CN114778262A - 一种食用油基质***素标准样品的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食用油基质***素标准样品的制备方法，包括以下步骤：（1）采用体积比为1:1的乙酸乙酯和环己烷溶剂将***素标准溶液溶解并超声混匀得到***素标准品；（2）将步骤（1）得到的***素标准品加入食用油中，并进行超声混匀，最后放入真空干燥箱中，在40℃、真空度20 Mpa下运行时间1h得到食用油基质***素标准样品。本发明通过添加法，将***素通过介质转换后与食用油结合，从而能够获得预期数值的***素，并能调节每种***素的含量和比例，同时还能结合食用油的基质特征，制备出多种食用油中***素的标准样品。同时，本方法添加的***素为有证标准物质，从而为制备后样品的溯源性提供了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于食品非法添加物质检测的基体标准物质技术领域，提出了一种食用油基质***素标准样品的制备方法及其应用。
背景技术
由桑科植物***干燥果实火麻仁冷榨得到的植物油脂火麻油在我国具有悠久的食用历史。火麻油含有***特有一类含有烷基和单萜分子的次生代谢产物***素，主要包括Δ9-四氢***酚（Δ9-Tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）、***酚（Cannabinol，CBN）和***二酚（Cannabidiol，CBD），其中，Δ9-THC因具有影响中枢神经的作用而最为受到关注，在世界各国均受到了严格管控。
由于火麻油的原料品种、产地来源及制备工艺的不同，其中各种***素的含量存在很大差异，但几乎所有火麻油中都有不同含量***素存在。随着工业***食品的日益普及，美国、加拿大、德国、瑞士、比利时、丹麦、智利及欧洲工业***协会等多个国家和组织相继发布了政策与法规，对火麻油等食用油中Δ9-THC含量制定了5 mg/kg~20 mg/kg的限量要求。我国有大量火麻油产品上市销售，也颁布了相关加工要求的地方标准如山西省地方标准DB 14/T 2273-2021《冷榨火麻油加工技术规范》，但尚未出台包括火麻油在内的工业***食品中Δ9-THC的限量标准。
当前***素的标准品大多为进口，售价昂贵、购买不便且大多为纯品，缺少结合了检测基质特性标准样品，使得在检测时无法有效的反应不同样品间的基质效应，从而造成检测结果的偏差。国际上常用带有实际基质的标准样品（reference materials）开展质量控制、实验室间比对或量值传递，也用于量值溯源、实验室的能力评价或代替纯标准品，但目前暂无食用油中***素的标准样品的研究。研制食用油中Δ9-THC、CBD、CBN标准样品，开展实验室间量值传递与量值比对，可提高实验室间检测分析数据的可比性，验证实验室能力，对于实验室方法可行性分析、仪器核查、人员技术水平考核、检测质量控制等实验室工作均具有重要意义。
根据公开的资料，我国及世界各国均缺少食用油中Δ9-THC、CBD、CBN等***素标准物质的制备方法及标准样品。标准样品对于保证检测结果间的一致性，提高检测结果的质量控制，建立检测结果的量值溯源具有十分重要的意义。
市面上销售的火麻油，不同程度的都含有一定量的***素，但是受到产地、品种、生产工艺的影响，不同火麻油中***素的含量均不相同。若使用不同含量的火麻油调配制备标准样品，存在以下几个问题：（1）调配的方法受火麻油中***素含量的影响较大，无法获得对质量控制最有效的数值。因调配的方法只能将原***素稀释而不能提高，而世界各国对食用油中的限量从5mg/L~20mg/L不等，这些限量有的已经超过市面上销售火麻油中***素的含量，稀释调配的方法不能满足要求。（2）天然火麻油中均同时含有Δ9-THC、CBD、CBN，且含量不一，调配的方法无法将这些***素分开赋值（如希望获得Δ9-THC为5mg/L,CBD为10mg/L，CBN为15mg/L的样品，但调配的方法无法得到）。（3）调配稀释的方法无法建立标准样品的量值溯源性。（4）食用油种类较多，但调配稀释的方法只能得到火麻油这一种基质，无法满足更多的要求。
发明内容
针对目前的问题，本发明提供了一种食用油基质***素标准样品的制备方法及其应用，其通过添加法，将***素通过介质转换后与食用油结合，从而能够获得预期数值的***素，并能调节每种***素的含量和比例，同时还能结合食用油的基质特征，制备出多种食用油中***素的标准样品。同时，本方法添加的***素为有证标准物质，从而为制备后样品的溯源性提供了良好的基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种食用油基质***素标准样品的制备方法包括以下步骤：
（1）采用体积比为1:1的乙酸乙酯和环己烷溶剂将***素标准溶液溶解并超声混匀得到***素标准品；
（2）将步骤（1）得到的***素标准品加入食用油中，充分搅拌并进行超声混匀，最后放入真空干燥箱中，在40℃、真空度20 Mpa下运行时间1h，挥发掉作为介质的溶剂（乙酸乙酯和环己烷），得到食用油基质***素标准样品。
进一步地，***素标准溶液为Δ9-THC、CBD、CBN标准溶液中的一种或多种，浓度均为0.1 mg/mL。
进一步地，步骤（1）中***素标准品的浓度为100 mg/L。
进一步地，步骤（2）中食用油为不含***素的市售食用油，所述市售食用油包括橄榄油、花生油、大豆油或调和油。
进一步地，本发明制得的食用油基质***素标准样品可用于：食用油食品中***素的检测；食用油样品中***素检测的质量控制；实验室间比对；检测结果的量值传递。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明的目的是制备一种标准样品，与传统上将标准品直接添加到样品基质上的方法不同的是，本发明将***素标准品与样品基质在更深层次上得到结合（传统添加法只能是加而没有结合），通过乙酸乙酯：环己烷=1：1（体积比）混合溶剂做为介质，将样品基质（食用油等）和目标物（三种***素）溶解后，在物理搅拌和超声作用下结合，再通过真空干燥挥发掉作为介质的溶剂。实验结果（均匀性和稳定性）表明，这种方法制备的标准样品可靠、稳定，具有应用于实验室间比对、结果监控、量值溯源的用途。
（2）本发明的制备标准样品时使用的介质溶剂（乙酸乙酯：环己烷体积比=1：1）；一是环己烷溶解油脂能力强，乙酸乙酯能够溶解多酚类物质，能够很好的溶解食用油基质和目标物，从而作为中间介质溶剂。二是三种***素目标物都属于多酚类物质，这是一种芳香烃环上的氢被羟基取代的化合物，根据结构分析和文献报道，这类目标物的化学极性较弱，根据化学极似的相似相溶原理，目标物易溶于极性较弱的溶剂中。根据化学溶剂极性表中的数据，相似极性的溶剂大多为苯、氯仿的组合，但多酚类目标物又不溶于苯或氯仿，且这两种试剂的毒性都较高。在比较化学极性表、目标物溶解性、参考试剂毒性和多次试验后，发现乙酯乙酯：环己烷=1：1的溶剂组合能够满足极性相似、目标物溶解性的要求，且试剂毒性小。三是乙酸乙酯和环己烷都易挥发，在完成样品制备后，很容易被挥发除去，既不在制备后的样品中存留，挥发的试剂毒性小，对环境和人员友好。
（3）超声波的方式除了能进步将目标物和食用油基质混匀外，还能将目标物与基质产生有机结合，从而增强样品的均匀性和稳定性。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
1、试剂与材料
乙酸乙酯、环己烷：色谱纯。Δ9-THC、CBD、CBN***素标准品，纯度≥100 mg/L，有证标准物质。
2、制备方法
2.1选择检测为阴性的市售食用油（橄榄油）作为基质样品，便于获得、储运和模拟实际检测的需求。
2.2将Δ9-THC、CBD、CBN***素标准品用乙酸乙酯：环己烷=1：1溶解后至浓度100mg/L，超声5min混匀。
2.3在阴性基质样品中加入三种***素标准品，40℃下超声2h混匀。按每1kg橄榄油中加入Δ9-THC、CBD、CBN***素标准品，各0.1mg 。
2.4将上述样品放入真空干燥箱中，40℃，真空度20 Mpa，运行时间1h，挥发掉作为介质的溶剂（乙酸乙酯和环己烷）。
2.5对制得的食用油基质标准样品进行定值和不确定度评估。
2.6对制得的食用油基质标准样品进行均匀性、稳定性检验。
3、应用方法
制得的标准样品可用于：食用油食品中***素的检测；食用油样品中***素检测的质量控制；实验室间比对；检测结果的量值传递。
用于检测主要体现在当无法获得***素的标准品，或因纯品标准品太贵等原因不能使用时，可使用本标准样品代替标准品去检测待测样品。由于本标准样品是通过有证标准物质制得，具有一定的量值溯源性，因此可以实现上述用途。具体做法是：将本标准样品与待测样品一同检测，将待测样品的峰面积/信号值与本标准样品的峰面积/信号值进行比较，由于标准样品中***素的含量是已知的，因此可以换算出待测样品中的***素含量。
4、测定方法（定值方法）
4.1 材料与试剂
Δ9-THC、CBD、CBN、Δ9-THC-d3标准溶液(含量均为0.1 mg/mL) ；甲醇、乙腈 (色谱纯) 德国Merck公司；乙酸铵（色谱纯）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱(100mg，3mL)。
4.2 仪器与设备
Xevo TQD液相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源(ESI)) 美国Waters公司；3-18K高速离心机 德国Sigma公司。
4.3 标准溶液的配制
混合标准溶液：移取适量***素标准溶液（Δ9-THC、CBD、CBN），用甲醇稀释配制成1.0 μg/mL的混合标准工作液，于-20 ℃避光保存。
内标溶液：移取适量内标溶液（Δ9-THC-d3），用甲醇稀释配制成1.0 μg/mL，于-20℃避光保存。
混合标准工作液：准确移取一定量的混合标准溶液和内标溶液，用75 %甲醇水溶液配制成质量浓度为10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L（分别含50.0 μg/L内标）的混合标准工作曲线。
4.4 样品前处理
4.4.1 样品提取
称样2g（精确至0.01g）于50 mL离心管中，加100 μL 1.0 μg/mL的Δ9-THC-d3内标溶液和10 mL乙腈，涡旋混匀30 s，50 ℃下超声提取15 min，10 000 r/min离心5 min，取5mL上清液待净化。
4.4.2 样品净化
将待净化液转移至事先用2 mL乙腈活化过的EMR固相萃取小柱中，待其自然重力流出后，用5 mL乙腈淋洗小柱，减压抽干30 s。上样和洗脱流速均应小于1 mL/min。收集全部流出液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL75 %甲醇水溶液，涡旋混匀30 s，超声3 min，过0.22 μm滤膜后待测定。
4.5 分析方法
4.5.1 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm*50 mm）；流动相：10 mmol/L乙酸铵水溶液：甲醇（2：8，V/V）；流速：0.2 mL/min；柱温：室温；进样量：10 μL。
4.5.2 质谱条件
电离模式：电喷雾正离子模式（ESI+）；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3kV；离子源温度：350 ℃；雾化气：氮气，1 000 L/h；碰撞气：氦气，50 L/h；其他参数见表1。
4.6分析结果
对检测结果采用方法学分析，通过标准曲线、检出限、定量限、准确度和精密度判断方法的稳定性和灵敏度。结果表明，该方法在10.0~200.0μg/kg范围里呈现良好的线性，相关系数均大于0.998，方法的检出限和定量限分别为3 μg/kg和10 μg/kg，能够满足世界各国对食用油中***素的限量要求，对1、2、10倍定量限的加标结果表明，三种***素的回收率在72.3~108.4 %，精密度RSD在4.9~12.4 %，方法准确度和精密度良好，能够满足分析要求。
5、均匀性检验
5.1样品制备
在1kg橄榄油样品中，加入1 mL含有100 mg/LΔ9-THC、CBD、CBN的标准物质，按制备方法所述制得标准样品后，使用密封盖棕色玻璃瓶，平均分装成30份，每份约30g样品。
随机提取10瓶用于均匀性检验。另将10瓶置于室温（20±5）℃，10瓶置于冷藏（4±2）℃保存，用于稳定性试验。
5.2 检验方法
参照CNAS-GL03：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》和GB/T 15000.3-2008“标准样品工作导则（3） 标准样品 定值的一般原则和统计方法”中对“均匀性研究”的要求，采用单因素方差分析（F检验）法，对制备后的样品进行均匀性检验。随机抽取10份制备好的样品，每份样品在重复性条件下测定2次，计算F值，并用95%置信区间查F分布临界值F 0.05，当样品的F<F 0.05时，表明样品内和样品间无显著性差异，结果见表4。均匀性检验的结果表明，制备的样品中三种***素浓度都是均匀的。
6、稳定性检验
参照CNAS-GL03：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》和GB/T 15000.3-2008“标准样品工作导则（3） 标准样品 定值的一般原则和统计方法”中对“稳定性研究”的要求，使用与均匀性检验相同的人员、设备、方法和实验条件，将均匀性测定结果的均值做为参考值，采用t检验法，对制备后的样品进行稳定性检验。将10份制备后的样品置于（20±5）℃室温环境中，另10份置于（4±2）℃环境中，计算不同时间间隔的测定结果的t值，按95%置信水平查t临界值表，当测得的t值小于t 0.05(df)(df为自由度)时，表明稳定性检验结果与均匀性检验结果的平均值之间无显著性差异，结果见表5。稳定性检验的结果表明，在两个不同储存温度下保存的样品都是稳定的，且储存在（4±2）℃条件下的样品稳定性更好。
7、不确定度评估
参照GB/T 15000.3-2008“标准样品工作导则（3） 标准样品 定值的一般原则和统计方法”中对“测量不确定度评估”的要求，根据方法的原理，建立数学模型，并据此分析标准样品中的主要来源，包括：***素标准品浓度的相对标准不确定度
、样品定容引入的相对不确定度
、称样引入的相对不确定度
、样品稀释引入的相对标准不确定度
、检测回收引入的相对标准不确定度
和重复性测量引入的相对标准不确定度
。 则合成相对不确定度为：
取k=2，则扩展不确定度为
，每种***素的最终定值见表6。
小结：（1）本发明可制备满足不同限量要求的***素标准样品，进而满足不同国家对不同***素的限量要求以及实验室定制的需要。（2）本发明可制备单种、多种***素的标准样品，还可根据需要对不同***素分开赋值，进而满足更多种类的需求。（3）本发明制备***素的标准品为有证标准物质，具有量值溯源性。（4）本发明可根据需要制备不同食用油基质（如花生油、橄榄油等）的***素标准样品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种食用油基质***素标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用体积比为1:1的乙酸乙酯和环己烷溶剂将***素标准溶液溶解并超声混匀得到***素标准品；
（2）将步骤（1）得到的***素标准品加入食用油中，充分搅拌并进行超声混匀，最后放入真空干燥箱中，在40℃、真空度20 Mpa下运行时间1h得到食用油基质***素标准样品。
2.根据权利要求1所述的食用油基质***素标准样品的制备方法，其特征在于，***素标准溶液为Δ9-THC、CBD、CBN标准溶液中的一种或多种，浓度均为0.1 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的食用油基质***素标准样品的制备方法，其特征在于，步骤（1）中***素标准品的浓度为100 mg/L。
4.根据权利要求1所述的食用油基质***素标准样品的制备方法，其特征在于，步骤（2）中食用油为不含***素的市售食用油，所述市售食用油包括橄榄油、花生油、大豆油或调和油。
5.一种如权利要求1-4所述的制备方法制得的食用油基质***素标准样品在食用油食品中***素的检测中的应用。
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| CN113758775A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-12-07 | 广州海关技术中心 | 固体饮料中柠檬黄含量标准样品及其制备方法 |
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2022
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