅料，研发了一种低GI饼干配方，丰富了高血糖人群的食物多样性。利用原料提高口感，可不加入任何糖类及其他甜味剂。体外消化模拟法得到的饼干血糖生成指数GI值为41.9，为低血糖生成指数饼干，适合糖尿病病人或血糖较高者食用。
(4)本发明提供的荞麦混合面粉，第一限制氨基酸实现互补，原料符合人体氨基酸最佳模式。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同菌株联合发酵荞麦粒的总酚、总黄酮含量；J+Z：酵母菌和植物乳杆菌；J+G:酵母菌和副干酪乳杆菌；Z+G：植物乳杆菌和副干酪乳杆菌；大写字母表示不同发酵菌种间总黄酮含量差异(p＜0.05)；小写字母表示不同发酵菌种间总酚含量差异(p＜0.05)；相同字母表示无显著差异(p＞0.05)，不同字母表示具有显著差异(p＜0.05)；
图2为不同菌株联合发酵荞麦米(脱壳)的总酚、总黄酮含量；J+Z：酵母菌和植物乳杆菌；J+G:酵母菌和副干酪乳杆菌；Z+G：植物乳杆菌和副干酪乳杆菌；大写字母表示不同发酵菌种间总黄酮含量差异(p＜0.05)；小写字母表示不同发酵菌种间总酚含量差异(p＜0.05)；相同字母表示无显著差异(p＞0.05)，不同字母表示具有显著差异(p＜0.05)；
图3为不同菌种发酵荞麦粉的总酚、总黄酮含量；J+Z：酵母菌和植物乳杆菌；J+G:酵母菌和副干酪乳杆菌；Z+G：植物乳杆菌和副干酪乳杆菌；大写字母表示不同发酵菌种间总黄酮含量差异(p＜0.05)；小写字母表示不同发酵菌种间总酚含量差异(p＜0.05)；相同字母表示无显著差异(p＞0.05)，不同字母表示具有显著差异(p＜0.05)；
图4为接种量对荞麦粉中总黄酮含量的影响；不同小写字母表示不同组间的差异，相同字母表示无显著差异(P＞0.05)；不同字母表示具有显著差异(p＜0.05)；
图5为接种比例对总黄酮含量的影响；不同小写字母表示不同组间的差异，相同字母表示无显著差异(P＞0.05)；不同字母表示具有显著差异(p＜0.05)；
图6为发酵时间对总黄酮含量的影响；不同小写字母表示不同组间的差异，相同字母表示无显著差异(P＞0.05)；不同字母表示具有显著差异(p＜0.05)；
图7为不同因素间的3D交互响应面图和等高线图，其中A为接种量和接种比例的3D响应面图，B为接种量和接种比例的等高线图，C为接种量和发酵时间的3D响应面图，D为接种量和发酵时间的等高线图，E为接种比例和发酵时间的3D响应面图，F为接种比例和发酵时间的等高线图；
图8为乳酸菌发酵对荞麦粉组织的影响，其中a为未发酵荞麦粉放大10000倍的电镜扫描图，b为未发酵荞麦粉放大20000倍的电镜扫描图；c为发酵荞麦粉放大10000倍的电镜扫描图，d为发酵荞麦粉放大20000倍的电镜扫描图；
图9为不同荞麦粉样品电子鼻响应雷达图；A图为发酵前、后(未加热)及加热前、后荞麦粉气味的电子鼻雷达图；图B为图A放大图；WFJ:未发酵荞麦粉；FJ：发酵荞麦粉；J-WFJ:未发酵荞麦粉加热组；J-FJ:发酵荞麦粉加热组；
图10为不同荞麦粉气味Loading图；
图11为不同荞麦粉气味的PCA图；WFJ:未发酵荞麦粉；FJ：发酵荞麦粉；J-WFJ:未发酵荞麦粉加热组；J-FJ:发酵荞麦粉加热组；
图12为不同荞麦粉气味的LDA图；WFJ:未发酵荞麦粉；FJ：发酵荞麦粉；J-WFJ:未发酵荞麦粉加热组；J-FJ:发酵荞麦粉加热组；
图13为荞麦粉消化液DPPH自由基清除率变化；WFJ:未发酵荞麦粉；FJ：发酵荞麦粉；大写字母表示未发酵荞麦粉在各消化阶段的差异性(p＜0.05)；不同小写字母表示发酵荞麦粉各消化阶段自由基清除率差异(p＜0.05)；
图14荞麦粉消化液ABTS+·自由基清除率变化；WFJ:未发酵荞麦粉；FJ：发酵荞麦粉；大写字母表示未发酵荞麦粉在各消化阶段的差异性(p＜0.05)；不同小写字母表示发酵荞麦粉各消化阶段自由基清除率差异(p＜0.05)；
图15为荞麦粉消化液α-淀粉酶抑制率变化；WFJ:未发酵荞麦粉；FJ：发酵荞麦粉；大写字母表示未发酵荞麦粉在各消化阶段的差异性(p＜0.05)；不同小写字母表示发酵荞麦粉各消化阶段自由基清除率差异(p＜0.05)；
图16为荞麦粉消化液α-葡萄糖苷酶抑制率变化；WFJ:未发酵荞麦粉；FJ：发酵荞麦粉；大写字母表示未发酵荞麦粉在各消化阶段的差异性(p＜0.05)；不同小写字母表示发酵荞麦粉各消化阶段自由基清除率差异(p＜0.05)；
图17为红枣粉添加量对饼干感官评分的影响；不同小写字母表示不同添加量的感官评分差异具有显著性(p＜0.05)；
图18为山药粉添加量对饼干感官评分的影响；不同小写字母表示不同添加量的感官评分差异具有显著性(p＜0.05)；
图19为芝麻粉添加量对饼干感官评分的影响；不同小写字母表示不同添加量的感官评分差异具有显著性(p＜0.05)；
图20为发酵荞麦饼干实物图；
图21为白面包、饼干水解率变化。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，采用的检测方法如下：
总黄酮含量检测：芦丁标准品，用70％乙醇超声溶解，配成.浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/g的标准品使用液，检测波长为505nm。获得的芦丁标准曲线为：y＝0.6842x-0.0015，R2＝0.9948；
取适当荞麦粉在70％乙醇溶液中超声波提取1h。在5000r/min下离心20min，取上清液过滤得到待测液。总黄酮含量以mg(芦丁)/g(荞麦粉)计算和表示。
多酚含量检测：采用Folin-Ciocalteu法检测总酚含量，吸取样品溶液100μL，加入500μL福林酚试剂，摇匀1min，同时将标准溶液，配成浓度为2、3、4、5、6μg/mL的标准品使用液，检测波长为760nm，所得没食子酸绘制标准曲线为：y＝0.0881x+0.0587，R2＝0.9978。
多酚提取方法同总黄酮含量检测。多酚含量按照以mg(没食子酸)/g(荞麦粉)计算和表示。
电子鼻检测：分别检测发酵前、后荞麦粉(未加热/加热)的四组气味成分。分别将10g样品置于烧杯中，用封口膜将烧杯密封。加热组在70℃下水浴5min。电子鼻传感器清洗时间100s，测定时间60s，分别进行Loading分析、PCA主成分分析及LDA线性判别分析。
GC-IMS检测：利用
Figure BDA0003597991120000061
风味分析仪采用顶空固态微萃取结合气相-离子迁移谱测定荞麦粉中挥发性化合物。称取样品3g，于20mL顶空瓶中，60℃下孵育15min，进样体积为500μL。色谱柱：MXT-5，15mL，0.53mm ID，1μm FT，柱温60℃，载气高纯N2(99.999％)，IMS温度45℃。每个样品重复3次。
实施例1复合菌株固态发酵荞麦的工艺条件优化
1.实验材料
1.1材料与试剂
副干酪乳杆菌CGMCC 1.9089(Lactobacillus paracei)和植物乳杆菌CGMCC1.1856(Lactobacillus plantarum)购于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)；安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。
荞麦，购于内蒙古赤峰。
2.实验方法
2.1菌种活化
发酵液的制备：
从-80℃冰箱中取出副干酪乳杆菌和植物乳杆菌冻存菌株，在MRS肉汤培养基中活化。利用YPD培养基(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)对安琪酵母进行震摇活化。将活化的种子液分别倒入灭菌的离心管中，5000r/min，10min，弃去上清液，用无菌生理盐水使其重新悬浮。调整乳酸菌菌液浓度为107cfu/mL，酵母菌菌液浓度为105cfu/mL，所得悬浮液作为发酵接种液。
2.2发酵原料的制备
分别称取荞麦粒(带壳)、荞麦米(脱壳)以及荞麦粉(脱壳后磨粉，过40目筛)10g于锥形瓶中，按料液比1：4(g/mL)加入蒸馏水，摇匀，高压灭菌121℃，20min。
2.3发酵菌株和发酵原料的选择
将2.1得到的105cfu/mL酵母菌菌液(J)、107cfu/mL植物乳杆菌菌液(Z)和107cfu/mL副干酪乳杆菌菌液(G)分别按照1:1比例(v/v)两两组合，以1％的接种量(以2.2中蒸馏水的体积计算)分别接种到荞麦粒(未脱壳)、荞麦米(脱壳)和荞麦粉中，发酵72h。同时做空白实验，按接种量加入相同体积的生理盐水。将发酵后的样品在55℃下烘干后用磨粉机研磨成粉，于自封袋中避光低温保存。测定经发酵后的荞麦总黄酮、总酚含量，筛选出最佳的发酵原料及发酵菌种组合。
2.4乳酸菌菌株联合发酵荞麦粉的单因素试验
2.4.1接种量的优化
植物乳杆菌和副干酪乳杆菌比例1:1，接种量为0.5％、1％、1.5％、2.0％、2.5％，发酵72h，测定各样品中的总黄酮含量。
2.4.2接种比例的优化
植物乳杆菌和副干酪乳杆菌接种比例：3：1、2：1、1：1、2：1、3：1，接种量1％，发酵72h。测定各组样品中的总黄酮含量。
2.4.3发酵时间的优化
接种量为1％，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌接种比例为1：1，发酵时间18h、36h、54h、72h、90h。测定各发酵时间的荞麦粉总黄酮含量。
2.5乳酸菌菌株联合发酵荞麦粉的响应面优化试验
在单因素实验的基础上进行响应面优化实验，以黄酮含量作为响应值，使用Design Expert 10对其进行分析，优化实验水平、因素具体如表1：
表1响应面实验水平设计
Figure BDA0003597991120000071
2.6体外消化实验
本部分实验所用的发酵后荞麦粉是按照上述响应面优化出的最优工艺发酵得到的荞麦粉。
2.6.1口胃肠液的制备
口腔液的制备：将Na2HPO4、KH2PO4和NaCl配置成水溶液，用0.2M PBS溶液将pH调至6.75后加入唾液淀粉酶，4℃下贮存备用。
胃液的制备：称取2.0g胃蛋白酶溶于100mL，0.1M HCL中，4℃下贮存备用。
肠液的制备：A液：胆汁盐和胰酶以6：1的质量溶于0.1MNaHCO3中；B液：NaCl和KCl溶于100mL水中。将A液、B液按1：1的体积混合，4℃下贮存备用。
2.6.2体外模拟消化
口腔消化：1.5g的荞麦粉与30mL的水混合后用0.1M NaHCO3调节pH至6.9。向其加入唾液1.5mL，37℃震荡10min，取出后冰浴10min，离心收集上清液。将上清液用乙酸乙酯萃取后去除水相合并有机相，45℃旋蒸至干，甲醇定容至10mL。-20℃下贮存备用。
口腔胃消化液：经口腔消化后，用6M HCl调pH至2.0。加入胃液1.5mL，37℃下震荡60min，取出后冰浴10min，离心，取上清液。用100mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，45℃旋蒸至干，用甲醇定容至10mL。-20℃下贮存备用。
口腔胃肠液：经口腔、胃液消化后取出，加入肠液15mL，37℃下震荡150min，取出冰浴10min，离心，取上清液。用乙酸乙酯萃取后合并有机相，45℃下旋转蒸发至干，甲醇定容至10mL。-20℃下贮存备用。
2.6.3抗氧化活性检测
DPPH：用酶标法测定DPPH。
ABTS：将ABTS用蒸馏水配置成为浓度为2mmol/L的溶液，取200mL过硫酸钾溶液(70mmol/L)与其混匀，避光12-16h。使用前用无水乙醇或PBS(pH＝7.4)缓冲液稀释之吸光度为0.7±0.02(波长＝734nm)
取适当稀释后的样品溶液10μL，加入ABTS储备液200μL，漩涡震荡30s，室温下避光6min，734nm下测定吸光度，用Trolox做标曲。同时做无水乙醇试剂空白组、甲醇对照组、以及无水乙醇样品空白组。
计算公式：
Figure BDA0003597991120000081
Ai:样品吸光度，Aj:无水乙醇空白组，A1：甲醇对照组。
α-葡萄糖苷酶抑制率：向10μL样品溶液加入50μLα-葡萄糖苷酶溶液，37℃孵育10min，加入25μLpNPG溶液，37℃下孵育10min，加入50μLNa2CO3终止反应，在λ＝405下测定吸光度。同时做实验对照组。
计算公式：
Figure BDA0003597991120000091
α-淀粉酶抑制率：向1mL提取液中加入2mLα-淀粉酶溶液，37℃下水浴10min后，加入1％的可溶性淀粉溶液1mL，37℃下水浴10min。加入DNS溶液1mL终止反应，5min后定容至10mL，在波长为504nm处测定吸光度，同时做阳性对照试验(阿卡波糖)。计算方式同α-葡萄糖苷酶抑制率。
3.实验结果
3.1发酵菌株及发酵原料的确定
不同菌株联合发酵荞麦粒(未脱壳)中黄酮和多酚含量如图1。J+Z联合菌株发酵后，荞麦粒中多酚含量显著降低(p>0.05)，总黄酮含量变化不显著(p<0.05)；J+G联合发酵组黄酮含量显著提高，为30.234±0.612mg/g(p<0.05)，但多酚含量变化无统计学意义(p>0.05)；Z+G组黄酮和多酚含量均明显下降(p<0.05)。因此，J+G联合发酵未脱壳的荞麦粒效果较好。
不同菌株联合发酵荞麦粒(脱壳)中黄酮和多酚含量如图2。J+Z联合菌株发酵后，荞麦米中总黄酮含量显著提升为28.197±0.508mg/g，但多酚含量无明显变化(p>0.05)；J+G发酵组黄酮(28.075±1.934mg/g)和多酚(326.069±1.31mg/g)均明显升高(p<0.05)，与未发酵组相比分别提高了36.81％和13.13％；Z+G组黄酮和多酚含量也明显升高(p<0.05)，且与J+G组黄酮多酚含量无明显差别(p>0.05)。因此，J+G和Z+G菌株联合发酵荞麦米的效果均较好。
不同菌株联合发酵荞麦粉中黄酮和多酚含量如图3。J+Z联合菌株发酵后，荞麦粉中总黄酮和多酚含量变化无统计学意义(p>0.05)；J+G组黄酮显著提高(22.387±0.309mg/g)，多酚含量无明显变化(p>0.05)；Z+G组黄酮和多酚含量均显著提高(p<0.05)，分别为30.743±0.397mg/g和263.537±7.49mg/g，与未发酵组相比分别提高了53.49％和57.14％。因此，Z+G菌株联合发酵荞麦粉的效果最佳。
综上，菌种组合影响发酵后荞麦中黄酮多酚的含量，荞麦的形态也影响菌株发酵荞麦的效果。与对照组相比，考虑到尽可能提高荞麦中黄酮和多酚的释放，以提高荞麦中黄酮多酚含量程度最高为依据，故应在后续研究中选择Z+G组合菌株，即副干酪乳杆菌和植物乳杆菌联合发酵荞麦粉的条件进行优化。
3.2联合菌株发酵荞麦粉的单因素试验结果
3.21乳酸菌联合菌株接种量对甜荞粉中总黄酮含量的影响
图4显示，随着乳酸菌菌株Z+G接种量的增加，甜荞粉中总黄酮含量先升高后显著降低。在菌株接种量为1.5％时，样品中的黄酮含量达到峰值39.069±0.432mg/g，因此确定1.5％为最佳接种量。
3.2.2乳酸菌联合菌株配比对甜荞中总黄酮含量的影响
如图5所示，副干酪乳杆菌和植物乳杆菌的菌株配比显著影响甜荞中总黄酮的含量。二者配比为1:1时，发酵甜荞粉中总黄酮含量达到峰值35.140±0.572mg/g。
3.2.3发酵时间对发酵样品中总黄酮含量的影响
如图6所示，发酵荞麦粉总黄酮含量随着发酵时间的延长含量先增加后显著减少，当发酵时间达到54h时，样品中总黄酮含量达到最大值为32.147±1.128mg/g。
3.3乳酸菌联合菌株发酵荞麦的响应面试验结果
以单因素实验结果为依据，以总黄酮含量为响应值，设计三因素三水平表(见表1)。利用Box-Behnken设计响应面实验如表2；多元回归分析见表3。
通过多元回归分析得到发酵荞麦粉总黄酮含量回归方程如下：R＝+42.57-1.95A+4.59B+2.30C+1.30AB-0.76AC+0.096BC-7.06A2-11.05B2-5.83C2；通过方差回归分析可得方程模型极显著p＜0.001；失拟项p＝0.0708不显著，R2＝0.9909＞0.9模型拟合性较好，以上分析结果说明该模型可以应用于预测发酵荞麦粉的最佳工艺下的总黄酮含量。
表2响应面实验设计及结果
Figure BDA0003597991120000101
Figure BDA0003597991120000111
表3发酵荞麦粉总黄酮含量回归方程分析
Figure BDA0003597991120000112
注：“*”为P＜0.05，显著；“**”为P＜0.01，极显著。
乳酸菌的发酵对荞麦粉细胞壁具有破坏作用，使荞麦粉中的黄酮类物质释放，从而导致荞麦粉中总黄酮含量增加。从表3可知，Z+G乳酸菌菌株组合的接种量、接种比例及发酵时间对发酵荞麦粉总黄酮含量均有显著影响(P＜0.05)，影响的顺序为：接种比例＞发酵时间＞接种量。接种量和接种比例间具有一定的交互作用。各因素之间的交互作用多荞麦粉总黄酮含量的影响，二次项P＜0.0001，对荞麦粉总黄酮含量具有极显著影响。利用Design Expert对拟合的响应图进行分析，各因素之间交互作用对荞麦粉总黄酮含量的影响见图7。
Z+G联合发酵荞麦粉时，接种量、接种比例和发酵时间之间的交互效应见图7。3D响应面图(图7A、C和E)中的陡峭形状反应了因素之间的交互作用对响应值的影响，曲线越陡峭说明因素间交互作用越明显，等高线(图7B、D和F)越趋近于椭圆形表明因素间交互作用越显著。从图7中可以看出菌种接种比例影响大于发酵时间、接种量，经过响应面实验优化结果得到荞麦粉最佳发酵工艺条件为：接种量1.435％；接种比例1.4；发酵时间46.87h，预测发酵荞麦粉最大总黄酮含量为43.402mg/g；因实验存在误差将发酵条件调整并进行验证试验：接种量为1.5％；接种比例为1：1；发酵时间47h，测得的最终总黄酮含量为44.057±0.374mg/g，该条件下与响应面预测值相比存在1.51％的误差率，实验结果与理论预测值相差不大，说明该模型有较高可靠性，结果理想。
3.4乳酸菌发酵对荞麦粉超微观组织的影响
如图8，a、b为未发酵荞麦粉分别放大10000倍和20000倍时的电镜扫描图；图8c和d为发酵荞麦粉分别放大10000倍和20000倍时的电镜扫描图。放大10000倍的未发酵荞麦粉可以看见较大的淀粉颗粒；放大20000倍时，仍然可以看见荞麦粉表面结构光滑和平整。与发酵荞麦粉相比较，发酵荞麦粉放大后虽然表面光滑但有明显的空洞结构，且断裂现象明显，这说明发酵破坏了荞麦粉的纤维结构。
3.5复合菌株对荞麦气味成分的影响
3.5.1电子鼻检测
图9为四个样品通过电子鼻传感器得到的响应值G/G0。四个样品的图形轮廓各不相同，说明了不同样品之间风味上存在差异。未发酵荞麦粉两个样品的雷达图在轮廓形状上有些相似，且随温度的上升探头响应值发生变化。经发酵的样品与未经发酵的样品在雷达图上各探头出现较大差异，说明发酵对荞麦粉的气味具有显著影响，W5C、W1W、W2W响应强度显著增加，说明发酵对荞麦粉的短链烷烃芳香类、硫化物和芳香成分(硫化物)等风味成分提升具有显著影响。图9中加热发酵荞麦粉(J-FJ)，W1W响应值明显上升，说明经加热后的样品可以增加香气成分，如硫化物等。
为进一步了解区分不同状态下的荞麦粉的风味变化，对样品中挥发性风味进行Loading、PCA和LDA分析。
3.5.2Loading分析
电子鼻Loading图是针对传感器的分析，将10个传感器的不同敏感成分进行区分，如图10所示，第一主成分贡献率最高为97.67％，第二主成分贡献率最高为0.28％。W6S、W3S两个传感器第一主成分和第二主成贡献率趋近于0，说明这两个传感器对荞麦粉的识别度小，可忽略。传感器W1W第一主成分贡献率最高，W1S对第二主成分贡献率最高。其中W1W、W1S分别对硫化物，甲基类物质敏感，说明这两个传感器对不同荞麦样品的差异性具有较大贡献。
3.5.3主元件分析(PCA)
从图11可知，第一主成分贡献率为99.67％，第二主成分贡献率为0.26％，总贡献率为99.93％＞85％，说明样品干扰性小，能将处理组间很好区分，该方法适合荞麦粉发酵前后挥发性成分分析。其中加热发酵荞麦粉(J-FJ)的第一主成分最大，发酵荞麦粉(FJ)第二主成分最大，且未经发酵的两个样品第一主成分和第二主成分的气味相似。发酵后的样品与未经发酵的荞麦粉具有显著差异。
3.5.4LDA分析
LDA分析是对收集到的信息的深入分析，是对同类间数据的缩小，不同类间数据距离的扩大，从而说明风味差异。由图12可知第一主成分贡献率为94.22％，第二主成分贡献率为4.42％，两成分总贡献率为98.64％＞85％，说明该方法可使用，四个样品(未发酵荞麦粉、加热未发酵荞麦粉、发酵荞麦粉、加热发酵荞麦粉)在气味上能区分开来。
3.6体外消化模拟
3.6.1发酵前后荞麦中总酚、总黄酮含量在消化过程中的变化
发酵前、后的荞麦粉在消化过程中总酚和总黄酮含量均随着消化的进行释放量显著增加(P<0.05)。未发酵荞麦粉在体外消化模拟过程中总酚和总黄酮含量均有所提高，分别为10.26％和10.12％。而发酵荞麦粉体外模拟消化与消化前荞麦相比，总酚和总黄酮含量减少。发酵荞麦粉在整个消化过程中总酚、总黄酮释放量是未发酵荞麦粉的1.166倍和1.130倍。
3.6.2发酵前后荞麦抗氧化活性在消化过程中的变化
发酵前后荞麦粉在各消化阶段中DPPH自由基清除率的变化如图13。未消化组中发酵后的荞麦粉自由基清除率为82.79％，相比未发酵荞麦粉提高了43.76％在整个消化过程中，发酵荞麦粉的DPPH自由基清除率大于未发酵荞麦粉，由此说明，发酵对提高荞麦粉的DPPH自由基清除率具有积极影响。
发酵前后荞麦粉在各消化阶段中ABTS+·自由基清除率的变化如图14。未消化组中，发酵荞麦粉ABTS+·自由基清除率较未发酵荞麦粉提高了15.77％。未发酵荞麦粉的口腔消化液中ABTS+·自由基清除率较消化前显著提升(P＜0.05)，在口腔消化液、胃消化液和肠消化液中自由基清除率变化无统计学意义(p＞0.05)。发酵荞麦粉在口腔消化液中ABTS+·自由基清除率较未消化前显著升高(p＜0.05)；口腔消化液与胃消化液中自由基清除率相比无明显差异(p＞0.05)，肠液与口腔消化液相比较显著降低(p＜0.05)。由此说明，消化能有效促进荞麦粉的抗氧化活性物质的释放。
发酵前后荞麦粉在各消化阶段中α-淀粉酶抑制率的变化如图15。未消化组中，发酵荞麦粉α-淀粉酶抑制率高于未发酵荞麦粉。发酵荞麦粉在消化过程中，口腔消化液与胃消化液中的α-淀粉酶抑制率无显著差异(p＞0.05)，肠消化液中抑制率与口腔消化液和肠消化液相比显著降低(p＜0.05)。未发酵荞麦粉经消化后，口腔消化液中α-淀粉酶抑制率显著提高，但在消化过程(口腔消化、胃消化和肠消化)中α-淀粉酶抑制率变化无统计学意义(p＞0.05)。
发酵前后荞麦粉在各消化阶段中α-葡萄糖苷酶抑制率的变化如图16。未消化的荞麦粉中α-葡萄糖苷酶抑制率均显著高于消化后荞麦粉。未发酵荞麦粉中抑制率，随着消化的进行α-葡萄糖苷酶抑制率先显著降低后增高。发酵荞麦粉口腔消化液中的抑制率显著高于胃消化液(p＜0.05)，但肠消化液中的抑制率与口腔消化液和消化液相比无显著差异(p＞0.05)。
3.6.3发酵前后荞麦中单体酚在消化过程中的变化
表4消化各阶段单体酚含量(x+SD,n＝3)
Figure BDA0003597991120000141
如表4，发酵后的荞麦粉中表儿茶素含量与未发酵荞麦粉相比提高了2.605倍，芦丁含量提高了1.908倍，没食子酸提高量为1.08倍。在肠消化阶段中，发酵荞麦粉阿魏酸释放量是未发酵荞麦粉的21.875倍。经三个消化阶段后，发酵荞麦粉中没食子酸含量与未消化前相比，释放量提高了4.441倍，同时发酵荞麦粉的表儿茶素释放总量为168.039μg/g，是未发酵荞麦粉的未消化阶段释放量的7.662倍。
综上，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌联合固态发酵荞麦粉可显著提高其黄酮含量，较发酵前提高了2.22倍；可以破坏荞麦粉的超微结构，增加酮类和酯类挥发性成分，赋予荞麦粉更加丰郁的气味。我们认为，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌利用荞麦粉中的氨基酸代谢，提升了酯类和酮类化合物，或者醇类化合物在微生物的作用下发生了氧化或者酯化反应，导致荞麦粉中酮类和酯类化合物显著增加。
实施例2
本实施例制备荞麦饼干所用的荞麦粉是实施例1按照其最优工艺(即接种量为1.5％；接种比例为1：1；发酵时间47h)发酵得到的荞麦粉。
1.实验方法
1.1氨基酸互补配比的计算
通过计算食物蛋白与理想蛋白的比值来进行必需氨基酸的评分(AAS)。
Figure BDA0003597991120000151
氨基酸评分差值计算(AASD)，当AASD≥0时说明氨基酸含量超过或等于理想模式氨基酸值；当AASD＜0时，说明氨基酸含量低于模式值，属于限制氨基酸，当绝对值最大时说明该氨基酸是食物中的第一限制氨基酸。
Figure BDA0003597991120000152
1.2谷物原料粉的复配
本实验通过计算荞麦粉和玉米粉的氨基酸模式值，从而确定这两种谷物的第一限制氨基酸。根据氨基酸互补的原则，计算出两种谷物的最佳添加比例。
1.3辅料添加量的单因素试验
为了提高产品的口感及营养价值，现选择添加芝麻粉、红枣粉、山药粉配比进行调配，利用单因素试验和响应面优化试验确定最佳添加量。
1.3.1单因素实验
按比例7:8(g:g)称取荞麦粉和玉米粉共60g，固定红枣粉18g，山药粉添加量为6g，调整芝麻粉的添加量为6g、8g、10g、12g、14g。焙烤条件为120℃，10min，黄油添加量为35g以感官评价进行评分。
按比例7:8(g:g)称取荞麦粉和玉米粉共60g，固定芝麻粉10g，山药粉添加量为6g，黄油添加量为35g，调整红枣粉的添加量为6g、10g、14g、18g、22g。焙烤条件为120℃，10min，黄油添加量为35g以感官评价进行评分。
按比例7:8(g:g)称取荞麦粉和玉米粉共60g，固定芝麻粉10g，红枣粉添加量为18g，黄油添加量为35g，调整山药粉的添加量为4g、6g、8g、10g、12g。焙烤条件为120℃，10min，黄油添加量为35g以感官评价进行评分。
称取上述单因素实验得到的复配粉，加入25g鸡蛋液(全蛋)混匀揉成团，用擀面杖将其均匀擀成硬币厚度，用模具成型。
1.4饼干配方的响应面优化试验
在单因素的基础上利用响应面进行优化试验，以感官评价作为响应值，使用Design Expert 10对其进行分析，优化实验水平、因素具体如表5：
表5响应面实验水平设计
Figure BDA0003597991120000161
1.5感官评分标准
表6饼干感官评价表
Figure BDA0003597991120000162
随机选取十二人进行产品品尝，以100分为满分对产品的色泽(30分)、风味(35分)、口感(35分)进行综合打分，计算其平均数作为感官评分值。
1.6饼干体外血糖生成指数估算
1.6.1体外血糖生成指数
通过测定0、10、20、40、60、90、120、180min时饼干中葡萄糖含量，根据下列公式计算水解率(HR)。
HR＝G×(7/0.1)×(1.1/0.1)×(1/1000)×(100％/DM)×(162/180)
式中G：葡萄糖质量/μg；DM：样品质量/mg。
1.6.2水解率曲线的绘制
以水解时间为X，HR为Y绘制，通过Origin计算曲线面积(AUC)，通过计算饼干中水解率曲线面积(AUC1)与AUC0白面包水解率曲线面积得出饼干水解指数(HI/％)。公式如下：
HI＝AUC1/AUC0×100％。
1.6.3血糖生成指数的估算
按照公式:eGI＝0.862HI+8.1981估算血糖生成指数。
1.7饼干营养指标的检测
营养元素测定方法见表7：
表7营养元素测定方法
Figure BDA0003597991120000171
2实验结果
2.1荞麦粉和玉米粉的氨基酸互补配比
2.1.1氨基酸评分
对发酵荞麦粉和玉米粉进行氨基酸评分，见表8-10。
表8荞麦和玉米必须氨基酸评分及AASD评分结果
Figure BDA0003597991120000172
表9荞麦和玉米AAS评分结果
Figure BDA0003597991120000173
表10荞麦和玉米限制氨基酸评分
Figure BDA0003597991120000174
2.1.2荞麦和玉米互补比例确定
设荞麦为X，玉米为Y，假设总分为100分
苏氨酸评分：75X+115Y＝100
赖氨酸评分：104X+82Y＝100
X＝0.56；Y＝0.50
2.1.3互补强化后氨基酸评分
苏氨酸：75×0.56+115×0.5＝99.5
赖氨酸：104×0.56+82×0.5＝99.24
2.1.4原料用量计算
必须氨基酸含量在互补配方中的含量＝添加量×蛋白质质量分数×必须氨基酸质量分数
荞麦含量：添加量(X)×3.92％＝0.56
玉米含量：添加量(Y)×3.09％＝0.5
从上述计算中得到，荞麦添加量为14g，玉米添加量为16g，即荞麦：玉米＝7：8。
2.2各种辅料的添加量对饼干感官评分的影响
荞麦粉和玉米粉以比例7：8(g/g)添加量总量为60g和黄油添加量35g，焙烤条件为120℃，10min。调整红枣粉、山药粉、芝麻粉含量进行感官评价。
2.2.1红枣粉的添加量
红枣作为药食两用的食材，具有多种营养物质，红枣中含有维生素及人体必需氨基酸等。将红枣粉加入到饼干中不仅能增加饼干的香气，同时还能提升饼干的营养价值。不同红枣粉添加量对饼干感官评价的影响如图17。饼干的感官评价随着红枣粉添加量的增加，先显著增加后显著减小(p＜0.05)；当红枣添加量为10g和14g时，对饼干的感官评价无显著性差异(p＞0.05)。当添加量为18g时感官评价显著提升(p＜0.05)，达到最大值为97.00±1.0分。随着红枣粉含量的再增加感官评价分数反而减少，是因为当红枣粉添加量过多时饼干甜度较大，口味不佳、呈现出较深颜色，入口香味较淡。
2.2.2山药粉的添加量
山药中含有丰富的酚类化合物、蛋白质等，具有增强免疫力和降血糖等作用，为药食两用食材。山药粉添加量对感官评价的影响如图18。饼干的感官评分随着山药粉的添加先显著提升后显著减小，其中当山药粉添加量为6g时，饼干口感较好，具有谷物特有的香味，饼干感官评分达到峰值为86.67±1.53。
2.2.3芝麻粉的添加量
芝麻粉的添加量对感官评分的影响如图19，当芝麻粉添加量过高时饼干过于酥脆难以成形，缺乏韧劲且芝麻味较大掩盖了其他配料的味道感官评分显著降低(p＜0.05)。当芝麻粉添加量为10g时，饼干口感酥脆，具有特殊的谷物香气，感官评分最高为92.133±1.206。
2.3饼干配方的优化
以单因素实验为基础，将感官评价作为响应面实验的响应值。根据单因素实验得出的最佳辅料添加配比选择出三个水平(见表5)。利用Box-Behnken设计响应面实验如下表11，多元回归分析见表12。
根据三因素实验通过多元回归分析得到辅料添加量回归方程如下：R＝+95.62-1.28A-0.76B+0.53C-2.71AB-2.94AC+4.67BC-6.47A2-10.80B2-9.81C2。以方差回归分析可得方程模型极显著P＜0.001；失拟项R＝0.204＞0.05不显著，R2＝0.9904＞0.9模型拟合性较好，以上分析结果说明该模型可以应用于预测饼干辅料添加量(芝麻粉、红枣粉、山药粉)。
表11响应面实验设计及结果
Figure BDA0003597991120000191
表12回归方程分析
Figure BDA0003597991120000192
Figure BDA0003597991120000201
注：“*”为P＜0.05，显著；“**”为P＜0.01，极显著。
从表12中可知，红枣粉的添加量对饼干感官评价具有显著影响(P＜0.05)。其中三个因素对饼干的影响顺序为红枣粉添加量＞山药粉添加量＞芝麻粉添加量。各因素之间均具有交互作用，因素间二次项＜0.0001，具有极显著影响。
由回归方程分析可知对饼干感官评价的影响大小为红枣粉添加量大于山药粉添加量和芝麻粉添加量，经过响应面优化实验结果得到最佳的辅料配方为红枣粉添加量17.6g；山药粉添加量5.97g；芝麻粉添加量10.08g，预测感官评价分数为95.71。因实验存在误差将辅料配方适当调整为红枣粉添加量18g；山药粉添加量6g；芝麻粉添加量10g，在该条件下进行验证实验，得到感官评价分数为95.86，与预测得到的分数相差0.156％。实验结果与理论值相差不大，说明该模型具有较高可靠性，结果理想。
因此得到最佳的饼干配方为荞麦粉28g；玉米粉32g；红枣粉添加量18g；山药粉添加量6g；芝麻粉添加量10g；黄油添加量35g，全蛋液25g将面团均匀擀至0.2cm厚度，模具成型，在120℃下焙烤10min，成品实物图见图20。
2.4饼干的体外血糖生成指数
2.4.1水解率HR及AUG从图21可以看出白面包的水解率远大于饼干的水解率。当白面包消化至60min时面包水解率达到顶点，水解率为26.032％。而饼干在消化至60min时水解率为10.304％，随之两个样品的水解率均呈降低后上升的趋势。
根据白面包及饼干的水解率绘制曲线得到AUG值，计算HI值，饼干的HI值为39.100％。
2.4.2血糖生成指数的估算
食物血糖生成指数(Glycemic index，GI)，常用于衡量摄入食物碳水化合物对人体血糖的影响，GI值分为高、中、低，其中高GI值是指食物进入胃肠后消化快，葡萄糖释放速度快，导致人体血糖高，通常GI值大于70；低GI值为55以下，是指食物进入胃肠后停留时间长、吸收率低，血糖比较低。根据上述得到的HI值，根据eGI值计算公式得到血糖生成指数eGI＝41.9＜55为低GI食物。
2.5饼干的营养指标及营养标签
饼干营养指标测定结果见表13，营养成分表见表14。
表13饼干营养指标测定结果
Figure BDA0003597991120000211
预包装食品营养标签通则须按照GB 28050-2011要求测定营养标签项目，通过公式计算营养参考值：
Figure BDA0003597991120000212
NRV％：营养素参考值；X：某营养素的含量；NRV：营养素的营养参考价值
表14营养成分表
Figure BDA0003597991120000213
综上，本发明采用按氨基酸互补、单因素试验和响应面优化实验，确定主辅料的添加量。利用体外消化模拟实验预估饼干的血糖生成指数，判定该饼干为低GI食品。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种发酵荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将植物乳杆菌和副干酪乳杆菌接种于荞麦粉和水的混合物中，经固态发酵后，烘干，粉碎，得到所述发酵荞麦粉。
2.根据权利要求1所述的发酵荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌和副干酪乳杆菌分别发酵培养后，分别稀释成浓度为107cfu/mL的菌液，再接种于荞麦粉和水的混合物中，进行固态发酵。
3.根据权利要求2所述的发酵荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的菌液的接种比例为1:1；所述植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的菌液的接种总量为所述水的体积的1.5％；所述固态发酵的发酵时间为47h。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到的发酵荞麦粉。
5.一种荞麦混合面粉，其特征在于，包括玉米粉和权利要求4所述的发酵荞麦粉和玉米粉，所述发酵荞麦粉和所述玉米粉的质量比例为7：8。
6.一种荞麦饼干，其特征在于，所述荞麦饼干的原料包括以下成分：权利要求4所述的发酵荞麦粉、玉米粉、黄油和鸡蛋液。
7.根据权利要求6所述的荞麦饼干，其特征在于，所述荞麦饼干的原料还包括红枣粉、山药粉和芝麻粉。
8.根据权利要求6所述的荞麦饼干，其特征在于，按重量份计，所述荞麦饼干的原料包括：权利要求6所述的发酵荞麦粉28份、玉米粉32份、红枣粉18份、山药粉6份、芝麻粉10份、黄油35份和鸡蛋液25份。
9.一种如权利要求7或8所述的荞麦饼干的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求6所述的发酵荞麦粉与玉米粉、红枣粉、山药粉、芝麻粉、黄油和鸡蛋液混合，揉搓，得到面团，之后塑形，焙烤，得到所述荞麦饼干。
10.如权利要求4所述的发酵荞麦粉或权利要求5所述的荞麦混合面粉在制备低GI的食品中的应用。
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