CN114765991A - 非色素睫状上皮细胞特异性启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含非色素睫状上皮细胞(NPCEC)特异性启动子的构建体。特别是，所述构建体包含赋予NPCEC特异性表达的BEST2最小启动子。所述BEST2最小启动子可以与表达型序列(例如编码目的多肽的基因、调控RNA序列、报告基因等)可操作地连接。此类构建体可以在表达载体中提供，例如，利用与表达型序列可操作地连接的所述BEST2最小启动子提供，或在经此类表达载体遗传修饰的宿主细胞中提供。

Description

非色素睫状上皮细胞特异性启动子

背景技术

睫状体能够持续分泌房水和控制眼内压(IOP)。它是高度血管化的组织，非色素睫状上皮细胞(NPCEC)充当屏障。NPE具有高代谢活性(含有更多的线粒体)和内陷，可为液体分泌提供更大的表面积。睫状体不仅在青光眼等眼病中起关键作用，而且还含有许多可能的治疗靶点，例如肾上腺素能α和β受体、多巴胺受体、***素受体和肽受体。仍然需要用于治疗眼病的改进的基因治疗方法，特别是用于在睫状体的NPECEC中选择性地表达基因的细胞特异性启动子。

发明内容

本发明提供了包含非色素睫状上皮细胞(NPCEC)特异性启动子的构建体。特别是，所述构建体包含最小BEST2启动子，所述启动子赋予与之可操作地连接的基因NPCEC特异性表达。所述BEST2最小启动子可以与表达型序列(例如编码目的多肽的基因、调控RNA序列、报告基因等)可操作地连接。此类构建体可以在表达载体中提供，例如，利用与表达型序列可操作地连接的所述BEST2最小启动子提供，或在经此类表达载体遗传修饰的宿主细胞中提供。

在一方面，提供了重组NPCEC特异性启动子构建体，其包含DNA序列，所述序列包含BEST2最小启动子和转录起始位点(TSS)。

在某些实施例中，所述最小BEST2启动子包含对应于人19号染色体的12,751,703-12,751,803位的核苷酸序列或由其组成。虽然上述编号是相对于人19号染色体的编号，但应当理解，从其他哺乳动物物种中获得的染色体上的相应位置也意在涵盖在本发明的范围内。

在某些实施例中，所述最小BEST2启动子包含以下序列或由其组成：选自由序列号：1和序列号：2组成的群组的核苷酸序列；或与所述核苷酸序列的序列同一性至少为约80-100％的序列，包括此范围内的任何同一性百分比，例如与所述核苷酸序列的序列同一性为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。所述最小启动子可以与提供额外功能的非天然序列接合。

在某些实施例中，所述构建体进一步包含一个或更多个转录因子结合位点，例如用于转录因子的位点，包括但不限于ZNFl43、AP-2、KLF9、p63、KLF1、ER、EGR2、STAT5A、EGR3、Sp1、Sp4、MAZ和ERG。

在某些实施例中，所述构建体进一步包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的一条或更多条调控序列。例如，所述构建体可以含有使所述最小BEST2启动子处于可诱导状态的增强子和/或调控序列。

在一些实施例中，所述构建体具有非天然构型，所述非天然构型具有位于所述最小BEST2启动子与所述TSS之间的非天然间隔、位于所述最小BEST2启动子与至少一条调控序列之间的非天然间隔或位于至少两条调控序列之间的非天然间隔。

在一些实施例中，所述构建体具有非天然TSS或非天然调控序列。

在某些实施例中，所述构建体进一步包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的表达型序列。所述表达型序列可以编码，例如，多肽、调控RNA或报告基因。

在某些实施例中，所述表达型序列编码序列特异性核酸内切酶。在一些实施例中，所述序列特异性核酸内切酶是基因组编辑酶。示例性基因组编辑酶包括但不限于Cas9多肽、锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在一实施例中，所述多肽编码序列编码酶法失活的II型CRISPR/Cas多肽。

在某些实施例中，所述构建体进一步包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的病毒T2A肽或IRES序列。在非限制性示例中，所述构建体是多顺反子构建体，其包含编码Cas9多肽的第一表达型序列以及编码与所述最小BEST2启动子可操作地连接的Cas9导向RNA的第二表达型序列。

在某些实施例中，所述构建体是双链构建体。在一些实施例中，所述构建体是DNA或RNA构建体。

在某些实施例中，所述构建体进一步包含编码报告基因的核苷酸序列，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列与所述最小BEST2启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述报告基因是提供可检测信号的多肽。例如，所述报告基因可以是荧光多肽，包括但不限于红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。或者，所述报告基因可以是在作用于底物时生成可检测产物的酶。例如，所述报告基因可以包括但不限于萤光素酶，例如萤火虫、海肾或长腹水蚤属萤光素酶。在某些实施例中，所述报告基因是mRNA。

在另一方面，提供了包含本文所述的构建体的表达盒，其中所述表达盒能够在NPCEC中特异性地提供基因表达。

在另一方面，提供了包含表达盒的表达载体，所述表达盒包含本文所述的构建体中的任何一项。

在某些实施例中，所述表达载体可以是病毒载体。在某些实施例中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述慢病毒载体包含长末端重复序列(LTR)、Ψ包装信号、rev应答元件(RRE)和中央多聚嘌呤区(cPPT)。

在某些实施例中，所述表达载体进一步包含选择标记。例如，所述选择标记可以是抗生素抗性基因，包括但不限于嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。

在某些实施例中，所述表达载体进一步包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

在某些实施例中，所述表达载体进一步包含哺乳动物复制起点，例如，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)复制起点。

在某些实施例中，所述表达载体进一步包含多克隆位点。

在某些实施例中，所述表达载体进一步包含多腺苷酸化位点。

在某些实施例中，所述表达载体进一步包含SV40早期启动子。

在某些实施例中，所述表达载体是双链表达载体。

在某些实施例中，所述表达载体是DNA或RNA表达载体。

在另一方面，提供了用本文所述的构建体、表达盒或表达载体进行遗传修饰的NPCEC。在一些实施例中，所述NPCEC是转化细胞系或原代细胞。在一些实施例中，所述构建体被整合到所述细胞的基因组中。

在另一方面，提供了在哺乳动物受试者中将目的基因产物的表达定位于NPCEC的方法，所述方法包含将本文所述的表达载体(包含编码与所述最小BEST2启动子可操作地连接的目的基因产物的表达型序列)引入所述受试者的眼部，其中目的基因产物在所述NPCEC中选择性地表达。

在另一方面，提供了在NPCEC中特异性地表达目的基因产物的方法，所述方法包含：a)用本文所述的构建体转染分离的细胞、细胞系或细胞群体，其中所述最小BEST2启动子与编码目的基因产物的表达型序列可操作地连接；以及b)如果所述细胞是NPCEC，则在其中目的基因产物由所述细胞表达的条件下培养所述分离的细胞、所述细胞系或所述细胞群体。

在另一方面，提供了用于在NPCEC中表达基因的试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的构建体、表达盒或表达载体。所述试剂盒可以进一步包含有关在MPCEC中表达所述基因的说明。在某些实施例中，所述试剂盒包含构建体、表达盒或表达载体，其包含最小BEST2启动子，所述启动子包含以下序列或由其组成：选自由序列号：1和序列号：2组成的群组的核苷酸序列；或与所述核苷酸序列的序列同一性至少为约80-100％的序列，包括此范围内的任何同一性百分比，例如与所述核苷酸序列的序列同一性为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

附图说明

结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：

图1展示了人眼内睫状体的位置示意图，其含有色素上皮(PE)和非色素上皮(NPE)。

图2A-2C展示了非色素睫状上皮细胞的体外靶向情况。图2A.用含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该蛋白由组成型活性EF1a(延伸因子1α)启动子驱动。LTR，长末端重复序列；U3/U5，独特的3′端或5′端区域；Psi，核衣壳包装的RNA靶位点；RRE，Rev应答元件；cPPT，中央多聚嘌呤区；PGK，磷酸甘油酸激酶启动子；Puro，嘌呤霉素抗性基因；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。图2B.在转染后24小时，可通过荧光显微镜检查在ARPE19和NPCE细胞中检测到GFP。5倍放大倍率。图2C.FAC分选表明，慢病毒构建体在ARPE19和NPCE细胞中的转染效率约为35％。

图3展示了非色素睫状上皮细胞的VMD2L1优先靶向情况。用以确定眼部非色素睫状上皮细胞(NPCEC)特异性启动子序列的策略。BEST2是NPCEC特异性基因，无其他上皮细胞，例如眼部的RPE细胞。无BEST2启动子特异性预测位点，但是BEST2基因上游的区域是启动子序列的建议位置。用含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该质粒构建体由位于BEST2基因(chr19：12,751,702-12,758,458)上游约1.1kb且与该基因本身有一些重叠的序列(chr19：12,750,691-12,751,903)驱动。如果该上游区域含有BEST2的启动子，则GFP应当在NPCE而非ARPE19细胞中表达。MCS，多克隆位点；BGH pA，牛生长激素poly A；SV40，猿猴病毒40；Neo，新霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因。

图4A-4C展示了驱动非色素睫状上皮细胞优先靶向的VMD2L1启动子的大小减缩情况。图4A.生成图3中所述的含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体，该蛋白由组成型活性EF1a(延伸因子1α)启动子、位于BEST2基因(chr19：12,751,702-12,758,458)上游约1.1kb的序列(启动子1；chr19：12,750,691-12,751,903)以及该上游区域的缩短版本(缩短至100bp，启动子2-14)驱动。图4B.用含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该蛋白由上图中所示的各启动子(EFla和启动子1-14)驱动。展示了转染后约24小时EF1a启动子(对照品)和启动子1、3、4、6和13对应的GFP阳性细胞的代表性图像。5倍放大倍率。图4C.对于各细胞系，用启动子1-14转染后，进行FAC分选，得到GFP阳性ARPE19(黑色)或NPCE(灰色)细胞所占的百分比，相对于EF1a对照数据进行归一化。启动子13(红色框；100bp)对NPCE细胞的特异性优于ARPE19细胞。

图5A-5B展示了VMD2L1的额外预测启动子区域的排除情况。图5A.设计了三个位于启动子1上游的额外启动子序列(启动子15-17；chr19：12,749,703-12,750,691)，建议第二区域中含有适用于BEST2基因的潜在启动子。图5B.用含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该蛋白由图5A中所示的启动子15-17驱动(另外也展示了来自图4的EF1a对照品)。展示了转染后约24小时EF1a启动子(对照品)和启动子15-17对应的GFP阳性细胞的代表性图像。5倍放大倍率。对于含有启动子15-17的质粒，未检测到GFP。

图6A-6B展示了在VMD2L1的启动子区域结合的转录因子。图6A.测试的14个启动子的序列区域在BEST2基因上游约1.1kb处，与BEST2基因有一些重叠。图6B.已知在1.2kb区域内结合的转录因子的位置经测试可在非色素睫状上皮细胞(NPCEC)中特异性地驱动GFP表达。BEST2基因显示于左侧。虚线突出显示与启动子13重叠的区域，该区域显示出对NPCEC的特异性。

图7A-7D展示了使用VMD2L1驱动的绿色荧光蛋白进行玻璃体内注射时对非色素睫状上皮细胞的体内优先靶向情况。图7A.生成含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒，该蛋白由组成型活性EF1a(延伸因子1α)启动子或适用于BEST2基因的启动子13驱动。图7B.慢病毒有效转导HEK293T细胞，对于EF1a，该慢病毒的滴度为4×10⁸，对于启动子13病毒载体，该慢病毒的滴度为1.2×10⁸。图7C.人(1，顶部序列，序列号：1)与小鼠(2，底部序列，序列号：2)的启动子13区域之间具有高度同源性。图7D.HEK293T细胞中产生的慢病毒将通过玻璃体内注射(右图中的箭头指示注射部位)进入小鼠眼部，以通过GFP表达显示出对非色素睫状上皮细胞的特异性。

图8A-8E展示了非色素睫状上皮细胞中CRISPR/Cas9介导的β-肾上腺素能受体2敲低。图8A.用慢病毒构建体转染人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该构建体含有针对β-肾上腺素能受体2(ADRB2)的导向RNA(gRNA)以及由组成型活性EFS(短延伸因子1α)启动子驱动的SpCas9。LTR，长末端重复序列；U3/U5，独特的3′端或5′端区域；Psi，核衣壳包装的RNA靶位点；RRE，Rev应答元件；cPPT，中央多聚嘌呤区；U6，III型RNA聚合酶III启动子；P2A，猪捷申病毒-12A；Puro，嘌呤霉素抗性基因；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。图8B.用对照品(无gRNA)或适用于ADRB2的gRNA 1-5转染的NPCEC用嘌呤霉素处理至少3天，然后收集用于蛋白印迹分析。基于GAPDH归一化ADRB2蛋白条带，各gRNA将ADRB2蛋白敲低约50％。图8C.用对照品(无gRNA)或适用于ADRB2的gRNA 1-5的双重和三重组合转染的NPCEC用嘌呤霉素处理至少3天，然后收集用于蛋白印迹分析。图8D展示了用gRNA 1-5转染的NPCEC中的ADRB2敲低。图8E展示了用gRNA 1-5的双重和三重组合转染的NPCEC中的ADRB2敲低。基于GAPDH归一化ADRB2蛋白条带。使用两条gRNA将ADRB2蛋白敲低约80-90％，其中gRNA 1和gRNA 2表现出的ADRB2蛋白敲低活性最强。

实施方式

在描述本发明的方法和组合物之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值都明确地公开。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。本发明涵盖了在所述范围内的任何所述值或介入值与在所述范围内的任何其他所述值或介入值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在所述范围内或排除在所述范围外，并且本发明也涵盖一个限值、无限值或两个限值包括在所述较小范围内的各范围，同时需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了一些潜在和首选的方法和材料。本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本发明内容应取代所引用出版物中的任何公开内容。

在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，本文所描述和列出的每个单独的实施例都具有分层的组分和特征，这些组分和特征可在不脱离本发明的范围和精神的情况下与其他几个实施例中任一实施例的特征进行快速分解或合并。可按陈述的事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序实施任何陈述的方法。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一个细胞”的指代对象包括多个此类细胞，而“所述载体”指的是一种或更多种载体及所属领域技术人员已知的等效物，例如质粒、构建体，等等。

本文所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中无任何内容可以解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。

在随后的描述中，使用了本领域通常使用的多个术语。为了让人清晰、一致地理解说明书、权利要求书以及这些术语的适用范围，给出了以下定义。

术语“启动子”是指控制基因转录或表达的调控DNA区域，其可以位于与RNA转录起始点的核苷酸或核苷酸区域相邻或重叠的位置。启动子含有与蛋白因子(通常称为转录因子)结合的特异性DNA序列，其促进RNA聚合酶与DNA的结合，从而实现基因转录。

“最小启动子”或“核心启动子”是指含有促进可操作地连接的多核苷酸转录表达的所有基本必需元件的启动子。

启动子还可以包括一个或更多个“调控元件”，这些元件也可以影响启动子的表达或转录。此类调控元件编码与其他因子结合的特异性DNA序列，这些因子可以包括但不限于增强子、沉默子、绝缘子和/或边界元件。

在本发明的环境下，术语“可操作地连接”是指以此类方式连接，以便一起发挥效用，从而允许转录。在一些实施例中，两条多核苷酸序列可以通过核苷酸键直接连接而进行可操作地连接。以这种方式，所述两个可操作地连接的元件不含间插序列，并且在连接时能够引导表达序列的转录。在其他实施例中，两个元件可以通过间插化合物进行可操作地连接，例如长度可变的多核苷酸序列。以这种方式，所述可操作地连接的元件虽然未直接并列，但仍然能够引导表达序列的转录。

因此，根据一些实施例，一个或更多个启动子元件可以彼此可操作地连接，另外，可以与下游表达序列可操作地连接，使得所述连接的启动子元件能够引导所述下游表达序列的表达。

术语“表达型序列”是指与启动子元件可操作地连接，使得启动子元件能够促使表达序列转录表达的多核苷酸。表达型序列通常在下游连接，即在启动子元件的3′端，以实现转录表达。这种转录表达的结果是产生了RNA大分子。表达的RNA分子可以编码蛋白，因此其随后可以通过适当的细胞机制翻译以产生多肽/蛋白分子。在一些实施例中，所述表达序列可以编码报告蛋白。或者，如本领域所公知，所述RNA分子可以是反义分子、RNAi或其他非编码RNA分子，其能够调节细胞中特异性基因的表达。

本文中使用的术语“核酸”包括任何核酸，并且可以是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。本领域技术人员可轻易理解的是，本文中使用的“多核苷酸”或“核苷酸聚合物”可以包括有义链和反义链核酸的合成或混合聚合物，并且可以经化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括，例如，标记、甲基化、用类似物取代一种或更多种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(例如，多肽)和修饰的键(例如，α异头多核苷酸等)。另外还包括模拟多核苷酸通过氢键和其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。

“载体”能将核酸序列转移至靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、微粒载体和脂质体)。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导目的核酸表达且可将核酸序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。

“表达载体”通常是整合性或自主性(即自我复制的)核酸分子，并且在被引入靶细胞中时，其含有在靶细胞中实现表达型序列的转录所必需的组分。表达载体可以包括质粒、粘粒、噬菌体、YAC、BAC、微型染色体、病毒，例如，逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、SV-40等。许多此类载体已在本领域中加以描述，并且适合与本发明的NPCEC特异性启动子结合使用。本发明的表达载体包括如本文所述的与表达型序列可操作地连接的NPCEC特异性启动子，所述启动子也可以任选地与转录终止序列可操作地连接，例如多腺苷酸化序列。所述表达载体任选地含有赋予宿主选择性的核酸元件、促进所述载体复制的元件、促进所述载体整合到所述靶细胞基因组中的元件、赋予所述靶细胞特性(例如抗生素抗性)以便选择或筛选转化细胞等的元件。用于设计和构建表达载体的技术和方法是本领域所熟知的技术和方法。

“基本上纯化的”通常是指物质(化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、肽组合物)的分离，使得该物质构成其所处样本的大部分。通常在样本中，基本纯化的组分占样本的50％，优选地为80％-85％，更优选地为90-95％。用于纯化目的多核苷酸和多肽的技术是本领域所熟知的技术，且包括，例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和基于密度的沉降法。

涉及蛋白、多肽或肽时，“分离的”是指在基本不存在相同类型的其他生物大分子的情况下，指定分子与其中实际上发现该分子或存在该分子的整个生物体分离且分散的。对于多核苷酸，术语“分离的”是指完全或部分缺乏以下各项的核酸分子：实际上通常与其相关的序列；其实际上存在但具有与之相关的异源序列的序列；或与染色体分离的分子。本文中用于描述核酸分子的“重组体”是指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，由于其来源或操作的缘故，该多核苷酸与与其实际上相关的多核苷酸完全或部分不相关。对于蛋白或多肽，术语“重组体”是指通过重组多核苷酸表达产生的多肽。通常情况下，克隆目的基因，然后在转化的生物体中表达(进一步描述见下文)。宿主生物在表达条件下表达外源基因，从而产生该蛋白。

术语“转化”是指将外源性多核苷酸***宿主细胞，而不考虑用于***的方法。例如，包括直接摄取或转导。外源性多核苷酸可以保持为非整合载体(例如质粒)，也可以整合到宿主基因组中。

“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他表示作为单细胞实体培养的微生物或高等真核细胞系的术语是指能用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受者，并且包括已转染原始细胞的初始后代的细胞。

“编码序列”或“编码”选定多肽的序列是置于合适调控序列(或“控制元件”)控制下时体内转录(对于DNA)和翻译(对于mRNA)成多肽的核酸分子。编码序列的边界可由5′(氨基)端起始密码子和3′(羧基)端翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3′端。

典型的“控制元件”包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3′端)、翻译起始优化序列(位于编码序列的5′端)和翻译终止序列。

“由……编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中多肽序列或其一部分含有长度至少为3至5个来自由核酸序列编码的多肽的氨基酸，更优选地至少为8至10个氨基酸，甚至更优选地至少为15至20个氨基酸的氨基酸序列。

“表达盒”或“表达构建体”是指能够指导目的序列或基因表达的组件。表达盒通常包括如上所述的控制元件，例如与目的序列或基因可操作地连接的启动子(以便指导其转录)，并且通常还包括聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施例中，本文所述的表达盒可以包含在质粒或病毒载体中。除表达盒的组分外，所述质粒或病毒载体还可以包括一种或更多种选择标记、允许所述质粒或病毒载体作为单链DNA存在的信号(例如，M13复制起点)、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如，SV40或腺病毒复制起点)。

“纯化的多核苷酸”是指目的多核苷酸或其片段，其基本上无所述多核苷酸天然结合的蛋白，例如含有少于约50％、优选地少于约70％、更优选地少于约至少90％的所述蛋白。用于纯化目的多核苷酸的技术是本领域所熟知的技术，并且包括，例如，用离液剂破坏含有多核苷酸的细胞以及通过离子交换色谱法、亲和色谱法和基于密度的沉降法分离多核苷酸和蛋白。

术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA。当外源DNA被引入细胞膜内时，细胞被“转染”。许多转染技术为本领域中公知的技术。参见，例如，Graham等人，(1973)病毒学，52：456；Sambrook等人，(2001)，分子克隆，实验室手册，第3版，冷泉港实验室，纽约；Davis等人(1995)，分子生物学基本方法，第2版；McGraw-Hill和Chu等人(1981)基因，13：197。此类技术可用于将一种或更多种外源DNA部分引入合适的宿主细胞。该术语是指遗传物质的稳定和瞬时摄取。

“基因转移”或“基因递送”是指用于将目的DNA或RNA可靠地***宿主细胞的方法或***。此类方法可引起非整合转移DNA的瞬时表达、转移复制子(例如附加体)的染色体外复制和表达，或转移遗传物质整合到宿主细胞的基因组DNA中。基因递送表达载体包括但不限于源自质粒载体、病毒载体和非病毒载体的载体。

“哺乳动物细胞”是指源自哺乳动物受试者的任何细胞，其适合用如本文所述的包含NPCEC特异性启动子的构建体或载体进行转染。所述细胞可以是异种异体细胞、自体同源细胞或同种异体细胞。所述细胞可以是直接从哺乳动物受试者中获取的原代细胞。所述细胞还可以是源自哺乳动物受试者中获取的细胞的培养和扩增的细胞。该定义也包括永生化细胞。在一些实施例中，所述细胞经基因工程改造以表达重组蛋白和/或核酸。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指由氨基酸残基构成的聚合物。该术语还适用于其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物、天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸、合成的氨基酸以及作用方式与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由基因密码编码的氨基酸以及后续经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的常规化学结构但作用方式与天然存在的氨基酸类似的化合物。

术语“受体”、“个人”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指的是需要诊断、治疗或疗法治疗的任何哺乳动物受试者，尤其是人类。用于治疗目的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农场动物，以及动物园动物、竞技动物或宠物，例如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪等。在一些实施例中，所述哺乳动物是人类。

术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体是指组合物、载体、稀释剂和试剂可互换使用，这些材料可以施用于人，且不产生阻止组合物施用的不良生理效应。

“剂量单位”是指适合特定待治疗个体的单一剂量的物理离散单位。每个单位含有预定量的活性化合物，所述活性化合物经计算以产生与所需药物载体相关的治疗效果。剂量单位形式的规格受(a)活性化合物的特征和待实现的治疗效果，以及(b)本领域这种复合活性化合物的局限性影响。

NPCEC特异性启动子构建体

本发明提供了包含最小BEST2启动子和转录起始位点的NPCEC特异性启动子构建体。所述NPCEC特异性启动子可以与表达型序列(例如编码目的多肽的基因、调控RNA序列、报告基因等)可操作地连接。此类构建体可以在表达载体中提供，例如，利用与表达型序列可操作地连接的所述最小BEST2启动子提供。本发明还提供了用包含所述NPCEC特异性启动子的构建体进行遗传修饰的宿主细胞，其可以被整合到宿主细胞染色体或表达载体中，以控制表达型序列的产生。

在某些实施例中，所述最小BEST2启动子包含对应于人19号染色体的12,751,703-12,751,803位的核苷酸序列或由其组成。虽然上述编号是相对于人19号染色体的编号，但应当理解，从其他哺乳动物物种中获得的染色体上的相应位置也意在涵盖在本发明的范围内。在某些实施例中，所述最小BEST2启动子包含以下序列或由其组成：选自由序列号：1和序列号：2组成的群组的核苷酸序列；或与所述核苷酸序列的序列同一性至少为约80-100％的序列，包括此范围内的任何同一性百分比，例如与所述核苷酸序列的序列同一性为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

“启动子”包含控制基因转录或表达的调控DNA区域，其位于与RNA转录起始位点(即，转录起始位点(TSS))相邻或重叠的位置。所述启动子还可以含有一种或更多种与转录因子结合的特异性DNA序列，其促进RNA聚合酶与DNA的结合，从而实现基因转录。“最小启动子”或“核心启动子”含有促进可操作地连接的表达型序列转录表达的所有基本必需元件。启动子还可以包括一个或更多个“调控元件”，这些元件影响启动子的表达或转录。此类调控元件包含与其他因子结合的特异性DNA序列，这些因子可以包括但不限于增强子、沉默子、绝缘子和边界元件。在某些实施例中，所述NPCEC特异性启动子构建体进一步包含一个或更多个转录因子结合位点，例如用于转录因子的位点，包括但不限于ZNF143、AP-2、KLF9、p63、KLF1、ER、EGR2、STAT5A、EGR3、Sp1、Sp4、MAZ和ERG。.

在一些实施例中，所述构建体具有非天然构型，所述非天然构型具有位于所述BEST2最小启动子与所述TSS之间的非天然间隔，和/或位于所述BEST2最小启动子与至少一个调控元件之间的非天然间隔，和/或位于调控元件之间的非天然间隔。在某些实施例中，所述调控元件直接连接，所述构建体中无间插序列。在其他实施例中，所述调控元件与间插序列可操作地连接。通常情况下，所述调控元件之间的间距不超过约15KB，一般不超过约10KB，通常不超过约1KB，更常出现的是不超过约500nt，并且可以不超过约100nt，直到所述两条序列直接连接。

在一些实施例中，所述启动子或TSS相对于天然调控和/或天然核心启动子序列或TSS进行修饰。通常情况下，此类修饰不会改变所述启动子在细胞类型选择性方面的功能活性；也不会改变所述启动子具有活性的细胞中的转录速率。修饰的BEST2启动子使得与所述修饰的BEST2启动子序列可操作地连接的表达型序列的转录速率为序列号：1或2所示启动子序列的转录速率的至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多。评估启动子强度和选择性的方法是本领域已知的方法，包括，例如，使报告基因序列在体内或体外细胞中表达，以及对报告基因活性进行定量。

在一些实施例中，所述启动子是诱导型启动子，并且含有允许控制表达型序列在宿主细胞中的表达的调控序列。控制表达的所述调控序列可与所述最小BEST2启动子可操作地连接，并且位于所述最小BEST2启动子的上游。此类调控序列是本领域技术人员已知的序列，并且其示例包括使得所述基因表达在响应于化学或物理刺激(包括存在调控化合物)时开启或关闭的调控序列。用于控制表达的所述调控序列可以是相对于所述哺乳动物宿主属于内源或外源的序列。在一些实施例中，细菌基因控制元件与病毒反式激活蛋白组合用于提供哺乳动物诱导性表达。哺乳动物相容性调控序列的示例包括能够控制工程化启动子以调节转录来响应于抗生素(包括但不限于四环素、链阳霉素和大环内酯)作用的调控序列。例如，在构建体中包括细菌四环素应答元件(TRE)能够通过四环素或其衍生物(例如，多西环素)诱导哺乳动物表达。参见，例如，Weber等人(2004)，分子生物学方法，267：451-66；Das等人(2016)，当今基因疗法，16(3)：156-67；Chruscicka等人(2015)，生物分子筛选杂志，20(3)：350-8；Yarranton(1992)，生物技术新见，3(5)：506-11；Gossen和Bujard(1992)，美国国家科学院院报，89(12)：5547-51，Gossen等人(1995)，科学，268(5218)：1766-9；其内容以引用方式并入本文。

可将目的表达型序列置于最小BEST2启动子的控制之下，使得目的序列在宿主NPCEC中转录为RNA。目的表达型序列可以包括但不限于编码目的多肽的基因、RNAi、调控RNA序列或报告基因。在一些实施例中，所述表达型序列与所述构建体中的所述最小启动子可操作地连接。

在一些实施例中，所述表达型序列是编码目的RNA干扰(RNAi)核酸或调控RNA的多核苷酸，例如但不限于微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹状RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、反义核酸等。编码所述RNAi核酸或调控RNA的所述核苷酸序列可以与所述最小启动子可操作地连接，以允许通过在合适的宿主细胞中转录产生所述RNAi核酸或调控RNA。

在一些实施例中，所述表达型序列是编码目的多肽的多核苷酸。目的多肽可以是任何类型的蛋白/肽，包括但不限于酶、细胞外基质蛋白、受体、转运蛋白、离子通道或其他膜蛋白、激素、神经肽、抗体或细胞骨架蛋白质；或其片段，或目的生物活性结构域。

在一些实施例中，目的多肽是用于基因组编辑的序列特异性核酸内切酶。所述序列特异性核酸内切酶用于在所述基因组的特定位点形成双链断裂，其中所述NPCEC特异性启动子构建体用于将所述序列特异性核酸内切酶的产生定位于NPCEC。然后，可通过非同源末端接合(NHEJ)、微同源介导的末端接合(MMEJ)或同源定向修复(HDR)途径修复双链断裂。可使用供体DNA将所需的基因组编辑引入所述基因组，以通过同源重组修复双链断裂。多种序列特异性核酸内切酶可用于基因组编辑，以在DNA中形成双链断裂，包括但不限于工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)Cas9。参见，例如，使用位点特异性核酸酶进行靶向基因组编辑：ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9***(T.Yamamoto编辑，Springer，2015)；基因组编辑：基因治疗的下一步(实验医学和生物学进展，T.Cathomen、M.Hirsch和M.Porteus编辑，Springer，2016)；AachenPress，基因组编辑(CreateSpace独立发布平台，2015)；其内容以引用方式并入本文。可通过以下方式来实现对所述基因组编辑酶产生时间的精确控制：将调控序列包括在所述启动子构建体中，使得所述最小1BEST2启动子处于可诱导状态，并将编码所述基因组编辑酶的重组多核苷酸与所述诱导型启动子可操作地连接，以便根据需要开启并关闭表达。

构建体中可以包括的示例性报告基因包括但不限于编码荧光或发光蛋白的报告基因，所述蛋白诸如红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。或者，所述报告基因可以是在作用于底物时产生可检测产物的酶，例如萤光素酶(例如，萤火虫、海肾或长腹水蚤属萤光素酶)，其催化与萤光素的反应以产生光。在某些实施例中，所述报告基因与目的基因连接，以监测目的基因的表达。在某些实施例中，所述报告基因是mRNA。

编码序列可以含有也可以不含信号肽或前导序列。可使用天然存在的信号肽或异源序列。宿主可在翻译后处理中移除前导序列。在***包含所述诱导型启动子构建体的载体之前，可以将控制序列和其他调控序列与所述编码序列连接。或者，可将所述编码序列直接克隆到已经含有所述控制序列和适当限制性位点的表达载体中。

在某些情况下，可能需要修饰所述编码序列，使其能够以适当的朝向附接于所述控制序列；即，保持读码框适当。突变体或类似物可以通过删除编码所述蛋白的所述序列的一部分、***序列和/或替换所述序列内的一个或更多个核苷酸来制备。修饰核苷酸序列的技术(例如定点诱变)是本领域技术人员所熟知的技术。参见，例如，Sambrook等人，同上；DNA克隆，第I和II卷，同上；核酸杂交(S.Lukyanov编辑，Springer，2007)。

包含与表达型序列(其编码目的基因产物)可操作地连接的所述最小BEST2启动子构建体的表达载体可用于转化分离的细胞、细胞系或细胞群体，其中如果所述细胞是NPCEC，则目的基因产物由所述细胞选择性地表达。在一些实施例中，所述基因产物是分泌的蛋白。所述转化细胞将所述蛋白产物分泌至周围介质中。所述载体可包括某些调控序列以增强所述蛋白产物的分泌，例如使用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列、干扰素(或)信号序列或源自已知分泌蛋白的其他信号肽序列增强。然后，可以通过本文所述的各种技术分离所述分泌的蛋白产物，例如，使用标准纯化技术，例如但不限于羟基磷灰石树脂、柱色谱法、离子交换色谱法、尺寸排除色谱法、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和色谱法、免疫沉淀等。

或者，不分泌蛋白，并且使用化学、物理或机械手段破坏转化的细胞，这些手段使细胞裂解且无法使重组蛋白保持基本完整。胞内蛋白也可以通过去除细胞膜上的成分来获得，例如，使用去污剂或有机溶剂去除所述成分，从而引起多肽渗漏。此类方法是本领域技术人员已知的方法，详见，例如，蛋白质纯化应用：实用方法(Simon Roe，编辑，2001)。

例如，破坏细胞的方法包括但不限于：声波处理或超声波处理；搅动；液体或固体挤压；热处理；冻融；干燥；***性减压；渗透休克；用裂解酶处理，包括蛋白酶如胰蛋白酶、神经氨酸酶和溶菌酶；碱处理；以及使用清洁剂和溶剂如胆盐、十二烷基硫酸钠、Triton、NP40和CHAPS。用于破坏细胞的特定技术在很大程度上是一个选择问题，其取决于表达所述多肽的细胞类型、培养条件和使用的任何预处理。

细胞遭到破坏后，通常通过离心去除细胞碎片，并使用标准纯化技术进一步纯化细胞内产生的肽或多肽，所述纯化技术诸如(但不限于)柱色谱法、离子交换色谱法、尺寸排除色谱法、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和色谱法、免疫沉淀等。

例如，一种获得细胞内蛋白的方法涉及亲和纯化，例如通过使用抗体(例如，先前产生的抗体)进行免疫亲和色谱分析或通过凝集素亲和色谱法实现。特别优选的凝集素树脂是能识别甘露糖部分的树脂，例如(但不限于)衍生自雪花莲凝集素(GNA)、小扁豆凝集素(LCA或兵豆凝集素)、豌豆凝集素(PSA或豌豆凝集素)、黄水仙凝集素(NPA)和熊葱凝集素(AUA)的树脂。本领域技术人员负责选择合适的亲和树脂。在亲和纯化之后，可以使用本领域所熟知的常规技术进一步纯化已表达的蛋白，例如通过上述技术中的任一项纯化。

哺乳动物宿主中的NPCEC特异性表达

可将包含编码目的基因产物的表达型序列的核酸***包含所述NPCEC特异性启动子构建体的表达载体中，以形成能够在哺乳动物宿主的NPCEC中选择性地产生目的基因产物的表达盒。表达盒通常包括与所述编码序列可操作地连接的控制元件，其允许在所述受试者物种体内表达所述基因。例如，目的表达型序列与所述最小BEST2启动子可操作地连接，以允许哺乳动物表达。可凭经验确定构建体产生所述基因产物的能力。

通常，还存在位于所述翻译终止密码子3′端的转录终止和多腺苷酸化序列。优选地，还存在位于所述编码序列5′端的用于优化翻译起始的序列。转录终止子/多腺苷酸化信号的示例包括源自SV40的终止子或信号(详见以下出版物：Sambrook等人，同上)以及牛生长激素终止子序列。

增强子元件还可以用于提高所述哺乳动物构建体的表达水平。示例包括SV40早期基因增强子，详见以下出版物：Dijkema等人，欧洲分子生物学组织期刊(1985)，4：761；源自劳斯肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子，详见以下出版物：Gorman等人，美国国家科学院院刊(1982b)，79：6777；以及源自人类CMV的元件，详见以下出版物：Boshart等人，细胞(1985)，41：521，例如包括在CMV内含子A序列中的元件。

此外，5′-UTR序列可与所述编码序列毗邻放置，以增强其表达。此类序列可以包括包含内部核糖体进入位点(IRES)的UTR。包括IRES即允许通过载体翻译一个或更多个开放阅读框。IRES元件吸引真核核糖体翻译起始复合物并促进翻译起始。参见，例如，Kaufman等人，核酸研究(1991)，19：4485-4490；Gurtu等人，生物化学与生物物理学研究通讯(1996)，229：295-298；Rees等人，生物技术(1996)，20：102-110；Kobayashi等人，生物技术(1996)，21：399-402；以及Mosser等人，生物技术(1997)，22150-161。许多IRES序列是已知的，包括衍生自多种病毒的序列，例如小核糖核酸病毒的前导序列如脑心肌炎病毒(EMCV)UTR(Jang等人，病毒学杂志(1989)，63：1651-1660)、脊髓灰质炎前导序列、甲型肝炎病毒前导序列、丙型肝炎病毒IRES、人鼻病毒2型IRES(Dobrikova等人，美国国家科学院院刊(2003)，100(25)：15125-15130)、源自***病毒的IRES元件(Ramesh等人，核酸研究(1996)，24：2697-2700)、贾第虫病毒IRES(Garlapati等人，生物化学杂志(2004)，279(5)：3389-3397)，等等。本文中还使用了多种非病毒IRES序列，包括但不限于源自酵母的IRES序列以及人血管紧张素II 1型受体IRES(Martin等人，分子与细胞内分泌学(2003)，212：51-61)、成纤维细胞生长因子IRES(FGF-1IRES和FGF-2IRES，Martineau等人(2004)，分子与细胞生物学，24(17)：7622-7635)、血管内皮生长因子IRES(Baranick等人(2008)，美国国家科学院院报，105(12)：4733-4738；Stein等人(1998)，分子与细胞生物学，18(6)：3112-3119；Bert等人(2006)，RNA，12(6)：1074-1083)和***2IRES(Pedersen等人(2002)，生物化学杂志，363(Pt 1)：37-44)。这些元件可以商购获得，其位于诸如由Clontech(加州山景城)、Invivogen(加州圣地亚哥)、Addgene(马萨诸塞州坎布里奇)和GeneCopoeia(马里兰州罗克维尔)出售的质粒中。另请参阅IRESite：经实验验证的IRES结构数据库(iresite.org)。载体中可以包括IRES序列，例如，以组合表达多种蛋白产物。

或者，编码病毒T2A肽的多核苷酸可用于利用单个载体产生多种蛋白产物。将2A连接肽***多顺反子构建体的编码序列之间。自裂解的2A肽允许来自多顺反子构建体的共表达蛋白质以等摩尔水平产生。可以使用来自多种病毒的2A肽，包括但不限于衍生自***病毒、马鼻炎A病毒、明脉扁刺蛾病毒和猪捷申-1的2A肽。参见，例如，Kim等人(2011)，PLoSOne，6(4)：e18556，Trichas等人(2008)BMC生物学，6：40；Provost等人(2007)，Genesis，45(10)：625-629；Furler等人(2001)，基因疗法，8(11)：864-873；其内容以引用方式全文并入本文。

在某些实施例中，通过在所述构建体中包括选择标记表达盒，在体外或体内鉴定含有所述NPCEC特异性启动子构建体的细胞。选择标记赋予所述细胞可识别的变化，以便阳性选择具有所述构建体的细胞。例如，荧光或生物发光标记(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、Dronpa、mCherry、mOrange、mPlum、Venus、YPet、藻红蛋白或荧光素酶)、细胞表面标记、表达报告基因(例如，GFP、dsRed、GUS、lacZ、CAT)、药物选择标记(例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素或组胺醇的抗性的基因)可用于鉴定细胞。或者，可以使用诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)等酶。可以使用任何选择标记，前提是它能够在所述细胞中表达，以便鉴定含有所述构建体的经遗传修饰的细胞。选择标记的其他示例为本领域技术人员所熟知。

在某些实施例中，所述选择标记表达盒编码两种或更多种选择标记。选择标记可以组合使用，例如细胞表面标记可以与荧光标记结合使用，或者药物抗性基因可以与***基因结合使用。在某些实施例中，所述选择标记表达盒是多顺反子表达盒，能够组合表达多种选择标记。所述多顺反子载体可以包括IRES或病毒2A肽，以便通过单个载体表达一种以上的选择标记。

在某些实施例中，包括***标记作为阴性选择标记以促进细胞的阴性选择。***基因可用于通过在经遗传修饰的细胞中诱导细胞凋亡或将无毒药物转化为有毒化合物来选择性地杀灭细胞。示例包括编码胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、细胞内抗体、端粒酶、半胱天冬酶和DNA酶的***基因。在某些实施例中，***基因与一种或更多种其他选择标记组合使用，例如上述用于细胞阳性选择的选择标记。此外，***基因可以用于经遗传修饰的细胞中，例如，通过允许随意破坏它们来提高它们的安全性。参见，例如，Jones等人(2014)，药理学前沿，5：254；Mitsui等人(2017)，分子疗法：方法与临床发展，5：51-58；Greco等人(2015)，药理学前沿，6：95；其内容以引用方式并入本文。

一旦完成，即可使用标准基因递送方案将编码目的基因产物的所述构建体施用于受试者。基因递送方法是本领域已知的方法。参见，例如，第5,399,346、5,580,859、5,589,466号美国专利。可将基因直接递送至脊椎动物受试者中，或者，可将所述基因离体递送至源自所述受试者的细胞和再植入所述受试者体内的所述细胞中。

现已开发了许多基于病毒的***，用于将基因转移至哺乳动物细胞中。这些病毒包括腺病毒、逆转录病毒(γ-逆转录病毒和慢病毒)、痘病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒(参见，例如，Warnock等人(2011)，分子生物学方法，737：1-25；Walther等人(2000)，药物，60(2)：249-271；以及Lundstrom(2003)，生物技术动向，21(3)：117-122；其内容以引用方式并入本文)。

例如，逆转录病毒为基因递送***提供了适宜的平台。可以使用本领域已知的技术将选定的序列***载体，并包装于逆转录病毒颗粒中。然后，可以在体内或离体分离重组病毒，并将其递送至所述受试者的细胞中。已经描述了许多逆转录病毒***(第5,219,740号美国专利；Miller和Rosman(1989)，生物技术，7：980-990；Miller，A.D.(1990)，人类基因疗法，1：5-14；Scarpa等人(1991)，病毒学，180：849-852；Burns等人(1993)，美国国家科学院院刊，90：8033-8037；Boris-Lawrie和Temin(1993)，遗传学与发育新见，3，102-109；以及Ferry等人(2011)，当今药物设计，17(24)：2516-2527)。慢病毒是一类特别适用于将多核苷酸递送至哺乳动物细胞中的逆转录病毒，因为它们能够感染***细胞和非***细胞(参见，例如，Lois等人(2002)，科学，295：868-872；Durand等人(2011)，病毒，3(2)：132-159；其内容以引用方式并入本文)。

本发明还描述了许多腺病毒载体。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒持续存在于染色体外，能够最大限度地降低与***诱变相关的风险(Haj-Ahmad和Graham，病毒学杂志(1986)，57：267-274；Bett等人，病毒学杂志(1993)，67：5911-5921；Mittereder等人，人类基因疗法(1994)，5：717-729；Seth等人，病毒学杂志(1994)，68：933-940；Barr等人，基因疗法(1994)，1：51-58；Berkner，K.L.，生物技术(1988)，6：616-629；以及Rich等人，人类基因疗法(1993)，4：461-476)。此外，已经开发了多种腺相关病毒(AAV)载体***用于基因递送。可使用本领域所熟知的技术轻易地构建AAV载体。参见，例如，第5,173,414和5,139,941号美国专利；第WO 92/01070(于1992年1月23日公开)和WO 93/03769(于1993年3月4日公开)号国际专利出版物；Lebkowski等人，分子与细胞生物学(1988)，8：3988-3996；Vincent等人，疫苗，90(1990)(冷泉港实验室出版社)；Carter，B.J.，生物技术新见(1992)，3：533-539；Muzyczka，N.，微生物学和免疫学最新话题(1992)，158：97-129；Kotin，R.M.，人类基因疗法(1994)，5：793-801；Shelling和Smith，基因疗法(1994)，1：165-169；以及Zhou等人，实验医学杂志(1994)，179：1867-1875。

可用于递送本发明的构建体的另一种载体***是肠内施用的重组痘病毒疫苗，详见以下出版物：Small，Jr.，P.A.等人(第5,676,950号美国专利，于1997年10月14日发布，其内容以引用方式并入本文)。

可用于递送构建体(包含与所述BEST2最小启动子可操作地连接的目的表达型序列)的其他病毒载体包括源自痘病毒家族的载体，包括牛痘病毒和禽痘病毒。例如，可按如下方式构建表达目的基因产物的牛痘病毒重组体。首先将编码特定基因产物的表达型序列***适当的载体中，使其与牛痘启动子和侧翼牛痘DNA序列(例如编码胸苷激酶(TK)的序列)相邻。然后，使用此载体转染同时感染牛痘的细胞。同源重组可将牛痘启动子和编码目的编码序列的基因***病毒基因组中。可通过在5-溴脱氧尿苷存在的情况下培养细胞，并挑选出对其具有抗性的病毒斑来选择所得到的TK-重组体。

或者，还可使用禽痘病毒(例如鸡痘病毒和金丝雀痘病毒)来递送构建体。在人和其他哺乳动物物种中使用禽痘载体尤为可取，因为禽痘病毒属的成员只能在易感禽类物种中进行有效复制，因此其在哺乳动物细胞中不具感染性。用于生产重组禽痘病毒的方法是本领域已知的方法，并且在牛痘病毒生产方面采用如上所述的基因重组方法。参见，例如，WO 91/12882；WO 89/03429；以及WO 92/03545。

诸如腺病毒嵌合载体等分子共轭载体(请见以下出版物：Michael等人，生物化学杂志(1993)，268：6866-6869；以及Wagner等人，美国国家科学院院刊(1992)，89：6099-6103)也可用于基因递送。

甲病毒属的成员(例如但不限于源自辛德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)的载体)也可用作病毒载体以递送构建体。有关用于实施本方法的辛德比斯病毒衍生的载体的描述，请参见以下出版物：Dubensky等人(1996)，病毒学，70：508-519；第WO 95/07995、WO 96/17072号国际专利出版物；Dubensky，Jr.、T.W.，等人，第5,843,723号美国专利，于1998年12月1日发布；Dubensky，Jr.，T.w.，第5,789,245号美国专利，于1998年8月4日发布，其内容均以引用方式并入本文。特别优选的嵌合甲病毒载体由源白辛德毕斯病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的序列组成。参见，例如，Perri等人(2003)，病毒学，77：10394-10403；以及第WO 02/099035、WO 02/080982、WO 01/81609和WO00/61772号国际专利出版物；其全文以引用方式并入本文。

还可在无病毒载体的情况下递送包含与目的表达型序列可操作地连接的最小BEST2启动子的合成表达盒。例如，所述合成表达盒可在递送至所述受试者或源于其的细胞之前包装为脂质体中的DNA或RNA。脂质包封通常使用能够稳定结合或包埋和保留核酸的脂质体来实现。浓缩DNA与脂质制剂的比例可以发生变化，但通常约为1∶1(mg DNA：微摩尔脂质)或更多脂质。有关使用脂质体作为核酸递送载体的综述，请参见以下出版物：Hug和Sleight，生物化学与生物物理学学报(1991)，1097：1-17；Straubinger等人，酶学方法(1983)，第101卷，第512-527页。

用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电)、阴离子(带负电)和中性制剂，特别优选阳离子脂质体。据证实，在功能上，阳离子脂质体能够介导以下各项的细胞内递送：质粒DNA(Felgner等人，美国国家科学院院刊(1987)，84：7413-7416)；mRNA(Malone等人，美国国家科学院院刊(1989)，86：6077-6081)；以及纯化的转录因子(Debs等人，生物化学杂志(1990)，265：10189-10192)。

阳离子脂质体可以轻易获得。例如，N[1-2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三乙铵(DOTMA)脂质体可从位于纽约州格兰德岛的GIBCO BRL获得，其商标名为Lipofectin。(另见Felgner等人，美国国家科学院院刊(1987)，84：7413-7416)。其他可商购的脂质包括(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其他阳离子脂质体均可使用本领域所熟知的技术利用现成的物料制备。参见，例如，Szoka等人，美国国家科学院院刊(1978)，75：4194-4198；第WO90/11092号PCT出版物，了解有关DOTAP(1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷)脂质体合成的信息。

类似地，可通过诸如Avanti Polar Lipids(阿拉巴马州伯明翰)轻易获得阴离子和中性脂质体，或者可使用现成的物质轻易地制备这些脂质体。这些物料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。这些物料还可与DOTMA和DOTAP起始物料以适当的比例混合。使用这些物料制备脂质体的方法是本领域所熟知的方法。

脂质体可包含多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)或大单层囊泡(LUV)。使用本领域已知的方法制备多种脂质体-核酸复合物。参见，例如，Straubinger等人，免疫学方法(1983)，第101卷，第512-527页；Szoka等人，美国国家科学院院刊(1978)，75：4194-4198；Papahadjopoulos等人，生物化学与生物物理学学报(1975)，394：483；Wilson等人，细胞(1979)，17：77；Deamer和Bangham，生物化学与生物物理学学报(1976)，443：629；Ostro等入，生物化学与生物物理学研究通讯(1977)，76：836；Fraley等入，美国国家科学院院刊(1979)，76：3348；Enoch和Strittmatter，美国国家科学院院刊(1979)，76：145；Fraley等人，生物化学杂志(1980)，255：10431；Szoka和Papahadjopoulos，美国国家科学院院刊(1978)，75：145；以及Schaefer-Ridder等人，科学(1982)，215：166。

可在与以下出版物中所述的结构类似的螺旋状脂质组合物中递送DNA和/或肽：Papahadjopoulos等人，生物化学与生物物理学学报(1975)，394：483-491。另见，第4,663,161和4,871,488号美国专利。

还可以将包含与目的表达型序列可操作地连接的最小BEST2启动子的表达盒包封入、吸附至微粒载体中或使其与微粒载体缔合。微粒载体的示例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的载体，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(称为PLG)的微粒。参见，例如，Jeffery等人，药学研究(1993)，10：362-368；McGee J.P.等人，微囊化杂志，14(2)：197-210，1997；O′Hagan D.T.等人，疫苗，11(2)：149-54，1993。

此外，其他微粒***和聚合物可用于体内或离体递送目的核酸。例如，聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺以及这些分子的共轭物)可用于转移目的核酸。类似地，DEAE右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀或使用其他不溶性无机盐(例如磷酸锶、硅酸铝包括膨润土和高岭土、氧化铬、硅酸镁、滑石等)进行的沉淀可与本发明的方法结合使用。参见，例如，Felgner，P.L.，先进药物递送综述(1990)，5：163-187，了解用于基因转移的递送***的综述。类肽(Zuckerman，R.N.等人，第5,831,005号美国专利，于1998年11月3日发布，其内容以引用形式并入本文)也可以用于递送本发明的构建体。

此外，采用微粒载体(例如金和钨)的基因枪递送***尤其适合递送包含与目的表达型序列可操作地连接的最小BEST2启动子的合成表达盒。用合成表达盒包被颗粒，通常在还原气氛下，通过“基因枪”的枪粉排放，递送合成表达盒并使其加速至高速。有关此类技术以及因此有用的装置的描述，参见，例如，第4,945,050、5,036,006、5,100,792、5,179,022、5,371,015和5,478,744号美国专利。此外，可使用无针注射***(Davis，H.L.等人，疫苗，12：1503-1509，1994；Bioject，Inc.，奥勒冈州波特兰)。

在一些实施例中，在治疗眼病的基因治疗应用中使用携带表达盒的重组载体，所述表达盒包含与目的表达型序列可操作地连接的最小BEST2启动子。所述载体可配制成组合物，以递送至脊椎动物受试者(例如哺乳动物受试者，优选人)中。这些组合物可以是预防性组合物(以预防疾病或病症)或治疗性组合物(以治疗疾病或病症)。所述组合物将包含“治疗有效量”的目的核酸，以便在体内生成足以在施用其的个体中产生治疗益处的量的目的基因产物。所需的确切量将根据以下方面确定：所治疗的受试者；待治疗受试者的年龄和全身情况；所需的保护程度；正在治疗的病症的严重程度；产生的特定治疗剂；给药方式等因素。本领域技术人员可以轻易地确定合适的有效量。因此，“治疗有效量”会落在可通过常规试验确定的相对较宽的范围内。

所述组合物通常包括一种或更多种“药学上可接受的赋形剂或溶媒”，例如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇等。另外，助剂如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、表面活性剂等，可以存在于此类溶媒中。某些核酸摄取和/或表达的促进剂也可以包括在所述组合物中或联合施用。

配制好后，所述组合物可以直接施用于所述受试者(例如，如上所述)，或者，使用诸如上述方法离体递送至源自所述受试者的细胞中。例如，用于将转化细胞离体递送和再植入受试者中的方法是本领域已知的方法，并且可包括，例如，右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、lipofectamine和LT-1介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封于脂质体中，以及将DNA直接显微镜下注射至细胞核中。

通常在有或无病毒载体的情况下，通过使用常规注射器、Bioject等无针设备或Accell基因递送***(PowderMed Ltd，英国牛津)等基因枪进行注射，如上所述直接在体内递送包含所述NPCEC特异性启动子(其与目的表达型序列可操作地连接)的表达盒组合物。

试剂盒

本发明还提供了用于在NPCEC中表达目的基因产物的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒提供了如本文所述的包含最小BEST2启动子和转录起始位点(TSS)的构建体，或包含此类构建体的表达盒或表达载体。所述试剂盒中还可以包括其他试剂，例如转染剂、NPCEC、用于培养NPCEC的合适培养基、缓冲液等。

在一些实施例中，所述试剂盒包含构建体，其包含以下序列：最小BEST2启动子核苷酸序列，其选自由序列号：1和序列号：2组成的群组；或与所述核苷酸序列的序列同一性至少为约80-100％的序列，包括此范围内的任何同一性百分比，例如与所述核苷酸序列的序列同一性为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％

对于试剂盒，这些药剂中的任何一种可以液体或固体形式装于任何适宜的包装(例如，棒状包装、剂量包装等)中。试剂盒中的所述药剂可以装于相同或不同的容器中。所述药剂也可以装于同一容器中。除上述组分外，标的试剂盒可能进一步包括(在某些实施例中)用于实施标的方法的说明书。这些说明书可能以各种形式存在于标的试剂盒中，其中一种或更多种可能存在于试剂盒中。这些说明书可能存在的一种形式是印在合适的介质或基材(例如，其上印有信息的一张纸或几张纸)、试剂盒包装、包装说明书等之上的印刷信息。这些说明书存在的另一种形式是其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。这些说明书可能存在的另一种形式是网址，可以借此通过互联网访问远程网站上的信息。

本发明现在被充分描述，本领域普通技术人员显而易见的是，可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下进行各种改变和修改。

实验

提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制发明人所认为其发明的范围，也无意表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保所使用数字(例如数量、温度等)的准确性，但是应该允许存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力指大气压或接近大气压。

为了包括本发明优选的实施方式，已根据发明人发现或提出的特定实施例来描述本发明。本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的内容，在不脱离本发明预期范围的情况下，可对列举的特定实施例进行多种修改和变更。例如，由于密码子冗余，可以在不影响蛋白质序列的情况下改变潜在的DNA序列。此外，出于对生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物作用种类或数量的情况下改变蛋白质的结构。所有这些修改都会包括在所附权利要求的范围内。

示例1

非色素睫状上皮细胞的体外靶向

睫状体不仅在眼病(即，青光眼)中起关键作用，而且还含有许多其他可能的治疗靶点，例如肾上腺素能α和β受体、多巴胺受体、***素受体和肽受体。图1展示了人眼内睫状体的位置示意图。睫状体能够持续分泌房水和控制眼内压(IOP)。它是高度血管化的组织，非色素睫状上皮细胞(NPCEC)充当屏障。

用含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该蛋白由组成型活性EF1a(延伸因子1α)启动子驱动，LTR，长末端重复序列；U3/U5，独特的3′端或5′端区域；Psi，核衣壳包装的RNA靶位点；RRE，Rev应答元件；cPPT，中央多聚嘌呤区；PGK，磷酸甘油酸激酶启动子；Puro，嘌呤霉素抗性基因；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(图2A)。在转染后24小时，可通过荧光显微镜检查于5倍放大倍率下在ARPE19和NPCE细胞中检测到GFP(图2B)。FAC分选表明，慢病毒构建体在ARPE19和NPCE细胞中的转染效率约为35％(图2C)。

示例2

鉴定非色素睫状上皮细胞特异性启动子序列

BEST2基因在NPCEC而非其他上皮细胞(例如眼部的RPE细胞)中特异性地表达。虽然无BEST2启动子特异性预测位点，但是BEST2基因上游的区域是启动子序列的建议位置。用含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该质粒构建体由位于BEST2基因(chr19：12,751,702-12,758,458)上游约1.1kb且与该基因本身有一些重叠的序列(chr19：12,750,691-12,751,903)驱动。如果该上游区域含有BEST2的启动子，则GFP应当在NPCE而非ARPE19细胞中表达。质粒示意图请见图3。质粒含有多克隆位点(MCS)、牛生长激素多腺苷酸化(BGH pA)序列、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、新霉素抗性基因(Neo)选择标记和氨苄青霉素抗性基因(Amp)选择标记。

接下来，缩减假定含有BEST2启动子的上游区域的大小，以确定驱动非色素睫状上皮细胞优先靶向的启动子序列。生成含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体，该蛋白由组成型活性EF1a(延伸因子1α)启动子、位于BEST2基因(chr19：12,751,702-12,758,458)上游约1.1kb的序列(启动子1；chr19：12,750,691-12,751,903)以及该上游区域的缩短版本(缩短至100bp，启动子2-14)驱动。用含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，该蛋白由图4A中所示的各启动子驱动(EFla和启动子1-14)。图4B展示了转染后约24小时EF1a启动子(对照品)和启动子1、3、4、6和13对应的GFP阳性细胞的代表性图像。对于各细胞系，用启动子1-14转染后，进行FAC分选，确定GFP阳性ARPE19或NPCE细胞所占的百分比，相对于EF1a对照数据进行归一化。启动子13(序列号：1中的100bp序列)对NPCE细胞的特异性优于ARPE19细胞(图4C。

示例3

排除VMD2L1的额外预测启动子区域

设计了三个位于启动子1上游的额外启动子序列(启动子15-17；chr19：12,749,703-12,750,691)，建议第二区域中含有适用于BEST2基因的潜在启动子(图5A)。用含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒构建体转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE19)和人非色素睫状上皮细胞(NPCEC)(该蛋白由启动子15-17(见图5A)驱动)，将其结果与EF1a对照品的结果进行比较。图5B展示了转染后约24小时EF1a启动子(对照品)和启动子15-17对应的GFP阳性细胞的代表性图像。对于含有启动子15-17的质粒，未检测到GFP。

示例4

在VMD2L1的启动子区域结合的转录因子

针对测试的14个启动子的序列区域(起始于BEST2基因上游约1.1kb处，且与BEST2基因有一些重叠)研究了转录因子结合情况(图6A)。已知在1.2kb区域内结合的、经测试可在NPCEC和BEST2基因中特异性地驱动GFP表达的转录因子的位置见图6B。

示例5

使用VMD2L1驱动的绿色荧光蛋白进行玻璃体内注射时在体内优先靶向非色素睫 状上皮细胞

生成含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒，该蛋白由组成型活性EF1a(延伸因子1α)启动子或适用于BEST2基因的启动子13驱动。慢病毒有效转导HEK293T细胞，对于EF1a，该慢病毒的滴度为4×10⁸，对于启动子13病毒载体，该慢病毒的滴度为1.2×10⁸。HEK293T细胞中产生的慢病毒将通过玻璃体内注射进入小鼠眼部，以显示出对非色素睫状上皮细胞的GFP表达特异性(图7D)。

示例6

非色素睫状上皮细胞中CRISPR/Cas9介导的β-肾上腺素能受体2敲低

用慢病毒构建体转染人NPCEC，该构建体含有针对β-肾上腺素能受体2(ADRB2)的导向RNA(gRNA)以及由组成型活性EFS(短延伸因子1α)启动子驱动的SpCas9FIG(图8A)。用对照品(无gRNA)或适用于ADRB2的gRNA 1-5转染的NPCEC用嘌呤霉素处理至少3天，然后收集用于蛋白印迹分析。基于GAPDH归一化ADRB2蛋白条带，各gRNA将ADRB2蛋白敲低约50％(图8B)。用对照品(无gRNA)或适用于ADRB2的gRNA 1-5的双重和三重组合转染的NPCEC用嘌呤霉素处理至少3天，然后收集用于蛋白印迹分析。基于GAPDH归一化ADRB2蛋白条带，使用两种gRNA将ADRB2蛋白敲低约80-90％，其中gRNA 1和gRNA 2表现出的ADRB2蛋白敲低活性最强(图8C-8E)。

序列表

<110> 小利兰·斯坦福大学董事会（The Board of Trustees of the LelandStanford Junior University）

<120> 非色素睫状上皮细胞特异性启动子

<130> STAN-1602 (S18-557)

<150> 62/905,910

<151> 2019-09-25

<160> 2

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人类

<400> 1

tgaagctaca gcctagccga gggaggagga ccaggaaagg gaggcacgcc cactccccag 60

ccccacccaa cgccaaagcc acccgcccat tccatccctg 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

gacttgggag gggctgccca cgcccactcc ccagctcctt cccaaacagt ctggcttcag 60

ccccacccaa tactgaagac accctccctt ttagtctctg 100

Claims (56)

1.一种包含最小BEST2启动子和转录起始位点(TSS)的重组启动子构建体，其中所述重组启动子构建体对非色素睫状上皮细胞(NPCEC)中的转录具有特异性。

2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述最小BEST2启动子包含对应于人19号染色体的12,751,703-12,751,803位的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的构建体，其中所述最小BEST2启动子包含选自由以下各项组成的群组的核苷酸序列：

a)选自由序列号：1和序列号：2组成的群组的核苷酸序列；以及

b)与选自由序列号：1和序列号：2组成的群组的核苷酸序列的序列同一性至少为95％的核苷酸序列，其中所述启动子能够进行NPCEC特异性转录。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体，其进一步包含一个或更多个转录因子结合位点。

5.根据权利要求4所述的构建体，其中所述一个或更多个转录因子结合位点选自由ZNF143、AP-2、KLF9、p63、KLF1、ER、EGR2、STAT5A、EGR3、Sp1、Sp4、MAZ和ERG组成的群组。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的构建体，其进一步包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的一条或更多条调控序列。

7.根据权利要求6所述的构建体，其中至少一条调控序列是增强子。

8.根据权利要求6或7所述的构建体，其中至少一条调控序列使所述最小BEST2启动子处于可诱导状态。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的构建体，其中所述构建体具有非天然构型，所述非天然构型具有位于所述最小BEST2启动子与所述TSS之间的非天然间隔、位于所述最小BEST2启动子与至少一条调控序列之间的非天然间隔或位于至少两条调控序列之间的非天然间隔。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的构建体，其中所述构建体具有非天然TSS或非天然调控序列。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的构建体，其进一步包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的表达型序列。

12.根据权利要求11所述的构建体，其中所述表达型序列编码多肽或调控RNA。

13.根据权利要求12所述的构建体，其中所述多肽是序列特异性核酸内切酶。

14.根据权利要求13所述的构建体，其中所述序列特异性核酸内切酶是基因组编辑酶。

15.根据权利要求14所述的构建体，其中所述基因组编辑酶是CRISPR相关蛋白9(Cas9)多肽、锌指核酸酶、TALEN或酶法失活的II型CRISPR/Cas多肽。

16.根据权利要求14或15所述的构建体，其中所述表达型序列编码Cas9导向RNA。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的构建体，其进一步包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的病毒T2A肽或IRES序列。

18.根据权利要求17所述的构建体，其中所述构建体是多顺反子构建体，其包含编码Cas9多肽的第一表达型序列以及编码与所述最小BEST2启动子可操作地连接的Cas9导向RNA的第二表达型序列。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的构建体，其中所述构建体是双链构建体。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的构建体，其中所述构建体是DNA或RNA构建体。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的构建体，其中所述构建体进一步包含编码报告基因的核苷酸序列，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列与所述最小BEST2启动子可操作地连接。

22.根据权利要求21所述的构建体，其中所述报告基因是提供可检测信号的多肽。

23.根据权利要求22所述的构建体，其中所述报告基因是荧光多肽或在作用于底物时生成可检测产物的酶。

24.根据权利要求23所述的构建体，其中所述荧光多肽是红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

25.根据权利要求23所述的构建体，其中所述酶是荧光素酶。

26.一种包含根据权利要求1至25中任一项所述的构建体的表达盒，其中所述表达盒能够在NPCEC中特异性地提供基因表达。

27.一种包含根据权利要求26所述的表达盒的表达载体。

28.根据权利要求27所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。

29.根据权利要求28所述的表达载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

30.根据权利要求29所述的表达载体，其中所述载体包含长末端重复序列(LTR)、Ψ包装信号、rev应答元件(RRE)和中央多聚嘌呤区(cPPT)。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的表达载体，其进一步包含选择标记。

32.根据权利要求31所述的表达载体，其中所述选择标记是抗生素抗性基因。

33.根据权利要求27至32中任一项所述的表达载体，其进一步包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

34.根据权利要求27至33中任一项所述的表达载体，其进一步包含哺乳动物复制起点。

35.根据权利要求34所述的表达载体，其中所述哺乳动物复制起点是猿猴病毒40(SV40)复制起点。

36.根据权利要求27至35中任一项所述的表达载体，其进一步包含多克隆位点。

37.根据权利要求27至36中任一项所述的表达载体，其进一步包含多腺苷酸化位点。

38.根据权利要求27至37中任一项所述的表达载体，其进一步包含SV40早期启动子。

39.根据权利要求27至38中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是双链表达载体。

40.根据权利要求27至39中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是DNA或RNA表达载体。

41.根据权利要求27至40中任一项所述的表达载体，其中所述构建体包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的多肽编码序列。

42.根据权利要求27至41中任一项所述的表达载体，其中所述构建体包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的Cas9导向RNA编码序列。

43.一种分离的非色素睫状上皮细胞(NPCEC)，其用根据权利要求1至25中任一项所述的构建体、根据权利要求26所述的表达盒或根据权利要求27至42中任一项所述的表达载体进行遗传修饰。

44.根据权利要求43所述的NPCEC，其中所述细胞是转化细胞系或原代细胞。

45.根据权利要求43或44所述的NPCEC，其中根据权利要求1至25中任一项所述的构建体、根据权利要求26所述的表达盒或根据权利要求27至42中任一项所述的表达载体被整合到所述细胞的基因组中。

46.一种在哺乳动物受试者中将目的表达型序列的表达定位于NPCEC的方法，所述方法包含将根据权利要求27至42中任一项所述的表达载体引入所述受试者的眼部，其中目的表达型序列在所述NPCEC中选择性地表达。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述表达型序列编码多肽或调控RNA。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述多肽是序列特异性核酸内切酶。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述序列特异性核酸内切酶是基因组编辑酶。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述基因组编辑酶是CRISPR相关蛋白9(Cas9)多肽、锌指核酸酶、TALEN或酶法失活的II型CRISPR/Cas多肽。

51.根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述表达型序列编码Cas9导向RNA。

52.根据权利要求46至51中任一项所述的方法，其中所述表达载体包含与所述最小BEST2启动子可操作地连接的病毒T2A肽或IRES序列。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述表达载体是多顺反子表达载体，其包含编码Cas9多肽的第一表达型序列以及编码与所述最小BEST2启动子可操作地连接的Cas9导向RNA的第二表达型序列。

54.一种在NPCEC中特异性地表达目的基因产物的方法，所述方法包含：

a)用根据权利要求1至25中任一项所述的构建体转染分离的细胞、细胞系或细胞群体，其中所述最小BEST2启动子与编码目的基因产物的表达型序列可操作地连接；以及

b)如果所述细胞是NPCEC，则在其中目的基因产物由所述细胞表达的条件下培养所述分离的细胞、所述细胞系或所述细胞群体。

55.一种用于在NPCEC中表达基因的试剂盒，其包含根据权利要求1至25中任一项所述的构建体、根据权利要求26所述的表达盒或根据权利要求27至42中任一项所述的表达载体。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述最小BEST2启动子包含选自由以下各项组成的群组的核苷酸序列：

a)选自由序列号：1和序列号：2组成的群组的核苷酸序列；以及

b)与选自由序列号：1和序列号：2组成的群组的核苷酸序列的序列同一性至少为95％的核苷酸序列，其中所述启动子能够进行NPCEC特异性转录。

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