CN114755414A

CN114755414A - 检测卡、胶体金-化学发光检测仪及检测方法

Info

Publication number: CN114755414A
Application number: CN202210342331.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋兴宇; 柴凤丽
Original assignee: Southern University of Science and Technology
Current assignee: Southern University of Science and Technology
Priority date: 2022-04-02
Filing date: 2022-04-02
Publication date: 2022-07-15

Abstract

本发明属于免疫检测领域，公开了检测卡、胶体金‑化学发光检测仪及检测方法。本发明的检测卡包括检测试纸条和壳体，检测试纸条包括依次连接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，检测卡中检测试纸条的反应垫上可同时检测多达12种待检分析物，壳体又包含2～12个卡槽，可同时***多个检测试纸条，每个卡槽中的检测试纸条可以检测不同浓度的待检分析物，实现了一个检测卡能够一次性检测多种、不同浓度的待检分析物；搭配胶体金‑化学发光检测仪，仪器结构简单，不仅能降低检测成本、缩短检测时间，而且可以实现大规模定性、定量检测。

Description

检测卡、胶体金-化学发光检测仪及检测方法

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及检测卡、胶体金-化学发光检测仪及检测方法。

背景技术

对抗生素进行检测在许多领域中有着重要意义。例如，在临床应用过程中，通过监测血液中抗生素的浓度，以达到最大的治疗效果，并将副作用降到最低；在农业方面，动物源性食品中的抗生素残留会导致人体过敏或中毒；真菌毒素是食源性疾病的重要来源，可导致急性中毒、致突变和致癌。所以，确保食品安全至关重要，常用于食品检测的方法有气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法和酶联免疫分析法，这些分析方法操作复杂，耗时长，需要昂贵的设备和专业的操作人员，并且仅限于设备齐全的实验室。因此，亟需开发新型的检测仪器和检测方法。

侧向流动免疫分析(LFA)方法作为一种快速、简便、经济的检测分析方法，已广泛应用于抗生素和真菌毒素检测领域。LFA的灵敏度和准确度主要取决于信号标签，胶体金是最广泛使用的纳米标签，但其灵敏度低，量子点、磁性纳米颗粒和上转换纳米颗粒作为金纳米颗粒的替代标签在LFA上广泛应用，这些纳米材料在与单克隆抗体结合时需要有机交联剂(如乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛)，会导致单克隆抗体的活性降低，从而影响其灵敏度。

目前LFA可用于检测食品中的抗生素和真菌毒素，常用的手段是使用传统的胶体金纳米标签定性检测一种或多种分析物，或使用荧光纳米标签定量检测一种或两种目标分析物，但使用荧光定量检测的设备大多数只能同时检测一个试纸条，不利于同时检测食品中残留的多种抗生素和真菌毒素。

因此，开发体积小、结构简单、操作简便、能同时检测多种待检物质的仪器是至关重要的。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测卡，能够同时检测多种待检分析物。

本发明还提出一种胶体金-化学发光检测仪，用于与检测卡搭配对待检分析物进行检测，不仅能够降低检测成本、缩短检测时间，而且可以实现大规模的检测。

本发明还提出一种具有上述检测仪的检测方法。

根据本发明的一个方面，提出了检测卡，包括：

检测试纸条，所述检测试纸条包括依次连接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述反应垫上设置有1～12条检测线；

壳体，所述壳体的表面设置有加样窗和可视窗，所述壳体内设有2～12个卡槽，相邻两个所述卡槽的间距为1～3mm；所述壳体被配置为在所述检测试纸条固定于所述卡槽内时，所述加样窗与所述样品垫对应，且所述可视窗与所述反应垫对应。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明的检测卡中，检测试纸条的反应垫上可同时设置多至12条检测线，每条检测线上可设置一种待检分析物的抗原，即每条检测试纸条可同时检测多达12种待检分析物。壳体又包含2～12个卡槽，可同时***多个上述检测试纸条，每个卡槽中的检测试纸条可以检测不同浓度的待检分析物，实现了一个检测卡能够一次性检测多种、不同浓度的待检分析物。

在本发明的一些实施方式中，所述反应垫上设置有检测线和控制线。

在本发明的一些实施方式中，所述结合垫上分配有待检分析物抗体-胶体金-酶复合物。

在本发明的一些实施方式中，所述酶选自辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)中的任一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述酶选自辣根过氧化物酶。

在本发明的一些实施方式中，所述检测线上分配有待检分析物的抗原。

在本发明的一些实施方式中，所述样品垫设置于所述结合垫上。

在本发明的一些实施方式中，所述结合垫靠近所述反应垫的一端搭接在所述反应垫的一端，所述吸水垫靠近所述反应垫的一端搭接在所述反应垫的另一端。

在本发明的一些实施方式中，所述结合垫与所述反应垫搭接的长度为1～2mm。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述结合垫与所述反应垫搭接的长度为1mm。

在本发明的一些实施方式中，所述吸水垫与所述反应垫搭接的长度为1～2mm。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述吸水垫与所述反应垫搭接的长度为1mm。

在本发明的一些实施方式中，所述反应垫选取硝酸纤维素(NC)膜、聚偏氟乙烯(PVDF)膜或尼龙膜中的任一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述反应垫选取硝酸纤维素膜。

在本发明的一些实施方式中，当反应垫的总长度为25mm时，按结合垫、吸水垫与反应垫搭接的长度各为1mm计算，各条检测线之间的间距也为1mm，则反应垫上大概能设置15条检测线，因为之前的实验中测试过在反应垫上按0.3μL/cm的速度分配检测线，检测线的宽度是0.5mm，15条检测线总宽7.5mm，又要考虑到反应垫分别与结合垫和吸水垫的间距至少为1mm，则反应垫只有14.5mm可用于分配检测线和控制线，这是在理想情况下可以检测到14种待检分析物，但考虑到仪器误差和实际情况，认为最多能同时检测12种待检分析物，即一个检测试纸条上最多设置12条检测线。

在本发明的一些实施方式中，所述加样窗与所述样品垫对应，所述可视窗与所述反应垫对应，是指所述检测试纸条固定于所述卡槽中时，可通过所述加样窗的孔将样品加入到所述检测试纸条的样品垫上，所述反应垫上的所述检测线和所述控制线的反应结果可通过所述可视窗观察和捕获。

在本发明的一些实施方式中，从所述加样窗加入待检分析物复合液，所述待检分析物复合液到达所述结合垫时，与所述结合垫上的待检分析物抗体-胶体金-酶复合物结合，未与所述待检分析物复合液结合完的所述待检分析物抗体-胶体金-酶复合物流动到所述反应垫，与所述反应垫的检测线上分配的待检分析物的抗原结合，胶体金的颜色深浅和酶的数量累积可通过所述可视窗呈现。

在本发明的一些实施方式中，所述待检分析物复合液为包括多种待检测分析物的样品。

根据本发明的第二个方面，提出了应用于所述检测卡的胶体金-化学发光检测仪，包括：

载物台，所述载物台用于固定检测卡；

发光捕获元件，所述发光捕获元件中设有电荷耦合器件，所述电荷耦合器件用于捕获所述检测卡上的胶体金信号和化学发光信号，所述电荷耦合器件与所述载物台垂直；

其中，所述载物台和所述电荷耦合器件被配置为能够产生相对移动从而改变所述电荷耦合器件对所述检测卡的信号捕获范围。

本发明的胶体金-化学发光检测仪搭配检测卡使用，其中的电荷耦合器件和载物台垂直设置，而不是平行设置靠反射镜进行折射成像，可根据检测卡的大小，通过载物台和电荷耦合器件的相对移动来实现电荷耦合器件对检测卡捕获区域的放大与缩小；电荷耦合器件可捕获胶体金信号和化学发光信号，其中胶体金信号的颜色深浅可作为定性的依据，化学发光信号可作为定量的依据，实现了对待检分析物的定性、定量多重检测，仪器结果简单，不仅能降低检测成本、缩短检测时间，而且可以实现大规模的检测。

在本发明的一些实施方式中，所述发光捕获元件为相机或摄像机中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述载物台上最多可放置2个所述检测卡，通过所述载物台和所述电荷耦合器件的相对移动来调节所述电荷耦合器件对所述检测卡的信号捕获范围，可检测到2～220种待检分析物。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金信号在有光环境下捕获。

在本发明的一些实施方式中，所述化学发光信号在避光环境下捕获。

在本发明的一些实施方式中，所述发光捕获元件上设置有光源，所述光源处于打开状态时，所述电荷耦合器件用于捕获所述胶体金信号；所述光源处于关闭状态时，所述电荷耦合器件用于捕获所述化学发光信号。

在本发明的一些实施方式中，所述发光捕获元件配置有镜头，所述光源设置在所述镜头上。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述电荷耦合器件垂直设置于所述载物台的上方。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金-化学发光检测仪还包括计算机和显示器，所述计算机与所述显示器相连，所述计算机通过对所述胶体金信号和所述化学发光信号进行分析，将分析结果传输到所述显示器中，通过所述显示器读取图像结果和数据分析结果。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述载物台设置于箱体中，所述箱体提供避光环境。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述箱体为正方体或长方体中的任一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述箱体的上表面设置有一个孔，用于嵌入所述发光捕获元件的镜头，使所述发光捕获元件垂直设置于所述箱体的上方，此时所述电荷耦合器件也垂直设置于所述箱体的上方。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述镜头上设置有LED灯，所述LED灯打开时用于提供光源，辅助所述电荷耦合器件捕获所述胶体金信号；所述LED灯关闭时，所述电荷耦合器件用于捕获所述化学发光信号。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述LED灯设置于灯架上，所述灯架环绕所述镜头设置或设置在所述镜头的一端。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述灯架成圆形或U型环绕所述镜头设置。

根据本发明的第三个方面，提出了所述检测仪的检测方法，包括以下步骤：

S1：将待检分析物复合液从检测卡壳体表面的加样窗加入，进行免疫层析反应，将所述检测卡置于载物台上；

S2：通过电荷耦合器件获取所述检测卡上的胶体金信号和化学发光信号，根据所述胶体金信号和所述化学发光信号判断所述待检分析物复合液中待检分析物的有无。

本发明的检测方法通过将检测卡放置于胶体金-化学发光检测仪中，利用电荷耦合器件对检测卡的胶体金信号和化学发光信号进行捕获，检测成本低，缩短了检测时间，操作简便，可实现大规模检测。

在本发明的一些实施方式中，所述电荷耦合器件的工作类型包括捕获所述胶体金信号或捕获所述化学发光信号，若捕获所述胶体金信号，需在有光环境中进行；若捕获所述化学发光信号，需在避光环境中进行。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1提出的检测卡和胶体金-化学发光检测仪的结构示意图；

图2为本发明实施例1中的检测试纸条的结构示意图；

图3为本发明实施例1中检测卡的壳体结构示意图；

图4为本发明实施例2对胶体金信号和化学发光信号捕获的结果图；其中A为胶体金信号捕获结果，B为化学发光信号捕获结果；

图5为本发明实施例2中利用化学发光模式对6种待检分析物进行的定量检测结果图；其中A为赭曲霉素(OTA)，B为甲砜霉素(TAP)，C为玉米赤霉烯酮(ZEN)，D为呕吐霉素(DON)，E为大观霉素(SM)，F为红霉素(ERM)；

图6为本发明实施例2中利用化学发光模式对4种待检分析物进行的定量检测结果图；其中G为恩诺沙星(ENR)，H为四环素(TC)，I为伏马毒素(FB1)，J为黄曲霉毒素(AF)；

图7为本发明实施例3中对220种待检分析物的胶体金信号和化学发光信号的捕获结果图；其中上为胶体金信号捕获结果，下为化学发光信号捕获结果。

附图标记：

110-检测卡；111-样品垫；112-结合垫；113-反应垫；114-吸水垫；115-检测线；116-控制线；120-上卡壳；121-下卡壳；122-卡槽；123-加样窗；124-可视窗；210-载物台；211-箱体；212-门；213-发光捕获元件；214-镜头；215-圆形灯架；216-计算机；217-显示器。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、前、后等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本实施例设计了一种检测卡和胶体金-化学发光检测仪，参考图1、图2和图3进行描述。

检测卡110包括检测试纸条和壳体。

检测试纸条的结构示意图如图2所示，检测试纸条包括依次连接的样品垫111、结合垫112、反应垫113和吸水垫114。样品垫111设置在结合垫112上，结合垫112靠近反应垫113的一端搭接在反应垫113的左端，搭接长度为1mm，结合垫112上分配有待检分析物抗体-胶体金-酶复合物，酶选自HRP；吸水垫114靠近反应垫113的一端搭接在反应垫113的右端，搭接长度为1mm；反应垫113选取NC膜，其上设置有10条检测线115和1条控制线116，检测线115上分配有待检分析物的抗原，10条检测线上的待检分析物的抗原不同，10条检测线115之间的间距都为1mm，最后一条检测线115与控制线之间的间距也为1mm。

如图3所示，检测卡110还包括壳体，壳体包括上卡壳120和下卡壳121，上卡壳120和下卡壳121盖合形成包含12个卡槽122的壳体，检测试纸条设置于卡槽122中，每个卡槽122中设置一个检测试纸条；上卡壳120上设置有加样窗123和可视窗124，加样窗123与检测试纸条的样品垫111对应，可视窗124与检测试纸条的反应垫113对应，一般从加样窗123加入待检分析物复合液，待检分析物复合液到达结合垫112时，与结合垫112上的待检分析物抗体-胶体金-酶复合物结合，未与待检分析物复合液结合完的待检分析物抗体-胶体金-酶复合物流动到反应垫113，与反应垫113的检测线115上分配的待检分析物的抗原结合，胶体金的颜色深浅和酶的数量累积可通过可视窗124呈现。

参见图1，胶体金-化学发光检测仪包括载物台210、箱体211、发光捕获元件213、计算机216、显示器217。载物台210设置于箱体211中，箱体211为长方体，箱体211的前方是门212，门212能够打开或关闭，通过打开门212将检测卡110放置于载物台210上，门212处于关闭状态时可提供避光环境；箱体211的上表面设置有一个孔(图中未示出)，用于嵌入发光捕获元件213的镜头214，使发光捕获元件213垂直设置于箱体211的上方，此时电荷耦合器件(设置于发光捕获元件213中，图中未示出)也垂直设置于箱体211的上方，这里的发光捕获元件213设置为相机；载物台210设置为升降台，即通过在垂直于电荷耦合器件的方向上下移动，来调节检测卡110与电荷耦合器件之间的距离，进而调节电荷耦合器件对检测卡110上的信号捕获范围；环绕镜头214设置有圆形灯架215，通过螺丝钉将圆形灯架215的臂端固定在箱体211的后方，然后将LED灯(图中未示出)环绕于圆形灯架215上；LED灯打开时用于提供光源，辅助电荷耦合器件捕获胶体金信号，LED灯关闭，即检测卡110处于避光环境中时，电荷耦合器件用于捕获化学发光信号；计算机216分别与显示器217、发光捕获元件213相连，发光捕获元件213中的电荷耦合器件捕获的胶体金信号和化学发光信号传输到计算机216，计算机216通过对胶体金信号和化学发光信号进行分析，将分析结果传输到显示器217中，通过显示器217可视化读取图像结果和数据分析结果。

实施例2

本实施例对5种商品化的抗生素和5种商品化的真菌毒素进行了检测，具体过程为：

分别取每种抗生素和每种真菌毒素的相应抗体-胶体金-HRP偶联物于试管中，形成10种Ab-AuNPs-HRP偶联物的混合物，其中大观霉素(SM)-AuNPs-HRP 3μL、恩诺沙星(ENR)-AuNPs-HRP 2μL、甲砜霉素(TAP)-AuNPs-HRP 1μL、四环素(TC)-AuNPs-HRP 1μL、红霉素(ERM)-AuNPs-HRP 1μL、玉米赤霉烯酮(ZEN)-AuNPs-HRP1μL、呕吐霉素(DON)-AuNPs-HRP1μL、赭曲霉素(OTA)-AuNPs-HRP 1μL、伏马毒素(FB1)-AuNPs-HRP 1μL和黄曲霉毒素(AF)-AuNPs-HRP 1μL，共13μL，将13μL的Ab-AuNPs-HRP偶联物复合液加在结合垫112上，检测线115上分配待检分析物的抗原液，控制线上分配羊抗小鼠的二抗，从加样窗123向样品垫111上加入上述10种待检分析物的复合液，每个加样窗加入的待检分析物复合液的浓度不同，即10个检测试纸条上的待检分析物复合液的浓度不同，分别为0.01、0.05、0.5、1、2、5、10、20、50、100ng/mL，打开箱体211的门212，将检测卡110置于箱体211中的载物台210上；

打开显示器217的软件，点击打开设备，启动发光捕获元件213，设置电荷耦合器件的工作类型：选择胶体金选项，需打开LED灯，用于捕获胶体金信号；不选择胶体金选项，默认捕获化学发光信号，需关闭LED灯，先捕获胶体金信号，捕获结束后取出检测卡110，通过加样窗123向检测试纸条的样品垫111上加化学发光底物，将检测卡110置于箱体211中的载物台上，切换模式对化学发光信号进行捕获；设置过滤阈值，用于二次过滤背景噪声，单独设置10种分析物的判定阈值和曝光时间，然后对温度和网格参数进行设置，对拍照***进行暗场校准后，点击开始，获取设定数量的图片，获取完成后，进行计算并校准，同时生成校准结果，检测结果的图片和数据显示在显示器217上。

对胶体金信号和化学发光信号的捕获结果如图4所示，其中第一行数字表示待检分析物的浓度梯度，左侧一列中的C line代表控制线，控制线下的10种分析物为待检分析物。图4的A为胶体金信号图，B为化学发光信号图，从图中可以看出，当待检分析物的浓度为0.01ng/mL时，检测试纸条上的10条检测线115和1条控制线116的胶体金信号和化学发光信号均可显示出来，这是由于此时结合垫112上的待检分析物抗体足以与待检分析物反应；随着待检分析物浓度的升高，检测线115的数量减少，当浓度达到100ng/mL时，检测线115全部消失，这是由于待检分析物的浓度远远大于结合垫112上待检分析物抗体的浓度，使得待检分析物抗体不能与分配在检测线115上的待检分析物的抗原结合，即没有相应的胶体金和酶标记，检测线115的位置也不会有相应的胶体金信号和化学发光信号。

同时，利用化学发光模式对待检分析物进行了定量检测，结果如图5、图6所示。图5、图6为10种待检分析物的竞争性抑制曲线和一定浓度范围的线性回归方程，竞争性抑制曲线显示(检测线/控制线，即图中的T/C)的化学发光强度随待检分析物浓度变化而变化的关系，线性回归方程显示(检测线/控制线，即图中的T/C)的化学发光强度随待检分析物的浓度取对数之后变化而变化的关系，结果显示随着待检分析物浓度的升高，检测线/控制线的化学发光强度均呈下降趋势，竞争性抑制曲线和线性回归方程的趋势一致，与胶体金信号和化学发光信号的结果图相一致，且R²都大于0.95，表明本发明中的检测试纸条和胶体金-化学发光检测仪的稳定性、重复性都比较好。

实施例3

本实施例对220种待检分析物进行了检测，具体过程同实施例2，不同之处在于本实施例在载物台210上放置了2个检测卡110，捕获信号时要上下移动载物台210，以调节信号捕获范围。结果如图7所示，电荷耦合器件最多可检测到220种待检分析物。这是由于载物台210上最多可放置2个检测卡110，两个检测卡110中各设置有12个检测试纸条，每个检测试纸条上设置有10条检测线115，通过载物台210的上下移动，最多可检测到其中一个检测卡110中的全部待检分析物(即12×10＝120种)和另一个检测卡110中的10个检测试纸条上的待检分析物(即10×10＝100种)，即可检测到220种待检分析物。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.检测卡，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述结合垫上分配有待检分析物抗体-胶体金-酶复合物。

3.根据权利要求2所述的检测卡，其特征在于，所述检测线上分配有待检分析物的抗原。

4.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述检测试纸条上的所述结合垫、所述反应垫和所述吸水垫依次相互搭接设置，具体包括：所述结合垫靠近所述反应垫的一端搭接在所述反应垫的一端，所述吸水垫靠近所述反应垫的一端搭接在所述反应垫的另一端。

5.应用于权利要求1～4任一项所述的检测卡的胶体金-化学发光检测仪，其特征在于，包括：

载物台，所述载物台用于固定检测卡；

6.根据权利要求5所述的检测仪，其特征在于，所述发光捕获元件上设置有光源，所述光源处于打开状态时，所述电荷耦合器件用于捕获所述胶体金信号；所述光源处于关闭状态时，所述电荷耦合器件用于捕获所述化学发光信号。

7.根据权利要求6所述的检测仪，其特征在于，所述发光捕获元件配置有镜头，所述光源设置在所述镜头上。

8.根据权利要求5所述的检测仪，所述电荷耦合器件垂直设置于所述载物台的上方。

9.权利要求5～8任一项所述的检测仪的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述电荷耦合器件的工作类型包括捕获所述胶体金信号或捕获所述化学发光信号，若捕获所述胶体金信号，需在有光环境中进行；若捕获所述化学发光信号，需在避光环境中进行。