CN114746540A - 堆叠的固定床生物反应器及其使用方法 - Google Patents

Abstract

一种模块化且堆叠的细胞培养***，其包括独立的细胞培养子单元，该独立的细胞培养子单元具有用于将细胞培养基材容纳在细胞培养空间中的内部腔室，向细胞培养空间供应流体的流体进口，以及从腔室移除流体的流体出口。所述腔室被布置用于使流体从流体进口流入，流动通过细胞培养空间，然后通过流体出口流出。所述子单元还包括在独立的细胞培养子单元的顶部和底部中的至少一者上的对准特征，其中，所述对准特征与另一个独立的细胞培养子单元的对准特征对准，以使得多个独立的细胞培养子单元是可堆叠的。

Description

堆叠的固定床生物反应器及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C§120要求2019年11月27日提交的系列号为62/941,308的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。

技术领域

本公开一般涉及生物加工领域，具体地，涉及模块化且堆叠的填充床生物反应器以及使用该生物反应器进行细胞培养的方法。

背景技术

在生物加工产业中，为了激素、酶、抗体、疫苗的生产以及细胞疗法，进行大规模的细胞培养。生物加工中使用的大部分细胞是锚着依赖性的，这意味着细胞需要表面来粘附才能生长和发挥功能。传统上，贴壁细胞的培养是在粘附细胞的二维(2D)表面上进行的，这些表面被包含在多种容器形式中的一种中，这些容器形式例如T形瓶、皮氏培养皿、细胞工厂、细胞堆叠容器、滚瓶和

容器。这些方式可能具有明显的缺点，包括难以达到足够高的细胞密度以使其适用于大规模生产细胞或疗法。

已经提出了替代性方法来增加所培养的细胞的体积密度。这些方法包括在搅拌罐中进行的微载体培养。在这种方式中，粘附于微载体表面的细胞经受持续不断的剪切应力，导致对增殖和培养性能有显著影响。高密度细胞培养***的另一个实例是中空纤维生物反应器，在该生物反应器中，当细胞在纤维间隙空间中增殖时，细胞可以形成大型三维聚集体。然而，细胞生长和性能因为缺乏营养物质而被大大抑制。为了缓解这一问题，这些生物反应器被制造得很小，不适于大规模制造。

用于锚着依赖性细胞的高密度培养***的另一个实例是填充床生物反应器***。例如，包含用于捕获细胞的基材或基质***的填充床的填充床生物反应器***先前已经公开于第4,833,083号；第5,501,971号和第5,510,262号美国专利中。填充床基质常由用作基材的多孔颗粒或者聚合物的非织造微纤维制成。这种生物反应器起到再循环流通生物反应器的作用。这种生物反应器的重大问题之一是填充床中的细胞分布不均匀。例如，填充床用作深度过滤器，并且细胞主要在进口区域处被捕获，导致在接种步骤期间产生细胞分布梯度。此外，由于随机的纤维填充，填充床截面的流动阻力和细胞捕获效率不均匀。例如，培养基快速流过细胞堆积密度低的区域，而缓慢流过因为被捕获的细胞数目较高而导致阻力较高的区域。这产生了通道效应，其中营养物质和氧气更有效地输送到细胞体积密度较低的区域，而细胞密度较高的区域则保持在次优培养条件下。现有技术中公开的填充床***的另一个显著缺点是不能够在培养过程结束时有效地收获完整的活细胞。第9,273,278号美国专利公开了一种生物反应器，该生物反应器被设计成在细胞收获步骤期间提高从填充床回收细胞的效率。其是基于使填充床基质疏松并且搅动或搅拌填充床颗粒，以使多孔基质碰撞并因此使细胞脱粘。然而，该方法是费力的，并且可能造成显著的细胞损伤，因此降低了整体细胞活力。

基于填充床生物反应器的所有现有平台具有局限性，当细胞密度向着其最大水平增加时，在生物反应器末端(相对于通过生物反应器的流动路径而言)的细胞不能够获得足够的营养物质或氧气，因此细胞产量将受抑制。这种营养物质或氧气的耗减可被看成是通过填充床的流动路径的营养物质和/或氧气供应的梯度。为了减少这种对细胞功能性有害的营养物质/氧气梯度的发展，可将固定床设计成具有相对较短的培养基灌注路径。然而，这样的设计大大影响了生物加工治疗制造业中的反应器放大性。例如，虽然悬浮搅拌罐生物反应器可被放大到高达2,000L或10,000L，但是典型的填充床生物反应器仅可被放大到50L的容量。虽然利用现有平台生产用于早期临床试验的病毒载体是可能的，但需要能够生产更多高质量产品的平台，以达到后期商业生产规模。特别地，需要划分填充床，同时管理细胞和营养物质的流体物流通过填充床，以及减小通过填充床的营养物质和/或氧气梯度的平台和方法。

发明内容

本文公开了一种模块化细胞培养***，所述模块化细胞培养***具有独立的细胞培养子单元，该细胞培养子单元具有内部腔室、流体进口、流体出口以及至少一个对准特征，所述内部腔室用于将细胞培养基材容纳在细胞培养空间中，所述流体进口用于向细胞培养空间供应流体，所述流体出口用于从内部腔室移除流体，并且所述至少一个对准特征被设置在独立的细胞培养子单元的顶部和底部中的至少一者上。所述内部腔室被布置成允许流体从流体进口流入，流动通过细胞培养空间，以及经由流体出口流出。所述至少一个对准特征可与另一个独立的细胞培养子单元的至少一个对准特征对准，以使得独立的细胞培养子单元可与另一个独立的细胞培养子单元堆叠。根据实施方式，所述***包括多个独立的细胞培养子单元，所述多个独立的细胞培养子单元被堆叠在一起。

在以下具体实施方式、附图和任一权利要求中部分地提出了本公开另外的方面，其中的部分方面源自具体实施方式，或可以通过实施本公开而得到了解。应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式都只是示例和说明性的，并不限制所公开的本公开内容。

附图说明

参照以下结合附图的具体实施方式，可以更完整地理解本公开，在附图中：

图1根据本公开的一个或多个实施方式，例示了细胞培养子单元的截面图；

图2根据本公开的一个或多个实施方式，例示了图1的模块化细胞培养子单元的堆叠体；

图3根据本公开的另一个实施方式，例示了细胞培养子单元的截面图；

图4根据本公开的一个或多个实施方式，例示了图3的模块化细胞培养子单元的堆叠体；

图5A和5B根据本公开的一个或多个实施方式，示出了在细胞培养子单元内的保留特征的详细视图；

图6根据本公开的一个或多个实施方式，例示了使用具有分开的培养基调节容器的模块化细胞培养堆叠体的细胞培养***和流动路径；

图7根据本公开的一个或多个实施方式，例示了使用模块化细胞培养堆叠体和共用的培养基调节容器的细胞培养***和流动路径；

图8A根据本公开的一个或多个实施方式，示出了模块化细胞培养子单元的径向流动歧管的平面图；

图8B根据本公开的一个或多个实施方式，示出了具有细胞培养基材的图8A的径向流动歧管的截面图；

图9根据本公开的一个或多个实施方式，例示了图8A和8B的细胞培养子单元的堆叠布置的截面示意图；

图10根据本公开的一个或多个实施方式，示出了在具有无菌拉带的运载体中的图9的堆叠布置；

图11根据本公开的一个或多个实施方式，示出了两个图10所示运载体的堆叠布置；

图12根据本公开的一个或多个实施方式，示出了更大的图10所示运载体的堆叠布置；

图13是例示了包含本公开实施方式的一种填充床生物反应器的生物加工***的示意图；并且

图14根据一个或多个实施方式，示出了用于控制细胞培养***的灌注流速的操作。

具体实施方式

将参考附图来论述本公开的各个实施方式，附图例示了根据本公开的非限制性实施方式所述的填充床生物反应器***和使用该生物反应器***的相关方法的各个方面。以下描述旨在提供生物反应器***的可行描述，并将参考非限制性实施方式在整个公开中对生物反应器***和方法的各个方面进行具体论述，这些实施方式在本公开的上下文中可彼此互换。

本公开描述了模块化固定床生物反应器以及具有这种固定床生物反应器的堆叠体的生物反应器***。实施方式包括固定床生物反应器的各个模块，以及连接单元的堆叠组件。使用可以组合的各个填充床模块提供了一种解决方案，该解决方案可缩放并且消除了细胞培养期间在填充床内的营养物质和/或氧气梯度所施加的操作条件局限性。每个单独的模块提供了短的培养基灌注路径并因此支持最佳的细胞培养条件。多个单独的模块可组装成一个单元，因此提供制造过程的放大灵活性。取决于生产批料的目标产量，终端用户可配置***，以例如同时使用1至10个或更多个单独的单元。

参考图1，其根据本公开的一个或多个实施方式，示出了模块化细胞培养***的单独的细胞培养单元100。细胞培养单元100包括容器，所述容器具有细胞培养基进口1和细胞培养基出口2，它们用于在生物反应器操作期间灌注培养基。***100还包括在细胞培养基材4的填充床层的任一侧上提供的流量分配板3,3′，其帮助在填充床中进行均匀的培养基灌注。流量分配板3,3′还可以是填充床的结构增强或防控挡件，以将细胞培养基材保持就位或在结构上支持细胞培养基材。利用进口1与出口2之间的细胞培养基材4的布置，培养基沿基材4中的箭头所指示的方向F流动通过基材4。在生物反应器操作期间，贴壁细胞在生物反应器床中所填充的基材4的表面上附着并生长。单元100被设计成使得填充床具有短的高度，以最大程度地减少营养物质和氧气沿着通过填充床的培养基流动路径F形成梯度。

细胞培养单元100还包括在单元100的顶部和/或底部上提供的一个或多个对准特征5。对准特征5用于对准多个与细胞培养单元100类似的细胞培养单元，以使得可放大生物反应器***。图2示出了以该方式堆叠四个单元100A-100D，以形成堆叠的细胞培养***110的一个实施方式的实例。图2中的插图A示出了相邻的单元100A和100B各自的对准特征5A和5B如何对准。这样，对准特征可确保可以稳固地堆叠和对准各单元。作为一些实施方式的一个方面，当单元100用作单个细胞培养单元或者当单元100是堆叠体的最顶部的单元时，堆叠特征可用于将顶部或盖子固定到单元100。对准特征可以呈现多种形式，包括图1和2所示的简单直壁，并且还可包括互锁以防止堆叠体意外分离的特征。

例如，图3示出了根据一个实施方式所述的细胞培养单元150，其中，对准特征15A和15B具有互锁轮廓以防止意外分离，如区域3B和插图B所示。此外，如图3的插图B所示，提供了顶盖6，该顶盖6具有集成的出口端口2。类似地，在细胞培养单元150的底部上提供的对准特征具有集成的出口端口7，该出口端口7被设计成作为堆叠在单元150下方的细胞培养容器的出口端口。以这种方式，可有效地堆叠各个单元，并且每个单元可具有进口端口和出口端口而无需额外的材料或体积来提供可缩放但是紧凑的细胞培养***。例如，堆叠四个单元150将得到如图4所示的细胞培养***160。在***160中，堆叠并集成了四个单独的单元，这些单独的单元具有图3所示的构造。图4中的单元1至单元4各自具有培养基进口(分别是1-1、1-2、1-3和1-4)和培养基出口(分别是2-1、2-2、2-3和2-4)。插图B示出了培养基出口的细节图。

图5A和5B示出了细胞培养单元的一个或多个实施方式的一个方面，其中，通过放置在保留特征15下方，可将流量分配板23或保留网保持在细胞培养基板4上方就位。除了将填充床保持在适当位置，保留网或流量分配板23可用于压缩填充床到期望的填充密度。例如，在图5A中，填充床是未压缩的，因为保留网未就位，因此得到相对较松的填充密度。然而，当将保留网23扣在保留特征15下方就位时，填充床可被压缩。根据一些实施方式，可改变保留特征15的厚度以针对给定应用达到期望的填充密度，或者可使用多个保留网来增加填充密度。

图6根据一些实施方式，示出了堆叠的细胞培养***250。如图所示，***250具有以图4所示的方式堆叠的四个单独的细胞培养单元1至4。通过指定的泵8，经由柔性管10独立地灌注每个单元中的细胞培养基。通过调整多个因素中的任何因素，包括pH、温度、溶解氧等，调节每个单元中的细胞培养基。在图6的实施方式中，这种调节在指定的培养基调节容器9a-9d中独立地发生。

图7示出了本公开的另一个实施方式，在该实施方式中为堆叠的细胞培养***270。以类似于图4和6那样的方式堆叠***270中的单独的单元1-4。然而，在***270中，使用共用的培养基调节容器279并行操作单元1-4。通过指定的泵8’，经由柔性管10来灌注各个单元1-4中的细胞培养基。培养基物流在分流器12中均匀地分布在单独的单元之间。生物反应器单元之间的相等流动阻力通过容器11中的静水压力平衡来实现。在通过容器11后，培养基借助于重力经过供氧柱(oxygenation column)17流回到培养基调节容器279，在供氧柱17中鼓出氧气并溶解到培养基中。任选地，***270在气体出口18处对大气开放。

根据本公开实施方式的上述方面，提供了一种用于锚着依赖性细胞的填充床生物反应器***，其可被轻易地放大到用于细胞或细胞衍生产品(例如，蛋白质、抗体、病毒颗粒)的任何实际生产规模。在一个实施方式中，单独的生物反应器子单元填充有结构限定的细胞培养基材，贴壁细胞可在该细胞培养基材上附着、增殖和发挥作用。在一个优选的实施方式中，细胞培养基材是织造聚合物材料或网，或者是织造片的堆叠体。

如上所述，图1和图3呈现了这些细胞培养子单元的实施方式的不同方面。例如，每个生物反应器具有培养基进口端口1，培养基出口端口2，以及供贴壁细胞附着、增殖和发挥作用的填充床区域4。为了确保将营养物质和氧气稳定且均匀地输送给粘附在填充床生物反应器中的细胞，需要有均匀和/或恒定的培养基物流通过生物反应器子单元。通过在填充床上游的下方包含流量再分配板3(图1和3)，实现了培养基灌注均匀性。位于培养基进口处的流量再分配板将培养基物流从中心进口点重新引导成水平方向，以确保均匀的培养基灌注通过填充床(图1中的箭头F)。由于通过填充床生物反应器的培养基灌注的填充流动性质，因此沿着填充床发展出了营养物质、pH和氧气梯度。这一事实对填充床的总高度施加了限制。一般地，由于耗减后的培养基梯度所施加的限制，用于贴壁细胞培养物的典型的填充床高度的最大值为10cm。为了使填充床生物反应器的生产容量增加超过单个10cm填充床可具有的生产容量，本文公开了模块化和可堆叠的子单元的构思。单独的生物反应器子单元的填充床高度可以是恒定的并具有小的厚度，该厚度足够小(例如，小于或等于约20cm，或者小于或等于约10cm)，使得在单独的子单元中，耗减后的培养基梯度不会成为问题。

为了最大程度地减小***在生产设施中的占用面积，可将多个子单元垂直集成为单个***。图2和图4各自示出了上下堆叠以形成堆叠***110和160的四个单独的子单元。为了保证组装件的物理稳定性，使各个单元对准，并且使子单元的顶表面和底表面上突出的边沿(参见，例如，图2中的插图A)互锁。或者，通过使用位于两个同样的子单元上的螺纹连接件(参见，例如，图3和4的插图B)可互锁各个子单元。如果期望作为独立单元来操作一个子单元，其顶部可用盖子6替换，该盖子6具有内置出口2，如图3所示。

图4示出了通过使用螺纹连接件来垂直集成的四个子单元。每个子单元具有单独的培养基进口1和出口2端口。每个子单元的底部用作下方子单元的顶部部分。每个子单元具有细胞培养基，其具有填充床织造基材以供贴壁细胞生长及治疗成分的生产。如上所述，通过如图5A和5B所示的保留网格3’，可在生物反应器中填充、压缩和保留织造网。在网基材4已经在生物反应器腔室中堆叠后，下压保留网格3’并且通过从生物反应器内壁突出的保留特征15来将保留网格3’锁定就位。

图2和4所示的垂直堆叠的各个生物反应器子单元通过单独的泵8来灌注，并且具有单独的培养基调节容器9(如图6所示)，因而这些生物反应器子单元可独立操作。这样的设置可特别适用于生物加工开发阶段。同时运行同样的生物反应器，并且具有维持不同的细胞培养条件(pH、DO、CO₂水平、培养基组成、进料时间表)的灵活性，这些特点将允许终端用户迅速识别出最佳的生物加工条件。

在生产过程中，通过使用如图7所示的单个灌注泵8’和共用的培养基调节容器279，可并行操作各个生物反应器子单元。为了在所有的生物反应器子单元中具有均匀且相等的培养基灌注，作为本实施方式的一个方面提出了独特的流体流动路径。具体地，在细胞培养基通过液体泵8’而灌注通过各个生物反应器子单元后，培养基进入流量分配单元12，如图7所示。从该单元到生物反应器子单元的所有培养基出口的直径相等，以提供相等的流动阻力。例如，图7将流量分配单元12描绘为具有四个培养基出口，以供四个单独的生物反应器子单元(单元1-单元4)使用。然而，实施方式包括具有更少或更多培养基出口和生物反应器子单元的***。对于稳态压力驱动流，通过每个单独的生物反应器子单元的体积流速可表示为：

Q＝ΔP/R

其中，ΔP是图7中的培养基进口13与出口14之间的压力差。该压力差由流体移动阻力导致的摩擦压力损失以及因重力和培养基进口13与出口14之间的高度差H所导致的静水压力损失组成。对于全部的四个生物反应器子单元，培养基进口13和出口14位于同样的水平，因此静水压力损失将相同。当全部的生物反应器子单元具有相同的填充床体积，并且管10的总长度相同时，动水压力将相同。由此，对于所有单独的生物反应器子单元(图7中的单元1-单元4)，培养基进口13与培养基出口14之间的总压力差将相同。这意味着在常规的细胞培养期间，单个流体泵8’可在所有的子单元中提供均匀的培养基灌注。在所有生物反应器子单元中的相同的培养基灌注速率将提供相同的细胞培养条件，并且将仅需要一个培养基调节容器279来维持培养基中的适当pH、供氧、温度和营养物质浓度。

为了平衡出口处的静水压力，还可以提供溢流单元11。溢流单元11具有管出口和培养基溢流挡板16，所述管出口位于与进口14相同的水平。培养基溢流挡板16允许培养基通过重力被馈送回培养基调节容器279中。溢流单元通过端口18向外部大气开放，同时通过无菌气体过滤器保持***的无菌性。允许培养基自由降落到培养基调节容器中显著增加了气体/液体界面的面积。另外，在返回路径上，培养基通过供氧柱17以补充溶解氧的被耗减水平。还可将预混合气体供应源19引入到生物反应器调节容器279中以对培养基重新供氧。该气体(通过蓝色箭头指示)在氧化柱中产生逆流并且在出口18处离开***。使供氧气体相对于供氧柱17中的培养基逆流可显著增加耗减后的培养基中的氧气浓度。

作为本公开的一些实施方式的另一方面，提供了填充床生物反应器容器和***，其利用的是细胞培养基径向流动通过填充床。这样的实施方式提供了一种固定床生物反应器，在该生物反应器的填充床细胞培养基材内具有均匀的流速，以在整个模块化***中的全体多重固定床中建立受控且均匀的环境。所述***进一步被设计用于减少生物反应器中的非床体积，以使生物反应器的占用面积尽可能地紧凑。仍进一步地，所述***被设计成模块化的，以使终端用户可根据其制造需求来优化***尺寸。所述***还被设计成封闭***。

根据一个或多个实施方式，该径向流动歧管化装置位于在其中培养细胞的各固定床子单元之间。径向流动歧管中的流速因为生物反应器设计中的阻力而变化，以使得培养基以均匀的速率穿过固定床的表面并通过固定床的本体而被输送至固定床。由于当负载有基材材料和培养基时各单元可变得非常重，因此，通过将模块重量限制到操作人员的安全搬运极限(例如，出于抬起的目的，小于25lbs)，模块化设计允许手动建立非常大的单用途固定床生物反应器。为了有助于容器易于使用并维持容器的封闭***性质，可使用无菌连接件，其可以是模块的部分或者可在模块周界上的管上提供。

为了控制培养基向上输送通过固定床细胞培养基材，塑造歧管302，其中，流速可在歧管化装置中变化(其中速度的变化不重要)，以将均匀的物流输送通过整个固定床体积，并因此在整个细胞培养区中建立均匀的流动环境。图8A示出了具有支撑结构的径向流动歧管302的平面图，培养基通过该歧管被分支(manifolded)并供应给固定床。在图8A的右侧，培养基通过歧管302的流速显示为随着培养基在歧管化装置内散布而变化。

图8B根据该实施方式示出了细胞培养子单元30的截面侧视图。子单元具有中心流动柱304，培养基通过该中心流动柱304被输送到子单元300。如箭头F_R所示，培养基沿着中心流动柱304向上流动，然后径向流动通过填充床基材306下方的歧管302。由于填充床306内以及歧管302内的均匀阻力，因此，通过填充床基材306自身的流动是均匀的。如图9所示，两个或更多个模块化子单元300A、300B可堆叠以形成堆叠的细胞培养***310。歧管302因此允许多个填充床扣在一起，同时保持均匀流动到所有的固定床区。

图10示出了由四个子单元322A-322D组成的更大的堆叠的细胞培养***320，其示出了这种设计的模块化如何实现***的直接缩放。图10还示出了无菌拉带324，其可被保留在适当位置以维持封闭***，或者可移除以进一步扩大模块化***。整个模块化***可任选地在运载体326中提供，该运载体326具有把手以便于用户搬运。如图11所示，可堆叠两个或更多个这些运载体326并且可拉动无菌带以结合相邻的运载体。这种布置允许进一步扩大***，同时维持模块化以易于搬运。例如，图12示出了六个连接的运载体，其中每个运载体包含四个细胞培养子单元。所得到的堆叠***的底板和顶板分别具有培养基进口和培养基出口，使得培养基可被供料通过整个***。所得到的设计非常紧凑，并且有90％以上的体积被细胞培养基材占据。

作为本公开实施方式的一个方面，一种合适的细胞培养基材将增强培养基通过填充床的流动均匀性，以用于均匀的细胞接种，向细胞均匀地供料营养物质，以及均匀地释放细胞以用于收获。这样的基材材料的实例公开于第62/801,325号和第62/910,696号美国临时专利申请公开，以及第WO 2019/104069号PCT申请公开，它们的内容通过引用全文纳入本文。

细胞培养基材是多孔的，以允许细胞、培养基、营养物质和细胞副产物灌注通过基材并允许具有细胞分泌物质(例如，重组蛋白、抗体、病毒颗粒、DNA、RNA、糖、脂质、生物柴油、无机颗粒、丁醇、代谢副产物)的废培养基通过基材并将其收获。下文提供了根据实施方式所述的细胞培养基材的进一步细节。

本文公开的容器或子单元可以是塑料、玻璃、陶瓷或不锈钢。根据一些实施方式，所有或部分的容器可以由透明材料制成，或者在容器的外壁中可以包括一个或多个透明窗，以便于通过人眼或多个传感器、探针、摄像机或监测单元中的任何装置来检查容器的内部。例如，根据一些实施方式的一个方面，可使用光学相机或拉曼光谱探针来监测容器的腔室中的细胞培养进展。

图13根据一个或多个实施方式，示出了被并入到生物加工***400中的如本文所述的生物反应器402。***400包括培养基调节容器411，其例如用于适当地维持细胞培养基参数，例如，pH、温度和供氧水平。自动控制泵409用于将培养基灌注通过生物反应器402。生物反应器进口413配备有额外的三通端口以促进细胞接种或收集所收获的细胞。***400可以包括内嵌传感器，以及在培养基调节容器411中的传感器。

如上所述，根据本公开实施方式所述的生物反应器可包括一个或多个端口和传感器，以用于监测和调整容器中的培养基和细胞培养环境。然而，根据一些实施方式，可在生物反应器外侧的第二容器中进行细胞培养基的感测和调节。例如，图13示出了连接到主要外部部件的生物反应器容器402的示意图，主要外部部件包括培养基调节容器，允许将培养基物流泵送到生物反应器中的泵，以及支持成功的生物过程所需的工艺条件的外部溶解氧传感器。细胞培养基在培养基调节容器411中得到调节，在该培养基调节容器411中维持适当的pH、温度和溶解氧水平。随后，通过泵409将培养基灌注通过生物反应器。泵409的流速被整合到反馈环路中，所述反馈环路自动调整以维持离开生物反应器的培养基中的溶解氧的最小预定水平。经由培养基调节容器411，可将给定的生物过程所需的所有转染试剂、营养物质和额外的培养基补充物引入到总培养基中，并且可移除废培养基。在过程结束时，可从生物反应器排出培养基并用细胞收获溶液重新填充。在收获溶液中孵育填充床预定的时间，并且该预定的时间足以使细胞从基材脱离后，通过在生物反应器出口处施加空气压以产生流速为70ml/cm²(填充床横截面积)/分钟的逆向流来收获细胞。在生物反应器的三通端口413处收获细胞。也可以在生物反应器中直接裂解细胞，并且可通过三通端口413收集包含AVV颗粒的裂解物溶液。

培养基调节容器411可包括生物加工产业中使用的典型生物反应器中见到的传感器和控制部件，以用于悬浮批料、进料批料或灌注培养。这些包括但不限于DO氧气传感器，pH传感器，供氧器/气体鼓泡单元，温度探针，以及营养物添加和碱添加端口。供应到鼓泡单元的气体混合物可通过用于N₂、O₂和CO₂气体的气体流量控制器来控制。培养基调节容器411还包括用于培养基混合的叶轮。上文列出的传感器所测量的所有培养基参数可通过培养基调节控制单元来控制，所述培养基调节控制单元与培养基调节容器411通信，并且能够测量和/或调节细胞培养基406的条件以达到期望的水平。

来自培养基调节容器411的培养基通过进口被输送到生物反应器402，其还可以包括注射端口以用于细胞接种，从而接种细胞并开始细胞培养。生物反应器容器402还可以包括一个或多个出口，细胞培养基通过该出口离开容器402。此外，细胞或细胞产物可以通过出口输出。为了分析来自生物反应器402的流出物的内容物，可以在线路中提供一个或多个传感器412。在一些实施方式中，***400包括流量控制单元，其用于控制进入到生物反应器402中的流量。例如，流量控制单元可以接收来自所述一个或多个传感器412的信号，并且基于该信号，通过将信号发送给在生物反应器402的进口408上游的泵(例如，蠕动泵)，调整进入到生物反应器402中的流量。因此，基于传感器412所测得的一个因子或多个因子的组合，泵可控制进入到生物反应器402中的流量，以获得期望的细胞培养条件。

培养基灌注速率由信号处理单元控制，该信号处理单元收集并比较来自培养基调节容器411的传感器信号以及来自位于填充床生物反应器出口处的传感器的传感器信号。由于通过填充床生物反应器402的培养基灌注的填充流动性质，因此沿着填充床发展出了营养物、pH和氧气梯度。根据图14的流程图，生物反应器的灌注流速可通过操作性连接到蠕动泵的流量控制单元自动控制。

图14示出了用于控制灌注生物反应器***(例如，图13的***400)的流量的方法450的一个实例。根据方法450，在步骤S1处通过生物反应器优化运行来预先确定***400的某些参数。根据这些优化运行，可确定pH₁、pO₁、[葡萄糖]₁、pH₂、pO₂、[葡萄糖]₂和最大流速的值。在步骤S2处，在生物反应器402的细胞培养室内测量pH₁、pO₁和[葡萄糖]₁的值，并且在步骤S3处，在培养基调节容器411(或根据本文所述实施方式的生物反应器)中通过传感器412来测量pH₂、pO₂和[葡萄糖]₂。基于S2和S3处的这些值，在S4处，灌注泵控制单元做出决定，以维持或调整灌注流速。例如，如果满足pH₂≥pH_2最小，pO₂≥pO_2最小和[葡萄糖]₂≥[葡萄糖]_2最小中的至少一项，则细胞培养基到达细胞培养室的灌注流速可以继续处于当前速率(S5)。如果当前的流速小于或等于细胞培养***的预定最大流速，则增加灌注流速(S7)。进一步地，如果当前的流速不小于或等于细胞培养***的预定最大流速，则细胞培养***的控制器可重新评估以下中的至少一项：(1)pH_2最小、pO_2最小和[葡萄糖]_2最小；(2)pH₁、pO₁和[葡萄糖]₁；以及(3)生物反应器容器的高度(S6)。

本公开的实施方式包括生物反应器和用于其中的细胞培养基材，包括作为锚着依赖性细胞的细胞生长基质和/或填充床***的基材，它们能够容易且有效地放大到用于细胞或细胞衍生产品(例如，蛋白质、抗体、病毒颗粒)的任何实际生产规模。在一个实施方式中，基质具有结构限定的表面区域以供贴壁细胞附着和增殖，当组装在填充床或其他生物反应器中时，该基质具有良好的机械强度并形成高度均匀的多重互连流体网络。在具体的实施方式中，机械稳定的不可降解的织造网可用于支持贴壁细胞生产。这种基质可实现均匀的细胞接种，以及有效收获细胞或生物反应器的其他产物。此外，本公开的实施方式支持细胞培养以在所公开的基质上实现融合的单层或多层贴壁细胞，并且可以避免形成营养物质灌注有限且代谢物浓度增加的3D细胞聚集体。一个或多个实施方式的结构限定的基质能够从生物反应器的填充床完全回收细胞并实现一致的细胞收获。在本公开的另一个实施方式中，提供了使用具有基质的生物反应器来进行细胞培养的方法，以用于治疗性蛋白质、抗体、病毒疫苗或病毒载体的生物加工生产。

在一个或多个实施方式中，细胞培养基质支持锚着依赖性细胞以高的体积密度形式附着和增殖。可将基质组装并用于生物反应器***中，例如，如本文所述的灌注填充床生物反应器，并且在接种步骤期间提供均匀的细胞分布，同时防止在基质或填充床内形成大型和/或不可控的细胞聚集体。因此，基质消除了生物反应器操作期间的扩散限制。此外，基质能够从生物反应器容易且有效地收获细胞。

基质可由基材材料形成，所述基材材料具有薄片状结构，并且具有第一侧和第二侧，该第一侧和第二侧通过相对较小的厚度分开。换言之，片状基材的厚度相对于基材的第一侧和第二侧的宽度和/或长度较小。此外，形成了通过基材厚度的多个孔或开口。开口之间的基材材料的尺寸和几何结构允许细胞粘附于基材材料的表面，就好像其近似二维(2D)表面，同时还允许有足够的流体在基材材料周围流动并流动通过开口。在一些实施方式中，基材是基于聚合物的材料，并且可以形成为模制的聚合物片；具有穿透厚度的开口的聚合物片；熔合成网状层的多个纤丝；或者织造成网层的多个纤丝。基质的物理结构具有高的表面/体积比以用于培养锚着依赖性细胞。根据各个实施方式，基质可以某些方式被布置或填充在生物反应器中，以获得均匀的细胞接种，均匀的培养基灌注，以及有效的细胞收获。

细胞培养基材是织造网层，其由在第一方向上行进的第一多个纤维和在第二方向上行进的第二多个纤维制成。基材的织造纤维形成了多个开口。开口的尺寸和形状可基于编织的类型改变(例如，纤丝的数目、形状和尺寸；相交纤丝之间的角等)。开口可由一定的宽度或直径来限定。织造网在宏观尺度上可被认为是二维片或层。然而，仔细观察织造网发现，由于网的相交纤维的上升和下降，它具有三维结构。因此，织造网的厚度可以比单根纤维的粗度厚。

织造网可以包括单纤丝或多纤丝聚合物纤维。在一个或多个实施方式中，单纤丝纤维的直径可以在约50μm至约1000μm的范围内。在微观尺度级别上，由于纤维相比于细胞的尺度(例如，纤维直径大于细胞)，因此单纤丝纤维的表面作为常规2D表面存在以供贴壁细胞附着和增殖。这种纤维被编织成具有限定图案和一定量的结构刚性的网。纤维可被编织成网，并且开口在约100μm x 100μm至约1000μm x 1000μm的范围内。这些纤丝直径和开口直径的范围是一些实施方式的实例，但是其不旨在限制所有实施方式的网的可能的特征尺寸。

基材网可以由在细胞培养应用中可相容的聚合物材料的单纤丝或多纤丝纤维制造，所述聚合物材料例如包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷。网基材可以具有不同的结构图案或编织形式，例如，包括针织、经向针织或织造(例如平纹编织、斜纹编织、荷兰编织、五针编织)。

可能需要对网纤丝的表面化学进行改性，以提供期望的细胞粘附性质。这些改性可通过网的聚合物材料的化学处理，或者通过将细胞粘附分子接枝到纤丝表面来实现。或者，可用显示细胞粘附性质的生物相容性水凝胶(例如，包括胶原或

)薄层涂覆网。或者，可通过使用行业已知的各种类型的等离子体、工艺气体和/或化学品的处理过程，使网的纤丝纤维表面具有细胞粘附性质。

织造网基材可以多个板的形式提供，所述多个板具有中心孔，该中心孔被构造成围绕本文所述的生物反应器的中心柱。多个这种板可堆叠在生物反应器的外区域以形成填充床。

根据一些实施方式，细胞培养基材是可溶性泡沫支架，其包括选自下述中的至少一种的离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物：果胶酸、部分酯化的果胶酸、部分酰胺化的果胶酸及其盐；以及包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

本公开的实施方式可实现具有实用尺寸的病毒载体平台，其可以每批次约10¹⁵至约10¹⁸个或更多的病毒基因组的规模来生产病毒基因组。例如，在一些实施方式中，病毒基因组收率可以为每批次约10¹⁵至约10¹⁶个病毒基因组，或每批次约10¹⁶至约10¹⁹个病毒基因组，或每批次约10¹⁶-10¹⁸个病毒基因组，或每批次约10¹⁷至约10¹⁹个病毒基因组，或每批次约10¹⁸至约10¹⁹个病毒基因组，或每批次约10¹⁸或更多个病毒基因组。

此外，本文公开的实施方式不仅能够实现细胞附着于细胞培养基材并生长，还能够收获所培养的活细胞。不能够收获活细胞是现有平台的显著缺点，并且其导致难以构建和维持足够数目的细胞，以形成生产能力。根据本公开的实施方式的一个方面，可从细胞培养基材收获活细胞，包括80％至100％的活细胞，或约85％至约99％的活细胞，或约90％至约99％的活细胞。例如，收获的细胞中至少80％是活的，至少85％是活的，至少90％是活的，至少91％是活的，至少92％是活的，至少93％是活的，至少94％是活的，至少95％是活的，至少96％是活的，至少97％是活的，至少98％是活的，或者至少99％是活的。可以使用例如胰蛋白酶、TrypLE或Accutase从细胞培养基材释放细胞。

示例性实施方案

以下是对所公开的主题的各个实施方案的方面的描述。每个方面可以包括所公开的主题的各种特征、特性或优点中的一种或多种。实施方案旨在例示所公开的主题的几个方面，并且不应被认为是对所有可能的实施方案的全面或详尽的描述。

方面1涉及一种模块化细胞培养***，其包括：独立的细胞培养子单元，所述独立的细胞培养子单元包括：被构造成将细胞培养基材容纳在细胞培养空间中的内部腔室，被构造成向细胞培养空间供应流体的流体进口，被构造成从内部腔室移除流体的流体出口，以及被设置在独立的细胞培养子单元的顶部和底部中的至少一者上的至少一个对准特征，所述内部腔室被构造成使流体从流体进口流入，流经细胞培养空间，并且通过流体出口流出，其中，所述至少一个对准特征被构造成与另一个独立的细胞培养子单元的至少一个对准特征对准，以使得独立的细胞培养子单元能与另一个独立的细胞培养子单元堆叠。

方面2涉及方面1的模块化细胞培养***，其还包括设置在流体进口与细胞培养空间之间的第一流量分配板。

方面3涉及方面2的模块化细胞培养***，其中，第一流量分配板被构造成在细胞培养空间的宽度上均匀地分配来自流体进口的培养基。

方面4涉及方面1-3中任一方面的模块化细胞培养***，其还包括设置在细胞培养空间与流体出口之间的第二流量分配板。

方面5涉及方面4的模块化细胞培养***，其中，第二流量分配板被构造成促进培养基从细胞培养空间均匀地流出。

方面6涉及方面2-5中任一方面的模块化细胞培养***，其中，第一和第二流量分配板限定了细胞培养空间的顶部和底部。

方面7涉及方面1-6中任一方面的模块化细胞培养***，其还包括设置在细胞培养空间中的细胞培养基材。

方面8涉及方面7的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括多孔材料。

方面9涉及方面7或方面8的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷中的至少一种。

方面10涉及方面8或方面9的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括模制的聚合物栅格、3D打印的聚合物格状片和织造网片中的至少一种。

方面11涉及方面7-10中任一方面的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括含有一种或多种纤维的织造网。

方面12涉及方面11的模块化细胞培养***，其中，所述一种或多种纤维具有约50μm至约1000μm，约50μm至约600μm，约50μm至约400μm，约100μm至约325μm，或约150μm至约275μm的纤维直径。

方面13涉及方面11或方面12的模块化细胞培养***，其中，织造网包括使所述一种或多种纤维成间隙的多个开口，所述多个开口具有约100μm至约1000μm，约200μm至约900μm，或约225μm至约800μm的直径。

方面14涉及方面7或方面8的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材是可溶性泡沫支架。

方面15涉及方面14的模块化细胞培养***，其中，可溶性泡沫支架包括：离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸、部分酯化的果胶酸、部分酰胺化的果胶酸及其盐；和至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

方面16涉及方面14或方面15的模块化细胞培养***，其中，可溶性泡沫支架包括粘附聚合物涂层。

方面17涉及方面16的模块化细胞培养***，其中，粘附聚合物涂层包括肽。

方面18涉及方面17的模块化细胞培养***，其中，粘附聚合物涂层包括选自下组的肽：BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型胶原、IV型胶原、变性胶原以及它们的混合物。

方面19涉及方面17的模块化细胞培养***，其中，粘附聚合物涂层包括

II-SC。

方面20涉及方面1-19中任一方面的模块化细胞培养***，其还包括多个独立的细胞培养子单元，所述多个独立的细胞培养子单元是堆叠的。

方面21涉及方面20的模块化细胞培养***，其中，所述对准特征是连接所述多个独立的细胞培养子单元中相邻的独立的细胞培养子单元的接合特征。

方面22涉及方面21的模块化细胞培养***，其中，接合特征允许相邻的独立的细胞培养子单元可松脱地接合。

方面23涉及方面21或方面22的模块化细胞培养***，其中，接合特征是相邻的独立的细胞培养子单元的对准特征的互锁轮廓，扣合关闭的配对部件，或者螺纹连接件中的至少一种。

方面24涉及方面4的模块化细胞培养***，其还包括设置在内部腔室的内壁上的保留特征，所述保留特征被构造成将第二流量分配板保持就位以抵靠向细胞培养基材。

应理解，各个公开的实施方式可以涉及与特定实施方式一起描述的特定特征、元素或步骤。还应理解，虽然以涉及一个特定实施方式的形式进行描述，但是特定特征、元素或步骤可以各个未例示的组合或排列方式中的替换性实施方式互换或组合。

还应理解的是，本文所用术语“该”、“一个”或“一种”表示“至少一个(一种)”，不应局限为“仅一个(一种)”，除非明确有相反的说明。因此，例如，提到的“一种开口”包括具有两个或更多个这类“开口”的实例，除非文中另行明确指明。

本文中，范围可表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当用先行词“约”将数值表示为近似值时，应理解具体数值构成了另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。

本文表示的所有数值应理解为包括“约”，无论是否如此陈述，除非另有明确指明。然而，还应当理解的是，所述的每个数值也可以考虑是精确值，无论其是否以“约”该数值表示。因此，小于“10mm的尺寸”和“小于约10mm的尺寸”都包括“小于约10mm的尺寸”和“小于10mm的尺寸”的实施方式。

除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。

虽然使用过渡语“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代性实施方式。因此，例如，包含A+B+C的方法的隐含的替代性实施方式包括其中方法由A+B+C组成的实施方式以及其中方法基本上由A+B+C组成的实施方式。

虽然参照附图以及前面的具体实施方式已经例示了本公开的多个实施方式，但是应理解的是，本公开不限于所公开的实施方式，在不偏离由以下权利要求书列出和限定的本公开的情况下，能够进行各种重排、修改和替换。

Claims (24)

1.一种模块化细胞培养***，其包括：

独立的细胞培养子单元，所述独立的细胞培养子单元包括：

内部腔室，所述内部腔室被构造成将细胞培养基材容纳在细胞培养空间中，

被构造成向细胞培养空间供应流体的流体进口，

被构造成从内部腔室移除流体的流体出口，所述内部腔室被构造成使流体从流体进口流入，流经细胞培养空间，并且通过流体出口流出，以及

被设置在独立的细胞培养子单元的顶部和底部中的至少一者上的至少一个对准特征，

其中，所述至少一个对准特征被构造成与另一个独立的细胞培养子单元的至少一个对准特征对准，以使得独立的细胞培养子单元能与另一个独立的细胞培养子单元堆叠。

2.如权利要求1所述的模块化细胞培养***，其还包括设置在流体进口与细胞培养空间之间的第一流量分配板。

3.如权利要求2所述的模块化细胞培养***，其中，第一流量分配板被构造成在细胞培养空间的宽度上均匀地分配来自流体进口的培养基。

4.如前述权利要求中任一项所述的模块化细胞培养***，其还包括设置在细胞培养空间与流体出口之间的第二流量分配板。

5.如权利要求4所述的模块化细胞培养***，其中，第二流量分配板被构造成促进培养基从细胞培养空间均匀地流出。

6.如权利要求2-5中任一项所述的模块化细胞培养***，其中，第一和第二流量分配板限定了细胞培养空间的顶部和底部。

7.如前述权利要求中任一项所述的模块化细胞培养***，其还包括设置在细胞培养空间中的细胞培养基材。

8.如权利要求7所述的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括多孔材料。

9.如权利要求7或权利要求8所述的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷中的至少一种。

10.如权利要求8或权利要求9所述的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括模制的聚合物栅格、3D打印的聚合物格状片和织造网片中的至少一种。

11.如权利要求7-10中任一项所述的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材包括含有一种或多种纤维的织造网。

12.如权利要求11所述的模块化细胞培养***，其中，所述一种或多种纤维具有约50μm至约1000μm，约50μm至约600μm，约50μm至约400μm，约100μm至约325μm，或约150μm至约275μm的纤维直径。

13.如权利要求11或权利要求12所述的模块化细胞培养***，其中，织造网包括使所述一种或多种纤维成间隙的多个开口，所述多个开口具有约100μm至约1000μm，约200μm至约900μm，或约225μm至约800μm的直径。

14.如权利要求7或权利要求8所述的模块化细胞培养***，其中，细胞培养基材是可溶性泡沫支架。

15.如权利要求14所述的模块化细胞培养***，其中，可溶性泡沫支架包括：

离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸、部分酯化的果胶酸、部分酰胺化的果胶酸及其盐；和

至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

16.如权利要求14或权利要求15所述的模块化细胞培养***，其中，可溶性泡沫支架包括粘附聚合物涂层。

17.如权利要求16所述的模块化细胞培养***，其中，粘附聚合物涂层包括肽。

18.如权利要求17所述的模块化细胞培养***，其中，粘附聚合物涂层包括选自下组的肽：BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型胶原、IV型胶原、变性胶原以及它们的混合物。

19.如权利要求17所述的模块化细胞培养***，其中，粘附聚合物涂层包括

II-SC。

20.如前述权利要求中任一项所述的模块化细胞培养***，其还包括多个独立的细胞培养子单元，所述多个独立的细胞培养子单元是堆叠的。

21.如权利要求20所述的模块化细胞培养***，其中，所述对准特征是连接所述多个独立的细胞培养子单元中相邻的独立的细胞培养子单元的接合特征。

22.如权利要求21所述的模块化细胞培养***，其中，接合特征允许相邻的独立的细胞培养子单元可松脱式地接合。

23.如权利要求21或权利要求22所述的模块化细胞培养***，其中，接合特征是相邻的独立的细胞培养子单元的对准特征的互锁轮廓，扣合关闭的配对部件，或者螺纹连接件中的至少一种。

24.如权利要求4所述的模块化细胞培养***，其还包括设置在内部腔室的内壁上的保留特征，所述保留特征被构造成将第二流量分配板保持就位以抵靠向细胞培养基材。

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