CN114787610A - 考虑光学测量的误差 - Google Patents

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Abstract

描述的装置和方法包括将血液样本的至少一部分放置在样本腔室(52)内，以及获取血液样本的一部分的显微图像。在显微图像内识别血液样本内给定实体的候选者。通过对候选者执行进一步的分析，候选者中的至少一些被验证为给定实体。给定实体的候选者的计数与给定实体的经验证的候选者的计数进行比较，并且至少部分地基于候选者的计数和经验证的候选者的计数之间的关系，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。还描述了其他应用。

Description

考虑光学测量的误差
相关申请的交叉引用
本申请要求Pecker于2019年10月22日提交的题为“Accounting for errors inoptical measurements”的美国临时专利申请第62/924,229号的优先权。
本申请与Pecker在与本申请同一日期提交的题为“Accounting for errors inoptical measurements”的PCT申请有关，该PCT申请要求Pecker于2019年10月22日提交的美国临时专利申请第62/924,229号的优先权。
以上提及的申请通过引用并入本文。
发明实施例的领域
本公开主题的一些应用大体上涉及身体样本的分析，且特别涉及对血液样本进行的光密度和显微测量。
背景
在一些基于光学的方法(例如，诊断和/或分析方法)中，通过执行光学测量来确定诸如血液样本的生物样本的性质。例如，可以通过对显微图像内的组分进行计数来确定组分的密度(例如，每单位体积的组分的计数)。类似地，可以通过对样本执行光吸收、透射、荧光和/或发光测量来测量组分的浓度和/或密度。典型地，样本被放置在样本载体中，并对包含在样本载体的腔室内的样本的一部分执行测量。对包含在样本载体的腔室中的样本的一部分执行的测量进行分析，以便确定样本的性质。
实施例的概述
根据本发明的一些应用，生物样本(例如，血液样本)被放置到样本载体中。当样本被放置在样本载体中时，使用一个或更多个光学测量设备对样本执行光学测量。例如，光学测量设备可以包括显微镜(例如，数字显微镜)、分光光度计、光度计、分光计、照相机、光谱照相机、高光谱照相机、荧光计、分光荧光计和/或光电探测器(诸如，光电二极管、光敏电阻和/或光电晶体管)。对于一些应用，光学测量设备包括专用光源(诸如发光二极管、白炽光源等)和/或用于操纵光收集和/或光发射的光学元件(诸如透镜、漫射器、滤光器等)。对于一些应用，使用的显微镜***通常类似于Greenfield在US 2014/0347459中描述的显微镜***，该US 2014/0347459通过引用并入本文。
计算机处理器通常接收并处理由光学测量设备执行的光学测量结果。此外典型地，计算机处理器控制对由一个或更多个光学测量设备执行的光学测量结果的获取。对于一些应用，光学测量设备被容纳在光学测量单元内。为了对样本进行光学测量，将样本载体放置在光学测量单元内。通常，光学测量单元包括显微镜***，该显微镜***被配置为对样本的一部分执行显微成像。对于一些应用，显微镜***包括被配置用于样本的明场(brightfield)成像的一组明场光源(例如发光二极管)、被配置为用于样本的荧光成像的一组荧光光源(例如发光二极管)、以及被配置为对样本成像的照相机(例如CCD照相机和/或CMOS照相机)。通常，光学测量单元还包括光密度测量单元，该光密度测量单元被配置为对样本的第二部分执行光密度测量(例如，光吸收测量)。对于一些应用，光密度测量单元包括多组光密度测量光源(例如，发光二极管)和光探测器，它们被配置用于对样本执行光密度测量。对于一些应用，上述多组光源(即，一组明场光源、一组荧光光源和一组光密度测量光源)中的每一个包括多个光源(例如，多个发光二极管)，每个光源被配置成以相应波长或相应波段发射光。
根据本发明的一些应用，(通常由计算机处理器)执行各种技术，以便确定是否产生了各种误差，并且如果产生了误差，则可选地识别误差的来源。这些误差可能源于所有样本的制备。例如，在执行测量之前，样本可能已经在样本载体中停留过长时间(这可能导致样本退化，和/或这可能导致与样本的一个或两个部分混合的染剂被样本内的实体过度吸收)。可替代地，误差可能源于样本的特定部分的制备。可替代地或附加地，误差可能源于样本载体的误差(诸如样本载体本身的材料不干净，和/或样本载体上的污垢或溢出的血液)，和/或显微镜***本身诸如照明(例如，用于明场成像的发光二极管和/或在样本的荧光成像期间使用的发光二极管)的误差，和/或与光路和/或电机和镜台(stage)部件或控制器相关联的误差，和/或由放置设备的环境(例如，相对湿度、温度、压力、颗粒浓度或任何其他环境因素)引起的误差。此外，可替代地或附加地，可能存在样本的固有问题(诸如某一实体的非常低的计数或非常高的计数，或自执行样本收集以来已经过了太多的时间)，这意味着计算机处理器不能以足够的精确度执行某些测量，和/或这意味着计算机处理器应该向用户标记这一点。
对于一些应用，响应于识别到误差，计算机处理器输出指示误差和/或指示误差来源的消息。对于一些应用，计算机处理器响应于识别到误差而不对血液样本执行某些测量。对于一些应用，响应于识别到误差，计算机处理器不会对样本执行任何测量，和/或标记样本对用户无效，和/或指示用户用新的试剂盒重复样本制备和/或重新收集血液样本。可替代地或附加地，计算机处理器通过校准对血液样本执行的测量来确定血液样本的某些参数，以便考虑到误差。
对于一些应用，例如，以上述方式中的一种或更多种来考虑到以下误差中的一种或更多种：
显微设备中的误差，诸如：
-移动显微镜台的电机的失步(step-loss)
-显微镜台的移动的反冲(backlash)的变化
-显微镜照相机与显微镜台之间的定时变化
-显微镜照相机和显微镜台之间的对齐(例如，由于这些元件之间的相对旋转)
-光学***的问题(例如，随着时间的推移焦点质量的变化，例如由样本引起的，或由显微镜台的一块(例如刮擦的一块)引起的)
-显微镜***中的调平(levelling)变化
-沿z轴(即光轴)的预期焦点位置的变化
-元件之间失去通信
-照相机线性响应的变化
环境因素引起的误差，诸如：
-设备在可允许的温度、湿度、高度等之外
-特定部件在目标值之外
一般误差，由诸如以下因素引起：
-扫描时间
-设备启动时间
-可用工作/存储内存
下面描述用于识别误差并对这种误差进行应对的技术的一些示例。
因此，根据本发明的一些应用提供了一种方法，包括：
通过以下步骤制备用于分析的血液样本：
将血液样本沉积在样本腔室内；和
将在其中沉积血液样本的样本腔室放置在显微单元内；
使用显微单元的显微镜获取在其中沉积血液样本的样本腔室的一个或更多个显微图像；
基于一个或更多个图像，确定在获取一个或更多个显微图像之前样本腔室内的已经在样本腔室内沉降的一个或更多个细胞类型的量；以及
至少部分地响应于此，确定样本的特性。
在一些应用中，制备用于分析的血液样本还包括用一种或更多种染剂对血液样本进行染色。
在一些应用中：
确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内的已经在样本腔室内沉降的一个或更多个细胞类型的量包括确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内超过阈值量的红细胞是否已经沉降在样本腔室内，以及
确定样本的特性包括：响应于确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内超过阈值量的红细胞已经沉降在样本腔室内，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
在一些应用中，该方法还包括：
在将其中沉积了血液样本的样本腔室放置在显微单元内之后，允许样本腔室中的一个或更多个细胞类型形成细胞的单层；
获取细胞的单层的一组一个或更多个附加显微图像；和
通过分析该组一个或更多个附加显微图像，对样本执行一个或更多个测量。
在一些应用中，该方法还包括基于在获取一个或更多个显微图像之前已经沉降在样本腔室内的一个或更多个细胞类型的量，确定在获取一个或更多个显微图像之前血液样本在样本腔室内已经存在多长时间的指示。
在一些应用中，该方法还包括对样本执行一个或更多个测量，
确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内的已经在样本腔室内沉降的一个或更多个细胞类型的量包括确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内超过阈值量的红细胞是否已经沉降在样本腔室内，以及
对样本执行一个或更多个测量包括：响应于确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内超过阈值量的红细胞已经沉降在样本腔室内，校准测量。
在一些应用中，制备用于分析的血液样本还包括用一种或更多种染剂对血液样本进行染色，校准测量包括校准测量以考虑到在获取一个或更多个显微图像之前，血液样本内的实体所经历的染色量，染色量由样本腔室内的已经沉降在样本腔室内超过阈值量的红细胞所指示。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的一部分放置在样本腔室内；
在血液样本内的红细胞沉降在样本腔室内的同时获取血液样本内的红细胞的显微图像；
通过分析图像确定血液样本的沉降动力学(settling-dynamics)特性；和
响应于此生成输出。
在一些应用中，将血液样本的一部分放置在样本腔室内包括将血液样本的未稀释部分放置在样本腔室内，并且获取血液样本内的红细胞的显微图像包括获取未稀释血液样本内的红细胞的显微图像。
在一些应用中，通过分析图像来确定血液样本的沉降动力学特性包括相对于血液样本内红细胞的沉降实时确定血液样本的沉降动力学特性。
在一些应用中，通过分析图像来确定血液样本的沉降动力学特性包括当血液样本内的红细胞仍在沉降时确定血液样本的沉降动力学特性。
在一些应用中，通过分析图像来确定血液样本的沉降动力学特性包括通过分析图像来确定血液样本中红细胞的沉降速率。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的第一部分放置在第一样本腔室内；
将血液样本的第二部分放置在第二样本腔室内；
获取血液样本的第一部分的显微图像；
对血液样本的第二部分执行光密度测量；
检测样本内给定实体的浓度超过阈值；和
通过比较从血液样本的第一部分的显微图像确定的参数与从对血液样本的第二部分执行的光密度测量确定的参数，确定给定实体的浓度超过阈值的原因。
在一些应用中，确定给定实体的浓度超过阈值的原因包括：通过确定由显微图像指示的实体的浓度与由光密度测量确定的实体的浓度相似来确定血液样本本身是导致样本内给定实体的浓度超过阈值的原因。
在一些应用中，确定给定实体的浓度超过阈值的原因包括：通过确定由显微图像指示的实体的浓度与由光密度测量确定的实体的浓度不同来确定血液样本的部分之一的制备是导致样本内给定实体的浓度超过阈值的原因。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内；
获取血液样本的一部分的显微图像；
在显微图像内识别选自由棘状红细胞、球形红细胞和圆齿红细胞组成的组中的至少一种类型的实体；
测量所选类型的实体的计数；和
响应于此生成输出。
在一些应用中，识别至少一种类型的实体包括识别棘状红细胞。在一些应用中，识别至少一种类型的实体包括识别球形红细胞。在一些应用中，识别至少一种类型的实体包括识别圆齿状红细胞。
在一些应用中，生成输出包括至少部分地基于所选类型的实体的计数超过阈值，使至少血液样本的该部分无效而不被用于对血液样本执行至少一些测量。在一些应用中，生成输出包括向用户生成计数的指示。在一些应用中，生成输出包括向用户生成样本的一部分的老化(age)的指示。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内；
获取血液样本的一部分的显微图像；
在显微图像内识别选自由棘状红细胞、球形红细胞和圆齿红细胞组成的组中的至少一种类型的实体；
测量所选类型的实体的计数；和
至少部分地基于计数来确定样本的一部分的老化的指示。
在一些应用中，该方法还包括通过分析显微图像来测量样本的参数，并且测量样本的参数包括对显微图像执行测量，以及基于样本的一部分的寿命的所确定的指示来校准测量。
在一些应用中，该方法还包括通过对血液样本的第二部分执行光密度测量来测量样本的参数，并且测量样本的参数包括基于样本的一部分的老化的所确定的指示来校准光密度测量。
在一些应用中，识别至少一种类型的实体包括识别棘状红细胞。在一些应用中，识别至少一种类型的实体包括识别球形红细胞。在一些应用中，识别至少一种类型的实体包括识别圆齿状红细胞。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内，样本腔室是包括基底表面的腔；
使细胞悬浮液中的细胞沉降在载体的基底表面上，以在载体的基底表面上形成细胞的单层；
获取细胞的单层的至少一部分的至少一个显微镜图像；
在显微图像内识别溶血红细胞；
测量所识别的溶血红细胞的计数；和
基于所识别的溶血红细胞的计数生成输出。
在一些应用中，该方法还包括基于所识别的溶血红细胞的计数，估计血液样本内大于所识别的溶血红细胞的计数的溶血红细胞的总计数，并且生成输出包括向用户生成溶血红细胞的估计的总计数的指示。
在一些应用中，生成输出包括至少部分地基于所识别的溶血红细胞的计数超过阈值，使样本的该部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
在一些应用中，使样本无效而不被用于对样本执行至少一些测量包括：基于所识别的溶血红细胞的计数，估计样本内大于所识别的溶血红细胞的计数的溶血红细胞的总计数。
在一些应用中，该方法还包括对血液样本进行染色，并且识别至少部分溶血的红细胞包括通过识别被染剂染色为溶血的红细胞来区分溶血红细胞和非溶血红细胞。
在一些应用中，对血液样本进行染色包括用赫斯特(Hoechst)试剂对血液样本进行染色。
在一些应用中，获取细胞的单层的至少一部分的至少一个显微镜图像包括获取细胞的单层的至少一部分的至少一个明场显微镜图像，并且识别被染剂染色的红细胞包括识别具有在明场显微镜图像内可见的轮廓并且具有类似于明场显微镜图像的背景的内部的红细胞。
在一些应用中，获取细胞的单层的至少一部分的至少一个显微镜图像包括获取细胞的单层的至少一部分的至少一个荧光显微镜图像，并且识别被染剂染色的红细胞包括识别在图像内呈现为亮圆形的红细胞。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将生物样本放置在具有多个区域的样本腔室中，每个区域限定各个不同的高度；
测量指示在各个区域处通过样本腔室的光透射的参数；和
使用计算机处理器：
将在各个区域处测量的参数相对于彼此归一化；
至少部分地响应于此，检测样本腔室内存在气泡(bubble)；和
响应于检测到样本腔室内存在气泡而执行动作。
根据本发明的一些应用，另外提供了一种方法，包括：
将血液样本放置在具有多个区域的样本腔室中，每个区域限定各个不同的高度；
测量在各个区域处指示通过样本腔室的光透射的参数；和
使用计算机处理器：
基于在所选择区域处的参数绝对值，计算样本内血红蛋白浓度；
将在各个区域处测量的参数相对于彼此归一化；以及
基于归一化的参数验证所计算的血红蛋白浓度。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内；
获取血液样本的一部分的显微图像；
在显微图像内识别血液样本内给定实体的候选者；
通过对候选者执行进一步的分析，将候选者中的至少一些验证为给定实体；
将给定实体的候选者的计数与给定实体的经验证的候选者的计数进行比较；和
至少部分地基于候选者的计数和经验证的候选者的计数之间的关系，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
在一些应用中：
在显微图像内识别血液样本内给定实体的候选者包括在显微图像内识别血液样本内的血小板候选者；
通过对候选者进行进一步分析来将至少一些候选者验证为给定实体包括：通过对候选者进行进一步分析来将至少一些血小板候选者验证为血小板；和
使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量包括：至少部分地基于血小板候选者的计数和经验证的血小板候选者的计数之间的关系，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
在一些应用中：
在显微图像内识别血液样本内给定实体的候选者包括在显微图像内识别血液样本内的白细胞候选者；
通过对候选者进行进一步分析来将至少一些候选者验证为给定实体包括：通过对候选者进行进一步分析来将至少一些白细胞候选者验证为白细胞；和
使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量包括：至少部分地基于白细胞候选者的计数和经验证的白细胞候选者的计数之间的关系，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
在一些应用中，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量包括：基于经验证候选者的计数与候选者的计数的比率超过最大阈值，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
在一些应用中，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量包括：基于经验证候选者的计数与候选者的计数的比率小于最小阈值，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内；
获取血液样本的一部分的显微图像；
在显微图像内识别血液样本内的白细胞候选者；
通过对白细胞候选者进行进一步分析，将白细胞候选者中的至少一些验证为给定类型的白细胞；
将白细胞候选者的计数与被验证为给定类型白细胞的白细胞候选者计数进行比较；和
至少部分地基于白细胞候选者的计数与被验证为给定类型白细胞的白细胞候选者的计数之间的关系，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
用一种或更多种染剂对血液样本进行染色；
获取血液样本的至少一个显微图像；
通过识别具有不规则形状的被染色对象来识别样本内的污染体；
通过对样本进行显微分析，对设置在样本内的一个或更多个实体进行计数；和
使设置在距所识别的污染体的给定距离内的样本的区域无效而不被包括在计数中。
在一些应用中，用一种或更多种染剂对血液样本进行染色包括用吖啶橙和赫斯特试剂对血液样本进行染色，并且识别碎片包括识别具有不规则形状并且被吖啶橙和赫斯特试剂都染色的被染色对象。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内；
对样本进行光学测量；
基于光学测量，确定样本腔室内存在一个或更多个空气气泡；
至少部分地基于确定一个或更多个空气气泡存在于样本腔室内来生成输出。
在一些应用中，该方法还包括基于光学测量确定样本的一个或更多个参数，以及基于确定一个或更多个空气气泡存在于腔室内使至少一些光学测量无效而不被用于确定样本的一个或更多个参数。
在一些应用中，生成输出包括基于确定一个或更多个空气气泡存在于样本腔室内，使血液样本的一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
在一些应用中，确定样本腔室内存在一个或更多个空气气泡包括分析样本沿着样本腔室的给定方向的光吸收分布。
在一些应用中，对样本执行光学测量包括以血红蛋白不吸收光的波长执行一个或更多个光吸收测量，以及确定在样本腔室内存在一个或更多个气泡包括以血红蛋白不吸收光的波长分析一个或更多个光吸收测量。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内，样本腔室是包括基底表面的腔；
使细胞悬浮液中的细胞沉降在载体的基底表面上，以在载体的基底表面上形成细胞的单层；
获取细胞的单层的至少一部分的至少一个显微镜图像；
在显微图像内识别不存在样本的区域；和
使至少所识别的区域无效而不被用于样本的一部分的显微分析。
在一些应用中，识别不存在样本的区域包括识别样本腔室的基底表面上的湿区域和干区域之间的界面。
在一些应用中，识别不存在样本的区域包括区分不存在样本的区域和存在样本且样本具有低细胞密度的一个或更多个区域。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内，样本腔室是包括基底表面和顶盖的腔；
使细胞悬浮液中的细胞沉降在载体的基底表面上，以在载体的基底表面上形成细胞的单层；
当显微镜聚焦在单层焦平面上时，获取细胞的单层的至少一部分的至少一个显微镜图像，该细胞的单层的一部分设置在单层焦平面内；
通过识别在不同于单层焦平面的焦平面处实体可见的区域来识别污垢设置在顶盖上或基底表面的下侧上；以及
使至少所识别的区域无效而不被用于样本的一部分的显微分析。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内，样本腔室是包括基底表面和顶盖的腔；
使细胞悬浮液中的细胞沉降在载体的基底表面上，以在载体的基底表面上形成细胞的单层；
当显微镜聚焦在单层焦平面上时，获取细胞的单层的至少一部分的至少一个显微镜图像，该细胞的单层的一部分设置在单层焦平面内；
识别显微镜图像的背景强度指示污垢设置在顶盖上或基底表面的下侧上的区域；和
使至少所识别的区域无效而不被用于样本的一部分的显微分析。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
利用荧光染剂对血液样本的至少一部分进行染色；
通过利用在给定光谱带发射光的光源照亮样本的一部分，通过使用显微单元获取血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像，来识别血液样本内的被染色细胞；
识别在由光源照明下获得的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域；和
基于所识别的荧光区域确定光源的特性。
在一些应用中，基于所识别的荧光区域确定光源的特性包括确定荧光光源的照明的空间分布自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，基于所识别的荧光区域确定光源的特性包括确定荧光光源的照明的空间均匀性自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，基于所识别的荧光区域确定光源的特性包括确定荧光光源的照明的空间位置自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，基于所识别的荧光区域确定光源的特性包括确定荧光光源的照明的晕影效应(vignette effect)自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，基于所识别的荧光区域确定光源的特性包括确定荧光光源的照明的光谱分布自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，基于所识别的荧光区域确定光源的特性包括确定荧光光源的照明的强度自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，该方法还包括通过对被染色细胞执行测量和基于所确定的光源特性对测量进行归一化来确定血液样本的参数。
在一些应用中，该方法还包括基于所确定的光源特性，使至少一些测量无效而不在血液样本上执行。
在一些应用中，识别在由光源的照明下获取的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别血液样本内的细胞间区域。
在一些应用中，识别在由光源的照明下获取的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别显微单元的一个或更多个荧光区域。
在一些应用中，获取血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像包括：当血液样本容纳在样本载体中时，获取血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像，以及识别在光源照明下获取的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别样本载体的一个或更多个荧光区域。
在一些应用中，样本载体包括玻璃和塑料层，该玻璃和塑料层经由发荧光的压敏粘合剂彼此耦合，并且识别在光源照明下获取的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或多个荧光区域包括识别压敏粘合剂。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
利用荧光染剂对血液样本的至少一部分进行染色；
通过利用在给定光谱带发射光的光源照亮样本的一部分，通过获取血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像，来识别血液样本内的被染色细胞；
识别在由光源照明下获得的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域；和
基于所识别的荧光区域，使被染色细胞的荧光归一化。
在一些应用中，识别在光源照明下获取的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别血液样本内的细胞间区域。
在一些应用中，识别在光源照明下获取的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别显微单元的一个或更多个荧光区域。
在一些应用中，获取血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像包括：当血液样本容纳在样本载体中时，获取血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像，以及识别在由光源照明下获取的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别样本载体的一个或更多个荧光区域。
在一些应用中，样本载体包括玻璃和塑料层，该玻璃和塑料层经由发荧光的压敏粘合剂彼此耦合，并且识别在光源照明下获得的显微图像内可见的除了被染色细胞之外的一个或多个荧光区域包括识别压敏粘合剂。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
通过用来自明场光源的光照亮血液样本的一部分，通过获取血液样本的至少一部分的多个明场显微镜图像，来识别血液样本内的实体；
分析在没有血液样本的情况下由明场光源发射的光的明场区域；和
基于对光的明场区域的分析来确定明场光源的特性。
在一些应用中，基于所识别的明场区域确定光源的特性包括确定明场光源的照明的空间分布自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，确定光源的特性包括确定明场光源的照明的空间均匀性自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，确定光源的特性包括确定明场光源的照明的空间位置自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，确定光源的特性包括确定明场光源的照明的晕影效应自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，确定光源的特性包括确定明场光源的照明的光谱分布自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，确定光源的特性包括确定明场光源的照明的强度自前一次测量以来是否已经改变。
在一些应用中，分析在没有血液样本的情况下由明场光源发射的光的明场区域包括在没有血液样本的情况下以固定的时间间隔周期性地分析由明场光源发射的光的明场区域。
在一些应用中，分析在没有血液样本的情况下由明场光源发射的光的明场区域包括在使用明场光源成像给定数量的血液样本之后分析由明场光源发射的光的明场区域。
在一些应用中，该方法还包括通过对血液样本内的实体执行测量和基于所确定的明场光源特性对测量进行归一化来确定血液样本的参数。
在一些应用中，该方法还包括基于所确定的明场光源特性，使至少一些测量无效而不被在血液样本上执行。
根据本发明的一些应用还提供了一种方法，包括：
用至少一种类型的荧光染剂对各个血液样本的部分进行染色；
使用显微单元，通过用多个光源照射样本的一部分，获取各个血液样本的一部分的荧光显微图像，多个光源中的每一个在各自的光谱带发射光；
检测在显微图像中的至少一些中存在误差；和
按以下方法对误差的来源进行分类：
响应于检测到误差是从给定时间点引入的，将荧光染剂识别为误差的来源；
响应于检测到误差随时间逐渐增加，将显微单元内的污垢识别为误差的来源；和
响应于检测到误差仅存在于由光源中的给定一个照明下获取的图像中，将光源中的给定一个识别为误差的来源。
根据结合附图进行的本发明的实施例的以下详细描述，本发明将得到更完全地理解，其中：
附图简述
图1是示出根据本发明的一些应用的生物样本分析***的部件的框图；
图2A、图2B和图2C是根据本发明的一些应用的用于执行显微测量和光密度测量两者的样本载体的各自视图的示意图；
图3A、图3B和图3C是根据本发明的一些应用获得的含有溶血红细胞的血液样本的显微图像；和
图4是示出根据本发明的一些应用的沿着样本腔室的长度记录的归一化光透射强度的分布的曲线图。
具体实施方式
现在参考图1，图1是示出根据本发明的一些应用的生物样本分析***20的部件的框图。通常，生物样本(例如，血液样本)被放置到样本载体22中。当样本被放置在样本载体中时，使用一个或更多个光学测量设备24对样本执行光学测量。例如，光学测量设备可以包括显微镜(例如，数字显微镜)、分光光度计、光度计、分光计、照相机、光谱照相机、高光谱照相机、荧光计、分光荧光计和/或光电探测器(诸如，光电二极管、光敏电阻和/或光电晶体管)。对于一些应用，光学测量设备包括专用光源(诸如发光二极管、白炽光源等)和/或用于操纵光收集和/或光发射的光学元件(诸如透镜、漫射器、滤光器等)。对于一些应用，使用的显微镜***通常类似于Greenfield在US 2014/0347459中描述的显微镜***，该US 2014/0347459通过引用并入本文。
计算机处理器28通常接收并处理由光学测量设备执行的光学测量结果。此外典型地，计算机处理器控制对由一个或更多个光学测量设备执行的光学测量的获取。计算机处理器与存储器30通信。用户(例如，实验室技术人员或从中抽取样本的个人)经由用户接口32向计算机处理器发送指令。对于一些应用，用户接口包括键盘、鼠标、操纵杆、触摸屏设备(诸如智能手机或平板计算机)、触摸板、轨迹球、语音命令接口和/或本领域已知的其他类型的用户接口。通常，计算机处理器经由输出设备34生成输出。此外通常地，输出设备包括显示器，诸如监视器，并且输出包括显示在显示器上的输出。对于一些应用，处理器在不同类型的视觉、文本、图形、触觉、音频和/或视频输出设备(例如，扬声器、头戴式耳机、智能手机或平板计算机)上生成输出。对于一些应用，用户接口32充当输入接口和输出接口，即它充当输入/输出接口。对于一些应用，处理器在诸如磁盘或便携式USB驱动器的计算机可读介质(例如，非暂时性计算机可读介质)上生成输出，和/或在打印机上生成输出。
对于一些应用，光学测量设备24(和/或计算机处理器28和存储器30)容纳在光学测量单元31内。为了对样本进行光学测量，将样本载体22放置在光学测量单元内。通常，光学测量单元包括显微镜***，该显微镜***被配置为对样本的一部分执行显微成像。对于一些应用，显微镜***包括被配置用于样本的明场成像的一组明场光源(例如发光二极管)、一组被配置为用于样本的荧光成像的荧光光源(例如发光二极管)、以及被配置为对样本成像的照相机(例如CCD照相机或CMOS照相机)。通常，光学测量单元还包括光密度测量单元，该光密度测量单元被配置为对样本的第二部分执行光密度测量(例如，光吸收测量)。对于一些应用，光密度测量单元包括一组光密度测量光源(例如，发光二极管)和光探测器，它们被配置用于对样本执行光密度测量。对于一些应用，上述多组光源(即，一组明场光源、一组荧光光源和一组光密度测量光源)中的每一个包括多个光源(例如，多个发光二极管)，每个光源被配置成以相应波长或相应波段发射光。
现在参考图2A和图2B，它们是根据本发明的一些应用的样本载体22的各自视图的示意图。图2A示出了样本载体的顶视图(为了说明目的，样本载体的顶盖在图2A中示出为不透明的)，并且图2B示出了底视图(其中样本载体已经相对于图2A所示的视图绕其短边旋转)。通常，样本载体包括第一组52一个或更多个腔室，其用于对样本进行显微分析，并且样本载体包括第二组54一个或更多个腔室，其用于对样本进行光密度测量。通常，样本载体的腔室经由样本入口孔38充满身体样本，诸如血液。对于一些应用，腔室限定一个或更多个出口孔40。出口孔被配置为通过允许腔室中存在的空气从腔室释放来促进用身体样本填充腔室。通常，如所示，出口孔纵向地相对于入口孔进行定位(相对于样本载体的样本腔室)。对于一些应用，出口孔因而提供了相比于将出口孔设置得更靠近入口孔的情况更有效的空气逸出机制。
参考图2C，其示出了根据本发明的一些应用的样本载体22的分解图。对于一些应用，样本载体包括至少三个部件：模制部件42、玻璃板44和被构造成将玻璃板粘附到模制部件的下侧的粘合层46。模制部件通常由聚合物(例如，塑料)制成，其(例如，经由注射模制)被模制以提供具有所需几何形状的腔室。例如，如所示，模制部件通常模制成限定围绕每个腔室的中心部分的入口孔38、出口孔40和沟槽(gutter)48。沟槽通常通过允许空气流到出口孔和/或通过允许身体样本绕腔室的中心部分流动来促进身体样本对腔室的填充。
对于一些应用，如图2A-C所示的样本载体在对血液样本进行完整血液计数时使用。对于一些应用，血液样本的第一部分被放置在第一组52的腔室(其用于对样本进行显微分析)内，血液样本的第二部分被放置在第二组54的腔室(其用于对样本进行光密度测量)内。对于一些应用，第一组52的腔室包括多个腔室，而第二组54的腔室仅包括单个腔室，如所示。然而，本申请的范围包括在第一组的腔室内或第二组的腔室内或其任何组合内使用任意数量的腔室(例如，单个腔室或多个腔室)。血液样本的第一部分通常相对于血液样本的第二部分被稀释。例如，稀释液可以含有pH缓冲液、染剂、荧光染剂、抗体、球形剂(sphering agents)、裂解剂等。通常，放置在第二组54的腔室内的血液样本的第二部分是天然的、未稀释的血液样本。可替代地或附加地，血液样本的第二部分可以是经过某种修饰的样本，包括例如稀释(例如，以受控方式稀释)、添加组分或试剂或分馏中的一种或更多种。
对于一些应用，在对样本进行显微成像之前，使用一种或更多种染色物质对血液样本的第一部分(其放置在第一组52的腔室内)进行染色。例如，染色物质可以被配置成优先于对其他细胞组分的染色来染色DNA。可替代地，染色物质可以被配置成优先于对其他细胞组分的染色来染色所有细胞核酸。例如，可以用吖啶橙试剂、赫斯特试剂和/或被配置成优先染色血液样本内的DNA和/或RNA的任何其他染色物质来染色样本。任选地，染色物质被配置为染色所有细胞核酸，但DNA和RNA的染色各自在一些照明和过滤条件下更显著可见，如例如关于吖啶橙所了解的。可以使用允许检测细胞的成像条件(例如，明场)和/或允许被染色的体的可视化的成像条件(例如适当的荧光照明)来获取样本的图像。通常，样本的第一部分用吖啶橙和用赫斯特试剂染色。例如，可以使用如Pollak的US 2015/0316477中所述的技术制备血液样本的第一(稀释的)部分，US 2015/0316477通过引用并入本文，并且描述了用于制备用于分析的血液样本的方法，该方法涉及稀释步骤，该稀释步骤有助于对样本的显微图像中的组分进行识别和/或计数。
通常，在显微成像之前，允许第一部分血液(放置在第一组52的腔室中)沉淀，诸如使用通过引用并入本文的、Pollak的US 9,329,129中所述的技术形成细胞的单层。对于一些应用，血液样本的第一部分的显微分析是相对于细胞的单层进行的。通常，血液样本的第一部分在明场成像下被成像，即在来自一个或更多个光源(例如，一个或更多个发光二极管，其通常在各自的光谱带处发射光)的照明下成像。此外，通常地，血液样本的第一部分另外在荧光成像下成像。通常，荧光成像是通过以下方式执行的：以已知激发波长(即，如果以这些波长的光激发，则已知被染色对象发射荧光的波长)将光指向样本来激发样本内的被染色对象(即，已经吸收了染剂的对象)，并检测荧光。通常，对于荧光成像，使用单独的一组光源(例如，一个或更多个发光二极管)以已知激发波长来照射样本。
注意，在本申请的上下文中，术语单层用于表示已经沉淀的细胞层，诸如设置在显微镜的单个聚焦场中。在单层内可以存在细胞的某种重叠，使得在某些区域内存在细胞的两个或更多个重叠层。例如，红细胞可以在单层内彼此重叠，和/或血小板可以与单层内的红细胞重叠，或设置在其上方。
如参考通过引用并入本文的Pollack的US 2019/0302099所描述的，对于一些应用，属于组52(其用于显微测量)的腔室彼此具有不同的高度，以便于使用各个腔室的显微镜图像测量不同的被测物(measurand)，和/或不同的腔室用于各个样本类型的显微分析。例如，如果血液样本和/或由样本形成的单层具有相对低密度的红细胞，则可以在具有较大高度的样本载体的腔室(即，相对于具有相对较低高度的不同腔室具有较大高度的样本载体的腔室)内执行测量，使得存在充足密度的细胞，和/或使得在由样本形成的单层内存在充足密度的细胞，以提供统计上可靠的数据。这样的测量可以包括例如红细胞密度测量、其他细胞属性的测量(诸如异常红细胞的计数、包括胞内体(例如，病原体、染色质小体)等的红细胞)和/或血红蛋白浓度。相反，如果血液样本和/或由样本形成的单层具有相对高密度的红细胞，则可以在具有相对低高度的样本载体的腔室上执行这样的测量，例如，使得存在足够稀疏的细胞，和/或使得在由样本形成的单层细胞内存在足够稀疏的细胞，从而可以在显微图像中识别细胞。对于一些应用，即使不存在属于组52的腔室之间的精确已知的高度变化，也可以执行这样的方法。
对于一些应用，根据被测量的被测物，选择在样本载体内执行光学测量的腔室。例如，具有较大高度的样本载体的腔室可以用于执行白细胞计数(例如，以减少可能源于较浅区域中的低计数的统计误差)、白细胞分化和/或检测更稀有形式的白细胞。相反，为了确定平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞分布宽度(RDW)、红细胞形态特征和/或红细胞异常，可以从具有相对低高度的样本腔室的腔室中获得显微图像，因为在这样的腔室中，细胞在区域的区中相对稀疏地分布，和/或形成细胞相对稀疏地分布的单层。类似地，为了对血小板计数、对血小板分类和/或提取血小板的任何其他属性(诸如体积)，可以从具有相对低高度的样本腔室的腔室中获得显微图像，因为在这样的腔室内有较少的红细胞在显微图像中和/或在单层中(完全或部分)与血小板重叠。
根据上述示例，优选地使用具有较低高度的样本载体的腔室进行光学测量以用于测量样本(诸如血液样本)内的一些被测物，而优选地使用具有较高高度的样本载体的腔室进行光学测量，以用于测量该样本内的其他被测物。因此，对于一些应用，通过对设置在属于样本载体的组52的第一腔室内的样本的一部分进行第一光学测量(例如，通过获取其显微图像)来测量样本内的第一被测物，并且通过对设置在样本载体的组52的第二腔室内的样本的一部分进行第二光学测量(例如，通过获取其显微图像)来测量同一样本的第二被测物。对于一些应用，例如使用通过引用并入本文的Zait的US 2019/0145963中描述的技术，第一和第二被测物相对于彼此归一化。
通常，为了对样本执行光密度测量，希望尽可能精确地知道对其执行光学测量的样本的一部分的光路长度、体积和/或厚度。通常，对样本的第二部分(其通常以未稀释形式放置在第二组54的腔室中)执行光密度测量。例如，可以通过对样本执行光吸收、透射、荧光和/或发光测量来测量组分的浓度和/或密度。
再次参考图2A，对于一些应用，属于组54(其用于光密度测量)的腔室通常限定至少第一区域56(其通常较深)和第二区域58(其通常较浅)，腔室的高度以预定义方式在第一和第二区域之间变化，例如，如通过引用并入本文的Pollack的WO 17/195205中所述。样本腔室的第一区域56和第二区域58的高度由玻璃板限定的下表面和由模制部件限定的上表面限定。第二区域处的上表面相对于第一区域处的上表面呈阶梯状(stepped)。在第一区域和第二区域处的上表面之间的阶梯提供区域之间的预定义高度差Δh，使得即使并非以足够的精确度了解区域的绝对高度(例如，由于制造工艺中的公差)，也以足够的精确度了解高度差Δh，以使用本文描述的技术并如通过引用并入本文的Pollack的US 2019/0302099中所描述的那样，来确定样本的参数。对于一些应用，腔室的高度从第一区域56到第二区域58变化，然后高度从第二区域到第三区域59再次变化，使得沿着样本腔室，第一区域56限定最大高度区域，第二区域58限定中等高度区域，而第三区域59限定最小高度区域。对于一些应用，高度的附加变化沿着腔室的长度发生，和/或高度沿着腔室的长度逐渐变化。
如上文所述，当样本被设置在样本载体中时，使用一个或更多个光学测量设备24对样本执行光学测量。通常，光学测量设备经由玻璃层观察样本，玻璃至少对光学测量设备通常使用的波长是透明的。通常，在执行光学测量时，将样本载体***容纳光学测量设备的光学测量单元31中。通常，光学测量单元容纳样本载体，使得模制层设置在玻璃层之上，并且使得光学测量单元设置在样本载体的玻璃层之下，并且能够经由玻璃层对样本执行光学测量。样本载体通过将玻璃板粘附到模制部件上形成。例如，玻璃板和模制部件可以在制造或组装期间(例如，使用热结合、溶剂辅助结合、超声焊接、激光焊接、热熔(heat staking)、粘合剂、机械夹固和/或附加基底)彼此结合。对于一些应用，玻璃层和模制部件在制造或组装期间使用粘合层46彼此结合。对于一些应用，由于制造工艺中的公差，样本腔室的绝对高度是未知的。如上所述，在第一和第二区域处的上表面之间的阶梯提供区域之间的预定义高度差Δh，使得即使没有以足够的精确度了解区域的绝对高度(例如，由于制造工艺中的公差)，也以足够的精确度了解高度差Δh来确定样本的参数。例如，使用本文描述的技术并且如通过引用并入本文的Pollack的US 2019/0302099中所描述的那样，沿着腔室的长度的替代或附加的高度变化(例如，高度的阶梯变化或高度的逐渐变化)可以用作第一和第二区域之间的阶梯的替代或附加。
对于一些应用，样本载体22的一部分被配置为至少在某些条件下发荧光。例如，样本载体的一部分可以被配置为当暴露于由光学测量设备24发射的光(例如，明场光或由显微镜***发射的荧光)时发荧光。或者样本载体的一部分可以被配置为当放置在其中容纳有光学测量设备24的光学测量单元31内时发荧光。如上文所述，对于一些应用，样本载体22包括粘合层46。对于一些应用，粘合层或其一部分被配置为以上述方式发荧光(例如，通过粘合层内的被配置为发荧光的粘合剂材料，通过含有被配置为发荧光的附加材料的粘合层，和/或通过涂覆有这种材料的粘合层)。对于一些应用，粘合层是压敏粘合剂，其至少一部分被配置为发荧光。例如，压敏粘合剂可以是丙烯酸型压敏粘合剂，其至少一部分被配置为发荧光。
根据本发明的一些应用，(通常由计算机处理器)执行各种技术，以便确定是否产生了各种误差，并且如果产生了误差，则可选地识别误差的来源。这些误差可能源于所有样本的制备。例如，在执行测量之前，样本可能已经在样本载体中停留过长时间(这可能导致样本退化，和/或这可能导致与样本的一个或两个部分混合的染剂被样本内的实体过度吸收)。可替代地，误差可能源于样本的特定部分的制备。例如，在制备第一部分(其通常被稀释并放置在第一组52的腔室内以进行显微分析)中可能存在误差，诸如在稀释样本的第一部分中的误差、气泡进入第一组52的腔室中或样本的该部分的污染。可替代地或附加地，在第二部分(其通常未稀释并放置在第二组54的腔室中以经由光密度测量进行分析)的制备中可能存在误差，诸如该部分的污染或气泡进入第二组54的腔室中。
可替代地或附加地，误差可能源于样本载体的误差(诸如样本载体本身(例如衬底)的材料不干净，和/或样本载体上的污垢或溢出的血液)，和/或显微镜***本身的误差，诸如照明(例如，用于明场成像的发光二极管和/或在样本的荧光成像期间使用的发光二极管)，和/或与光路和/或电机和镜台部件或控制器相关联的误差，和/或由放置设备的环境(例如，相对湿度、温度、压力、颗粒浓度或任何其他环境因素)引起的误差。此外，可替代地或附加地，可能存在样本的固有问题(诸如某一实体的非常低的计数或非常高的计数，或自执行样本收集以来已经过了太多的时间)，这意味着计算机处理器不能以足够的精确度执行某些测量，和/或这意味着计算机处理器应该向用户标记这一点。
对于一些应用，响应于识别到误差，计算机处理器输出指示误差和/或指示误差来源的消息。对于一些应用，计算机处理器响应于识别到误差而不对血液样本执行某些测量。对于一些应用，响应于识别到误差，计算机处理器不会对样本执行任何测量，和/或标记样本对用户无效，和/或指示用户用新的试剂盒重复样本制备和/或重新收集血液样本。可替代地或附加地，计算机处理器通过校准对血液样本执行的测量来确定血液样本的某些参数，以便考虑到误差。
对于一些应用，例如，以上述方式中的一种或更多种来考虑到以下误差中的一种或更多种：
显微设备中的误差，诸如：
-移动显微镜台的电机的失步
-显微镜台的移动的反冲变化(例如，如下文进一步详细描述)
-显微镜照相机和显微镜台之间的定时变化(例如，如下文进一步详细描述)
-显微镜照相机和显微镜台之间的对齐(例如，由于这些元件之间的相对旋转)
-光学***的问题(例如，随着时间的推移焦点质量的变化，例如由样本引起的，或由显微镜台的一块(例如刮擦的一块)引起的，例如，如下文进一步详细描述)
-显微镜***中的调平变化
-沿z轴(即光轴)的预期焦点位置的变化
-元件之间失去通信
-照相机线性响应的变化
环境因素引起的误差，诸如：
-设备在可允许的温度、湿度、高度等之外
-特定部件在目标值之外
一般误差，由以下因素引起：
-扫描时间
-设备启动时间
-可用工作/存储内存
下面描述用于识别误差并对这种误差进行应对的技术的一些示例。
如上所述，通常，血液样本的第一部分进行显微分析，同时被设置在第一组52的样本腔室内。通常，在显微成像之前，允许第一部分血液(其放置在第一组52的腔室中)沉淀，诸如使用通过引用并入本文的、Pollak的US 9,329,129中所述的技术，形成细胞的单层。
对于一些应用，计算机处理器被配置成通过在样本载体被放置到显微单元之后获取样本的一个或更多个显微图像，并分析该一个或更多个图像，来确定在样本载体被放置到显微单元之前，样本腔室内的一个或更多个细胞类型(例如，红细胞)是否已经在样本室内沉降。
通常，如果确定在获取显微图像之前所有红细胞都已经沉降，这表明在将样本载体放置到显微单元中之前，血液样本在样本腔室内停留太长时间。应当注意，虽然显微图像的分析通常是相对于沉降细胞的单层进行的，但仍然希望在一些红细胞仍在沉降时将样本载体放置到显微单元中，因为这表明在将样本放置到显微单元中之前，样本没有在样本载体中停留太长时间。相反，如果所有的红细胞(或足够大比例的红细胞)已经沉降，那么样本可能已经退化，和/或染剂可能已经被样本内的实体过度吸收。因此，细胞仍在沉降的程度可以用作从受试者中提取样本的最近时间和/或样本放置在样本载体或样本腔室中的最近时间(即，样本的新鲜度)的度量。因此，对于一些应用，响应于确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内超过阈值量的红细胞已经沉降在样本腔室内，使样本(或其一部分)无效而不被用于对样本执行至少一些测量。
对于一些应用，至少部分地基于确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内的一个或更多种细胞类型是否已经在样本腔室内沉降，来确定血液样本的老化的指示。对于一些应用，至少部分地基于在获取一个或更多个显微图像之前样本腔室内的尚未在样本腔室内沉降的一种或更多种细胞类型的量(或比例)，来确定血液样本的老化的指示。
对于一些应用，对样本的第二部分(通常以未稀释的形式放置在第二组54的室中)执行与上述段落中描述的分析大致相似的分析(用于确定样本最近从受试者中提取的时间和/或样本最近放置在样本载体或样本室中的时间)。
注意，通常，在计算机处理器(例如，使用上述分析技术)已经确定最近从受试者中提取样本的时间和/或最近将样本放置在样本载体或样本腔室中的时间的指示之后，在对血液样本的第一部分进行进一步成像之前(为了对血液样本进行显微分析而进行进一步成像)，将样本载体留在显微单元内的适当位置几分钟(例如，在2-10分钟之间，例如，大约5分钟)。这是为了让血液样本的第一部分有时间沉降到单层中。
对于一些应用，响应于确定在获取一个或更多个显微图像之前，样本腔室内超过阈值量的红细胞已经沉降在样本腔室内，校准对样本执行的测量。例如，这种测量可以被校准，以考虑到在获取一个或更多个显微图像之前，血液样本内的实体所经历的染色量，如样本腔室内已经在样本腔室内沉降的超过红细胞的阈值量所指示的。对于一些应用，在获取一个或更多个显微图像之前，基于样本腔室内尚未在样本腔室内沉降的一个或更多个细胞类型的量(或比例)来校准对样本执行的测量。
对于一些应用，当血液样本内的红细胞在样本腔室内沉降时，获取血液样本内的红细胞的显微图像，并且由计算机处理器通过分析图像来确定血液样本的沉降动力学特性(例如，红细胞沉降速率)。通常，血液样本的沉降动力学特性(例如，红细胞沉降速率)由计算机处理器相对于红细胞的沉降实时地确定(即，当红细胞仍在沉降时确定)。这与测定血液样本的沉降动力学特性(例如，红细胞沉降速率)的其他技术形成鲜明对比，在这些技术中测量红细胞沉降所需的总时间。要注意的是，如果这样的测量是对血液样本的稀释部分进行的，则蛋白质对红细胞的沉降时间的影响被削弱。因此，对于一些应用，这样的测量是对血液样本的未稀释部分进行的。
对于一些应用，使用每样本信息(诸如，红细胞或血小板平均细胞体积、平均细胞血红蛋白浓度或其他此类样本指示性测量值)，校正上述用于确定最近从受试者中提取样本的时间和/或最近将样本放置在样本载体中的指示和/或用于确定沉降动力学特性的分析。可替代地或附加地，使用关于单细胞水平的信息(即，通过提取与个体细胞有关的数据并基于这些数据校正所确定的沉降动力学特性)来校正用于确定最近从受试者提取样本的时间和/或最近将样本放置在样本载体中的指示和/或用于确定沉降动力学特性的分析。
对于一些应用，响应于确定血液样本内的给定实体的浓度超过阈值，计算机处理器通过将从血液样本的第一部分的显微图像确定的参数与从对血液样本的第二部分执行的光密度测量确定的参数进行比较来确定给定实体的浓度超过阈值的原因。例如，响应于检测到样本的第一部分(通常被稀释并放置在第一组52的腔室中)具有非常高的红细胞计数或非常低的红细胞计数，计算机处理器可以执行比较，以便确定是否是血液样本固有地具有非常高的红细胞计数或非常低的红细胞计数的情况，或者它是否由样本的该部分的制备中的误差(例如，第一部分的稀释)引起的。计算机处理器通常通过确定由显微图像指示的实体的浓度与由光密度测量确定的实体的浓度相似来确定血液样本本身是导致样本内给定实体的浓度超过阈值的原因。此外通常，计算机处理器通过确定由显微图像指示的实体的浓度与由光密度测量确定的实体的浓度不同来确定血液样本的该部分的制备是导致样本内给定实体的浓度超过阈值的原因。
对于一些应用，使用除浓度以外的样本参数(例如，平均细胞体积、平均细胞血红蛋白等)进行与上段所述类似的分析。对于一些应用，响应于识别到对样本的相应部分所测量的参数之间存在差异，确定样本的相应部分可能是两个不同样本的部分(例如，来自两个不同患者)。
对于一些应用，如由样本的相应部分确定的参数用于相互校正。例如，如果在每个样本部分中测量的参数的值彼此不同，但确定存在该参数的位于在每个样本部分中测量的两个值的误差范围内的第三值(或值范围)，则可以确定该第三值(或值范围)可能是正确的。
对于一些应用，响应于样本的一个或更多个参数在正常范围之外，计算机处理器将这些参数与样本的其他参数进行比较。响应于所有参数都在正常范围之外(或者甚至以与一个或更多个参数中的误差相关的方式出现错误)，那么计算机处理器可以确定这是由于影响所有这些参数的计算中的误差造成的。
对于一些应用，计算机处理器被配置成识别样本的第一部分的显微图像内的棘状红细胞、球形红细胞和/或圆齿状红细胞。通常，这种实体的存在是样本的部分已经由于老化和/或样本存储条件而退化的指示。对于一些这样的应用，计算机处理器测量这样的实体的计数，并且至少部分地基于所选类型的实体的计数超过阈值，使至少血液样本的该部分无效而不被用于对血液样本执行至少一些测量。对于一些应用，计算机处理器向用户生成计数和/或相关联的临床状况的指示。可替代地或附加地，计算机处理器至少部分地基于计数确定样本部分的老化指示。对于一些应用，为了确定样本的参数，对显微图像执行测量，并且基于样本部分的所确定的老化指示和/或基于上述实体的计数来校准测量。对于一些应用，通过对血液样本的第二部分(其通常设置在第二组54的样本腔室内)执行光密度测量，以及基于样本部分的所确定的老化指示和/或基于前述实体的计数来校准光密度测量，从而确定样本的参数。(对于一些应用，基于一个或更多个其他因素(例如，红细胞形态、红细胞体积、血小板计数、样本内碎片的水平和/或可能影响散射的任何对象或属性的存在或量)来校准光密度测量。)
对于一些应用，计算机处理器估计棘状红细胞、球形红细胞和/或圆齿状红细胞的体积。对于一些这样的应用，这些细胞的体积被合并到样本内平均红细胞体积的总体测量值中。
现在参考图3A和图3B，它们是根据本发明的一些应用分别在紫色和绿色LED照明下获得的明场显微图像。如上所述，通常获取血液样本的第一部分的显微图像，并分析该第一部分内细胞的单层。通常，在对样本的部分进行成像之前，球化技术不应用于样本中的红细胞。本申请的发明人已经发现，当使用本文描述的技术对样本的部分进行显微成像时，在显微图像中可见一些溶血红细胞。通常，在样本被赫斯特试剂(或与细胞膜有亲和力的任何荧光或非荧光染剂)染色后，在明场成像下，细胞轮廓是可见的，但细胞的其余部分看起来像图像的背景。这种影响可以在图3A和图3B中观察到，其中可见红细胞60，并且可见溶血红细胞62的轮廓，但是该细胞的内部看起来与背景相似，使得轮廓看起来像“空”细胞。“空”细胞通常具有与红细胞相似的形状和大小。
还参考图3C，它是根据本发明的一些应用获得的荧光显微图像。在血液样本已经用赫斯特试剂染色并且使用以约360nm为中心的UV照射被激发之后，记录图像。可以观察到，与模糊地呈现为暗圆形的红细胞60不同，溶血红细胞62呈现为具有与红细胞大致相似的形状和大小的亮圆形。据推测，溶血红细胞被与残留在溶血红细胞的膜上的残余物结合的赫斯特试剂染色。这导致溶血红细胞在明场图像中呈现为“空”细胞，和/或在荧光图像中呈现为亮圆形。进一步假设，红细胞在荧光图像中呈暗圆形的原因是因为在整个样本中存在游离赫斯特试剂的背景辐射，但这种辐射被红细胞中的血红蛋白减弱，使其呈现出比背景更暗的颜色。
因此，根据本发明的一些应用，在非球化血液样本内识别到溶血红细胞。通常，样本用诸如赫斯特试剂的染剂(或与细胞膜有亲和力的任何荧光或非荧光染剂)染色。通过识别其轮廓可见、但其内部看起来与背景大致相似(使得轮廓看起来像“空”细胞)的细胞，溶血红细胞在染色样本的明场图像中被识别。可替代地或附加地，在染色样本的荧光图像内识别到溶血红细胞。通常，溶血红细胞具有与图像内的红细胞大致相似的形状和大小。
对于一些应用，可见的溶血红细胞仅构成存在于样本部分内的溶血红细胞的总数的一小部分，因为通常情况下，一部分溶血红细胞是不可见的。对于一些应用，计算机处理器识别可见的溶血红细胞，并测量样本的一部分内所识别的溶血红细胞的计数。通常，基于所识别的溶血红细胞的计数，计算机处理器估计样本的一部分内大于所识别的溶血红细胞的计数的溶血红细胞的总计数。替代地或附加地，基于所识别的溶血红细胞的计数，计算机处理器估计样本内溶血红细胞与非溶血红细胞的比率。通常，该比率是通过估计样本的一部分内溶血红细胞的总计数来计算的，该总计数大于所识别的溶血红细胞的计数。对于一些应用，计算机处理器向用户输出血液样本内溶血红细胞的估计的总计数或溶血红细胞与非溶血红细胞的比率的指示。可替代地或附加地，计算机处理器至少部分地基于所识别的溶血红细胞的计数超过阈值，或基于上述比率超过阈值，使样本无效而不被用于对样本执行至少一些测量。对于一些应用，样本的无效基于估计样本的一部分内溶血红细胞的总计数，该总计数大于所识别的溶血红细胞的计数。
对于一些应用，为了识别血液样本内的给定实体(诸如，血小板、红细胞、白细胞等)，计算机处理器首先通过分析血液样本的第一部分的显微图像来识别血液样本内给定实体的候选者。随后，计算机处理器通过对候选者执行进一步的分析，将候选者中的至少一些验证为给定实体。
对于一些应用，计算机处理器将给定实体的候选者的计数与给定实体的经验证的候选者的计数进行比较，并且至少部分地基于候选者的计数和经验证的候选者的计数之间的关系，使样本的至少一部分无效而不被用于对样本执行至少一些测量。例如，如果经验证的候选者的计数与候选者的计数的比率超过最大阈值，则计算机处理器可以使样本的至少一部分无效而不用于对该样本执行至少一些测量，因为这指示太多候选者得到验证，表明存在误差。可替代地或附加地，如果经验证的候选者的计数与候选者的计数的比率低于最小阈值，则计算机处理器可以使样本的至少一部分无效而不用于对该样本执行至少一些测量，因为这指示太少候选者得到验证，表明存在误差。对于一些应用，如果经验证的血小板的计数与血小板候选者的计数的比率低于最小阈值，则计算机处理器使样本的至少一部分无效而不被用于执行血小板计数，因为这指示太少血小板候选者被验证为血小板，表明存在误差。例如，这种误差可能是由于碎片(或其他污染体)被错误地识别为血小板或血小板候选者所造成的。注意，误差的来源可能是在样本的部分的制备中、在样本载体中、在显微单元的部分中和/或在血液本身中。对于一些应用，对于样本内的红细胞、白细胞和/或其他实体(例如，异常白细胞、循环肿瘤细胞、红细胞、网织红细胞、Howell-Jolly体等)执行类似的技术。
对于一些应用，计算机处理器被配置为识别血液样本内的白细胞候选者，然后被配置为通过执行对白细胞候选者的进一步分析来将至少一些白细胞候选者验证为给定类型的白细胞(例如，嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、原始细胞、未成熟细胞、异型淋巴细胞和/或嗜碱性粒细胞)。对于一些应用，计算机处理器将白细胞候选者的计数与被验证为给定类型的白细胞的白细胞候选者的计数进行比较，并且至少部分地基于白细胞候选者的计数与被验证为给定类型的白细胞的白细胞候选者的计数之间的关系，使样本的至少一部分无效而不用于对样本执行至少一些测量。例如，如果被验证为给定类型的白细胞的白细胞候选者计数与白细胞候选者的计数的比率超过最大阈值，则计算机处理器可以使样本的至少一部分无效而不用于对样本执行至少一些测量，因为这指示太多的候选者已经得到验证，表明存在误差。替代地或附加地，如果被验证为给定类型的白细胞的白细胞候选者的计数与白细胞候选者的计数的比率低于最小阈值，则计算机处理器可以使样本的至少一部分无效而不用于对样本执行至少一些测量，因为这指示太少候选者得到验证，表明存在误差。注意，误差的来源可能是在样本的部分的制备中、在样本载体中、在显微单元的部分中和/或在血液本身中。
对于一些应用，计算机处理器被配置成通过识别具有不规则形状(例如，纤维形状、非圆形形状和/或细长形状)的被染色对象来识别样本内的碎片(或其他污染体)。如上所述，通常，计算机处理器通过对样本执行显微分析来执行设置在样本内的一个或更多个实体的计数。对于一些应用，计算机处理器使设置在距所识别的碎片(或其他污染体)给定距离内的样本区域无效而不被包括在计数中。通常，碎片由染剂染色，且通常进一步地，碎片用吖啶橙和赫斯特试剂染色。对于一些应用，计算机处理器通过识别具有不规则形状和/或被染剂(例如吖啶橙和赫斯特试剂)染色的对象来识别碎片(或其他污染体)。
现在参考图4，其是根据本发明的一些应用的示出沿着属于第二组54的样本腔室的样本腔室的长度测量的光透射强度分布的归一化对数的曲线图。如上所述，通常，计算机处理器被配置成对放置在第二组54的样本腔室中的样本的第二部分执行光学测量(例如，光密度测量)。对于一些应用，光(例如来自LED的光)在血红蛋白吸收光的光谱带上透射穿过腔室，并且透射光的强度由光电探测器检测。根据比尔-兰伯特(Beer-Lambert)定律，被吸收的光量被解释为指示样本的第二部分内血红蛋白的浓度。
对于一些应用，计算机处理器基于光学测量确定一个或更多个空气气泡存在于第二组的样本腔室之一内。例如，由于在样本腔室内具有不同高度的区域，沿着腔室长度的透射强度的归一化对数分布(其与血红蛋白吸收分布相关)预期具有给定形状，例如，随着区域之间的差异(由于腔室的高度的阶梯)，光透射强度的对数基本恒定的区域。这由图4中的实线70表示，该实线70是对于几个不同样本沿着样本腔室的长度记录的透射强度的归一化对数的组合。如所示，沿着样本腔室的最小高度区域56，透射强度的对数基本上是恒定的。(事实上，沿着该区域的长度有轻微的斜率，这是由于在样本载体的制造中的公差导致沿着该区域的长度的高度变化，如上所述。)然后，随着沿着样本腔室的距离转变到中等高度区域58(在该区域血红蛋白吸收更大，因此光透射更低)，透射强度的对数下降，然后随着沿着样本腔室的距离转变到最大高度区域59(在该区域血红蛋白吸收更大，因此光透射更低)，透射强度的对数进一步下降。注意，透射被归一化的方式是通过在最大高度区域的给定部分内取光透射强度的对数的值的平均值并将其赋值为1，在最小高度区域的给定部分内取光透射强度的对数的值的平均值并将其赋值为第二值，然后将其他值关于这两个值归一化。(在一些情况下，在最小高度区域的给定部分内的光透射强度的对数的值被分配为欧拉数的值(即，2.718)，尽管在图4所示的示例中，情况并非如此。)期望填充样本腔室的任何样本的归一化分布具有相似分布，而不管样本的绝对血红蛋白吸收率，因为分布的形状取决于沿着样本腔室的不同区域的相对吸收。
图4中的细曲线72示出了对于给定样本沿样本腔室的长度记录的透射强度的归一化对数。可以观察到，在最小高度区域内，存在曲线的相对平坦部分(其在曲线70之下)，然后是峰值(其在曲线70之上)。另外，沿着中等高度区域，曲线72低于曲线70。通常，这样的分布指示在最小高度区域内存在气泡(例如，空气气泡和/或不同物质的存在)的事实。在气泡的位置处，光透射更大，导致在该位置处曲线72中有一个峰值。在其它位置(例如，在最小高度区域的其它部分内)和沿着整个中等高度区域，在最小高度区域内气泡的存在使得透射强度的归一化对数值相对于不包含气泡的样本的值降低。类似地，当在样本腔室的其他区域内(或沿整个区域)存在气泡时，这将产生不同的透射强度的归一化对数分布。例如，如果沿着整个最小高度区域存在气泡，这将导致中等高度区域内的透射强度的归一化对数相对于不包含气泡的样本的透射强度的归一化对数降低。对于一些应用，腔室的高度以不同的方式变化，但通常执行类似的技术，并作相应的修改。
因此，根据本发明的一些应用，除了测量指示沿样本腔室的长度的光透射的参数的绝对值之外，确定指示沿样本腔室的光透射的参数的归一化值(例如，光透射强度的归一化对数)。基于参数的归一化值，计算机处理器确定样本腔室内可能存在气泡(例如，空气气泡或不同物质的存在)。对于一些应用，响应于确定样本腔室内可能有气泡，计算机处理器生成输出。例如，计算机处理器可以生成错误消息(例如，指示应该重新填充样本腔室的消息)，可以使样本无效，和/或可以使对样本执行的测量的一部分无效。
对于一些应用，计算机处理器执行光吸收测量，但仅使用腔室中不存在气泡的区域进行测量。因此，对于一些应用，基于指示样本腔室内至少一些区域处的光透射的参数的绝对值，计算机处理器计算样本内的血红蛋白浓度。另外，计算机处理器将在样本腔室内的各个区域处所测量的参数相对于彼此归一化。至少部分响应于归一化参数，计算机处理器确定使用哪一个区域来计算样本内血红蛋白浓度。可替代地，计算机处理器可以使样本无效而不被用于计算样本内血红蛋白浓度，和/或可以生成错误消息(例如，指示应该重新填充样本腔室的消息)。
沿着腔室的宽度，期望的是样本具有相对恒定的吸收分布。对于一些应用，计算机处理器被配置成将出乎意料的低吸收水平(不符合上述分布)解释为表明存在空气气泡。对于一些应用，为了确定是否存在空气气泡，以血红蛋白不吸收光的波长(例如，使用绿光)执行一个或更多个光吸收测量。可替代地或附加地，照相机(例如，显微镜的CCD照相机或CMOS照相机)用于对血液样本的第二部分成像，并且计算机处理器基于图像确定是否存在空气气泡。
通常，基于光学测量，由计算机处理器确定样本的一个或更多个参数。对于一些应用，基于确定一个或更多个空气气泡存在于腔室内，使至少一些光学测量无效而不用于确定样本的一个或更多个参数。对于一些应用，计算机处理器基于确定一个或更多个空气气泡存在于样本腔室内而生成输出，该输出指示血液样本的一部分已经无效而不用于对样本执行至少一些测量。
对于一些应用，通常对放置在第一组52的样本腔室中的血液样本的第一部分执行类似的技术。例如，计算机处理器可以被配置为识别样本腔室的显微图像内不存在样本的区域，并使至少所识别的区域无效而不用于样本的一部分的显微分析。对于一些应用，计算机处理器被配置成通过识别样本腔室的基底表面上的湿区域和干区域之间的界面来识别这样的区域。通常，在识别这样的区域时，计算机处理器被配置成区分不存在样本的区域和存在样本且样本具有低细胞密度的区域。
对于一些应用，计算机处理器被配置成识别样本载体的外表面上污垢(例如，溢出的血液)的存在。如上文所述，通常，获取已沉降在样本载体的基底表面上的细胞单层的至少一个显微镜图像。通常，当显微镜聚焦在单层焦平面上时获取图像，其中细胞的单层设置在单层焦平面内。对于一些应用，计算机处理器通过识别在不同于单层焦平面的焦平面处实体可见的区域来识别污垢设置在样本载体的顶盖上或基底表面的下侧上。可替代地或附加地，计算机处理器识别其中(在单层焦平面处获取的)显微镜图像的背景强度指示污垢设置在顶盖上或基底表面的下侧上的区域。对于一些应用，响应于此，计算机处理器使至少所识别的区域无效而不用于样本的该部分的显微分析。
如上所述，通常，血液样本的第一部分在明场成像下被成像，即在来自一个或更多个明场光源(例如，一个或更多个明场发光二极管，其通常在各自的光谱带发射光)的照明下成像。此外，通常地，血液样本的第一部分另外在荧光成像下成像。通常，荧光成像是通过以下方式执行的：以已知激发波长(即，如果以这些波长的光激发，则已知被染色对象发射荧光的波长)将光指向样本来激发样本内的被染色对象，并检测荧光。通常，对于荧光成像，使用单独一组的一个或更多个荧光发光二极管以已知激发波长来照射样本。
对于一些应用，计算机处理器分析由明场光源发射的光，并确定明场光源的特性。例如，计算机处理器可以周期性地确定自前一次测量以来，明场光源的照明的空间分布是否已经改变(例如，自前一次测量以来，照明的空间均匀性是否已经改变或者空间位置是否已经改变)，自前一次测量以来明场光源的照明的晕影效应是否已经改变，自前一次测量以来明场光源的照明的光谱分布是否已经改变，和/或自前一次测量以来明场光源的照明的强度是否已经改变。如上所述，通常，计算机处理器通过对在血液样本的显微图像内识别的实体执行测量来确定血液样本的参数。对于一些应用，基于明场光源的所确定特性对这些测量进行归一化。对于一些应用，基于明场光源的所确定特性，使至少一些测量无效而不对血液样本执行。
对于一些应用，为了确定明场光源的特性，计算机处理器分析在没有样本载体的情况下由明场光源发射的光。可替代地或附加地，计算机处理器分析明场光源发出的通过血液样本内细胞间区域的光。
对于一些应用，计算机处理器分析由荧光光源发射的光，并确定荧光光源的特性。例如，计算机处理器可以周期性地确定荧光光源照明的空间分布自前一次测量以来是否已经改变(例如，照明的空间均匀性自前一次测量以来是否已经改变或空间位置自前一次测量以来是否已经改变)、荧光光源照明的晕影效应自前一次测量以来是否已经改变、荧光光源照明的光谱分布自前一次测量以来是否已经改变、和/或荧光光源照明的强度自前一次测量以来是否已经改变。如上所述，通常，计算机处理器通过对在血液样本的显微图像内识别的实体执行测量来确定血液样本的参数。对于一些应用，基于所确定的荧光光源的特性对这些测量进行归一化。对于一些应用，基于荧光光源的所确定特性，使至少一些测量无效而不对血液样本执行。
对于一些应用，为了确定荧光光源的特性，计算机处理器识别在由荧光光源照明下获得的显微图像内可见的除被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域，并基于所识别的荧光区域确定荧光光源的特性。例如，这种荧光区域可以包括血液样本内的细胞间区域、显微单元的一个或更多个荧光区域和/或样本载体的一个或更多个荧光区域(例如，上文描述的样本载体的压敏粘合剂)。对于一些应用，样本载体放置在显微单元内的镜台上，并且镜台包括用于执行上述测量的荧光区域。替代地或附加地，样本载体包括荧光区域(例如，荧光贴片)，用于执行上述测量。
对于一些应用，计算机处理器被配置为通过在没有任何样本载体的情况下获取显微图像并识别这样的图像中的污垢或划痕来检测显微单元的部分(诸如CCD照相机、CMOS照相机、透镜和/或用于保持样本载体的镜台)上是否有污垢或划痕。对于一些应用，周期性地(例如，以固定时间间隔)获取这样的图像，以便确定显微单元是否在显微单元的该部分上有污垢或划痕。对于一些应用，响应于检测到这样的污垢和/或划痕，这将被标记给用户。可替代地或附加地，图像内对应于存在污垢和/或划痕的位置的区域不被包括在样本的至少一些图像分析中。进一步可替代地或附加地，校准对图像内对应于存在污垢和/或划痕的位置的区域执行的测量，以便考虑到污垢和/或划痕。
对于一些应用，计算机处理器被配置为使用与前述技术大体相似的技术来检测样本载体的部分是否有污垢或划痕。例如，样本载体可以在其中没有样本的情况下成像。对于一些应用，计算机处理器被配置为例如通过在其中没有样本的情况下对样本载体进行成像来检测样本载体的部分是否不规则地发荧光。
对于一些应用，响应于检测到在至少一些荧光显微图像中存在误差，计算机处理器将误差的来源分类如下。响应于检测到误差是从给定时间点引入的，计算机处理器将染剂识别为误差的来源，因为这表明误差是由于使用新批次的染剂而引入的。响应于检测到误差随时间逐渐增加，计算机处理器将显微单元内的污垢识别为误差的来源，因为这种污垢通常导致随时间的逐渐退化。响应于检测到误差仅存在于由光源(例如，发光二极管)中的给定一个照明下获取的图像中，则计算机处理器将光源中的给定一个识别为误差的来源。
对于一些应用，光学测量单元包括显微镜，该显微镜包括显微镜台，样本载体通常放置在显微镜台上。通常，计算机处理器使用一个或更多个用于驱动机械元件移动的电机来驱动显微镜台移动。在一些情况下，存在与机械元件的移动相关联的一定程度的反冲。例如，当移动的方向被启动或逆转时，在传送到电机的计算机实现的指令和被实现的机械元件的移动之间可能存在延迟。对于一些应用，计算机处理器在执行任何移动时考虑这种影响(例如，通过假设存在给定的固定延迟，或通过周期性地测量延迟并考虑最近测量的延迟)。对于一些应用，使用显微***来量化反冲量，并且反冲量被解释为指示机械元件和/或电机的状况。例如，可以通过观察在显微镜***中产生可识别移动需要多少电机步长，和/或通过在运动的两个不同方向上重复相同的测量，以及在图像之间或在从与两个不同方向上的运动相关联的图像中提取的度量之间进行关联，来量化反冲量。对于一些应用，基于上述测量，确定机械元件和/或电机的状态。对于一些应用，响应于所确定的机械元件和/或电机的状态而生成输出。例如，可以拒绝分析样本的至少一些图像(和/或与样本有关的数据)，可以锁定显微镜和/或光学测量单元的其他部分以使它们不能使用，和/或可以生成警报(例如，可以生成指示需要维修的警报和/或指示合理的抢先维修的警报)。
对于一些应用，在镜台移动期间获取显微图像(和/或其他信号)。对于一些这样的应用，在给定时间镜台的报告位置或内插位置与在该位置的照相机或传感器采集的实际定时之间可能存在定时不匹配。这可能导致在获取给定图像(或数据)的假定位置中的误差，并且随后如果该位置用于其他目的(例如，如果该图像(或这些数据)和相应位置被用于聚焦显微镜的输入)，则可能导致额外的误差。对于一些应用，这种定时不匹配是通过例如如下使用同一目标的两个测量值来测量的。使用沿机械轴的静态采集来获取目标的第一图像(或与目标相关联的数据集)，并且使用在镜台移动期间的采集来获取目标的第二图像(或与目标相关联的数据集)。检测图像之间的差异或从图像中提取的度量之间的差异(和/或两个数据集之间的差异)，如果检测到这种差异，则计算机处理器将其用作用于确定存在定时不匹配和/或用于校正定时不匹配的输入。对于一些应用，这样的测量是周期性地进行的，并且用作用于确定光学测量***的部分(例如显微镜***的部分，包括图像获取部分、机械元件和/或电机)的状态的输入。对于一些应用，响应于检测到存在定时不匹配和/或相对先前测量的差异，生成输出。例如，可以拒绝分析样本的至少一些图像(和/或与样本有关的数据)，可以锁定显微镜和/或光学测量单元的其他部分以使它们不能使用，和/或可以生成警报(例如，可以生成指示需要维修的警报和/或指示合理的抢先维修的警报)。
对于一些应用，光学测量单元(例如，光学测量***的显微镜，和/或光学测量单元的光吸收测量部分)的状态是通过对安装在光学测量单元本身中(或常规输入到光学测量单元中)的目标进行成像来估计的。例如，可以使用划痕玻璃表面、印刷玻璃表面、一个或更多个荧光或非荧光珠、针孔或任何其他分辨率目标。对于一些应用，通过获取和分析这样目标的图像(和/或与之相关的数据)，计算机处理器导出光学测量单元的光学属性，诸如像差、分辨率、对比度、散射和衰减。对于一些应用，计算机处理器周期性地执行这样的分析，并将确定的属性与预定值进行比较。对于一些应用，响应于检测到所确定的属性中的一个或更多个与预定值之间存在差异，生成输出。例如，可以拒绝分析样本的至少一些图像(和/或与样本有关的数据)，可以锁定显微镜和/或光学测量单元的其他部分以使它们不能使用，和/或可以生成警报(例如，可以生成指示需要维修的警报和/或指示合理的抢先维修的警报)。对于一些应用，基于确定的属性，计算机处理器校正提取的图像特征、(在非成像测量的情况下)测量值和/或样本的被测物。例如，由于目标中表观对比度的变化，吸收测量值可以被校正。
对于一些应用，本文所述的样本是包括血液或其组分的样本(例如，稀释或未稀释的全血样本、主要包括红细胞的样本、或主要包括红细胞的稀释样本)，并且确定与诸如血小板、白细胞、异常白细胞、循环肿瘤细胞、红细胞、网织红细胞、Howell-Jolly体等血液中的组分有关的参数。
一般而言，应当注意，尽管已经针对血液样本描述了本发明的一些应用，但本发明的范围包括将本文描述的装置和方法应用于各种样本。对于一些应用，样本是生物样本，诸如血液、唾液、***、汗液、痰液、***分泌物、粪便、母乳、支气管肺泡灌洗、洗胃、眼泪和/或鼻涕。生物样本可以来自任何生物，并且通常来自温血动物。对于一些应用，生物样本是来自哺乳动物的样本，例如来自人体的样本。对于一些应用，样本取自任何家畜、动物园动物和农场动物，包括但不限于狗、猫、马、牛和羊。可替代地或附加地，生物样本取自作为疾病媒介的动物，包括鹿或老鼠。
对于一些应用，类似于上文所述的技术应用于非身体样本。对于一些应用，样本是环境样本，诸如水(例如地下水)样本、表面拭子、土壤样本、空气样本或其任何组合。在一些实施例中，样本是食品样本，诸如肉类样本、乳制品样本、水样、洗涤液样本、饮料样本和/或其任何组合。
本文描述的本发明的应用可以采取从计算机可用或计算机可读介质(例如，非暂时性计算机可读介质)可访问的计算机程序产品的形式，该计算机程序产品提供由计算机或任何指令执行***(诸如计算机处理器28)使用的程序代码或与计算机或任何指令执行***(例如计算机处理器28)有关的程序代码。对于本描述的目的，计算机可用或计算机可读介质可以是任何装置，其可以包括、存储、传递、传播或传输由指令执行***、装置或设备使用的或与指令执行***、装置或设备结合使用的程序。介质可以是电子、磁性、光学、电磁、红外或半导体***(或装置或设备)或传播介质。通常，计算机可用或计算机可读介质是非暂时性计算机可用或计算机可读介质。
计算机可读介质的例子包括半导体或者固态存储器、磁带、可移动计算机磁盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、硬磁盘以及光盘。光盘的当前示例包括压缩磁盘-只读存储器(CR-ROM)、压缩磁盘-读/写(CD-R/W)以及DVD。
适于存储和/或执行程序代码的数据处理***将包括通过***总线直接或间接耦合到存储器元件(例如，存储器30)的至少一个处理器(例如，计算机处理器28)。存储器元件可以包括在程序代码的实际执行期间采用的本地存储器、大容量储存器和高速缓冲存储器，其提供至少一些程序代码的临时存储，以便减少在执行期间必须从大容量储存器中检索代码的次数。该***可以读取程序储存设备上的本发明的指令，并遵循这些指令来执行本发明实施例的方法。
网络适配器可以耦合到处理器，以使处理器能够通过介入的专用或公共网络耦合到其他处理器或远程打印机或储存设备。调制解调器、线缆调制解调器以及以太网卡仅为当前可用类型的网络适配器中的几种。
用于执行本发明的操作的计算机程序代码可用一种或更多种编程语言(包括面向对象编程语言，诸如，Java、Smalltalk、C++等等，以及常规程序编程语言，诸如，“C”编程语言或类似编程语言)的任意组合编写。
将理解，本文描述的算法可以通过计算机程序指令来实现。这些计算机程序指令可被提供给通用计算机的、专用计算机的、或用于生产机器的其他可编程数据处理装置的处理器，使得经由计算机(例如，计算机处理器28)的或其他可编程数据处理装置的处理器执行的指令产生用于实现在本申请中所描述的算法中所指定的功能/行为的方式。这些计算机程序指令还可以被存储在计算机可读介质(例如，非暂时性计算机可读介质)中，其可以指导计算机或其他可编程数据处理装置以特定方式起作用，使得在计算机可读介质中储存的指令产生制品，该制品包括实现在流程块和算法中所指定的功能/行为的指令工具。计算机程序指令还可被载入到计算机或其他可编程数据处理装置，以使将在计算机或其他可编程装置上执行的一系列操作步骤产生计算机实现的过程，使得在计算机或其他可编程装置上执行的指令提供用于实施本申请中所述的算法中指定的功能/行为的过程。
计算机处理器28通常是用计算机程序指令编程以产生专用计算机的硬件设备。例如，当被编程以执行本文描述的算法时，计算机处理器28通常充当专用样本分析计算机处理器。通常，本文描述的由计算机处理器28执行的操作根据所使用的存储器的技术将存储器30的物理状态转换为具有不同的磁极性、电荷等，存储器30是真实的物理物品。
本文描述的装置和方法可以结合以下任何一个专利申请中描述的装置和方法使用，所有这些专利申请都通过引用并入本文：
Bachelet的US 2012/0169863；
Greenfield的US 2014/0347459；
Pollak的US 2015/0037806；
Pollak的US 2015/0316477；
Pollak的US 2016/0208306；
Yorav Raphael的US 2016/0246046；
Bachelet的US 2016/0279633；
Eshel的US 2018/0246313；
Yorav Raphael的WO 16/030897；
Eshel的WO 17/046799；
Eshel的WO 17/168411；
Pollack的WO 17/195205；
Zait的US 2019/0145963；和
Yorav Raphael的WO 19/097387。
本领域中的技术人员将认识到，本发明不被限制于上文所具体示出和描述的内容。更确切地，本发明的范围包括上文所描述的各种特征的组合和子组合以及本领域技术人员在阅读以上描述之后将想到的且未在现有技术中的其变型和修改。

Claims (36)

1.一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内；
获取所述血液样本的一部分的显微图像；
在所述显微图像内识别所述血液样本内给定实体的候选者；
通过对所述候选者执行进一步的分析来将所述候选者中的至少一些验证为所述给定实体；
将所述给定实体的候选者的计数与所述给定实体的经验证候选者的计数进行比较；和
至少部分地基于所述候选者的计数和所述经验证候选者的计数之间的关系，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
在所述显微图像内识别所述血液样本内给定实体的候选者包括在所述显微图像内识别所述血液样本内的血小板候选者；
通过对所述候选者执行进一步的分析来将所述候选者中的至少一些验证为所述给定实体包括：通过对所述候选者执行进一步分析来将所述血小板候选者中的至少一些验证为血小板；和
使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量包括：至少部分地基于血小板候选者的计数和经验证的血小板候选者的计数之间的关系，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
在所述显微图像内识别所述血液样本内给定实体的候选者包括在所述显微图像内识别所述血液样本内的白细胞候选者；
通过对所述候选者执行进一步的分析来将所述候选者中的至少一些验证为所述给定实体包括：通过对所述候选者执行进一步分析来将所述白细胞候选者中的至少一些验证为白细胞；和
使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量包括：至少部分地基于白细胞候选者的计数和经验证的白细胞候选者的计数之间的关系，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量包括：基于经验证候选者的计数与候选者的计数之间的比率超过最大阈值，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量包括：基于经验证候选者的计数与候选者的计数的比率小于最小阈值，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量。
6.一种方法，包括：
将血液样本的至少一部分放置在样本腔室内；
获取所述血液样本的一部分的显微图像；
在所述显微图像内识别所述血液样本内的白细胞候选者；
通过对所述白细胞候选者执行进一步的分析，将所述白细胞候选者中的至少一些验证为给定类型的白细胞；
将所述白细胞候选者的计数与被验证为所述给定类型的白细胞的白细胞候选者的计数进行比较；和
至少部分地基于所述白细胞候选者的计数与被验证为给定类型的白细胞的白细胞候选者的计数之间的关系，使所述样本的至少一部分无效而不被用于对所述样本执行至少一些测量。
7.一种方法，包括：
利用荧光染剂对血液样本的至少一部分进行染色；
通过利用以给定光谱带发射光的光源照亮所述样本的一部分，通过使用显微单元获取所述血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像，来识别所述血液样本内的被染色细胞；
识别在由所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域；和
基于所识别的荧光区域确定所述光源的特性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，基于所识别的荧光区域确定所述光源的特性包括确定所述荧光光源的照明的空间分布自前一次测量以来是否已经改变。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，基于所识别的荧光区域确定所述光源的特性包括确定所述荧光光源的照明的空间均匀性自前一次测量以来是否已经改变。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，基于所识别的荧光区域确定所述光源的特性包括确定所述荧光光源的照明的空间位置自前一次测量以来是否已经改变。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，基于所识别的荧光区域确定所述光源的特性包括确定所述荧光光源的照明的晕影效应自前一次测量以来是否已经改变。
12.根据权利要求7所述的方法，其中，基于所识别的荧光区域确定所述光源的特性包括确定所述荧光光源的照明的光谱分布自前一次测量以来是否已经改变。
13.根据权利要求7所述的方法，其中，基于所识别的荧光区域确定所述光源的特性包括确定所述荧光光源的照明的强度自前一次测量以来是否已经改变。
14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，还包括通过对所述被染色细胞执行测量和基于所述光源的所确定的特性对所述测量进行归一化来确定所述血液样本的参数。
15.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，还包括基于所述光源的所确定的特性，使对所述血液样本执行的至少一些测量无效。
16.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，识别在由所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述血液样本内的细胞间区域。
17.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，识别在由所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述显微单元的一个或更多个荧光区域。
18.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，获取所述血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像包括：当所述血液样本容纳在样本载体中时获取所述血液样本的一部分的所述多个荧光显微镜图像，并且其中识别在由所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述样本载体的一个或更多个荧光区域。
19.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，所述样本载体包括玻璃和塑料层，所述玻璃和塑料层经由发荧光的压敏粘合剂彼此耦合，并且其中识别在由所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述压敏粘合剂。
20.一种方法，包括：
利用荧光染剂对血液样本的至少一部分进行染色；
通过利用在给定光谱带发射光的光源照亮所述样本的一部分，通过获取所述血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像，来识别所述血液样本内的被染色细胞；
识别在所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域；和
基于所识别的荧光区域，使所述被染色细胞的荧光归一化。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，识别在所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述血液样本内的细胞间区域。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，识别在所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述显微单元的一个或更多个荧光区域。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，获取所述血液样本的一部分的多个荧光显微镜图像包括：当所述血液样本容纳在样本载体中时获取所述血液样本的一部分的所述多个荧光显微镜图像，并且其中识别在所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述样本载体的一个或更多个荧光区域。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，所述样本载体包括玻璃和塑料层，所述玻璃和塑料层经由发荧光的压敏粘合剂彼此耦合，并且其中识别在所述光源照明下获取的显微图像内可见的除所述被染色细胞之外的一个或更多个荧光区域包括识别所述压敏粘合剂。
25.一种方法，包括：
通过用来自明场光源的光照亮血液样本的一部分，通过获取所述血液样本的至少一部分的多个明场显微镜图像，来识别所述血液样本内的实体；
在没有血液样本的情况下分析由所述明场光源发射的光的明场区域；和
基于对光的所述明场区域的分析来确定所述明场光源的特性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，基于所识别的明场区域确定所述光源的特性包括确定所述明场光源的照明的空间分布自前一次测量以来是否已经改变。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，确定所述光源的特性包括确定所述明场光源的照明的空间均匀性自前一次测量以来是否已经改变。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，确定所述光源的特性包括确定所述明场光源的照明的空间位置自前一次测量以来是否已经改变。
29.根据权利要求25所述的方法，其中，确定所述光源的特性包括确定所述明场光源的照明的晕影效应自前一次测量以来是否已经改变。
30.根据权利要求25所述的方法，其中，确定所述光源的特性包括确定所述明场光源的照明的光谱分布自前一次测量以来是否已经改变。
31.根据权利要求25所述的方法，其中，确定所述光源的特性包括确定所述明场光源的照明的强度自前一次测量以来是否已经改变。
32.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，其中，在没有血液样本的情况下分析由所述明场光源发射的光的明场区域包括在没有所述血液样本的情况下以固定的时间间隔周期性地分析由所述明场光源发射的光的明场区域。
33.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，其中，在没有血液样本的情况下分析由所述明场光源发射的光的明场区域包括在已经使用所述明场光源对给定数量的血液样本成像之后分析由所述明场光源发射的光的明场区域。
34.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，还包括通过对所述血液样本内的实体执行测量和基于所述明场光源的所确定的特性对所述测量进行归一化来确定所述血液样本的参数。
35.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，还包括基于所述明场光源的所确定的特性，使对所述血液样本执行的至少一些测量无效。
36.一种方法，包括：
用至少一种类型的荧光染剂对各个血液样本的部分进行染色；
使用显微单元，通过用多个光源照射所述样本的一部分，获取所述各个血液样本的一部分的荧光显微图像，所述多个光源中的每一个在各自的光谱带处发射光；
检测在所述显微图像中的至少一些中存在误差；和
通过以下操作对所述误差的来源进行分类：
响应于检测到所述误差是从给定时间点引入的，将所述荧光染剂识别为所述误差的来源；
响应于检测到所述误差随时间逐渐增加，将所述显微单元内的污垢识别为所述误差的来源；和
响应于检测到所述误差仅存在于由所述光源中的给定的一个光源的照明下获取的图像中，将所述光源中的给定的一个光源识别为所述误差的来源。
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