CN114749221A - 一种蛋白质组学样品前处理装置及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质组学样品前处理装置及其制备方法与应用，方法包括步骤：将移液枪头的尖端用封口膜封闭后装入二苯甲酮溶液，在无氧以及紫外光照射条件下进行活化处理，得到活化移液枪头；将两性功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合均匀后装入所述活化移液枪头中，在无氧以及紫外光照射条件下发生聚合反应，在所述活化移液枪头内生成两性整体柱，得到反应后移液枪头；去除封口膜，对所述反应后移液枪头进行冲洗处理，制得蛋白质组学样品前处理装置。本发明提供的蛋白质组学样品前处理装置能够通过离心力或压力驱动完成蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全流程，可实现高灵敏度，高通量地蛋白质组学分析，其方法简单，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质组学技术领域，特别涉及一种蛋白质组学样品前处理装置及其制备方法与应用。
背景技术
在蛋白质组学技术领域，基于液相色谱-质谱的蛋白质组学检测手段被广泛应用于蛋白质组成、蛋白质翻译后修饰和蛋白-蛋白相互作用的研究，为疾病发生发展、生物学规律和机制的探究提供了强有力工具。然而蛋白质样品往往需要经过复杂的前处理流程才可以进行液相色谱-质谱分析，主要包括蛋白质的富集、纯化、还原、烷基化、酶解和多肽除盐等步骤，很大程度地限制了样品前处理的通量。对于一些珍贵的生物样品，前处理过程中的操作损失，样品转移都有可能会造成蛋白质鉴定深度的不足。所以，发展一种既能够高通量处理样品，又能对有限的生物样品拥有足够鉴定深度的前处理技术是非常有必要的。
为了简化样品前处理步骤，同时保证操作通量，过去公开了许多集成化的样品制备方法。Nat.Methods 2014,11,319-324公开的iST(in-StageTip)技术，将所有在溶液中酶解(in-solution digestion)的步骤整合到封闭尖端的移液枪头中。目前该技术可以在2小时内同时处理96个生物样品，并从20μg的S.cerevisiae蛋白质中鉴定到4144种蛋白。基于磁珠的SP3技术(single-pot solid-phase-enhanced sample preparation)可以用于蛋白质富集和溶液中酶解，该技术实现了高通量蛋白质组学分析(Mol.Syst.Biol.2020,16,e9111)。基于强阳离子交换树脂(SCX)和C18膜的蛋白质组学前处理技术SISPROT(simpleand spintip-based proteomics technology)也被发明，在2小时内即可对蛋白质样品进行集成化处理，10μg的HeLa蛋白质能稳定地检测出超过2000种蛋白(Anal.Chem.2016,88,4864-4871)。而后发展的基于强阳离子交换树脂/强阴离子树脂(SCX/SAX)和C18基质的SISPROT技术进一步避免了前处理过程中样品可能的损失，所有的蛋白质样品制备步骤和多肽除盐步骤均可在一个移液枪头中实现，在500ng的细胞裂解液中鉴定了近4000个蛋白质组(Anal.Chim.Acta 2021 1173,338672)。
整体柱在蛋白质组学领域发展已久。基于毛细管柱的整体柱多用于多肽分离，Anal.Chem.2009,81,3529-3536公开了有机-硅混合整体柱，用于分离1μg小鼠肝脏提取物中的蛋白质。一种强阳离子交换(SCX)整体柱作为预富集柱，与反相色谱柱联用，用于多维的在线肽分离(Anal.Chem.2007,79,6599-6606)。由于整体柱具有生物相容性好和单体选择性广等特点，整体柱也被广泛应用于蛋白质样品制备。一种基于SCX整体柱的蛋白质组学前处理方法RCPR(rare cell proteomic reactor)被发明，用于在线、集成化的蛋白质样品处理(Mol.Cell.Proteomics 2011,10,M110.000679)。此外，Anal.Chem.2016,88,877-882也发展了一种基于SCX整体柱的微反应器，用于在线的样品制备，并用毛细管电泳-串联质谱法从50ng的非洲爪蟾受精卵匀浆中鉴定了近1000种蛋白质。毛细管柱形式的整体柱用于样品前处理可以达到很好的蛋白质鉴定深度，但大多数整体柱处理通量有限，无法完成大量样品实验的需求。基于移液枪头的整体柱受到关注，与毛细管整体柱相比，移液枪头式整体柱易于合成，且通过离心可进行平行操作，有望用于高通量样品制备。目前，基于移液枪头的反相整体柱，如商业化的ZipTip和EvoTip，主要用于多肽除盐步骤；Anal.Chem.2020,92,3913-3922公开的基于移液枪头的固相金属亲和色谱m-IMAC(micro immobilizedmetal ion affinity chromatography columns)主要用于蛋白质的亲和纯化。过去已公开的移液枪头式的整体柱可以实现在特定蛋白组学样品前处理步骤中的应用，但集成化与样品处理通量无法兼顾。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种蛋白质组学样品前处理装置及其制备方法与应用，旨在解决现有技术无法兼顾实现对生物样品进行高通量、高灵敏度蛋白质组学分析的问题。
本发明的技术方案如下：
一种蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其中，包括步骤：
将移液枪头的尖端用封口膜封闭后装入二苯甲酮溶液，在无氧以及紫外光照射条件下进行活化处理，得到活化移液枪头；
将两性功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合均匀后装入所述活化移液枪头中，在无氧以及紫外光照射条件下发生聚合反应，在所述活化移液枪头内生成两性整体柱，得到反应后移液枪头；
去除封口膜，对所述反应后移液枪头进行冲洗处理，制得蛋白质组学样品前处理装置。
所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其中，所述二苯甲酮溶液中的溶剂为体积比为1:1的甲醇和1,4-丁二醇组成的混合溶剂。
所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其中，所述两性功能单体为[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵；和/或，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；和/或，所述致孔剂为质量比为5：5：3的正丙醇、1,4-丁二醇和水组成的三元混合溶剂；和/或，所述引发剂为偶氮二异丁氰。
所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其中，所述两性功能单体、交联剂以及致孔剂的质量比为3:4:26。
所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其中，所述在无氧以及紫外光照射条件下发生聚合反应的步骤中，紫外光照射的波长为365nm，聚合反应时间为20-40min。
一种蛋白质组学样品前处理装置，其中，采用本发明所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法制得。
一种蛋白质组学样品前处理装置的应用，其中，将本发明所述的蛋白质组学样品前处理装置用于蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全过程。
所述的应用，其中，将所述蛋白质组学样品前处理装置用于蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全过程包括步骤：
将待测生物样品加入所述蛋白质组学样品前处理装置中，使待测生物样品中的蛋白质富集到两性整体柱上，得到富集有蛋白质的两性整体柱；
采用含有机溶剂的水溶液对所述蛋白质组学样品前处理装置进行清洗，去除残留在所述蛋白质组学样品前处理装置中的杂质；
将还原剂、烷基化试剂和酶解溶液依次加至富集有蛋白质的两性整体柱上，实现蛋白质的还原、烷基化并将蛋白质酶切成多肽；
采用盐溶液将所述多肽从所述两性整体柱上洗脱出来，得到多肽样品。
所述的应用，其中，所述含有机溶剂的水溶液为含有乙腈的柠檬酸钾水溶；和/或，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐；和/或，所述烷基化试剂为氯乙酰胺；和/或，所述酶解溶液包括胰蛋白酶和胞内蛋白酶。
所述的应用，其中，还包括步骤：将所述多肽样品在除盐后进行液相色谱-质谱分析。
有益效果：本发明提供的蛋白质组学样品前处理装置包含在移液枪头内生成的两性聚合柱，由于所述两性聚合体具有孔径丰富、比表面积大、通透性好、性质稳定等特点，因此能够通过离心力或压力驱动完成蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全流程，实现大规模的样品前处理操作；所述蛋白质组学样品前处理装置可实现高灵敏度，高通量地蛋白质组学分析，其方法简单，成本低廉，例如，所述装置和色谱仪Evosep One(Evosep)配合使用，避免了多肽样品在冻干和复溶过程中损失，减少了蛋白质样品前处理和分析的时间，提高了检测通量和灵敏度，实现了蛋白质的深度覆盖。
附图说明
图1为本发明中基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置及蛋白质样品前处理具体操作流程，其中，1为移液枪头，2为制备的两性整体柱，3为两性整体柱的内部材料放大示意图；
图2为本发明中蛋白质组学样品前处理装置的制备原理示意图，图2中(A)为移液枪头内表面的活化和枪头中两性整体柱的聚合，图2中(B)为两性整体柱合成所需两性功能单体和交联剂的化学反应；
图3为实施例1中基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置的扫描电镜图，放大倍率为1000；
图4为实施例1中评估基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置和蛋白质的结合能力示意图，图4中(A)为聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果图，图4种(B)为BCA蛋白浓度测定结果图；
图5为实施例2中基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置处理1μg 293T蛋白质样品的色谱图；
图6为实施例3中同一批次基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置平行处理30个1μg 293T样品的蛋白质数量统计图；
图7为实施例3中三个不同批次基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置分别平行处理的10个1μg 293T样品的蛋白质数量统计图。
具体实施方式
本发明提供一种蛋白质组学样品前处理装置及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其包括步骤：
S10、将移液枪头的尖端用封口膜封闭后装入二苯甲酮溶液，在无氧以及紫外光照射条件下进行活化处理，得到活化移液枪头；
S20、将两性功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合均匀后装入所述活化移液枪头中，在无氧以及紫外光照射条件下发生聚合反应，在所述活化移液枪头内生成两性整体柱，得到反应后移液枪头；
S30、去除封口膜，对所述反应后移液枪头进行冲洗处理，制得蛋白质组学样品前处理装置。
具体来讲，通过本发明方法制备的蛋白质组学样品前处理装置如图1所示，其包括移液枪头1以及结合在移液枪头内部位于尖端位置的两性整体柱2，所述两性整体柱2的材料放大后如3所示，由于所述两性整体柱具有孔径丰富、比表面积大、通透性好、性质稳定等特点，因此能够通过离心力或压力驱动完成蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全流程，实现大规模的样品前处理操作。所述蛋白质组学样品前处理装置可实现高灵敏度，高通量地蛋白质组学分析，其方法简单，成本低廉，例如，所述蛋白质组学样品前处理装置和色谱仪Evosep One(Evosep)配合使用，避免了多肽样品在冻干和复溶过程中损失，减少了蛋白质样品前处理和分析的时间，提高了检测通量和灵敏度，实现了蛋白质的深度覆盖。
在一些实施方式中，将移液枪头的尖端用封口膜封闭后装入二苯甲酮溶液，在无氧以及紫外光照射条件下对移液枪头进行活化处理，所述二苯甲酮溶液在紫外光照射下可以使移液枪头内表面产生自由基，为两性整体柱和移液枪头内表面的键合做准备。在本实施例中，所述二苯甲酮溶液中含10wt％的二苯甲酮，溶剂为甲醇和1,4-丁二醇组成的混合溶剂，所述甲醇和1,4-丁二醇的体积比为1:1。在本实施中，对移液枪头进行活化处理的次数为3次，单次活化的时间为10-20min，所用紫外光波长为365nm。
在一些实施方式中，所述两性功能单体为[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述致孔剂为质量比为5：5：3的正丙醇、1,4-丁二醇和水组成的三元混合溶剂，所述引发剂为偶氮二异丁氰。本实施例选择[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵作为两性功能单体，是因为其同时带有磺酸根和季铵根离子，与蛋白质静电相互作用力强，有利于富集全部类型的蛋白质。如图2所示，在紫外光照射条件下，二苯甲酮溶液可以活化移液枪头，使其内表面带有活性自由基；加入含有两性功能单体，交联剂，致孔剂和引发剂的聚合溶液后，紫外光引发两性单体和交联剂间的聚合反应，同时也可实现两性整体柱与移液枪头内表面的紧密键和，从而制备得到所述蛋白质组学样品前处理装置。
在一些实施方式中，所述两性功能单体、交联剂以及致孔剂的质量比为3:4:26。
在一些实施方式中，在无氧以及紫外光照射条件下发生聚合反应的步骤中，紫外光照射的波长为365nm，聚合反应时间为20-40min。
在一些实施方式中，还提供一种蛋白质组学样品前处理装置，其采用本发明所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法制得。
在一些实施方式中，还提供一种蛋白质组学样品前处理装置的应用，其中，将本发明所述的蛋白质组学样品前处理装置用于蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全过程。
具体来讲，将所述蛋白质组学样品前处理装置用于蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全过程包括步骤：将待测生物样品加入所述蛋白质组学样品前处理装置中，使待测生物样品中的蛋白质富集到两性整体柱上，得到富集有蛋白质的两性整体柱；采用含有机溶剂的水溶液对所述蛋白质组学样品前处理装置进行清洗，去除残留在所述蛋白质组学样品前处理装置中的杂质；将还原剂、烷基化试剂和酶解溶液依次加至富集有蛋白质的两性整体柱上，实现蛋白质的还原、烷基化并将蛋白质酶切成多肽；采用盐溶液将所述多肽从所述两性整体柱上洗脱出来，得到多肽样品。
在本实施例中，所述含有机溶剂的水溶液优选为含有乙腈的柠檬酸钾水溶，所述还原剂优选为三(2-羧乙基)膦盐酸盐；所述烷基化试剂优选为氯乙酰胺；所述酶解溶液包括胰蛋白酶和胞内蛋白酶，所述酶解溶液需添加5％(v/v)乙腈溶液，所述酶解条件为37℃下反应1h，对是否避光没有特殊限定；所述盐溶液优选为500mmol/L氯化钠溶液。
在本实施例中，所述蛋白质组学样品前处理装置可以在离心力或压力驱动下实现蛋白质样品前处理全流程。
在本实例中，将所述多肽样品在除盐后进行液相色谱-质谱分析，可实现微量复杂样品的高灵敏度，高通量蛋白质组学分析。具体地，除盐装置可选择商品化C18枪头EvoTip，多肽样品通过高浓度盐直接从基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置洗脱至EvoTip中，之后配合液相色谱Evosep One，以实现少量样品的高灵敏度，高通量蛋白质组学分析，整个流程几乎无样品转移损失。本发明所述蛋白质组学样品前处理装置和色谱Evosep One配合使用，避免了多肽样品在冻干和复溶过程中损失，减少了蛋白质样品前处理和分析的时间,提高了检测通量和灵敏度，实现了蛋白质的深度覆盖。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的解释说明：
实施例1
实施例中所用293T蛋白质样品均为HEK 293T细胞在兼容性裂解液(10mmol/LHEPES，pH 7.4，600mmol/L盐酸胍，1％DDM，1mmol/L Na3VO4和蛋白酶抑制剂)下裂解得到，试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获买得的常规产品。
本实施例提供了基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置的制备方法包括以下步骤：
(1)将10μL移液枪头依次使用超纯水、甲醇和丙酮超声清洗，氮气吹干后，用封口膜封闭移液枪头的尖端；
(2)用氮气对10wt％的二苯甲酮溶液(溶剂为甲醇和1,4-丁二醇，体积比为1:1)进行去氧处理，然后将10μL去氧后的溶液加入所述移液枪头中，在保护气氛，365nm紫外光照射下活化15min，结束后去除二苯甲酮溶液，并向移液枪头中重新加入10μL去氧后的二苯甲酮溶液，按照前述步骤重复操作，共进行3次活化处理，得到活化后的移液枪头。
(3)将正丙醇，1，4-丁二醇和水按照质量比5：5：3进行混合，得到三元致孔剂，将单体为[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(MSA)加入致孔剂中，使其完全溶解，再依次加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和引发剂偶氮二异丁氰(AIBN)，混合均匀，得到聚合溶液。其中单体、交联剂、三元致孔剂添加质量比为3：4：26，引发剂加入质量为单体质量的1％。使用氮气对前述聚合溶液进行脱氧，加入10μL脱氧后的聚合溶液润洗活化后的移液枪头，之后去除聚合溶液，并重新加入1μL脱氧后的聚合溶液，在保护气氛，365nm紫外光照射30min下进行聚合反应。
(4)所述聚合反应结束后，去除移液枪头尖端的封口膜，装入乙腈，通过离心操作去除致孔剂和其他未反应的化合物，得到基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置。可在常温下用甲醇浸润移液枪头用于所述装置的保存。
本实施例使用扫描电子显微镜(Merlin，ZEISS)对所述样品前处理装置进行表征，其扫描电镜结果如图3所示。所制备的两性整体柱具有丰富的孔隙结构，部分孔径超过2μm。
本实施例使用固定离心力下溶液通过所述装置的流速来评估通透性。甲醇在1000相对离心力下通过所述装置的流速为30.53μL/min，所述流速适合于蛋白质样品前处理过程。
本实施例还评估了基于移液枪头式两性整体柱的前处理装置的蛋白质结合能力，在酸性条件(pH 3)下，重复上样10μg 293T蛋白质样品至所述装置，收集流出液。如图4所示，所述装置可结合约26μg 293T蛋白，结合能力强，可用于蛋白质样品的富集和后续前处理操作。
实施例2
本实施例使用了移液枪头式两性整体柱作为样品前处理装置，该样品前处理装置制备方案与实施例1相同。
本实施例中，样品分离检测平台采用液相色谱Easy-nLC 1200(Thermo FisherScientific)和质谱仪Q-Exactive(Thermo Fisher Scientific)。其中，蛋白质样品在所述前处理装置中实现预富集，还原，烷基化和酶解全过程，之后洗脱至商品化C18枪头EvoTip中进行除盐。
本实施例还提供了基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置用于蛋白质样品前处理的方法包括如下步骤：
将60μL的甲醇、20μL的100mmol/L柠檬酸钾水溶液(pH 3)和20μL的10mmol/L柠檬酸钾水溶液(pH 3)依次通过所述装置，活化两性整体柱，并创造上样所需的酸性环境。
(2)活化后，将1μg 293T蛋白质样品(样品用10mmol/L柠檬酸钾水溶液稀释至pH 3附近)上样至两性整体柱。用含有20％乙腈的8mmol/L柠檬酸钾水溶液去除表面活性剂等杂质。
(3)将15μL 10mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)溶液浸润两性整体柱，在室温下反应30min，打开蛋白质的二硫键，而后加入10μL 25mmol/L Tris-HCl(pH 8)，洗去还原剂。
(4)将5μL含有5％(v/v)ACN，10ng/μL胰蛋白酶和10ng/μL胞内蛋白酶的10mmol/L氯乙酰铵溶液浸润两性整体柱，在37℃下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。
(5)使用20μL 500mmol/L氯化钠水溶液，将多肽从基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置洗脱到商品化C18枪头EvoTip中，并进行除盐操作。
本实施例中除盐后的样品需要在冻干机冻干，而后复溶于0.1％(v/v)甲酸水溶液，才可用上述液相色谱和质谱仪进行检测。
通过所述液相色谱-质谱仪检测到的蛋白质和多肽数量见表1：
表1
| 实验次数 | 鉴定蛋白数量 | 鉴定多肽数量 |
| 实验1 | 2240 | 11381 |
| 实验2 | 2227 | 10821 |
| 实验3 | 2297 | 11688 |
从表1可知，3次重复实验都鉴定到了超过2200个蛋白质和10000个多肽，表明本实施例的样品前处理装置用于常规液相色谱-质谱分析具有很好的性能和重现性。图5为三次重复实验中随机一个样品的色谱峰图，从图5可知，色谱峰分布均匀，峰容量大，检测响应强度高。
将本实施例的样品前处理装置和现有的SISPROT蛋白前处理装置对同样的1μg293T样品进行前处理，并用所述液相色谱-质谱仪实现蛋白质的检测，检测结果见表2：
表2
从表2可知，同样处理1μg 293T样品，两种方案鉴定到的多肽数目相似，而本实施方式比SISPROT技术平均多鉴定到83个蛋白质。说明本实施例中基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置具有很好的前处理效果。
实施例3
本实施例提供了基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置用于高通量蛋白质组学分析的方法，所述装置制备方案与实施例1相同。样品分离检测平台采用液相色谱Evosep One(Evosep)和质谱仪TimsTOF Pro(Bruker)。
本实施例中样品前处理操作步骤与实施例2的样品前处理操作步骤相同。本发明所述装置可与高通量高灵敏度的液相色谱-质谱联用***配合使用。具体的，可直接将本装置处理过的蛋白组学样品洗脱至EvoTip中，样品无需经过冻干和复溶的操作，即可进行所述液相色谱-质谱分析。
本实施例的样品前处理操作时间控制在2h，样品进样和液相色谱-质谱分析总时间约为60min。
本实施例利用同一批次制备的基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置同时处理30个1μg 293T样品，并用所述液相色谱-质谱***实现蛋白质的检测，检测结果见图6。30个样品平均检测到6393个蛋白质，实现了蛋白的深度鉴定，变异系数的中位值和平均值也均小于20％。说明同一批制次制备的基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置具有很好的重复性和稳定性。
本实施例分三天分别制备了3个批次的基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置，每一批次的装置均在制备当天处理30个相同的1μg 293T样品，并随机选取10个样品进行检测。检测结果见图7。无论是同一天还是不同天的样品都具有相似的鉴定深度，平均鉴定到6214个蛋白质。这说明基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置的批次效应小，且性能稳定。
本实施例通过基于移液枪头式两性整体柱的蛋白质组学样品前处理装置实现了高通量，高灵敏度且稳健的蛋白质组学分析。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将移液枪头的尖端用封口膜封闭后装入二苯甲酮溶液，在无氧以及紫外光照射条件下进行活化处理，得到活化移液枪头；
将两性功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合均匀后装入所述活化移液枪头中，在无氧以及紫外光照射条件下发生聚合反应，在所述活化移液枪头内生成两性整体柱，得到反应后移液枪头；
去除封口膜，对所述反应后移液枪头进行冲洗处理，制得蛋白质组学样品前处理装置。
2.根据权利要求1所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其特征在于，所述二苯甲酮溶液中的溶剂为体积比为1:1的甲醇和1,4-丁二醇组成的混合溶剂。
3.根据权利要求1所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其特征在于，所述两性功能单体为[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵；和/或，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；和/或，所述致孔剂为质量比为5：5：3的正丙醇、1,4-丁二醇和水组成的三元混合溶剂；和/或，所述引发剂为偶氮二异丁氰。
4.根据权利要求1所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其特征在于，所述两性功能单体、交联剂以及致孔剂的质量比为3:4:26。
5.根据权利要求1所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法，其特征在于，所述在无氧以及紫外光照射条件下发生聚合反应的步骤中，紫外光照射的波长为365nm，聚合反应时间为20-40min。
6.一种蛋白质组学样品前处理装置，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述蛋白质组学样品前处理装置的制备方法制得。
7.一种蛋白质组学样品前处理装置的应用，其特征在于，将权利要求6所述的蛋白质组学样品前处理装置用于蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全过程。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述蛋白质组学样品前处理装置用于蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解的全过程包括步骤：
将待测生物样品加入所述蛋白质组学样品前处理装置中，使待测生物样品中的蛋白质富集到两性整体柱上，得到富集有蛋白质的两性整体柱；
采用含有机溶剂的水溶液对所述蛋白质组学样品前处理装置进行清洗，去除残留在所述蛋白质组学样品前处理装置中的杂质；
将还原剂、烷基化试剂和酶解溶液依次加至富集有蛋白质的两性整体柱上，实现蛋白质的还原、烷基化并将蛋白质酶切成多肽；
采用盐溶液将所述多肽从所述两性整体柱上洗脱出来，得到多肽样品。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含有机溶剂的水溶液为含有乙腈的柠檬酸钾水溶；和/或，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐；和/或，所述烷基化试剂为氯乙酰胺；和/或，所述酶解溶液包括胰蛋白酶和胞内蛋白酶。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，还包括步骤：将所述多肽样品在除盐后进行液相色谱-质谱分析。
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