CN114778857B - 检测非造血***肿瘤的试剂组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测非造血***肿瘤的试剂组合物及其应用。所述试剂组合物包括3组抗体，第一组抗体包括抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体；第二组抗体包括抗HLA‑ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体；第三组抗体包括抗胞浆cytokeratin抗体；其中第一组抗体、第二组抗体分别用于不同管样本，第三组抗体与第二组抗体用于同一管样本。本发明的试剂组合物可应用于流式细胞术筛查、诊断和/或随访检测非造血***肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及一种非造血***肿瘤的试剂组合物及其应用，其中所述检测包括筛查、诊断和/或随访检测，属于生物医药技术领域。
背景技术
恶性肿瘤一直是影响人类健康的重大疾患。肿瘤的早筛查、早诊断、早治疗可以大大提高完全缓解率和生存率。淋巴造血***肿瘤的诊断与随访经过多年发展，都相对成熟，尤其是近年来靶向治疗的兴起，取得了巨大成就。而对于非造血***肿瘤来说，例如恶性上皮来源的肿瘤（如肺癌、乳腺癌、胆囊癌、结肠癌、***癌、食道癌、输卵管癌、头颈部癌、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰腺癌等）、胚胎性肿瘤（神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚叶瘤（PNET）等）、软组织肿瘤和骨外肉瘤（尤文肉瘤、横纹肌肉瘤）、骨肿瘤和软骨肿瘤（骨肉瘤、软组织肉瘤）、恶性肾脏肿瘤（肾母细胞瘤、肾上腺癌、肾透明细胞癌）、恶性黑色素瘤等，长期以来，诊断主要靠影像学和肿物穿刺或者手术切除做病理，但是影像学不够灵敏，而手术是有创技术，有些肿物不便取材，有时候需要更多技术辅助明确诊断，此外手术切除以后，无法再取材随访，因此急需一种高度灵敏的相对无创的技术帮助筛查和/或诊断与随访非造血***肿瘤。
流式细胞术是使用抗原抗体结合，激光激发荧光的技术检测细胞表面和胞浆内免疫学标志，来高灵敏度、高特异性识别细胞的技术，在淋巴造血***肿瘤的诊断和随访中起到举足轻重的作用。而流式细胞术在非造血***肿瘤的诊断中的应用，仅有少量报道，主要原因是非造血***肿瘤种类繁多，受到取材和技术限制，且现有技术中对非造血***肿瘤标志物了解不够深刻，很难形成相对固定的、覆盖率广泛的、规范化的检测方案，因此长期以来没有得到广泛应用。
为解决该问题，科研人员已做过研究性的探索，包括欧洲流式联盟（euroflow）从2012年开始不断推出的方案，并于2021年发表了儿童非造血***肿瘤检测方案的文章，但是euroflow方案依然存有如下缺陷：1、主要是针对与造血***肿瘤鉴别的思路，排除不够全面，对于CD56-转移癌容易漏诊；2、该方案缺乏高覆盖率的标志物，虽然其中采用的标志物GD2、EpCAM、numyogenin/nuMyoD1相对特异，但是实际上，GD2只覆盖神经母细胞瘤和部分黑色素瘤，EpCAM只见于上皮来源肿瘤，而且并不是一个高覆盖率的标志，numyogenin/nuMyoD1仅能覆盖横纹肌肉瘤；3、该方案可能因为针对儿童肿瘤，而对于与造血***的鉴别不足：非造血***肿瘤的诊断，其中重要的是与CD45-/CD56+的和CD45-/CD56-的淋巴造血***肿瘤鉴别，而该方案中使用CD271、CD9、CD90、CD99等标志，在淋巴造血***中表达率也很高，在非造血***中反而覆盖率不高，因此鉴别力不足；而与造血***肿瘤的鉴别，使用胞浆CD3、胞膜CD3、CD4、CD8、CD19，只能覆盖B细胞肿瘤、T细胞肿瘤和原始浆样树突状细胞肿瘤，不能覆盖浆细胞肿瘤、NK肿瘤、急性巨核细胞白血病、急性红白血病，因此无法全面排除CD45-/CD56+的和CD45-/CD56-的淋巴造血***肿瘤。
经查，现有技术中未发现适用于包括成人和儿童在内的所有人群的，覆盖率高、特异性好、相关固定规范的能应用于流式细胞术筛查/诊断和随访非造血***肿瘤的技术方案。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种试剂组合物，适用于在有或者没有任何临床信息的情况下，通过高度灵敏、特异性、通用的流式细胞术检测非造血***肿瘤。
本发明的另一目的在于提供所述的试剂组合物在检测非造血***肿瘤中的应用。
本发明中，所述检测包括筛查、诊断和/或随访检测。
本发明中所述的“非造血***肿瘤”，是世界卫生组织发布的相对应于淋巴造血***肿瘤以外的，绝大对数类型的实体瘤，包括：恶性上皮来源的肿瘤（如肺癌、乳腺癌、胆囊癌、结肠癌、***癌、食道癌、输卵管癌、头颈部癌、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰腺癌等）、胚胎性肿瘤（神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚叶瘤（PNET）等）、软组织肿瘤和骨外肉瘤（尤文肉瘤、横纹肌肉瘤）、骨肿瘤和软骨肿瘤（骨肉瘤、软组织肉瘤）、恶性肾脏肿瘤（肾母细胞瘤、肾上腺癌、肾透明细胞癌）、恶性黑色素瘤等。
一方面，本发明提供了一种能用于流式细胞术检测非造血***肿瘤的试剂组合物，该试剂组合物包括第一组抗体、第二组抗体、第三组抗体，其中：
第一组抗体包括：抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体；第一组抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第一流式管中；
第二组抗体包括：抗HLA-ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体；第二组抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第二流式管中；
第三组抗体包括：抗胞浆cytokeratin（CK）抗体；第三组抗体用于加入到已加入第二组抗体且进行破膜处理后的第二流式管中。
本发明的试剂组合物，可应用于流式细胞术筛查和/或诊断与随访非造血***肿瘤，包括：恶性上皮来源的肿瘤（如肺癌、乳腺癌、胆囊癌、结肠癌、***癌、食道癌、输卵管癌、头颈部癌、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰腺癌等）、胚胎性肿瘤（神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚叶瘤（PNET）等）、软组织肿瘤和骨外肉瘤（尤文肉瘤、横纹肌肉瘤）、骨肿瘤和软骨肿瘤（骨肉瘤、软组织肉瘤）、恶性肾脏肿瘤（肾母细胞瘤、肾上腺癌、肾透明细胞癌）、恶性黑色素瘤等。既实现了高度灵敏和特异性诊断，也能够治疗后随访，形成规范化方案，可以提高效率和准确性，并为将来实现自动化、人工智能化提供方便。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物中，各抗体均为单克隆抗体。其中抗胞浆cytokeratin（CK）抗体为包括CK8单克隆抗体、CK18单克隆抗体、CK19单克隆抗体的复合物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物中，各抗体均为荧光素标记的抗体。优选地，第一组抗体中，抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体的荧光素标记顺序为FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421、V500。第二组抗体中，抗HLA-ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体的荧光素标记顺序为PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421和V500。第三组抗体中，抗胞浆cytokeratin（CK）抗体的荧光素标记为FITC。本发明中通过对不同抗体搭配特定的荧光素，可以使得本发明的抗体组合物应用于筛查和/或诊断与随访非造血***肿瘤时，各通道的所有荧光素都能达到优异的染色效果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物中，各抗体组分均可商购获得。各抗体应符合相关行业标准要求。其中抗胞浆cytokeratin（CK）抗体可选用克隆号CK3-6H5的抗胞浆cytokeratin（CK）抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体组合物中，第一组抗体为抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体按照5：5：5：3：2：3：3：3的体积比混合的混合物。第二组抗体为抗HLA-ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体按照5：5：3：2：3：3：3的体积比混合的混合物。上述各抗体的混合比例均是指各抗体在效价基本相当的情况下的混合比例。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包括多个容器，各容器分别容置本发明所述的试剂组合物的各组抗体（第一组抗体、第二组抗体、第三组抗体）。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒还可包括：溶血素、破膜剂、缓冲液、与流式细胞仪配套使用的流式管中的一种或多种。这些试剂和耗材均可商购获得。其中所述破膜剂优选为包括A液、B液的破膜剂。各试剂材料可分别容置于不同的容器中。
本发明的试剂盒可用于筛查、诊断和/或随访检测非造血***肿瘤，所述的非造血***肿瘤，是世界卫生组织发布的相对应于淋巴造血***肿瘤以外的，绝大对数类型的实体瘤，包括：恶性上皮来源的肿瘤、胚胎性肿瘤、软组织肿瘤、骨外肉瘤、硬骨肿瘤、软骨肿瘤、恶性肾脏肿瘤、恶性黑色素瘤中的一种或多种。
本发明的另一方面还提供了所述的抗体组合物在制备用于检测非造血***肿瘤的流式细胞上机样本中的应用。
根据本发明的具体实施方案，所述制备用于检测非造血***肿瘤的流式细胞上机样本的过程包括步骤：
（1）将待测样本分别加入到甲管和乙管两个流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×106/管-1×107/管；
（2）向步骤（1）处理得到的甲管中加入本发明所述的试剂组合物中的第一组抗体，向步骤（1）处理得到的乙管中加入本发明所述的试剂组合物中的第二组抗体，各流式管室温避光孵育；
（3）向步骤（2）孵育后的乙管中加入破膜剂A液，继续室温避光孵育；
（4）向步骤（2）孵育后的甲管流式管中加入1×溶血素，向步骤（3）孵育后的乙管流式管中加入1×溶血素，继续室温避光孵育；
（5）将步骤（4）孵育后的各流式管离心后去上清；
（6）向步骤（5）去上清后的乙管中加入破膜剂B液和本发明所述的试剂组合物中的第三组抗体，室温避光孵育；
（7）向步骤（5）去上清后的甲管以及步骤（6）孵育后的乙管流式管中，分别加入PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用PBS缓冲液重悬细胞，即得到流式细胞上机样本。
本发明中，对操作步骤的描述，除非特别注明或是从上下文的表述能明显确定存在先后关系的之外，描述的先后顺序并不用于限定这些步骤实际操作的先后顺序。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述待测样本可为骨髓或外周血，也可以为组织样本、体液样本等所有能制备出单个活细胞，适用于流式细胞术检测的样本。
根据本发明的具体实施方案，步骤（1）中，每管样本加入量体积不超过160μl（如果患者外周血细胞量少，根据需要可先加入体积超过160μl，离心去上清浓缩）。
根据本发明的具体实施方案，各试剂的用量可参照本领域现有技术的常规用量或是按照商家的推荐剂量。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂组合物，第一组抗体的加入量为15-58μl/管，第二组抗体的加入量为12-48μl/管，第三组抗体的加入量为3-10μl/管。
根据本发明的具体实施方案，每次PBS的加入量为2-3ml/管，所述离心条件可为1000-2000rpm（或300-450g）离心5分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（2）孵育时间可为10-30分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（3）中，孵育时间可为5-20分钟。破膜剂A液的加入量按照商家的推荐剂量即可，通常为100μl/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（4）中，孵育时间可为5-30分钟。1×溶血素的加入量为2-3ml/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（6）中，通常需孵育10-30分钟左右。所述离心条件可为1000-2000rpm（或300-450g）离心5分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（6）中，破膜剂B液的加入量按照商家的推荐剂量即可，通常为50μl/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（7）中，洗涤用PBS缓冲液的加入量为2-3ml/管。所述离心条件可为1000-2000rpm（或300-450g）离心5分钟。重悬用PBS缓冲液的加入量为0.5-1ml/管。
根据本发明的具体实施方案，重悬细胞进行流式细胞上机检测时，甲管样本选择CD45组合SSC设门，CD56、GD2和CD36分别组合CD45设门；乙管样本选择CD45组合SSC设门，CD56、cytokeratin和CD36分别组合CD45设门；筛选CD45-/CD56+或者CD45-/GD2+或者CD45-/cytokeratin+或者CD45-/CD56-/GD2-/cytokeratin-/CD36-和/或HLA-ABC-细胞（注意排除浆细胞肿瘤、急性B淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血病以及少数罕见其他CD45阴性淋巴造血***肿瘤，以及防止漏掉CD45-/CD56-/GD2-/cytokeratin-非造血***肿瘤），进行分析。
另一方面，本发明还提供了一种检测非造血***肿瘤的装置，所述检测包括筛查、诊断和/或随访检测，所述装置包括检测单元和分析单元，其中：
所述检测单元包括用于通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的试剂材料，用于获得样本的检测结果；所述试剂材料包括本发明所述的试剂组合物；
所述分析单元用于分析检测单元的检测结果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测非造血***肿瘤的装置中，所述检测单元的应用过程包括：利用本发明所述的抗体组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样本；进行流式细胞上机检测。所述分析单元的分析过程包括：对检测结果进行分析，以判别（包括辅助判别）非造血***肿瘤，即世界卫生组织发布的相对应于淋巴造血***肿瘤以外的，绝大对数类型的实体瘤，包括：恶性上皮来源的肿瘤（如肺癌、乳腺癌、胆囊癌、结肠癌、***癌、食道癌、输卵管癌、头颈部癌、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰腺癌等）、胚胎性肿瘤（神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚叶瘤（PNET）等）、软组织肿瘤和骨外肉瘤（尤文肉瘤、横纹肌肉瘤）、骨肿瘤和软骨肿瘤（骨肉瘤、软组织肉瘤）、恶性肾脏肿瘤（肾母细胞瘤、肾上腺癌、肾透明细胞癌）、恶性黑色素瘤等。
根据本发明的具体实施方案，本发明的装置用于检测非造血***肿瘤时，其中，通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：
利用本发明所述的试剂组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样本；
进行流式细胞上机检测。
根据本发明的具体实施方案，本发明的装置用于检测非造血***肿瘤时，其中，各流式管的设门分析可按照以下操作进行：
其中流式细胞上机检测时甲管按照以下方式设门：设置去黏连细胞门P1，P1内设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内，使用CD45/CD56抗体设NH1门检测CD45-/CD56+细胞，使用CD45/GD2抗体设NH2门检测CD45-/GD2+细胞；显示NH1门和NH2门内细胞CD3/CD4/CD36/CD9/CD81的表达情况；优选地，进一步，P2门内，使用CD45/CD36设NH3门检测CD45-/CD36-细胞；显示NH3门内细胞CD9/GD2/CD56/CD81的表达情况；
其中流式细胞上机检测时乙管按照以下方式设门：设置去黏连细胞门P1，P1内设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内，使用CD45/CD56抗体设NH4门检测CD45-/CD56+细胞，使用CD45/胞浆cytokeratin抗体设NH5门检测CD45-/cytokeratin+细胞；显示NH4门和NH5门内细胞HLA-ABC/CD38/CD19/CD36/CD7的表达情况；优选地，进一步，P2门内，使用CD45/CD36设NH6门检测CD45-/CD36-细胞；显示NH6门内细胞cytokeratin/HLA-ABC/CD38/CD56的表达情况。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的装置用于检测非造血***肿瘤时，其中流式细胞上机检测时甲管按照以下方式设门：使用FSC-A/H设置去黏连细胞门P1，P1门内使用FSC/SSC设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门（包括嗜酸性粒细胞）；P2门内，使用CD45/CD56抗体设NH1门检测CD45-/CD56+细胞，该设门可以筛查出绝大对数（文献报道为90%以上，本发明的统计数字为96.65%）非造血***肿瘤，使用CD45/GD2抗体设NH2门检测CD45-/GD2+细胞，主要见于神经母细胞瘤和大多数黑色素瘤，其他骨和软组织肿瘤、小细胞肺癌、脑瘤也有不同程度的表达；P2门内，使用CD45/CD36设NH3门确定是否存在CD45-/CD36-细胞。显示NH1门和NH2门内细胞CD3/CD4/CD36/CD9/CD81的表达情况，排除CD3+T细胞，CD4+T细胞、CD4dim的单核或原始浆样树突状细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，并且绝大对数神经母细胞瘤等非造血***肿瘤表达CD81和/或CD9；显示NH3门内细胞CD9/GD2/CD56/CD81的表达情况，防止漏掉CD45-/GD2-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，这些肿瘤绝大对数会表达CD81+和/或CD9+。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的装置用于检测非造血***肿瘤时，其中流式细胞上机检测时乙管按照以下方式设门：使用FSC-A/H设置去黏连细胞门P1，P1门内使用FSC/SSC设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内，使用CD45/CD56抗体设NH4门检测CD45-/CD56+细胞，该设门可以筛查出绝大对数非造血***肿瘤，使用CD45/胞浆cytokeratin抗体设NH5门检测CD45-/cytokeratin+细胞，主要见于上皮来源肿瘤细胞（本发明的细胞系研究和临床样本检测，上皮来源肿瘤细胞中，CD45-/cytokeratin+阳性率为94.59%）；P2门内，使用CD45/CD36设NH6门确定是否存在CD45-/CD36-细胞。显示NH4门和NH5门内细胞HLA-ABC/CD38/CD19/CD36/CD7的表达情况，排除CD38阳性的良恶性浆细胞、各种急性白血病细胞等，CD19+B细胞和/或浆细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，CD7+T细胞、NK细胞和其他异常表达CD7的树突状细胞肿瘤和急性髓系白血病等，这些肿瘤几乎均表达HLA-ABC，本发明的统计数据为99%以上。显示NH6门内细胞cytokeratin/HLA-ABC/CD38/CD56的表达情况，防止漏掉CD45-/cytokeratin-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，这些肿瘤绝大多数会出现CD38-/HLA-ABC-（本发明的实验统计显示CD38-为95.40%，HLA-ABC-为93.10%）非造血***肿瘤。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测非造血***肿瘤的装置中，所述分析单元还可包括根据设门分析检测结果进一步判断疾病的模块（本发明所述的判断包括筛查、提示、辅助诊断、诊断、随访微小残留病变）。本发明通过在多标志组合设门内，将所显示的各群细胞与相应的正常细胞进行比较，找出肿瘤细胞，排除淋巴造血***肿瘤和非特异性染色，确定非造血***肿瘤性质，并进行常见亚型的区分。
具体而言，本发明可用于高度灵敏、特异性、统一性地筛查和/或诊断与随访几乎所有非造血***肿瘤。此处非造血***肿瘤，指世界卫生组织发布的相对应于淋巴造血***肿瘤以外的，绝大对数类型的实体瘤，包括：恶性上皮来源的肿瘤（如肺癌、乳腺癌、胆囊癌、结肠癌、***癌、食道癌、输卵管癌、头颈部癌、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰腺癌等）、胚胎性肿瘤（神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚叶瘤（PNET）等）、软组织肿瘤和骨外肉瘤（尤文肉瘤、横纹肌肉瘤）、骨肿瘤和软骨肿瘤（骨肉瘤、软组织肉瘤）、恶性肾脏肿瘤（肾母细胞瘤、肾上腺癌、肾透明细胞癌）、恶性黑色素瘤等。
根据本发明的具体实施方案，本发明在对两管样本进行分析时，其中每管通用的CD45/SSC用于初步筛查正常样本中常见的各群细胞（成熟淋巴细胞、单核细胞、分化阶段粒细胞、有核红细胞）比例是否正常，是否存在有高比例肿瘤细胞，进一步结合每管的其他标志进行判断。具体而言，各类疾病的判断可以按照以下方式进行：
（1）肿瘤细胞的识别：正常样本每管的CD45/SSC设门图片都主要由淋巴细胞门(lym)、单核细胞门（mono）、粒细胞门（gra）、有核红细胞门（NRBC）组成，像问号一样包绕CD45dim/SSC小的区域（原始细胞孔）。正常骨髓中不存在CD45-/CD56+和/或GD2+、CD45-/CD56+和/或cytokeratin+），以及CD45-/CD56-/GD2-/cytokeratin-/CD36-/HLA-ABC-细胞，此时进一步根据所出现的情况做下述判断：
①排除淋巴造血***肿瘤：在鉴别（区分）淋巴造血***与非造血***肿瘤中，GD2和cytokeratin特异性几乎达到99%以上，因此主要是GD2和cytokeratin均阴性的情况下，CD45-/CD56+或者CD45-/CD56-淋巴造血***肿瘤的鉴别，主要见于急性B淋巴细胞白血病和浆细胞肿瘤，罕见的情况下有急性巨核细胞白血病、急性红白血病、原始浆样树突状细胞肿瘤，以及其他淋巴造血***肿瘤。急性B淋巴细胞白血病98%表达CD19，90%以上表达CD38，几乎100%表达HLA-ABC；浆细胞肿瘤100%表达CD38，95%以上表达HLA-ABC；急性巨核细胞白血病发病率极低，并且几乎100%表达HLA-ABC，90%以上表达CD38，80%以上表达CD36，60%表达CD4；急性红白血病发病率极低，95%以上表达CD36和CD38；原始浆样树突状细胞肿瘤100%表达CD4，其他罕见淋巴造血***肿瘤95%以上表达HLA-ABC，90%以上表达CD38，而非造血***肿瘤绝大多数不表达这几个标志，本发明中CD3/CD4/CD19/CD36/CD38/HLA-ABC组合基本可以排除CD45-/CD56+或者CD45-/CD56-淋巴造血***肿瘤。
②排除非特异性染色：检测比例低的情况下，可能会出现假阳性，因此出现CD45-/CD56+和/或GD2+、CD45-/CD56+和/或cytokeratin+，以及CD45-/CD56-/GD2-/cytokeratin-/CD36-/HLA-ABC-细胞，怀疑非造血***肿瘤时，尤其是肿瘤细胞不表达CD56、GD2和cytokeratin时，使用CD9和CD81进一步确定。非特异性染色很多时候由血小板、有核红细胞细胞以及死细胞造成，这些假阳性细胞绝大多数会表达CD36，本发明中使用CD9/CD81/CD36组合可以高效排除非特异性染色。
③防止漏诊：因为非造血***肿瘤种类繁多，来源复杂，免疫表型的异质性很大，因此需要注意防止漏掉CD45-/CD56-/GD2-/cytokeratin-肿瘤，本发明中使用CD36和/或HLA-ABC结合CD45设门，如果出现CD45-/CD56-/GD2-/cytokeratin-/CD36-/HLA-ABC-细胞，即高度怀疑非造血***肿瘤。
④进一步亚型判断：非造血***肿瘤主要分为神经肌肉来源和上皮来源，神经肌肉来源95%以上表达CD56，不表达cytokeratin，其中神经母细胞瘤是最常见的非造血***肿瘤，表达GD2、CD9、CD81，其中GD2特异性相对较高，CD9和CD81特异性差，见于很多淋巴造血***细胞和非造血细胞；上皮来源非造血***肿瘤90%以上表达cytokeratin，CD56表达率55-78%，但是需要注意的是，cytokeratin是一个20多个亚单位组成的大家族，不同种类的上皮来源肿瘤表达不同的亚单位，本发明中选择包括CK8、CK18、CK19单克隆抗体的cytokeratin抗体复合物，覆盖率可高达94.59%。进一步亚型的确定，鉴于同一起源的非造血***肿瘤免疫表型相似，需要结合临床发病部位确定。但是流式细胞术的主要任务是筛查（找到肿瘤），诊断（排除其他可能性，包括辅助诊断），以及治疗后随访时的检测。同一大类不同亚型的肿瘤治疗相似，因此本发明的方案能够满足临床需要。
综上所述，本发明提供了筛查和/或诊断与随访非造血***肿瘤的试剂组合物及其应用。本发明优势在于：（1）基于对大量淋巴造血***肿瘤、非造血***肿瘤、正常细胞等的认识，设计了一套覆盖非常全面的、高度灵敏和特异的、实用性极强的方案，最大程度降低了漏诊率。（2）在应用方面，总所周知非造血***肿瘤现有诊断技术最难的就是随访，即微小残留病变检测，本方案使用复杂的多种标志组合设门，除了防止漏诊以外，还有助于治疗后随访，有非常重大的意义。（3）本发明采取覆盖率极广的筛查/诊断与随访方案，方案固定后可以预混抗体，增强了规范化，减少室间差异，可以实现商品化，提高了工作效率和精确诊断率，具有极大的社会意义。（4）方案规范化普适化后，可以促进样本处理、机器获取、数据分析的流水线工作，实现自动化，为将来人工智能的发展创造了条件。（5）流式细胞术进入临床诊断虽然有三四十年时间，但是非造血***肿瘤这个发病率最高、对人类危害最大的肿瘤，却极少涉及，更没有一个适用于所有人群的高度有效的规范化检测方案。故本发明是目前社会急需、临床工作急需的，非常适合广泛应用推广的筛查/诊断与随访非造血***肿瘤的检测和分析方案。（6）本发明中每管各有侧重点，每管都有诊断和鉴别诊断指标，从客观上做到了：①诊断与鉴别诊断同步进行；②极低比例时候排除非特异性染色造成假阳性；③防止漏掉GD2、cytokeratin和CD56均阴性的非造血***肿瘤；④因为涉及众多淋巴造血和非造血肿瘤的鉴别，因此首次提出将HLA-ABC和CD36、CD38这些主要见于淋巴造血***肿瘤（包括CD45阴性的淋巴造血细胞）的标志，用于非造血***肿瘤的诊断与鉴别诊断。
附图说明
图1-图2显示本发明一具体实施方案中正常骨髓样本流式细胞术设门分析结果。
图3-图4显示本发明一具体实施方案中神经母细胞瘤的骨髓样本流式细胞术设门分析结果。
图5-图6显示本发明一具体实施方案中上皮来源肿瘤（肺癌）的骨髓样本流式细胞术设门分析结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1 试剂的配制
本实施例使用的抗体组合为，
第一组抗体组分为：抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体，各抗体的荧光素标记顺序为FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421、V500；取以上八种单克隆抗体试剂按体积比5：5：5：3：2：3：3：3的体积比混合装于第一容器中；
第二组抗体组分为：抗HLA-ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体，各抗体的荧光素标记顺序为PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421和V500；以上七种单克隆抗体试剂按照5：5：3：2：3：3：3的体积比混合，装于第二容器中；
第三组抗体组分为：抗胞浆cytokeratin（CK）抗体，荧光素标记为FITC，装于第三容器中。
本实施例中的各抗体为可商购获得，其中，抗胞浆cytokeratin（CK）抗体为德国美天旎公司产品（克隆号CK3-6H5），其是主要由CK8、CK18、CK19单克隆抗体组成的复合物，其余各荧光素直接标记抗体均为美国Becton Dickinson公司产品。
任选再配溶血素装于第四容器中，破膜剂A液装于第五容器中，破膜剂B液装于第六容器中，PBS缓冲液装于第七容器中，溶血素、破膜剂、PBS缓冲液为可商购获得，其中，细胞裂解液、破膜剂均为美国Becton Dickinson公司产品，PBS缓冲液为Beckman Coulter公司产品。
实施例2 样本的处理
采用实施例1的各组抗体对样本进行处理：
按照细胞计数结果，将样本加入到流式管甲管中，保证加入的细胞量约为2×106个，再按表1向流式管中加入29μl不同荧光素标记的八种胞膜单克隆抗体试剂，与细胞悬液充分混匀后常温避光孵育15分钟，加入3ml 1×溶血素，避光孵育10分钟裂解红细胞，1500rpm离心5分钟去上清后，加入3ml PBS混匀，1500rpm离心5分钟去上清后，加入0.5mlPBS缓冲液重悬细胞，即为处理好的样本，可供上机检测。
按照细胞计数结果，将样本加入到流式管乙管中，保证加入的细胞量约为2×106个，再按表1向流式管中加入24μl不同荧光素标记的七种胞膜单克隆抗体试剂，与细胞悬液充分混匀后常温避光孵育15分钟，加入100μl破膜剂A液，室温避光孵育5分钟，加入3ml 1×溶血素混匀，避光孵育10分钟裂解红细胞，1500rpm离心5分钟去上清后加入50μl破膜剂B液和5μl胞浆单克隆抗体试剂cytokeratin（CK）-FITC，室温避光孵育15分钟，最后加入3mlPBS缓冲液混匀，1500rpm离心5分钟后去上清，用0.5ml PBS缓冲液重悬细胞，即为处理好的样本，可供上机检测。
实施例3 样本的检测
将按照实施例2的方法处理好的样本，在美国Becton Dickinson公司3激光10色FACS Canto plus流式细胞仪上机检测，优选获取每管100万细胞（建议至少30万）后，使用diva 2.8软件或者kaluza等其他软件分析数据。
其中，流式细胞上机检测时按照以下方式设门：
①固定设门：依次进行去除黏连细胞门、活细胞门、血细胞门；②多标志组合设门：从单个活细胞开始进行，为了防止漏掉肿瘤细胞，所有细胞的设门和界定，都需要与血细胞门在并列条件下进行；③在多标志组合设门内，出现正常不存在的细胞，找出肿瘤细胞；④排除其他CD45阴性、CD56阳性或者阴性的淋巴造血***肿瘤，以及其他可能非特异性染色，做出诊断；⑤并根据GD2和cytokeratin的表达进行常见亚型区分。
1. 固定设门：由去黏连细胞门、活细胞门、血细胞门组成。呈串联关系。
去黏连细胞门：首先使用前向角光散射（Forward scatter，FSC）的面积（area，A）和高度（height，H）设置去黏连细胞门（常用P1表示），通过FSC-面积（Area，A）/高度（Height，H）可以去除黏连细胞，原理是细胞是球形，A与H成正相关。（见图1-图6的第一张小图）。
活细胞门：P1内细胞，使用FSC/侧向角光散射（side scatter，SSC）设置活细胞门（常用P2表示），得到单个活细胞。FSC/SSC原理是活细胞大小和颗粒性呈近正态分布，围绕一个中心聚集成团，与死细胞、凋亡细胞、碎片及背景噪音有明显界限（见图1-图6的第二张小图）。
血细胞门：单个活细胞门（P2门）内常规首先使用CD45/SSC设置各血细胞门，大致观察淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、有核红细胞，以及是否存在明显的肿瘤细胞或者异常细胞。通过CD45/SSC将各群血细胞进行大致区分，原理是根据造血细胞CD45表达荧光强度不同（成熟淋巴细胞＞单核细胞＞粒细胞＞有核红细胞），SSC大小差异（嗜酸性粒细胞>粒细胞＞单核细胞＞成熟淋巴细胞＞有核红细胞）（见图1-图6的第三张小图）。目的是防止在误诊或者肿瘤演化之后，漏掉大的肿瘤细胞群，以及设定内对照。
2.多标志组合设门初步锁定可疑细胞：与CD45/SSC设门同步进行，从单个活细胞（P2）开始。甲管使用CD45/CD56抗体设NH1门检测CD45-/CD56+细胞，该设门可以筛查出绝大对数（本发明的统计数字为96.65%）非造血***肿瘤；使用CD45/GD2抗体设NH2门检测CD45-/GD2+细胞，主要见于神经母细胞瘤和大多数黑色素瘤，其他骨和软组织肿瘤、小细胞肺癌、脑瘤也有不同程度的表达。P2门内，乙管使用CD45/CD56抗体设NH4门检测CD45-/CD56+细胞，该设门可以筛查出绝大对数非造血***肿瘤；使用CD45/胞浆cytokeratin抗体设NH5门检测CD45-/cytokeratin+细胞，主要见于上皮来源肿瘤细胞（本发明的细胞系研究和临床样本检测，上皮来源肿瘤细胞中，CD45-/cytokeratin+阳性率为94.59%）；
3.P2门内进一步使用淋巴造血细胞通用标志防止漏诊：P2门内，甲管和乙管使用CD45/CD36分别设NH3门（甲管）和NH6门（乙管）确定是否存在CD45-/CD36-细胞；显示NH3门内细胞CD9/GD2/CD56/CD81（甲管）和NH6门内cytokeratin/HLA-ABC/CD38/CD56（乙管）的表达情况，防止漏掉CD45-/GD2-/CD56-/cytokeratin-非造血***肿瘤细胞，这些肿瘤绝大对数会出现CD81+和/或CD9+，并且HLA-ABC-/CD38-/CD36-。
4.进一步排除CD45阴性淋巴造血***肿瘤细胞，并做亚型诊断：甲管显示NH1门和NH2门内细胞CD3/CD4/CD36/CD9/CD81的表达情况，排除以下细胞：CD3+T细胞，CD4+T细胞、CD4dim的单核或原始浆样树突状细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞；乙管显示NH4门和NH5门内细胞HLA-ABC/CD38/CD19/CD36/CD7的表达情况，排除CD38阳性的良恶性浆细胞、各种急性白血病细胞等，CD19+B细胞和/或浆细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，CD7+T细胞、NK细胞和其他异常表达CD7的树突状细胞肿瘤和急性髓系白血病等，这些淋巴造血***细胞除了有核红细胞几乎均表达HLA-ABC，本发明的实验数据显示为99%以上，有核红细胞95%以上表达CD36；根据甲管GD2表达、乙管cytokeratin表达，对非造血***肿瘤做出亚型判断：GD2主要见于神经母细胞瘤，以及部分黑色素瘤和其他胚胎肿瘤，cytokeratin主要见于上皮来源的非造血***肿瘤。
本发明通过在多标志组合设门内，将所显示的各群细胞与相应的正常细胞进行比较，找出肿瘤细胞，排除淋巴造血***肿瘤，确定非造血***肿瘤性质。
简而言之，本发明在多标志组合设门内，尽可能覆盖各年龄段的常见与罕见非造血***肿瘤，并找到了淋巴造血***肿瘤通用标志，巧妙地通过这些标志排除淋巴造血***肿瘤和非特异性染色，并防止漏诊不表达GD2和cytokeratin的非造血***肿瘤，此处的非造血***肿瘤，指世界卫生组织发布的相对应于淋巴造血***肿瘤以外的，绝大对数类型的实体瘤，包括：恶性上皮来源的肿瘤（如肺癌、乳腺癌、胆囊癌、结肠癌、***癌、食道癌、输卵管癌、头颈部癌、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰腺癌等）、胚胎性肿瘤（神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚叶瘤（PNET）等）、软组织肿瘤和骨外肉瘤（尤文肉瘤、横纹肌肉瘤）、骨肿瘤和软骨肿瘤（骨肉瘤、软组织肉瘤）、恶性肾脏肿瘤（肾母细胞瘤、肾上腺癌、肾透明细胞癌）、恶性黑色素瘤等。
具体而言，图1-图2：同一病例的正常骨髓样本，2管共同分析。
具体而言，图1显示正常骨髓样本甲管分析。依次设置：①FSC-A/H设置P1为去黏连细胞门，得到P1内为单个细胞；②在P1内显示FSC/SSC设置P2为活细胞门，得到P2内为单个活细胞；③P2门内使用CD45/SSC设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞（Gra）、单核细胞（mono）、有核红细胞（NRBC）、嗜酸性粒细胞门（eo）；④P2门内使用CD45/CD56设NH1门，筛查CD45-/CD56+肿瘤细胞，该正常样本无；⑤使用CD45/GD2抗体设NH2门检测CD45-/GD2+细胞，该正常样本无；⑥P2门内，使用CD45/CD36设NH3门确定是否存在CD45-/CD36-细胞，该正常样本无；⑦显示NH1门和NH2门内细胞CD3/CD4/CD36/CD9/CD81的表达情况，排除CD3+T细胞，CD4+T细胞、CD4dim的单核或原始浆样树突状细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，该正常样本无；⑧显示NH3门内细胞CD9/GD2/CD56/CD81的表达情况，防止漏掉CD45-/GD2-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，这些肿瘤绝大对数会出现CD81+和/或CD9+，该正常样本无。
具体而言，图2显示正常骨髓样本，乙管分析（图中cytokeratin使用缩写CK）。依次设置：①FSC-A/H设置P1为去黏连细胞门，得到P1内为单个细胞；②在P1内显示FSC/SSC设置P2为活细胞门，得到P2内为单个活细胞；③P2门内使用CD45/SSC设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞（Gra）、单核细胞（mono）、有核红细胞（NRBC）、嗜酸性粒细胞门（eo）；④P2门内使用CD45/CD56抗体设NH4门检测CD45-/CD56+细胞，该正常样本无；⑤P2门内使用CD45/胞浆cytokeratin抗体设NH5门检测CD45-/cytokeratin+细胞，该正常样本无；⑥P2门内，使用CD45/CD36设NH6门确定是否存在CD45-/CD36-细胞，该正常样本无；⑦显示NH4门和NH5门内细胞HLA-ABC/CD38/CD19/CD36/CD7的表达情况，排除CD38阳性的良恶性浆细胞、各种急性白血病细胞等；CD19+B细胞和/或浆细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，CD7+T细胞、NK细胞和其他异常表达CD7的树突状细胞肿瘤和急性髓系白血病等，该正常样本无；⑧显示NH6门内细胞cytokeratin/HLA-ABC/CD38/CD56的表达情况，防止漏掉CD45-/cytokeratin-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，该正常样本无。
具体而言，图3-图4为同一神经母细胞瘤患者骨髓样本甲、乙管免疫分型。
具体而言，图3显示神经母细胞瘤患者骨髓样本甲管分析。依次设置：依次设置：①FSC-A/H设置P1为去黏连细胞门，得到P1内为单个细胞；②在P1内显示FSC/SSC设置P2为活细胞门，得到P2内为单个活细胞；③P2门内使用CD45/SSC设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞（Gra）、单核细胞（mono）、有核红细胞（NRBC）、嗜酸性粒细胞门（eo）；④P2门内使用CD45/CD56设NH1门，筛查CD45-/CD56+肿瘤细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）表达CD45-/CD56+；⑤使用CD45/GD2抗体设NH2门检测CD45-/GD2+细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）表达CD45-/GD2+；⑥P2门内，使用CD45/CD36设NH3门确定是否存在CD45-/CD36-细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）为CD45-/CD36-；⑦显示NH1门和NH2门内细胞CD3/CD4/CD36/CD9/CD81的表达情况，排除CD3+T细胞，CD4+T细胞、CD4dim的单核或原始浆样树突状细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达CD3、CD4、CD36，表达CD9、CD81；⑧显示NH3门内细胞CD9/GD2/CD56/CD81的表达情况，防止漏掉CD45-/GD2-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达CD3、CD4、CD36、CD45，表达CD9、CD81、GD2、CD56，为非造血***肿瘤细胞，神经母细胞瘤可能性大，结合临床及其他实验室检测明确诊断。
具体而言，图4显示与图3同一神经母细胞瘤骨髓样本，乙管分析（图中cytokeratin使用缩写CK）。依次设置：①FSC-A/H设置P1为去黏连细胞门，得到P1内为单个细胞；②在P1内显示FSC/SSC设置P2为活细胞门，得到P2内为单个活细胞；③P2门内使用CD45/SSC设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞（Gra）、单核细胞（mono）、有核红细胞（NRBC）、嗜酸性粒细胞门（eo）；④P2门内使用CD45/CD56抗体设NH4门检测CD45-/CD56+细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）表达CD45-/CD56+；⑤P2门内使用CD45/胞浆cytokeratin抗体设NH5门检测CD45-/cytokeratin+细胞，该样本无；⑥P2门内，使用CD45/CD36设NH6门确定是否存在CD45-/CD36-细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）为CD45-/CD36-；⑦显示NH4门和NH5门内细胞HLA-ABC/CD38/CD19/CD36/CD7的表达情况，排除CD38阳性的良恶性浆细胞、各种急性白血病细胞等；CD19+B细胞和/或浆细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，CD7+T细胞、NK细胞和其他异常表达CD7的树突状细胞肿瘤和急性髓系白血病等，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达HLA-ABC、CD38、CD19、CD36、CD7；⑧显示NH6门内细胞cytokeratin/HLA-ABC/CD38/CD56的表达情况，防止漏掉CD45-/cytokeratin-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，该样本可见13.2%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达cytokeratin、HLA-ABC、CD38、CD19、CD36、CD7、CD45，表达CD56，为非造血***肿瘤细胞，神经母细胞瘤可能性大，结合临床及其他实验室检测明确诊断。
具体而言，图5-图6为同一上皮来源非造血***肿瘤（肺癌）患者骨髓样本甲、乙管免疫分型。
具体而言，图5显示上皮来源非造血***肿瘤（肺癌）患者骨髓样本甲管分析。依次设置：依次设置：①FSC-A/H设置P1为去黏连细胞门，得到P1内为单个细胞；②在P1内显示FSC/SSC设置P2为活细胞门，得到P2内为单个活细胞；③P2门内使用CD45/SSC设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞（Gra）、单核细胞（mono）、有核红细胞（NRBC）、嗜酸性粒细胞门（eo）；④P2门内使用CD45/CD56设NH1门，筛查CD45-/CD56+肿瘤细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）表达CD45-/CD56+；⑤使用CD45/GD2抗体设NH2门检测CD45-/GD2+细胞，该样本无；⑥P2门内，使用CD45/CD36设NH3门确定是否存在CD45-/CD36-细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）为CD45-/CD36-；⑦显示NH1门和NH2门内细胞CD3/CD4/CD36/CD9/CD81的表达情况，排除CD3+T细胞，CD4+T细胞、CD4dim的单核或原始浆样树突状细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达CD3、CD4、CD36，表达CD9、CD81；⑧显示NH3门内细胞CD9/GD2/CD56/CD81的表达情况，防止漏掉CD45-/GD2-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达CD3、CD4、CD36、GD2、CD45，表达CD9、CD81、CD56，为非造血***肿瘤细胞。
具体而言，图6显示与图5同一上皮来源非造血***肿瘤（肺癌）骨髓样本，乙管分析（图中cytokeratin使用缩写CK）。依次设置：①FSC-A/H设置P1为去黏连细胞门，得到P1内为单个细胞；②在P1内显示FSC/SSC设置P2为活细胞门，得到P2内为单个活细胞；③P2门内使用CD45/SSC设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞（Gra）、单核细胞（mono）、有核红细胞（NRBC）、嗜酸性粒细胞门（eo）；④P2门内使用CD45/CD56抗体设NH4门检测CD45-/CD56+细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）表达CD45-/CD56+；⑤P2门内使用CD45/胞浆cytokeratin抗体设NH5门检测CD45-/cytokeratin+细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）表达CD45-/cytokeratin+；⑥P2门内，使用CD45/CD36设NH6门确定是否存在CD45-/CD36-细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）为CD45-/CD36-；⑦显示NH4门和NH5门内细胞HLA-ABC/CD38/CD19/CD36/CD7的表达情况，排除CD38阳性的良恶性浆细胞、各种急性白血病细胞等；CD19+B细胞和/或浆细胞，CD36+有核红细胞、巨核细胞和单核细胞，CD7+T细胞、NK细胞和其他异常表达CD7的树突状细胞肿瘤和急性髓系白血病等，该样本94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达HLA-ABC、CD38、CD19、CD36、CD7；⑧显示NH6门内细胞cytokeratin/HLA-ABC/CD38/CD56的表达情况，防止漏掉CD45-/cytokeratin-/CD56-/CD36-非造血***肿瘤细胞，该样本可见94.10%细胞（占有核细胞，深灰色细胞群）不表达HLA-ABC、CD38、CD19、CD36、CD7、CD45，表达cytokeratin、CD56，为非造血***肿瘤细胞，上皮来源可能性大，结合临床病史考虑肺癌骨髓累及。
本方案的研发历程和利用本实施例的方法进行临床验证：河北燕达陆道培医院从2008年开展这项工作，到2022年3月31日为止做了858份样本检测，来自850人：男性476人，女性374人，中位年龄4岁（0-80岁），≤14岁792人，>14岁58人。858份样本中：骨髓样本617份，外周血样本3份，脑脊液样本196份，胸腹水9份，***切除样本3份，各种组织穿刺物30份。其中阳性结果575份，阴性结果283份，与其他实验室检查及临床诊断符合率90%以上。
对575份阳性样本的检测结果进行分析，其中8份为不同时间点随访样本，选择最高比例的一次进行分析，因此共分析来自567人的567份样本，男性319人，女性248人，中位年龄4岁（0-80岁），肿瘤细胞比例中位数为0.16%（0.01%-96.23%），骨髓样本442份，外周血2份，脑脊液84份，胸腹水样本9份，***切除样本2份，各种组织穿刺物28份。覆盖WHO诊断标准中涉及的几乎全部肿瘤类型（见表2）。
567例样本的免疫表型分析（表3）：主要的表型是CD45阴性（100%）、CD56阳性（96.65%）、CD36阴性（100%）、HLA-ABC阴性（93.10%）、CD81阳性（98.52%）、CD38阴性（95.40%），CD9和CD99灵敏度相对较差，分别为75%和58.86%。其他特异性淋巴造血***标志CD4、CD3、CD19、CD7的表达率均为零。CD45-/CD56+覆盖率高达96.65%，其中CD56阴性病例主要见于上皮来源肿瘤细胞，而该类型cytokeratin（CK）表达率高达94.59%，神经母细胞瘤中GD2表达率为93.21%，但是对于亚型区分的特异性相对较差，在其他亚型中阳性率76.7%。
为了进一步分析这些标志在淋巴造血***中的表达情况，另外选择72例非肿瘤骨髓样本进行了上述标志的检测，无一出现CD45-/CD56+或者GD2+或者cytokeratin+或者CD45-/CD56-/GD2-/cytokeratin-/CD36-/HLA-ABC-细胞。
与现有技术的研究相比，本发明的一个重要突破点是根据非造血***肿瘤诊断种类繁多表型差异大的特点，找到了淋巴造血***肿瘤中表达率非常高而非造血***中极少表达的非系别特异性标志进行筛查和鉴别诊断，主要包括HLA-ABC、CD36、CD38。
为了进一步验证本发明的特异性标志中HLA-ABC的鉴别效率，本发明选择2016年8月1日至2021年10月30日河北燕达陆道培医院流式细胞室做免疫表型的样本进行HLA-ABC表达率研究，其中包括：非肿瘤样本272例，男性146例，女性126例，中位年龄31岁（0-87岁），骨髓样本268例，外周血1例，组织样本3例；淋巴造血***肿瘤869例，其中男性544例，女性325例，中位年龄28岁（0-85岁），骨髓样本845例，外周血样本19例，组织穿刺物7例，胸腹水1例。覆盖WHO淋巴造血肿瘤分类中所有疾病（急性未分化白血病1例，急性混合表型白血病14例，急性B淋巴细胞白血病258例，急性髓系白血病417例，急性T淋巴细胞白血病83例，骨髓增殖性肿瘤10例，髓系增生异常综合征44例，髓系增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤6例，多发性骨髓瘤11例，成熟B细胞淋巴瘤18例，成熟T细胞淋巴瘤5例，成熟NK细胞淋巴瘤2例。发现在正常造血细胞中，除了有核红不表达HLA-ABC以外，其他细胞的HLA-ABC表达率100%，而且表达强度为一致性高表达；在淋巴造血***肿瘤中，HLA-ABC丢失率0.12%（1/869）。
本发明从2008年开始探索，2020年10月形成确定性方案，迄今检测192例患者，其中阳性130例，阴性62例，结果发现使用本发明进行筛查/诊断与随访非造血***肿瘤，覆盖率和特异性高达99%以上，灵敏度0.01%。假阳性率和假阴性率均<1%。本发明涉及的非造血***肿瘤，是指世界卫生组织发布的相对应于淋巴造血***肿瘤以外的，绝大对数类型的实体瘤，包括：恶性上皮来源的肿瘤（如肺癌、乳腺癌、胆囊癌、结肠癌、***癌、食道癌、输卵管癌、头颈部癌、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、胰腺癌等）、胚胎性肿瘤（神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚叶瘤（PNET）等）、软组织肿瘤和骨外肉瘤（尤文肉瘤、横纹肌肉瘤）、骨肿瘤和软骨肿瘤（骨肉瘤、软组织肉瘤）、恶性肾脏肿瘤（肾母细胞瘤、肾上腺癌、肾透明细胞癌）、恶性黑色素瘤等。由此可见本发明对于整个肿瘤临床流式细胞术诊断领域来说，是一个覆盖率高、实用性强、高度灵敏、高度特异、可以降低漏诊率的重要的检测与分析方案。
Claims (9)
1.一种能用于流式细胞术检测非造血***肿瘤的试剂组合物，其特征在于，该试剂组合物包括第一组抗体、第二组抗体、第三组抗体，其中：
第一组抗体由抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体组成；第一组抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第一流式管中；
第二组抗体由抗HLA-ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体组成；第二组抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第二流式管中；
第三组抗体为抗胞浆cytokeratin抗体，所述抗胞浆cytokeratin抗体为包括CK8单克隆抗体、CK18单克隆抗体、CK19单克隆抗体的复合物；第三组抗体用于加入到已加入第二组抗体且进行破膜处理后的第二流式管中。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，各抗体均为荧光素标记的抗体；
第一组抗体中，抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体的荧光素标记顺序为FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421、V500；
第二组抗体中，抗HLA-ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体的荧光素标记顺序为PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421和V500；
第三组抗体中，抗胞浆cytokeratin抗体的荧光素标记为FITC。
3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于：
第一组抗体为抗CD9抗体、抗GD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD81和抗CD45抗体按照5：5：5：3：2：3：3：3的体积比混合的混合物；
第二组抗体为抗HLA-ABC抗体、抗CD38抗体、抗CD19抗体、抗CD56抗体、抗CD36抗体、抗CD7抗体和抗CD45抗体按照5：5：3：2：3：3：3的体积比混合的混合物。
4.一种检测非造血***肿瘤的试剂盒，该试剂盒包括多个容器，其特征在于，各容器分别容置权利要求1-3任一项所述的试剂组合物的各组抗体。
5.权利要求1-3任一项所述的试剂组合物在制备用于检测非造血***肿瘤的流式细胞上机样本中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非造血***肿瘤包括：恶性上皮来源的肿瘤、胚胎性肿瘤、软组织肿瘤、骨外肉瘤、骨肿瘤、软骨肿瘤、恶性肾脏肿瘤、恶性黑色素瘤中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制备用于检测非造血***肿瘤的流式细胞上机样本的过程包括步骤：
（1）将待测样本分别加入到甲管和乙管两个流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×106/管-1×107/管；
（2）向步骤（1）处理得到的甲管中加入权利要求1-3任一项所述的试剂组合物中的第一组抗体，向步骤（1）处理得到的乙管中加入权利要求1-3任一项所述的试剂组合物中的第二组抗体，各流式管室温避光孵育；
（3）向步骤（2）孵育后的乙管中加入破膜剂A液，继续室温避光孵育；
（4）向步骤（2）孵育后的甲管流式管中加入1×溶血素，向步骤（3）孵育后的乙管流式管中加入1×溶血素，继续室温避光孵育；
（5）将步骤（4）孵育后的各流式管离心后去上清；
（6）向步骤（5）去上清后的乙管中加入破膜剂B液和权利要求1-3任一项所述的试剂组合物中的第三组抗体，室温避光孵育；
（7）向步骤（5）去上清后的甲管以及步骤（6）孵育后的乙管流式管中，分别加入PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用PBS缓冲液重悬细胞，即得到流式细胞上机样本。
8.一种检测非造血***肿瘤的装置，其特征在于，所述检测包括筛查、诊断和/或随访检测，所述装置包括检测单元和分析单元，其中：
所述检测单元包括用于通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的试剂材料，用于获得样本的检测结果；所述试剂材料包括权利要求1-3任一项所述的试剂组合物；
所述分析单元用于分析检测单元的检测结果。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，该装置用于检测非造血***肿瘤时，其中：
通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：
利用权利要求1-3任一项所述的试剂组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样本；
进行流式细胞上机检测；
其中流式细胞上机检测时甲管按照以下方式设门：设置去黏连细胞门P1，P1内设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内，使用CD45/CD56抗体设NH1门检测CD45-/CD56+细胞，使用CD45/GD2抗体设NH2门检测CD45-/GD2+细胞；P2门内，使用CD45/CD36设NH3门检测CD45-/CD36-细胞；显示NH1门和NH2门内细胞CD3/CD4/CD36/CD9/CD81的表达情况；显示NH3门内细胞CD9/GD2/CD56/CD81的表达情况；
其中流式细胞上机检测时乙管按照以下方式设门：设置去黏连细胞门P1，P1内设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内，使用CD45/CD56抗体设NH4门检测CD45-/CD56+细胞，使用CD45/胞浆cytokeratin抗体设NH5门检测CD45-/cytokeratin+细胞；P2门内，使用CD45/CD36设NH6门检测CD45-/CD36-细胞；显示NH4门和NH5门内细胞HLA-ABC/CD38/CD19/CD36/CD7的表达情况，显示NH6门内细胞cytokeratin/HLA-ABC/CD38/CD56的表达情况。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5877299A (en) * | 1995-06-16 | 1999-03-02 | Stemcell Technologies Inc. | Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations |
| US6117985A (en) * | 1995-06-16 | 2000-09-12 | Stemcell Technologies Inc. | Antibody compositions for preparing enriched cell preparations |
| CN101516912A (zh) * | 2006-06-07 | 2009-08-26 | 生物联合公司 | 识别癌细胞上表达的cd-43和cea的含糖表位的抗体及其使用方法 |
| CN101624579A (zh) * | 2008-07-10 | 2010-01-13 | 上海惠泰医疗科技公司 | 分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒及其应用 |
| CN107753954A (zh) * | 2012-12-13 | 2018-03-06 | 免疫医疗公司 | 功效改进且毒性降低的抗体与sn‑38的免疫缀合物的剂量 |
| CN108290939A (zh) * | 2015-10-16 | 2018-07-17 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 用于抑制谱系特异性抗原的组合物和方法 |
| CN112462065A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-03-09 | 浙江博真生物科技有限公司 | 一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法 |
| CN113933513A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-01-14 | 信纳克(北京)生化标志物检测医学研究有限责任公司 | 检测靶向治疗后急性t淋巴细胞白血病的试剂组合物及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| GB201319374D0 (en) * | 2013-11-01 | 2013-12-18 | Univ Nottingham | Glycans as functional cancer targets abd antibodies thereto |
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5877299A (en) * | 1995-06-16 | 1999-03-02 | Stemcell Technologies Inc. | Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations |
| US6117985A (en) * | 1995-06-16 | 2000-09-12 | Stemcell Technologies Inc. | Antibody compositions for preparing enriched cell preparations |
| CN101516912A (zh) * | 2006-06-07 | 2009-08-26 | 生物联合公司 | 识别癌细胞上表达的cd-43和cea的含糖表位的抗体及其使用方法 |
| CN101624579A (zh) * | 2008-07-10 | 2010-01-13 | 上海惠泰医疗科技公司 | 分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒及其应用 |
| CN107753954A (zh) * | 2012-12-13 | 2018-03-06 | 免疫医疗公司 | 功效改进且毒性降低的抗体与sn‑38的免疫缀合物的剂量 |
| CN108290939A (zh) * | 2015-10-16 | 2018-07-17 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 用于抑制谱系特异性抗原的组合物和方法 |
| CN112462065A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-03-09 | 浙江博真生物科技有限公司 | 一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法 |
| CN113933513A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-01-14 | 信纳克(北京)生化标志物检测医学研究有限责任公司 | 检测靶向治疗后急性t淋巴细胞白血病的试剂组合物及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| An anti-transferrin receptor antibody enhanced the growth inhibitory effects of chemotherapeutic drugs on human non-hematopoietic tumor cells;Xin Shen 等;《International Immunopharmacology》;20081220;第8卷(第13-14期);第1813-1820页 * |
| Characterization and Purification of Neoplastic Cells of Nodular Lymphocyte Predominant Hodgkin Lymphoma from Lymph Nodes by Flow Cytometry and Flow Cytometric Cell Sorting;Jonathan R Fromm 等;《The American Journal of Pathology》;20170228;第187卷(第2期);第304-317页 * |
| 流式细胞术在非造血***肿瘤骨髓侵犯检测中的价值;王卉 等;《中华检验医学杂志》;20110211(第2期);第141-146页 * |
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| GR01 | Patent grant | ||
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