CN114760844A - 用于促进和增强植物生长以及预防和抑制植物病害的方法以及植物提取物的组合物 - Google Patents

用于促进和增强植物生长以及预防和抑制植物病害的方法以及植物提取物的组合物 Download PDF

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Abstract

一种植物组合物，作为叶面施用或土壤浇灌施用在植物上以促进生长并预防或抑制所述植物上的病害。植物组合物包含百里香叶颗粒提取物和白屈菜提取物。该组合物通常以0.2％至5％的浓度稀释。

Description

用于促进和增强植物生长以及预防和抑制植物病害的方法以 及植物提取物的组合物
相关申请的交叉引用
本专利申请要求共同转让的序号为62/878,600、标题为“用于促进和增强植物生长以及预防和抑制植物病害的方法以及植物提取物的组合物”，且于2019年7月25日向美国专利商标局提交的美国专利申请的优先权权益。
本发明的技术领域
本发明总体上涉及用于植物生长和保护的植物提取物。
本发明的技术背景
市面上已经有多种用于帮助植物生长或治疗病害的溶液。其中一些使用化学品，而另一些则使用有机成分。化学溶液，即使它们经常提供最好的结果，也可能对接触了被处理的植物的人类健康产生不利影响。另一方面，有机溶液通常不具有必要的效率。因此，需要一种与市场上发现的大多数化学溶液一样有效甚至更高效的有机溶液，以帮助植物生长和治愈病害。
用于农业的草药提取物由天然存在的植物(或其他生物体)配制而成，作为合成化学品的替代品，合成化学品可能对种植者、消费者更具毒性，并且对环境更有害。与合成化学替代品相比，由于没有有害残留物，此类产品的优势在于可生物降解性和对自然更环保。由于所列出的这些优势，世界各地的农业产业都在开发植物药品，为可持续农业做出贡献。在植物生长周期的初始阶段(发芽和早期幼苗生长)测试这些产品的功效是一个昂贵且耗时的过程。发芽率通常由培养皿测定法确定。对于早期生长，通常使用另一种涉及水培或温室生长(直接发芽)的***。制定了标准操作程序，用于分析草药提取物对发芽和早期生长(SOP)的影响。这是通过修改由国际种子测试协会(ISTA，1985)提出的卷筒纸巾测试在所定义的***中完成的。SOP的功效通过与直接发芽试验进行比较来确定。SOP具有以下优点：(1)有效测试潜在生长刺激剂对种子发芽和早期生长的影响；(2)时间(持续2周)和空间效率；(3)可重复的；在生长室的规定条件下进行；(4)相对简单且成本低的方法，可由工作人员在行业中执行，只需最少的培训和容易获得的材料。
发明内容
本发明的上述和其他目的通常通过提供促进植物生长和预防或抑制植物病害的植物组合物来实现。
在本发明的一个方面，提供了一种植物组合物。植物组合物包含百里香叶颗粒提取物、白屈菜根提取物和白屈菜叶提取物。该组合物以0.2％至5％的浓度稀释，该组合物用于促进植物生长和预防或抑制植物病害。
植物组合物可包含0.1％至99％的白屈菜根提取物、0.1％至99％的白屈菜叶提取物和0.1％至30％的百里香叶颗粒提取物。
植物组合物可以被稀释至0.5％和5％之间的浓度。植物组合物可具有抗菌和/或抗真菌特性。植物组合物还可包含酊剂或海草。所述海草可以是泡叶藻(Ascophyllumnodosum)。该组合物可包含0.5至2g/L的海藻。
所述组合物还可包含额外的百里香叶提取物。百里香叶提取物可以是百里香叶提取物在50％酒精中以1:2稀释。
所述组合物还可包含百里酚或蓍草叶的提取物。蓍草叶提取物可在50％酒精中按1:2稀释。
植物组合物还可包含土壤混合物。土壤混合物可包含椰子壳纤维。土壤混合物还可包含泥炭藓和珍珠岩或菌根。
在本发明的另一个方面，提供了一种植物组合物。该植物组合物包含在50％酒精中以1:2稀释的蓍草叶提取物，该组合物用于促进植物生长和预防或抑制植物病害。植物组合物还可具有抗细菌和/或抗真菌特性。
可以使用冷压或冷冻干燥来制备提取物。可以使用涉及使用发酵加工的技术进一步制备提取物。发酵可以是好氧的或厌氧的。产生的细菌可能是乳酸菌或可能源自芽孢杆菌属物种。
在本发明的又一方面，提供了一种使用植物组合物处理植物的方法。该植物组合物包含浓度在0.2％至5％之间的百里香叶颗粒提取物和白屈菜提取物，该方法还包括使用浓度在0.2％至5％之间的植物组合物的对该植物进行土壤浇灌。在这样的方法中，土壤浇灌可以单次施用或可以在预定时间段内分次施用。
在本发明的另一方面，提供了一种使用植物组合物处理植物的方法，其中植物组合物包含浓度在0.2％至5％之间的百里香叶颗粒提取物、白屈菜提取物。该方法包括将浓度为0.2％至5％的植物组合物施用于植物的叶片。植物组合物的应用可以包括将叶片浸入植物组合物中。植物组合物的施用还可以包括用植物组合物喷洒叶片。
可以通过在预定的时间段内以单剂量或分剂量喷洒或浸渍叶片来施用植物组合物。
被认为是新颖的本发明的特征在所附权利要求中特别阐述。
简要附图说明
本发明的上述和其他目的、特征和优点将从以下描述中变得更加明显，并参考附图，其中：
图1A是示例性番茄植株的图示，第一番茄植株是对照组，而其他番茄植株用根据本发明的原理的植物提取物的不同组合物处理，图示显示高度指示。
图1B是图1的番茄植株的图示。图1A示出了叶绿素指示。
图2是在温室条件下生长的示例性生菜植株的图示，第一生菜植株是对照组，而其他生菜植株根据本发明的原理用植物提取物的不同组合物处理。
图3是图2显示有根的生菜植株的图示。
图4A是在单盆中生长的示例性生菜植株的图示，第一生菜植株作为对照组，而另一生菜植株用根据本发明原理的植物提取物的组合物进行处理。
图4B是图4A的生菜植株显示为在盆外且没有土壤的图示。
图5A是在单盆中生长的示例性烟草植株的图示，第一烟草植株作为对照组，而另一烟草植株用根据本发明原理的植物提取物的组合物进行处理。
图5B是图4A的烟草植株显示为在盆外且没有土壤的图示。
图6是根据本发明原理的用于大豆发芽的标准操作程序(SOP)的图示。
图7是具有相同遗传学信息的示例性***芽的图示，左侧的***芽用根据本发明原理的植物提取物的生物刺激剂组合物进行处理。
图8A是在第一次试验中用葡萄孢属菌塞感染的示例性生菜叶的图示，第一片生菜叶是对照组，而其他生菜叶用根据本发明原理的植物提取物的不同组合物进行处理。
图8B是在第二次试验中用灰葡萄孢菌块感染的示例性生菜叶的图示，第一生菜叶是对照组，而其他生菜叶用根据本发明原理的植物提取物的不同组合物处理。
图9A是显示用水和根据本发明的原理的植物提取物的组合物处理并用灰葡萄孢菌感染后的土壤浇灌过的健康植物的分离叶的病害指数的图，第一片叶片是对照组和其他水和植物提取物处理不同组合物。
图9B是图9A的分离叶的示意图。
图10A是根据本发明原理使用植物提取物的不同组合物进行土壤浇灌处理的番茄植株的图示。
图10B是放置在图10A的受感染番茄植株上方的防潮帐篷的图示。
图10C是对照组植株和用图10A的植物提取物的不同组合物处理的其他植物的病害指数和附着的番茄植株叶片的图示。
图10D是图10A的番茄植株叶片上的灰葡萄孢菌的图示。左侧植株为对照组，右侧植株为用具有1％的植物提取物的组合物进行处理。
图11A是土壤浇灌的番茄植株的图示，第一种植物是对照组，其他植物用根据本发明的原理的不同浓度的植物提取物进行处理。
图11B是图11A的土壤浇灌的番茄植株的病害指数的图示。
图12A是生菜(左)和番茄(右)叶的图示，顶排叶片是对照组，底排叶片浸没在根据本发明的原理的植物提取物中并用灰葡萄孢菌攻击。
图12B说明图12A的生菜和番茄叶的病害指数。
图13是分别用根据本发明原理的1％和2％浓度的植物提取物、1.5％漂白剂和水(对照组)处理的离体啤酒花叶片的示例性植物毒性反应的图示，所示叶片为处理48小时后的情况。
图14是用灰葡萄孢菌接种分离的啤酒花叶片的示例的图示，顶部叶片用根据本发明的原理的1％浓度的植物提取物处理，底部叶片用水处理，所示叶片是接种后约48h的情况。
图15是分别在受控生长室中生长以及用根据本发明原理的植物性药采用土壤浇灌法处理的示例性啤酒花的图示。
图16A是使用ImageJ软件(左部分)的病害严重程度的软件渲染，示出了在根据本发明的原理用土壤浇灌植物提取物处理的啤酒花上由葡萄孢菌引起的坏死病变百分比以及添加软件渲染之前的图像(右侧部分)。
图16B是使用分离的啤酒花叶片用灰葡萄孢菌攻击的土壤浇灌的啤酒花的图示，第一个用水处理(对照组)，其他用根据本发明的原理的不同浓度的植物提取物处理。
图17是显示根据对照组以及依本发明原理的不同浓度的植物提取物的受感染啤酒花叶片的面积百分比和发病率百分比的图表。
图18是用水处理(T5)和根据本发明的原理的1％浓度的植物提取物处理的***分离叶片的示例性植物毒性反应的图示，示出叶片为处理后6天的情况。
图19A是使用白粉病(PM)感染的叶片作为接种物来源，对用根据本发明的原理的植物提取物或对照组处理的***的分离叶片进行接种的方法的图示。
图19B是图19A所示的患有PM的叶片根据本发明的原理在接种后8天的示意图，其中箭头指示感染体征或症状。
图20是用PM感染并用根据本发明原理的植物提取物处理的***叶病害严重程度的软件渲染。
图21是第二个试验的图示，其中三个***品种已经用对照组进行处理或用根据本发明的原理的植物提取物与百里酚一起处理。
图22是用水(对照组)或根据本发明的原理的植物提取物处理的图21所示的分离的受感染的不同品种的***叶的面积百分比图。
图23是在不同品种的***叶在接种39DPI天后用水(对照组)和根据本发明原理的的1％植物提取物与百里酚一起使用处理的病害进展的图示。
图24是显示高水平白粉病侵染的***植株的图示。
图25A是黄单胞菌与根据本发明原理的浓度为1％至5％植物提取物的图示。
图25B是黄单胞菌与百里香提取物(1:2在50％酒精中)组合的图示。
图25C是黄单胞菌与蓍草提取物(1:2在50％酒精中)组合的图示。
图26A至26C是用百里香和蓍草以及用根据本发明原理的植物提取物处理的环境沙门氏菌(S22)的图示。
图27说明了致病性沙门氏菌(S1)，第一个用对照组处理，其他是百里香、蓍草提取物和根据本发明原理的不同浓度的植物提取物处理。
图28是沙门氏菌(S31-绿豆芽分离物)与百里香的图示。
图29是带有百里香(上图)和蓍草提取物(下图)的疥疮链霉菌的图示。
图30是用根据本发明原理的不同浓度的植物提取物接种后禾谷镰刀菌生长的图示，左侧板是在接种禾谷镰刀菌24小时后的PDA板，而右侧是接种禾谷镰刀菌数72小时后的PDA板。
图31是禾谷镰刀菌与百里香和蓍草提取物的生长示意图，左侧PDA平板是在接种禾谷镰刀菌后24小时，右侧PDA平板是在接种禾谷镰刀菌72小时后，T是百里香叶，Y是蓍草提取物，T和Y都是由申请人开发和制备的，T+和Y+分别是市售的百里香和蓍草提取物。
图32A是抗微生物和MIC测定的图示，一些是对照组处理的，而一些是用根据本发明原理的不同浓度的植物提取物处理的。
图32B是使用根据本发明原理的不同浓度的植物提取物与市售百里酚的组合的抗微生物和MIC测定的图示。
图33是使用百里酚或根据本发明原理的植物提取物与市售百里酚的组合的赭曲霉抗真菌和MIC测定的图示。
图34是禾谷镰刀菌孢子在不同时间(24小时至48小时之间)在根据本发明的原理的不同浓度的植物提取物溶液中孵育后发芽的图示。
图35是禾谷镰刀菌孢子在根据本发明原理的不同浓度的植物提取物溶液中温育不同时间段后发芽的20X图示。
优选实施例的详细描述
下文将描述用于促进和增强植物生长以及预防和抑制植物病害的新方法和植物提取物的组合物。尽管根据具体说明性实施例描述了本发明，但应理解，本文所述的实施例仅作为示例，并且本发明的范围不意在受此限制。
提供了一种植物组合物或百里香(Thymus vulgaris)的颗粒提取物与白屈菜(Chelidonium majus)的根、叶或其混合物的提取物的混合物，以促进植物生长并预防或抑制植物病害。植物组合物可以具有不同的浓度，例如但不限于浓度w/v0.2％、0.5％、1.0％、1.5％、2％和5％。浓度通常在蒸馏水中制备并过滤灭菌。在本公开中，除非特别提及，否则术语百里香酚通常是指百里香叶提取物，其在加入植物组合物或混合物之前在50％的酒精酊剂中以1:2稀释。此外，正如在一些实验中提到的，蓍草花提取物在使用前在50％酒精酊剂中按1:2稀释。
如上所述，百里香(Thymus vulgaris)的颗粒提取物和白屈菜(Chelidoniummajus)的根、叶或其混合物的提取物的植物组合物或混合物可用作生物刺激剂。根提取物、叶提取物或其两者的提取物可以与百里香的特定部分结合。
在混合物中使用的百里香以及根和叶的相对量可以在以下范围内：
·0.1％至99％的白屈菜根提取物；
·0.1％至99％的白屈菜叶提取物；以及
·0.1％至30％的百里香叶的颗粒提取物。
白屈菜的提取过程可以常规进行(10:1-70％乙醇)，然后喷雾干燥，或冷压或冷冻干燥。
可以进一步用各种细菌，使用需氧或厌氧发酵，来进行白屈菜的提取过程。在提取过程中使用的细菌这样一个示例是乳酸菌，也称为LAB。芽孢杆菌属的细菌也可用于该过程。
更多的百里香叶和/或蓍草叶或百里香或蓍草的任何其他部分可以进一步添加到组合物中。
实施例I:百里香和白屈菜的植物组合物对组织培养中生长的番茄植株的生长作用：
在第一个实施例中，番茄幼苗的根已经在组织培养中用不同示例性组成(0.5％、1％和2％)的植物组合物处理。处理三周后，将番茄植株从组织培养管中取出并记录叶绿素含量，并记录株高。
结果表明，三周后，与对照组相比，在组织培养中用植物组合物(0.5％、1％和2％)处理过的番茄幼苗的根具有更高的叶绿素含量并且总株高更高。
此处参考图1A和1B，图示说明了示例性番茄植株，番茄植株用不同浓度的植物组合物(0.0％(对照组)、0.5％、1％和2％)处理。图1A示出了高度指示，图1B示出了叶绿素指示。
表1：对照组和植物组合物处理过的番茄植株的叶绿素含量(μg.cm-2)。表中的数字代表每株两片复叶的平均值。记录每片叶片的三个单独读数。
表1：当用对照组和不同浓度的植物组合物处理时，处理过的番茄植株的叶绿素含量(μg.cm-2)。
Figure BDA0003548452180000061
*每次处理只记录一株植物的株高。
实施例II-植物提取物在温室条件下对幼苗生长的影响：
A-关于温室条件下位于生长室的托盘中的植物提取物的实验：
关于本示例性实验，将生菜种子播种至200个穴盘中的土壤混合物，例如Agro
Figure BDA0003548452180000062
G6(Fafard)，中用于发芽。生长两周后，生菜植株仅用根际(约1毫升/株)水(作为对照组)或浓度为1％的植物提取物处理。每种处理方式设置七(7)次重复。
现在参考图2和3，其示出了在温室条件下生长三(3)周后的生菜植株。从左到右，生菜植株用对照组处理，以及0.5％、1.0％和2.0％的浓度分别进行处理。图2示出了在盆中的生菜。图3显示被挖出的生菜植株的根部。
在三周的生长后，如图2和3所示，与对照组(仅水)相比，用植物提取物处理的生菜植株更健康、更高。浓度为0.5％的植物提取物与蓍草的剂量组合显示出健康的植物特征，例如但不限于良好的高度、绿色的叶片和粗壮的茎(未示出数据)。用浓度为1％或2％的植物提取物与百里香组合处理的生菜植株表现出或多或少类似于对照组植株特性的植株特性(数据未显示)。
表2：温室条件下生长的生菜叶的叶绿素含量(μg.cm-2)
处理 生菜叶绿素含量
对照组(H2O) 28.56±0.09
乙醇 26.5±0.707
蓍草 30.23±1.8
植物组合物0.5％ 29.63±0.80
植物组合物1.0％ 32.2±1.02
植物组合物2.0％ 30.6±0.60
*以上数字代表四株植物的平均值(每株两片复叶)。记录每片叶片的三个单独读数。
现在参考表2，在用1％浓度的植物组合物处理的生菜植株中发现最高的叶绿素含量，平均为32.2μg.cm-2。
表3：生菜的鲜重(FW)和干重(DW)，以克为单位
Figure BDA0003548452180000071
现在参考表3，浓度为1.0％的植物提取物产生最高的FW，为5.75g。如下表4所示，与对照组处理相比，植物组合物1％的总根长度(与处理无关)略高。
表4：生菜的总长度和根长(cm)(Ave)
Figure BDA0003548452180000072
关于本示例，不同浓缩率的植物组合物对植物(即生菜和烟草)表现出增强作用并促进它们的生长参数。植物组合物，即Agro
Figure BDA0003548452180000073
G6(Fafard)的改良剂，对植物产生了积极的增强作用并促进了它们的生长参数。植物组合物的成分和分子可以与土壤混合物的成分积极相互作用，例如但不限于通用土壤混合物Agro
Figure BDA0003548452180000074
G6(Fafard)。进一步有利的是使用包含椰子壳纤维、纤维泥炭、珍珠岩、石灰石、石膏和/或菌根的土壤混合物来帮助润湿、根系生长和矿物质保留。用市售土壤混合物(如Agro
Figure BDA0003548452180000075
)对植物组合物进行土壤改良可能有助于产生更健康的移植物，如在生菜中所示，并且可能进一步在其他植物中显示出类似的结果。
B-关于植物组合物对温室条件下盆栽生菜和烟草的影响的实验：
在另一个实验中，将烟草和生菜种子播种到200个穴盘中的第一种土壤混合物中，例如Agro
Figure BDA0003548452180000076
S4，用于发芽。在生长一(1)周后，将幼苗移植到具有第二土壤混合物，例如用14-14-14TYPE 70nutricote NPK改良的市售Agro
Figure BDA0003548452180000077
G6(Fafard)，的盆中(6英寸)。由于所述土壤混合物的特定泥炭组成，所使用的土壤混合物通常包含高孔隙率，其提供优异的排水和气体扩散。用以下一种处理方式对移植的幼苗进行处理：作为对照组的水处理，或1％浓度的植物组合物。每个处理过的盆以5天的间隔接受3次单一剂量的土壤浇灌(10毫升/盆)。4周后，4周后收获植物。在这样的实验中，所有处理均重复7次。
此处参考图4A和4B中，示出了在本实验中在单盆中生长的示例性生菜植株在盆中以及从盆中洗出土壤后的情况。与对照组相比，单独用1％浓度的植物组合物处理的生菜叶片更绿、更强壮，没有任何营养缺乏的迹象，对照组包括第二种土壤混合物(单独的Agro
Figure BDA0003548452180000078
G6)。1％浓度处理的生菜植株的鲜重和干重显著高于用对照组处理过的植株，如图4A和4B以及下表5。
表5：对照组处理植株中生菜植株的鲜重和干重以及高度
Figure BDA0003548452180000081
有趣的是，用1％浓度处理的生菜植株的叶绿素含量与用对照组处理的生菜植株的含量相似，如下表6所示。
表6：生菜植株的叶绿素含量(μg.cm-2)
重复 1％浓度的植物组合物 对照组
1 32.2 32.1
2 33.6 32.0
平均值 32.6±0.5 32.1±0.05
*表中数字代表平均四株植物(每株两片复叶)。记录每片叶片的三个单独读数。
基于本实验，不同浓缩率的植物组合物对温室条件下生长的植物(即生菜)表现出促进作用，并促进此类植物的生长参数。对用植物组合物对第一种土壤混合物，例如Agro
Figure BDA0003548452180000082
G6(Fafard)进行改良，进一步对植物产生了积极的增强作用，并促进了相同植物的生长参数。因此，植物组合物的成分和分子可以与第一种土壤混合物，例如Agro
Figure BDA0003548452180000083
G6(Fafard)，的成分发生积极的相互作用。
参考表5，与用对照组处理的植物相比，用1％植物组合物处理的植物具有更高的鲜重和干重和高度。总之，与用对照组处理的生菜植株相比，用1％植物组合物处理的生菜植株干重增加8％，鲜重增加10％，高度增加9.6％。
可以进一步观察到，在用1.0％植物组合物和对照组处理的植物中发现的叶绿素含量之间没有可辨别的差异。
此处参考图5A和5B，其示出了在单盆中生长的示例性烟草植株。参考图5A，其示出了在单盆中生长的烟草植株并且参考图5B，其示出了从盆中取出并洗去土壤的相同植株。图5A和5B中的左侧烟草植株以对照组(仅土壤混合物)进行处理，而右侧的植株用1.0％浓度的植物组合物进行处理。在仅使用土壤混合物(例如Agro
Figure BDA0003548452180000084
G6)的对照组盆中种植的烟草植株外观正常；高大、绿色、叶片大小，但底部叶片显示出缺乏迹象。用1％植物组合物处理的烟草植株更健康，并且具有更旺盛的特征，例如更高、更绿和更少的苍白叶片。用1％组合物处理的烟草植株比用对照组处理的植株具有更高的鲜重、干重和高度。
表7：烟草的鲜重、干重和高度(对照组，植物组合物)
Figure BDA0003548452180000091
*此表中的读数是三种植株的平均值。
现在参考表7，总之，与对照组相比，干重增加31％，鲜重增加28％，身高增加9.6％。
表8：对照组烟草的叶绿素含量(μg.cm-2)
Figure BDA0003548452180000092
*注意，每个读数代表从植物的两个相邻叶片获取的四个读数的平均值。
现在参考表8，其中记录了用1.0％的植物组合物处理的最高叶绿素含量，与对照组相比，增加了5.42％。
总之，当在温室条件下生长，不同浓缩率的植物组合物处理显示出对植物(例如但不限于烟草植株)的促进作用并促进所述植株的生长参数。当植物组合物与土壤混合物如Agro
Figure BDA0003548452180000093
G6(Fafard)结合时，对植物的促进作用进一步增加，并且这种组合物促进了所述植物的生长参数。植物组合物的成分和分子可能与土壤混合物的成分，例如Agro
Figure BDA0003548452180000094
G6(Fafard)，发生积极的相互作用，。
III-植物组合物的示例以及植物组合物与Stimulagro组合对大豆发芽和早期生长的实验：
在本示例性实验中，SOP方法用于评估不同草药治疗产品的效果，例如但不限于C7、包含白屈菜提取物和Stimulagro:泡叶藻提取物的植物组合物。Stimulagro是一种主要由藻类制成的组合物。草药产品单独或组合使用，用于大豆的发芽和早期生长，并与水对照组处理进行比较。该实验还包括测量生理特性，例如但不限于生长特性、生物量、叶绿素含量和气体交换参数。
实验进一步包括应用SOP。实验包括使用ISTA(1985)的卷纸测试并进行一些修改。ISTA方法使用干种子和湿纸。第一个修改涉及将种子浸泡在双蒸水中过夜(20-24小时)，并使用干燥的预折叠纸。这样，发芽延迟时间减少了，种子粘在干燥的纸上，纸更容易卷起来。测试是在从卷纸上剪下的纸上进行的，例如60×20厘米的剪纸(即Classique Kraftbrown，Servicorp，QC，加拿大)并纵向折叠，例如折叠成60×10厘米的部分。将种子放置在单行中，例如距顶部1厘米且相距5厘米。通过将纸再次纵向折叠以覆盖种子，将种子固定在适当的位置。将包含种子的长方形纸沿短轴滚动并用胶水或胶带固定，例如透明胶带-
Figure BDA0003548452180000101
MagicTM胶带3/4”×1296”，MN，USA。以种子朝向顶部的方式将该卷筒垂直放置在塑料容器内，例如1L容器，该容器包含一定比例的相应处理溶液，在这种情况下，示例性为40ml。将容器保存在预定条件下的生长室中，例如加拿大温尼伯的
Figure BDA0003548452180000102
环境室，设置为16:8h光：暗循环，温度为25±2℃，通量密度为400μM m-2s-1冷白光和白炽灯，以及50％的相对湿度。纸巾永远不会变干。每天早上，弃去残留培养基，加入相同比例(即40ml)的新鲜处理液。每天监测发芽。用15天大的幼苗测试生长(枝长、枝条新鲜和干燥质量)、叶绿素含量和光合速率。
光合作用测量：使用便携式红外气体分析仪，例如IRGA-LI-6400，LI-COR Inc.，Lincoln，NB，USA测量光合速率，例如μmol m-2s-1CO2。对大豆植株叶片的不同区域，例如用于种子处理的完全展开的单叶叶和用于叶面施用的完全展开的第三三叶叶，进行测量。在这样的实验中，在测量期间大约每30分钟进行一次红外气体分析仪(即IRGA)校准和调零。
叶绿素含量测量：使用SPAD502仪表，例如美国新泽西州的柯尼卡美能达光学公司，通过每次处理平均10个读数来估计完全展开的叶片的叶绿素含量。结果被显示在土壤植物分析开发(SPAD)单元中。
发芽、生长特征和生物量测量：每天监测发芽。使用尺子从基部到茎尖测量植物高度。在示例性测量过程中，新鲜(FM)和干燥(DM)枝条在三个随机选择的植株/卷(6株/重复)上采集并在分析天平上称重，例如
Figure BDA0003548452180000103
天平，Adam Equipment Inc.，美国康涅狄格州牛津。此外，在纸巾上方收获芽以用于FM测量，然后在示例性60℃下干燥72小时并称重以获得DM。
实验设计和统计分析：
实验设计是完全随机设计(CRD)。在这样的示例性设计中，CRD包括5个重复，每个重复20个种子，每卷10个种子，每个容器2卷。数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)，进行方差分析，例如单因素方差分析，然后是后期Newman-Keuls多项比较检验，例如使用软件GraphPad Prism版本5.01,2007，Graf Pad Software,Inc.，加利福尼亚州，美国。在示例性设计中，显著性水平为*P<0.05。
仅用1％植物组合物处理大豆种子导致干重在统计学上显著增加，例如示例性的12.9％。此外，结果表明，用植物组合物和Stimulagro的组合对大豆种子进行处理通常会导致处理后大豆的生理特性得到积极增强。在其他处理中，将1％植物组合物与Stimulagro的组合的处理被认为是最有益的处理。与水对照组相比，所述处理显著(P<0.05)增加了大豆幼苗(在这种情况下为2周龄)的芽高(即13.2％)、干重(即10.7％)和光合速率(即20.3％)(见表9中的示例性结果)。
表9：植物组合物(C7)、Stimulagro(ST)以及植物组合物和Stimulagro的组合对大豆的株高、鲜重和干重、SPAD单位和光合速率的影响。
Figure BDA0003548452180000111
如表9中所见，结果清楚地示出了当用与Stimulagro组合的植物组合物处理时大豆的生理特性、生长参数和光合作用速率的提高。
结果进一步强调了SOP-大豆的区别价值和一种草药提取物处理，特别是作为大豆的生长刺激剂，的潜力，如图6所示。SOP用于大豆的发芽和生长，分析植物组合物以及植物组合物与Stimulagro的组合对大豆发芽和早期生长的影响。仍参考图6，还示出了由国际种子测试协会(ISTA，1985)开发的卷筒纸巾测试的修改版本。
所遵循的方案(SOP-大豆)总结如下：
·为分析草药提取物对大豆发芽和早期生长的影响而开发的SOP(SOP-大豆)。
·修改了由国际种子测试协会(ISTA，1985)开发的卷筒纸巾测试。
参考图6，操作步骤包括：
a)在进行测定之前，将大豆种子浸泡预定时间，例如过夜(20小时)。
b)将吸收性材料，例如纸巾(即60厘米×20厘米)，纵向对折。
c)将预定数量的预浸种子(即10个)放置成一排，例如放置在距离顶部1厘米处，以5厘米间隔放置在一排中，每端留出5厘米。
d)通过将预先折叠好的纸放置在种子上，将种子固定到位。
e)将吸收材料再次折叠，例如1厘米，以加强卷纸的底部。
f)将含有种子的干纸纵向快速卷动并用胶带固定该纸。
g)将卷筒垂直放置在具有预定体积的处理溶液(例如40毫升)的透明容器中。
h)将容器保持在生长室中的规定条件下，例如保持在25±2℃和16：8小时白天：夜间循环，通量密度为400μMmm-2s-1。
i)每天添加预定体积的新鲜处理溶液，例如40ml。
本操作步骤通常旨在提供以下优点：
·测试潜在生长刺激剂对种子发芽和早期生长影响的有效方法。
·快速测试(即持续2周)和节省空间。
·可重复；在规定的生长条件下进行。
·相对简单和低成本的方法，可以由员工在产业中执行，仅需最少的培训和容易获得的材料。
IV.评估植物提取物提高盆栽***产量效果的实验
本实验使用“Candyland”杂交品种进行。为了识别或筛选生物刺激剂特性以及对开花和产量的影响，使用了具有足够材料进行试点试验的许可患者种植者。
该实验包括在***植株上测试几种浓度的植物提取物，从0.03到2％，以评估对芽大小和产量的影响。测试中使用了具有相同遗传学的相同品种。测试的植物总数为120。植物组合物处理组使用总共60株植物，未处理对照组使用60株植物。将处理过的植物与对照组植株进行比较，两者均在常规家庭温室条件下进行水培生长。对植株应用叶面施肥、灌根或叶面施肥和土壤浇灌的组合。
为了测试生物刺激剂效果，在使用的情况下，不同处理范围为0.03至2％浓度的植物组合物，例如单独根浸或根浸结合叶面施用，总共施用4至30次。如图7所示，实验性处理导致作物更健康并显著提高和增加***花的产量和大小。图7的左侧示出了除常规施肥和管理方案之外用0.03至2％的植物组合物处理的***(Cannabis sativa)植株芽的处理结果。图7的右侧示出了仅接受常规施肥/管理方案的***植株芽的结果。在本实验中，与对照组处理的植株相比，用植物提取物处理的植株的总产量提高了25％。具有相同遗传学的相似植物品种用于对照组和处理组的测试。
作为生物杀菌剂的植物组合物：
根据另一个实施方案，植物组合物可以进一步用作生物杀真菌剂，从而帮助治疗或阻止病害在植物上的传播。
I-用植物组合物单独或与蓍草组合处理的生菜叶的叶面处理导致治疗或抑制灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)：
在第一个测试中，将灰葡萄孢菌块(5mm)放置在处理过的植物(植物组合物的单剂量或植物组合物与蓍草(Y)的组合剂量)以及对照组(水)的分离叶片上。叶片被保存在带有湿滤纸的托盘中，例如Pyrex托盘。每天观察处理过的叶片。72小时后记录生菜叶感染结果。
现在参考图图8和表10，示出了用葡萄孢属菌块感染并如上所述处理的生菜叶的两个试验，一个在左侧，另一个在右侧。用对照组处理的植物的生菜叶坏死病变直径较高，而用单独的植物组合物处理的植株较低。
表10：用1％植物组合物或者用水对照组处理的生菜的坏死直径
处理 生菜坏死直径(cm)
对照组 2.28cm±1.16
植物组合物(1.0％) 0.6cm±0.07
植物组合物(1.0％)+蓍草50:50 1.4cm±0.28
*坏死直径是从10片叶子中读取到的平均值
II-温室试验评估植物提取物抑制番茄和生菜上灰霉病的功效
在示例性试验中，有机番茄和生菜种子在预定数量的，例如20个，穴盘的土壤混合物，例如Agro
Figure BDA0003548452180000121
S4(Fafard)，中发芽。生长2周后，将幼苗移植到盆，例如直径为6英寸的盆，中的另一种土壤混合物，例如用14-14-14TYPE 70nutricote NPK修正的Agromix G6(Fafard)内。将盆置于标准温室生长条件下的随机区组设计(RBD)中，并使用自动化***进行灌溉。所有试验重复两次。合并重复试验的适当数据。
为了确定植物组合物是否可以抑制病害，使用不同的方法施用1％浓度的植物组合物：首先是土壤浇灌，其次是浸叶。
土壤浇灌：
在第一种处理方法中，4周龄的盆栽植物接受单剂量的1％的植物组合物，例如10ml或20ml，作为土壤浇灌，以例如每24小时的频率重复，持续96小时。对照组处理改为接受水。如表11所示，使用不同的量将处理组(总共8个)应用到植株附近的土壤。植物组合物后处理24小时后，分离叶片和仍然附着在植株上的叶片用灰葡萄孢菌进行感染。此外，将不同浓度的植物组合物被用作土壤浇灌，以检查其在灰霉病发展过程中在病害抑制中的作用。
病害接种：
将来自新鲜生长的葡萄孢属真菌的真菌菌丝体插块置于土壤浇灌植株的均匀叶片上，并用植物组合物处理或用水基对照组处理。被感染的叶片用潮湿的塑料袋覆盖，以在其上形成一个潮湿的帐篷，如图9B和10所示。将植物置于单独的潮湿生长室中并在72小时后记录感染情况。
病害测量：
在接种72小时后记录分离叶和未分离叶的病害指数。按照Haliem(2012)和Steward和Macdonald(2014)的说明，使用ImageJ等渲染软件将病害指数测量为坏死病变区域与健康组织区域的比率，并记录为百分比。所有处理均重复10次，试验重复两次。对收集的数据进行平均，并使用JMP11(SAS单向方差分析，TukeyHSD，α0.05)分析处理组之间的差异，并指出处理组之间的显著性。
分离叶片：
与对照组处理相比，接受10ml重复剂量或20ml单剂量1％植物组合物(参见例如下表11的T1至T5)的植物成功地减少了损伤面积。图9A示出了用水(对照组)和植物组合物处理的土壤浇灌的健康植株之后用10ml至40ml灰葡萄孢菌感染后的植株的分离叶的病害指数值。图9B中的数值是每次处理10片叶片的平均值。此外，图9B示出了用对照组和不同量的植物组合物处理的植株的坏死病变。单剂量10ml的1％浓度的植物组合物，见表11中的1％，处理组T1，使坏死病变显著(P<0.05)减少84％，与具有>15％的坏死病变的叶组织的对照组处理相比，平均坏死病变面积为2％，参见图9A和B。另外，表11中的10ml的重复剂量处理组T2、T3和T4与对照组相比，在减少病变区域方面显著有效，而彼此之间没有显著差异。
非分离叶：
图1中所见的植物组合物土壤浇灌处理的结果显著降低了土壤浇灌的植株的未分离叶片上的感染，并且相比图9A和9B所示的体外分离的叶片更为有效。现在参考图10，其示出了土壤浇灌处理的方法和该方法的结果。分别地，在步骤A，番茄植株在盆中被土壤浇灌。在步骤B，在受感染的番茄叶片上安装一个防潮帐篷。在步骤C，制作病害指数，该指数显示了对用10ml至40ml范围的对照组和处理组的植株的受感染和附着的番茄叶片的数量。在步骤D，示出了来自对照组和用1.0％的植物组合物处理的番茄植株叶片上的灰霉病杆菌。与对照处理相比，病害指数下降了近90％。所有四种处理组，即表11中所示的T1至T4，的病害指数均显著降低。
表11：施用于番茄植株的植物组合物的土壤浸处理
Figure BDA0003548452180000141
以1％和2％的浓度施用植物组合物的土壤浇灌显示在病害发展期间有效抑制番茄上的灰霉病。与对照组植株相比，发现浓度为1％和2％的植物组合物在抑制番茄叶片病害方面显著有效。更重要的是，1％的植物组合物被确定为比2％浓度的植物组合物更有效。现参考图11A，用植物组合物通过土壤浇灌方式对番茄植株进行处理。从左到右为，对照组、浓度为1.0％的植物组合物，浓度为2.0％的植物组合物。现在参考图11B，其示出了用植物组合物通过土壤浇灌处理的番茄植株的病害指数。
在另一个实施方案中，将植物组合物添加到土壤混合物中，例如Agro
Figure BDA0003548452180000142
G6(Fafard)，使得番茄植株能够抵抗灰霉病的致病因子灰葡萄孢菌。植物组合物的成分和分子可以与土壤混合物的成分，如
Figure BDA0003548452180000143
G6(Fafard)，发生积极的相互作用，从而在植物，如番茄植株，中诱导抗病性。因此，对Agro
Figure BDA0003548452180000144
G6(Fafard)的植物成分改良导致番茄植株灰霉病得到抑制。
浸叶法：
第二种处理方法包括分离大小均匀的番茄和生菜叶片，并将所述分离叶片浸入1％的植物组合物中预定的持续时间，例如30秒。该方法还包括将浸没的叶片置于衬有湿滤纸的板中，例如Pyrex板。该方法还包括将对照组叶片浸入水中。该方法还包括将生长活跃的培养物的灰葡萄孢菌塞放置在对照组和用植物组合物处理的植株的分离叶片上。托盘被密封，例如使用包裹装置(即，Saran包裹)密封，并在室温下孵育，如图12A所示。孵育72小时后记录病害指数。
参考图12A中，示出了左侧的生菜叶和右侧的番茄叶。在这样的示例性实验中，将底行浸入，或在某些情况下浸没，至1％的植物组合物中并用灰葡萄孢菌感染，其中将顶行浸入水基对照组中。现参考图12B，病害指数显示为图标。在这样的示例中，病害指数是根据10个生物学重复计算的。与对照组处理相比，用植物组合物处理的生菜(以33％的减少量)和番茄(高达45％的减少量)中观察到显著的病害减少。
III.植物提取物植物组合物对在温室生产***下生长的***和啤酒花上的真菌病害的抑制功效
1.植物提取物组合物在啤酒花(Humulus lupulus)中的生物活性：叶面施用后对啤酒花分离叶的植物毒性试验：
在又一个示例性实验中，获得了Willamette品种的啤酒花根茎。该实验方法包括将根茎插条移植到土壤混合物中的盆中。例如，花盆为6英寸，土壤混合物为Agromix G6(Fafard)。该实验方法还包括在预定条件下，例如昼夜12/12小时，昼夜温度23/21℃，210光子μm-2s-1，湿度始终保持在65％一整天，放置在生长室中。
实验方法进一步包括从两个月大的植株上分离啤酒花叶片并将分离叶片放置在衬有湿滤纸的板，例如
Figure BDA0003548452180000151
板，中。现在参考图13，该方法还包括将叶片浸入不同浓度的植物组合物，例如3-ml的植物组合物中。在这样的实验中，每次处理使用来自三种不同植株的三片叶片并在室温下孵育。对照组处理包括作为阳性对照组的1.5％漂白剂和作为阴性对照组的水。
当植物暴露于对植物有毒的外部因素时会发生植物毒性，并且发生叶缘坏死和褐变、变黄(萎黄病)、黄色或棕色或黑色斑点(参见例如KristinGetter，密歇根州立大学推广部，园艺系)。如果与水处理相比，处理过的叶片表现出任何先前的症状，则认为植物组合物的浓度是植物毒性的。
仍然参考图13，示出了用植物组合物处理的离体啤酒花叶片在处理后两天的植物毒性反应。将叶片浸入预定体积(即3毫升)的两种不同浓度的植物组合物或相同预定体积(即3毫升)的漂白剂或水(对照组)中。该实验还包括用1％和2％的植物组合物处理组来涂覆分离叶片。该涂层不会对啤酒花产生或生成任何植物毒性。因此，当在温室生长条件下商业使用时，认为植物组合物的叶面施用量为0.2％至2％是安全的。
植物组合物在叶面施用后对灰霉病的杀真菌活性：
在另一个实验中，将来自啤酒花植株的两个月大的叶片分离并浸入3ml的相应处理组(不同浓度的植物组合物)中，并放置衬有湿滤纸的Pyrex板24小时。每个处理组有三片叶片。如图14所示，在叶片的中心用琼脂塞接种，该琼脂塞含有一周大的活跃生长的灰葡萄孢菌菌落。将板在室温下孵育48小时。对照处理组由仅用水处理的叶片组成。进一步在图14中，顶部叶片用1％浓度的植物组合物处理，其中底部叶片用水和灰葡萄孢菌进行处理。可以观察到，单次叶面施用1％的植物组合物可抑制啤酒花上的灰霉病。
施用土壤浇灌后的啤酒花分离叶片的植物毒性试验：
该实验的目的是测试当植物组合物被土壤浇灌并在预定时期内作为单剂量或分剂量施用时对盆栽植物、在Agromix G6(Fafard)中生长的啤酒花和叶片的植物毒性作用。在这个实验中，在这样的实验中，时间段是连续三天。
两个月大的啤酒花植株，如图15所示，用单独的水或1％浓度的植物组合物处理。如表12所示，通过移取所需量(例如在每株的树冠区域周围3厘米深)输送施用的植物药。每个处理组由两株盆栽植物组成。在个处理组中对总共6片叶片处理24小时后观察到植物毒性症状。
表12：施用于啤酒花植株的植物药的土壤浇灌处理
Figure BDA0003548452180000161
*表12的每个处理组由6片叶片组成。
参见表12中的T4至T6处理组，1％浓度的植物组合物单独或组合剂量不会对啤酒花造成任何植物毒性。事实上，植物药的分剂量施用通常有助于对植物产生无害影响。
植物组合物在土壤浇灌施用后对灰霉病的杀真菌活性：
在另一个实验中，该实验包括用真菌病原体，灰葡萄孢菌，体外攻击处理后的啤酒花植株。
在这样的示例性实验中，从生长在土壤混合物例如Agromix G6(Fafard)中的处理组和对照组植株中分离出六片大小均匀的叶片。该实验进一步包括将含有灰葡萄孢菌的琼脂塞(即5mm塞)放置在分离叶中心对分离叶进行接种。该实验还包括将受感染的叶片放置在托盘中，在托盘的底部有潮湿的滤纸，如图16A所示。然后将放置的感染叶片在室温下孵育特定时间，例如5天。该实验还包括控制叶片。对照组处理包括仅用水处理叶片。该实验还可以包括使用计算机程序评估病害严重程度。在这样的实验中，使用ImageJ软件对严重性进行评分或绘制地图，也显示在图16A中(Haliem，2012；Steward and Macdonald，2014)。在这样的实验中，病害严重程度被定义为感染面积与总叶面积的百分比。
统计分析
结果的统计分析可以包括对数据进行平均，并通过双向方差分析(ANOVA)分析处理组和对照组之间的差异，并且在必要时使用SPSS统计软件包v.22.0，(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)通过P<0.05时的最小显著性差异(LSD)进行分析。
比较仅用水进行土壤浇灌处理的植株(对照组处理)和施用1％的植物组合物进行土壤浇灌处理的植株。处理包括连续三天的三个剂量(T6，第1天＝20，第2天＝30，第3天＝20)。该比较导致病害发病率和病害严重程度的百分比分别显著降低50％和31％，如图16B、17和如下表13所述。在图17中，示出了来自对照组和处理组植株的受感染的分离的啤酒花叶片的面积百分比。仅计算受感染叶片的病害严重程度(受感染叶片面积/总叶片面积)。计算六片叶片的发病率(感染叶片数/叶片总数)。“*”表示使用最小显著差异(LSD)检验处理组和水对照组之间存在显著差异(P<0.05)。
表13:与水对照组处理相比，使用土壤浇灌法处理的啤酒花植株在感染期间病害严重程度降低％
Figure BDA0003548452180000171
*表示使用最小显著差异(LSD)检验处理组和水对照组之间的显著差异(P<0.05)
1.植物组合物提取物在***中的生物活性：
在另一个实施方案中，示例性浓度的植物药用于***幼苗。
叶面施用后啤酒花分离叶片的植物毒性试验：
在另一个示例性实验中，该实验包括将***叶从生长特定持续时间例如四个月的植株中分离。该实验进一步包括通过将所述叶片(即每次处理6片叶片)浸入以下浓度的植物组合物来处理分离叶片：T3为1％，T5用于水处理，如图18所示。该实验进一步包括将叶片放入板，例如Pyrex板中，衬有湿滤纸并在室温下孵育。现参考图16，其示出了上述处理6天后的叶片。
基于本实验，单剂量的植物组合物(T3)不会对***造成任何植物毒性作用。
试验I:植物组合物在***叶面施用中预防白粉病的功效：
试验I包括使用分离的***叶。使用已经浸入不同处理组T3和T5的相同叶片(见上文)。白粉病(PM)接种物包括均匀感染PM分生孢子的叶片碎片(例如1cm2片)。每个叶片碎片位于被植物组合物处理过的(T3)或水处理过的(T5)叶的中心，如图19A所示。该试验还包括在室温下孵育板并监测病害随时间的发展，例如在接种后8天期间。该试验还包括通过将结果与仅水处理的对照处理组T5进行比较来评估病害严重程度和治疗的有效性。
来自***试验I的初步结果表明，单独的1％的植物组合物(T3)可防止白粉病(PM)的病害进展，并保持叶片绿色和健康。感染迹象仅在图19A和19B的水处理的叶片上观察到。图19B示出了接种后(8天)后的叶片，箭头表示感染的迹象或症状。由于试验I是一项初步筛选实验，因此进行了另一项试验，即试验II，以确认目前的结果并将试验扩展到包括对白粉病具有不同易感性的不同***品种。
试验II:植物组合物在三种***品种上预防白粉病的功效-叶面施用：
该试验II使用两个生物重复进行，使用三个品种的分离的***叶，这些品种已知它们对白粉病(PM)的不同易感性。这些品种为：品种I(易感)、品种II(易感)和品种III(高度易感)。每个品种用1％的植物组合物与百里酚的组合剂量进行处理，并与仅包含水的对照组处理进行比较。试验II包括分离每个品种的叶片并将所述分离叶片浸入1％植物组合物与百里酚的组合剂量或水剂量(对照组)中。在本试验II中，每次处理在五(5)片***叶上进行，实验重复两次。试验II还包括用感染的叶片碎片(例如1cm2)接种叶片。如先前在试验I中所述，每片碎片包括白粉病菌。试验II使用两片叶片碎皮代替试验I中使用的一片叶片碎片。试验II进一步包括在室温下培养板并监测病害随着时间的推移而进展。
试验II包括在确定的时间段内，例如感染后(DPI)的29天，记录或收集病害严重程度测量值。使用计算机程序，例如软件ImageJ，对病害严重程度进行评分，如图20所示。病害严重程度定义为受感染面积与总叶面积的比例(％)。在本试验II中，在12、18、26和29DPI记录或收集病害发生率。分析进一步包括对收集的数据进行平均并分析处理组和对照组之间的差异，示例性分析使用双向方差分析(ANOVA)，必要时使用SPSS统计软件包v.22.0(IBMCorp.，Armonk，NY，USA)在P<0.05时通过最小显著性差异(LSD)进行分析。
试验II被认为成功地确定了PM病害的存在和所述PM病害的进展。试验II进一步确定病害的存在和进展是由于两种接种源的存在和更长的潜伏期，因此认为这有助于有效的病害传播和成功的感染，如图21所示。
参照表14，在12DPI时，与用1％的植物组合物与百里酚(20％)的组合剂量处理的叶片相比，在水处理的叶片中的病害发生率更高，为60％至80％。在26DPI或更高时，除Sachigo品种外，大多数叶片都显示出病害迹象，发病率几乎达到100％，无论是水对照组还是植物药处理组。用1％浓度的植物组合物与百里酚组合处理的叶片的病害严重程度总是更轻。
表14：与水对照组处理相比，采用叶面施用法用1％浓度的植物组合物和百里酚处理后在不同DPI时的植物药对三种***品种的病害进展和白粉病严重程度的影响。DPI：日后
Figure BDA0003548452180000181
$％发病率是指在被筛选的总数为5的叶片中的感染叶片数。
λ病害严重程度降低是相对于对照组计算的。
*对照组处理包括将叶片浸入3ml水中。
现在参考图22，其示出了来自对照组(cont)(即水处理组)和处理组的(Trt)植物(其是与百里酚组合的1％的植物组合物)的受感染的分离***叶的面积百分比。病害严重程度的计算方法是感染叶面积除以总叶面积。术语“*”表示使用最小显著差异(LSD)检验处理组和水对照组之间的显著差异(P<0.05)。
现参考图23，在39DPI时，与水对照组中大部分叶片的症状相比，PM感染似乎仅限于用1％的植物组合物和百里酚的组合剂量处理的叶片中受限的坏死区域。仍参考图23中，所示的圆圈表示用与百里酚组合的浓度为1％的植物组合物处理的叶片中含有真菌，其中黑色箭头表示经水处理的叶片中变黄，这表示真菌仍然存活。如图所示，灰色箭头表示PM的迹象。
IV.评估植物提取物抑制盆栽***白粉病功效的中试试验
在又一个中试实验中，包括使用“Candyland”杂交品种。参考图24，白粉病几乎存在于大多数高强度植物上。
中试实验包括在***植株上测试几种浓度的植物组合物提取物，例如0.03至2％，以评估对白粉病的预防或治疗能力/特性。测试中使用了具有相同遗传学信息的相同品种。在这种用于白粉病预防控制的示例性中试实验中，测试的植物总数为120。该实验包括将测试的植物放置在充满白粉病感染植物(接种物)的房间中。示例性实验包括用植物组合物处理的包括总共60株植物的第一组和用对照组处理的包括60株植物的第二组。该实验进一步包括测试总共20株感染白粉病的植物以测量病害消除(治疗性处理)。该实验还包括一处理组，该处理组包括用不同浓度的植物组合物处理的10株植物，浓度通常为0.2％至2％。该实验还包括一对照组。对照组包括仅用水处理的10株植物。总是比较来自处理组和对照组的植物，并且来自两组的植物在常规家庭温室条件下水培生长。来自各组的植物使用喷叶、灌根或喷叶和土壤浇灌的组合进行处理。
在病害控制的背景下，通过喷叶或灌根途径或两者的组合来施用植物组合物，证明有效地从病害植物中完全消除白粉病。发现0.03至2％的浓度足以消除处理植物的病害。没有接受植物组合物的植株表现出高强度的病害。此外，值得一提的是，接受植物组合物的健康植株在处理后没有表现出或发展出任何病害迹象。此外，两次施用浓度范围为0.03至2％的植物组合物可以进一步足以消除患病植物的白粉病。这些结果与之前对***进行的测试一致，进一步支持了该产品的生物杀菌特性。
V.评估植物组合物和百里酚的组合对各种植物病原体和食源性病原体的生长抑 制的抗微生物特性。
在又一个实验方法中，使用不同浓度的植物组合物、百里香叶提取物、蓍草提取物、百里酚以及植物组合物和前述的组合来筛选它们的抗微生物特性。
植物提取物的制备：
单剂量制剂：
提供了一种制备单剂量植物组合物的植物提取物的方法。制备单剂量的方法包括将植物组合物溶解在水中并连续稀释以获得0.5％、1.0％和2.0％(w/v)的溶液。该方法可以进一步包括连续稀释至多5.％(w/v)。
该方法进一步包括制备浓度为1:256、1:512和1:768的百里酚。
该方法还包括制备以1:2的比例在50％酒精中组合的百里香叶和蓍草提取物。
组合剂量制剂：
还提供了制备组合剂量的植物组合物的植物提取物的方法。
该方法包括稀释每种植物组合物并将稀释的植物组合物混合至特定浓度的百里酚。
该方法进一步包括使用水和PDB作为阴性对照组并且使用乙醇作为阳性对照组。
MIC测定：为培养的病原体建立植物产品的最低抑菌浓度(MIC)。
伯克霍尔德试验：参考图1A至5B，为了用植物组合物的植物提取物(百里酚、百里香和蓍草叶提取物)进行生物测定，将来自每个浓度的确定体积(例如10μl)的溶解提取物点在细菌/真菌菌落上。对于阴性对照组，使用相同体积的水滴。在确定的持续时间，例如48小时后，观察到透明区形式的生长抑制，如图1A至5B中所示。。
制备孢子或分生孢子：
孢子或分生孢子的制备包括在PDA上生长灰葡萄孢菌和木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)3至4周。该制备还包括用一定体积的PDB(例如5ml1/4强度的PDB穿过无菌纱布)淹没培养板的表面，以收集孢子或分生孢子。在示例性制剂中，将孢子浓度/mL调节至106/mL。
孢子抑制百分比和MIC测定：
测定包括将确定体积(即5μl)的每种处理组或对照组一式两份放置在PDA板的表面上，并将放置的一式两份孵育48小时以测量菌丝生长。
使用96孔板并在生长培养基上抑制真菌孢子发芽的潜力
孢子收集：目标病原体：灰葡萄孢菌和禾谷镰刀菌(F.graminearum)。
与孢子混合的植物药的系列稀释液的制备：测量粉末状植物药组合物并稀释成浓度为0.5％、1.0％和2.0％的溶液。在其他实施方案中，植物组合物可进一步稀释成高至5.0％的溶液。百里香和蓍草提取物没有稀释而是被过滤。
96-孔培养：将所有溶液置于96-微量滴定板中，并将禾谷镰刀菌和灰霉病杆菌的孢子添加到溶液中。然后将板孵育24小时和48小时。用于血细胞计数器和PDA板的样品都是从同一板上采集的。
用混合有真菌孢子的植物提取物接种PDA：在PDA平板的4或5个特定点进行接种。每个点代表提取物和真菌孢子的不同溶液或与真菌孢子混合的不同浓度的植物组合物溶液。
为了测试三种浓度的提取物的抗真菌或抗微生物功效，对以下生物进行了测试：
细菌：
1-野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)细菌性叶斑病
2-沙门氏菌属(Salmonella spp.)(S531)与食物隔离(弱)
3-沙门氏菌属(Salmonella spp.)(S22)环境(中度)
4-沙门氏菌属(Salmonella spp.)(SL1)人类病原体(强)
真菌：
1-灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)灰霉病
2-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)小麦和大麦中的枯萎病
3-木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)小麦和大麦中的枯萎病
4-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)小麦和大麦中的枯萎病
5-赭曲霉(Aspergillus ochraceus)赭曲霉毒素A
用于确定植物组合物和其他提取物的抗微生物效率的MIC测定：
现参考表15和图25A至23，尽管已知白屈菜具有直接的抗微生物和抗真菌特性(Móricz等人，2015年；Parvu等人，2008年；)，但在水中稀释0.2至5％的植物组合物显示直接仅对禾谷镰刀菌有影响。现参考表15和图25A至25C，百里香叶提取物、蓍草叶提取物和百里香酚对筛选细菌和真菌非常有效，如表15和图25A至25C所示。现参考图25A，其示出了与浓度范围为1至5％的植物组合物提取物组合的黄单胞菌属。现参考图25B中，示出了黄单胞菌与百里香提取物在50％的酒精中以1:2的比例混合。现在参考图25C，其示出了黄单胞菌与蓍草提取物在50％的酒精中以1:2的比例混合。用植物提取物(植物组合物、百里酚、百里香和蓍草叶提取物)进行生物测定。将确定体积(例如10μl)的每个浓度的溶解提取物点在细菌菌落上。
现在参考图26A至26C，其示出了用百里香、蓍草、植物组合物和对照组(C)处理的环境沙门氏菌(S22)。用植物提取物(植物组合物、百里酚、百里香和蓍草叶提取物)进行生物测定。在细菌菌落上发现确定体积(即10μl)的每个浓度的溶解提取物。
现在参考图2。在图27中，左图示出了带有对照组的致病性沙门氏菌(S1)，右图示出了用百里香、蓍草提取物和植物组合物处理的沙门氏菌(S1)。使用植物提取物(植物成分、百里酚、百里香和蓍草叶提取物)进行生物测定，将确定体积(即10μl)的每个浓度的溶解提取物点在细菌菌落上。
现在参考图28，示出了用百里香处理的沙门氏菌(S31-绿豆芽分离物(mungbeansprout isolate))。这样的处理似乎是最有效的。使用植物提取物(植物成分、百里香酚、百里香和蓍草叶提取物)进行生物测定，将确定体积(即10μl)的每个浓度的溶解提取物点在细菌菌落上。
现在参考图29，示出了带有百里香(上图)和蓍草提取物(下图)的疥疮链霉菌(Streptomyces scabies)。使用植物提取物(植物成分、百里香酚、百里香和蓍草叶提取物)进行生物测定，将确定体积(即10μl)的每种浓度的溶解提取物点在细菌菌落上。
表15：提取物与真菌和细菌的生物测定。
Figure BDA0003548452180000211
Figure BDA0003548452180000221
*无抑制。表中数字代表三个单独板的净径区平均值
与对照组相比，用1.0％和2.0％的植物组合物(以及稍微0.5％)接种的禾谷镰刀菌似乎具有降低的生长。在用百里香混合溶液处理的真菌上没有观察到真菌的生长。植物成分和酊剂都抑制菌丝的生长。
参考图图30和31以及表16，蓍草提取物似乎比对照组市售产品更有效地抑制镰刀菌病原体的生长。现参考图30中，示出了用示例性浓度为0.5％、1.0％和2.0％的植物组合物接种后禾谷镰刀菌的生长。在图30中，左侧板上的PDA在接种禾谷镰刀菌24小时后显示，右侧板上的PDA在接种禾谷镰刀菌72小时后显示。现在参考图31中，示出了用百里香和蓍草提取物接种后禾谷镰刀菌的生长。在图31中，左侧的PDA板为接种禾谷镰刀菌24小时后的情况。右侧的PDA板为接种禾谷镰刀菌48小时后的情况。术语“T”是指百里香叶，而术语“Y”是指蓍草提取物，这样的术语T和Y是指由申请人开发和制备的百里香叶和蓍草提取物。术语“T+”是指百里香，术语“Y+”是指蓍草提取物，这两个术语均指市售百里香和蓍草提取物。
表16：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)×植物组合物和镰刀菌×百里香和蓍草提取物的平均生长。。
Figure BDA0003548452180000222
*数字代表6次重复的平均值/以cm为单位的浓度/“-”代表没有增长。
参照表16，认为该植物组合物允许百里酚在单独对下列细菌/真菌使用百里酚时无效的浓度下作为抗微生物剂或抗真菌剂有效：
1-野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)细菌性叶斑病
2-沙门氏菌属(Salmonella spp.)(S531)与食物隔离(弱)
3-沙门氏菌属(Salmonella spp.)(S22)环境(中度)
4-沙门氏菌属(Salmonella spp.)(SL1)人类病原体(强)
5-黄曲霉(Aspergillus ochraceus)
还考虑了与其他市售植物药如百里酚的协同效应。参考图32A至33，这种组合导致改进的抗微生物特性。浓度为2％的植物组合物与百里酚1:512组合对上述细菌(1至4)非常有效，因为知道单剂量的百里酚1:512无效。在大肠杆菌的致病品种上观察到相同的模式。
现参考图32，对于黄曲霉，观察到浓度为1％的植物组合物与百里酚1：768组合足以有效地阻止黄曲霉真菌的生长，因为知道单独的百里酚1：768是无效的。现在参考图32A中，示出了使用植物组合物的抗微生物和MIC测定。参考图32B中，示出了植物组合物和市售百里酚的组合。野油菜黄单胞菌(XP)、沙门氏菌属(S531)、沙门氏菌属(S22)、沙门氏菌属(SL1)仅用植物组合物或用植物组合物和市售百里酚的组合处理。用上述植物提取物进行生物测定。进行生物测定包括将每个浓度的确定体积(即10μl)的溶解提取物点在上述细菌的菌落上。
现在参考图33，其示出了使用植物组合物或植物组合物与市售百里酚的组合的黄曲霉抗真菌和MIC测定。用单独的植物组合物或用植物组合物和市售百里酚的组合处理黄曲霉。使用植物提取物进行生物测定，将每个浓度的确定体积(即10μl)的溶解提取物点在上述细菌的菌落上。
现在参考图34和35以及表17，进行了评估灰葡萄孢菌和禾谷镰刀菌的发芽率的体外研究。体外研究表明，植物成分对孢子发芽有刺激作用。不考虑目标病原体，植物组合物似乎在暴露24小时后随着浓度的增加具有孢子发芽的刺激作用。有趣的是，在暴露48小时后，包括对照组在内的所有处理中的发芽百分比(％)相似。48小时后，在PDB中生长的禾谷镰刀菌在用蓍草和百里香处理时有53％的孢子发芽。
现参考图35和表17，用百里香和蓍草处理以及用35％乙醇处理显示完全抑制。这些结果表明35％的乙醇是有毒的。现参考图34，示出了禾谷镰刀菌孢子在植物组合物溶液中孵育后发芽的视图(20x)。图35从左上以顺时针方向示出：24小时的植物组合物的2％溶液，24小时的1％浓度的植物组合物溶液，24小时的植物组合物的对照组溶液，以及48小时的植物组合物的1％溶液。可以观察到，无论植物组合物的浓度如何，镰袍霉属(usarium)孢子都在发芽。仍然参考图35示出了禾谷镰刀菌孢子在蓍草提取物溶液中温育后发芽的视图(20x)。图35从左上以顺时针方向说明：24小时的阳性对照组，48小时的根据本发明原理的蓍草产品，48小时的市售蓍草产品，以及48小时的阴性对照组。
表17:用0.5％、1.0％和2.0％浓度的植物组合物孵育24和48小时后灰葡萄孢菌和禾谷镰刀菌的发芽率
Figure BDA0003548452180000241
*所有数据均使用血细胞计数器和显微镜获取。所有百分比代表在血细胞计数器上随机选择的100个孢子中，带有测量x≥1.5x孢子长度的胚管的孢子数量。
总之，参考表17和图32A至35所示，体外研究表明，单独在水中稀释的植物组合物不具有直接的抗真菌或抗菌活性。在禾谷镰刀菌上仅观察到抗真菌特性。体外研究进一步表明，百里香和蓍草提取物是唯一具有抗真菌和抗菌抑制特性的植物提取物。同时，当组合使用时，该植物组合物显示出改善百里香叶提取物或百里酚的抗真菌和抗微生物特性。据信该植物组合物允许百里酚在单独使用百里酚时无效的浓度下作为抗微生物剂或抗真菌剂有效。最后，一项评估灰葡萄孢菌和禾谷镰刀菌发芽率的体外研究表明，植物成分对孢子发芽有促进作用。
在低于植物组合物的2％的浓度下，草本提取物在用于喷叶处理或土壤浇灌处理时不会对生菜、番茄、烟草、啤酒花和***的叶片产生任何植物毒性反应。该植物组合物被认为是在农业实践中应用的安全选择。与对照组相比，植物组合物的应用导致叶绿素含量(番茄和生菜幼苗和烟草成熟植物)、高度(番茄幼苗、生菜和烟草)以及鲜重和干重(生菜和烟草)显著增加。
对***植株的中试实验表明，植物组合物浓度范围为0.03％至2％的土壤浇灌、喷叶处理或其组合(土壤浇灌和喷叶)导致增加的芽大小和产量。此外，与水对照组相比，用浓度为1％的植物组合物和/或用植物组合物和海草藻类Stimulagro的组合处理大豆种子导致大豆生长和早期生长的显著增强。尽管在这些测试中使用了Stimulagro，但其他类型的海草或海草组合物可以与植物组合物结合使用。要使用的海草的一个这样的示例可以是泡叶藻(Ascophyllum nodosum)。发现该植物组合物与海藻或海草具有协同作用，与此类海藻或海草的提取或加工方法无关。该结果意味着该植物组合物可用作促进植物生长的生物刺激剂。更重要的是，使用土壤混合物(例如市售的Agro
Figure BDA0003548452180000242
G6(Fafard))对植物成分进行改良，对植物(例如但不限于生菜和烟草)产生了积极的促进作用，并促进了植物的生长参数，例如但不限于此类植物的叶绿素含量、高度、鲜重和干重。改良的植物组合物进一步抑制灰霉病。因此，用土壤混合物(例如但不限于Agro
Figure BDA0003548452180000243
(生菜和烟草))对植物组合物进行土壤改良可能有助于生产更健康的植物，如生菜和烟草所示，并且推测在其他植物上也显示出类似的结果。植物组合物成分和分子可能与土壤混合物，例如Agro
Figure BDA0003548452180000251
G6(Fafard)，的成分发生积极的相互作用。
植物组合物的植物提取物对细菌和真菌没有直接抑制作用。在禾谷镰刀菌上仅观察到抗真菌特性。体外试验显示与其他植物药(例如但不限于百里香叶和蓍草提取物和百里香酚)具有潜在的协同作用，可改善对重要细菌或真菌植物病原体的抗菌性能。评估灰葡萄孢菌和禾谷镰刀菌发芽率的体外研究表明，该植物成分对孢子发芽有促进作用。
基于对预防和治疗抗真菌作用的反复证明，植物组合物通常诱导针对感染的基于植物的反应，包括潜在的抗性类型。此外，植物组合物的治愈能力(例如***上的白粉病)和预防真菌疾病，例如叶面或地面浇灌的***白粉病、番茄、生菜和啤酒花的灰霉病，叶面施药的***白粉病一般都比平时好。植物组合物可用作生物杀虫剂以增强植物抵抗疾病的抵抗力。
VI.植物提取物的代谢物组成及生物活性分析
在又一个实验中，已经分析了包含根据上述实施方案的植物提取物的组合物，以确定存在的代谢物组分。
在这样的实验中，进行了两个系列的测试，第一个在叶片提取物上，第二个在根提取物上。在这样的示例性实验中，分析方法包括QE Orbitrap MS(LC/MS/MS)和GC/EI/MS代谢物分析。
叶提取物
在涉及叶提取物的测试中，发现鉴定的生物活性代谢物选自以下：芹菜素、染料木黄酮、京尼平、对香豆酰酪胺18-羟基油酸酯、4-香豆酰奎宁酸酯、绿原酸、染料木苷、咖啡酰莽草酸酯、15-HETE、对羟基苯甲酸、琥珀酸、酪醇、γ-羟基丁酸、香草酸、3-羟基苯甲酸、乙酸、咖啡酸、苯乙酸、磷酸。
仍然参考叶片提取物测试，发现以下代谢物在植物生理学中具有不同作用：外伤酸、脱落酸、表茉莉酸、茉莉酸、水杨基-HCH、外伤素、赤霉素、7-异甲基-茉莉酸、a-亚麻酸、吲哚-3-乙酸酯、a,a-海藻糖、a-亚麻酸、D-果糖。
根提取物
在涉及叶提取物的测试中，发现鉴定的生物活性代谢物选自以下：13-环氧十八烷-9、11-二烯酸、阿魏酸、9(S)、12(S)、13(S)-三羟基-10(E)-十八碳烯酸、芹菜素、染料木素、京尼平、对香豆酰酪胺18-羟基油酸酯、4-香豆酰奎宁酸酯、绿原酸、染料木苷、咖啡酰莽草酸、香草醛、琥珀酸、酪醇、γ-羟基丁酸、香草酸、4-香豆酸、乙酸、咖啡酸、苯乙酸、磷酸、泛酸。
仍然参考叶提取物测试，发现以下代谢物在植物生理学中具有不同作用：外伤酸、脱落酸、表茉莉酸、7-异茉莉酸、茉莉酸、水杨基-HCH、外伤素、赤霉素、7-异甲基茉莉酸酯、α-亚麻酸酯、吲哚-3-乙酸酯、α,α-海藻糖、谷胱甘肽、水杨酸酯、α-生育酚、α-亚麻酸、D-果糖、GABA。
代谢组学分析
进一步进行代谢组学分析。结果呈现在表18中，示出了化合物中生物碱的相对示例性浓度。生物碱在植物的保护和生长方面可能具有许多优势。
表18：根据代谢组学分析的包含在植物提取物的化合物中生物碱的相对浓度
Figure BDA0003548452180000252
Figure BDA0003548452180000261
*白屈菜中的生物碱含量可能因品种、植物部位、植物生长阶段和提取方法而异
尽管上文已详细描述了本发明的说明性和当前优选的实施例，但应理解，本发明构思可以以其他方式实施和采用，并且所附权利要求旨在解释为包括除受现有技术的限制之外的此类变化。

Claims (33)

1.一种植物组合物，包括：
百里香叶的颗粒提取物；
白屈菜(Chelidonium majus)根提取物；和
白屈菜(Chelidonium majus)叶提取物；
将所述组合物稀释至0.2％至5％的浓度，并且所述组合物用于促进植物生长和预防或抑制植物病害。
2.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述组合物包括：
0.1％至99％的所述白屈菜根提取物；
0.1％至99％的所述白屈菜叶提取物；和
0.1％～30％的所述百里香叶颗粒提取物。
3.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述组合物以0.5％至5％的浓度稀释。
4.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述植物组合物具有抗菌和/或抗真菌特性。
5.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述植物组合物还包含酊剂。
6.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述组合物还包含海草。
7.如权利要求6所述的植物组合物，其中，所述海草是泡叶藻(Ascophyllum nodosum)。
8.如权利要求6所述的植物组合物，其中，所述组合物包含0.5至2g/L的海藻。
9.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述组合物还包含额外的百里香叶提取物。
10.权利要求8的植物组合物，其中，所述百里香叶提取物是在50％酒精中以1:2稀释的百里香叶提取物。
11.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述组合物还包含百里酚。
12.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述组合物还包含蓍草叶提取物。
13.如权利要求12所述的植物组合物，其中，所述蓍草叶提取物是在50％酒精中以1:2稀释的蓍草叶提取物。
14.如权利要求1所述的植物组合物，其中，所述组合物还包含土壤混合物。
15.如权利要求14所述的植物组合物，其中，所述土壤混合物包含椰子壳纤维。
16.如权利要求14所述的植物组合物，其中，所述土壤混合物包含泥炭藓和珍珠岩。
17.如权利要求14所述的植物组合物，其中，所述土壤混合物包含菌根。
18.一种植物组合物，包含在50％酒精中以1:2稀释的蓍草叶提取物，所述组合物用于促进植物生长和预防或抑制植物病害。
19.如权利要求18所述的植物组合物，所述植物组合物具有抗菌和/或抗真菌特性。
20.如权利要求18所述的植物组合物，所述提取物选自冷压或冷冻干燥中的任一种。
21.如权利要求18所述的植物组合物，所述提取物通过发酵与细菌一起加工。
22.如权利要求21所述的植物组合物，所述发酵是需氧的或厌氧的。
23.如权利要求21所述的植物组合物，所述细菌是乳酸菌或来自芽孢杆菌属物种。
24.一种使用植物组合物处理植物的方法，该植物组合物包含浓度在0.2％至5％之间的百里香叶颗粒提取物、白屈菜提取物，该方法还包括使用浓度在0.2％至5％之间的植物组合物。
25.如权利要求24所述的使用植物组合物处理植物的方法，其中，以单剂量施用土壤浇灌。
26.如权利要求24所述的使用植物组合物处理植物的方法，其中，所述土壤浇灌在预定的时间段内分次施用。
27.一种使用植物组合物处理植物的方法，所述植物组合物包含浓度在0.2％至5％之间的百里香叶颗粒提取物、白屈菜提取物，所述方法还包括在植物叶片上施用浓度在0.2％至5％之间的植物组合物。
28.如权利要求27所述的处理植物的方法，其中，所述植物组合物的应用包括将所述叶片浸入所述植物组合物中。
29.如权利要求27所述的处理植物的方法，其中，所述植物组合物的施用包括用所述植物组合物喷洒叶片。
30.如权利要求28所述的使用植物组合物处理植物的方法，其中，所述植物组合物以单剂量施用。
31.如权利要求28所述的使用植物组合物处理植物的方法，其中，所述植物组合物在预定的时间段内以分开的剂量施用。
32.如权利要求29所述的使用植物组合物处理植物的方法，其中，所述植物组合物以单剂量施用。
33.如权利要求29所述的使用植物组合物处理植物的方法，其中，所述植物组合物在预定的时间段内以分开的剂量施用。
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