CN114745958A - 新型保护性屏障组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了使用产生生化物质的微生物和/或由所述微生物合成的副产物来增强表面和/或物体的屏障功能的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供组合物及其使用方法,其包含衍生自人类微生物群并且能够以生物膜表型生长的乳杆菌属和/或其生物活性提取物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年11月26日提交的美国临时专利申请序列号62/940,598以及2020年4月28日提交的序列号63/016,336的优先权,其中的每一个都通过引用整体并入本文。
序列表
本申请的序列表标记为“SeqList-24Nov20_ST25.txt”,其创建于2020年11月24日,大小为2KB。序列表通过引用整体并入本文。
背景技术
化学和生物威胁对全世界的军队和非军事人员都是一种威胁。化学威胁可包括起疱剂和神经性毒剂,通常会导致长期后果或死亡。生物威胁可包括细菌、病毒和真菌,它们被分散作为伤害人类或其他生物体(如农作物)的手段。当前生物威胁的常见例子包括炭疽和鼠疫。
适当的保护或对抗手段对于限制或防止有害化学和生物威胁的影响是必要的。可以制定屏障来解决多种化学和生物威胁。
屏障可以防止威胁进入或直接接触人。屏障可用于中和、隔离或以其他方式使威胁灭活。屏障可以防止威胁粘附或增强威胁的分散。对于生物威胁,屏障可以主动防止或阻止增殖手段,包括抑制生物膜形成或孢子形成。
像许多生物威胁一样,鼠疫的病原体-鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)依赖于其形成生物膜的能力。鼠疫耶尔森氏菌细胞的有效传播依赖于跳蚤前肠中的生物膜形成,从而促进血餐的堵住消化以及随后血餐通过鼠疫耶尔森氏菌细胞回流到人体中。
攻击、溶解或以其他方式削弱细菌生物膜基质均有助于处理生物制剂。控制皮肤或其他器官上的病原菌、生物膜和其他物质是恢复或保持军人和平民等健康的重要组成部分。然而,目前的治疗主要集中在症状控制上,而不是调节整个微生物组以抑制生长并减少化学或生物威胁的粘附和附着。
需要新的工具来对抗不断增长的有害生物体和物质。防止有害生物体或物质的接触或粘附,中和或隔离有害生物体或物质,以及增强屏障的耐久性,这些方法都可以共同或独立地运行,以促进非生物和生物屏障功能的改善。
发明内容
本发明提供了用于产生生物体和/或非生物物质的屏障或增强屏障功能的组合物和方法。优选的实施方式提供了优选地当以生物膜表型生长时产生生物膜的细菌和/或由该细菌合成的生物活性物质。
在优选的实施方式中,本发明的组合物包括来自生物膜的分泌物质。在一个实施方式中,分泌物质可以在添加到组合物之前从培养物中纯化。本发明还提供包括呈例如冻干和/或冷冻干燥形式的细胞裂解物的组合物。
在一些实施方式中,细菌菌株是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)Qi6(在本文中也称为Lf Qi6)。在一个实施方式中,本发明提供了Lf Qi6分离的或生物纯的培养物。在另一个实施方式中,本发明提供了生长为生物膜的Lf Qi6的生物纯的培养物。本文进一步提供了利用生物膜表型的方法,以及生物膜表型的提取物及其裂解物。
在某些实施方式中,通过改进肺、眼、鼻、口、气管、食道、耳、胃、肠和/或脑中的屏障来增强先天屏障功能。
一方面,本发明优选具有选自抑制抗微生物活性、抑制病原生物膜生长、抑制病原生物膜粘附、促进病原生物膜脱离、促进共生生物膜生长和增强皮肤屏障功能的一种或多种生物活性。
在某些实施方式中,本发明提供自净化表面。
在示例性实施方式中,病原菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),共生细菌是表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。
在某些实施方式中,该组合物可以增强现有屏障的耐久性或产生新的、耐用的屏障,和/或变得自净化。在优选的实施方式中,屏障是稳定的,保持其减少化学和/或微生物污染的能力至少1、2、3、7、10、30或180天或更长时间。
在某些实施方式中,组合物产生或增强无生命物体和/或表面的屏障。这些物体可以是大表面,例如船体和飞机机翼,也可以是微观表面,例如用于修复神经的工具。本发明的组合物和方法可以防止无生命物体的积垢,这在手术器械的情况下可以防止细菌感染。优选地,本发明的组合物和方法防止或限制生物体或非生物物质直接接触对象,隔离生物体或非生物物质,和/或灭活生物体或非生物物质。在这方面,表面可以自净化。
在优选的实施方式中,本发明提供了具有屏障功能特性的生物活性蛋白质。在一个具体的实施方式中,本发明提供了“Qi611S”,一种具有根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施方式中,本发明还提供了包括Qi611S的“Qi611S蛋白质”,以及其生物活性片段和变体。
附图说明
图1示出了当暴露于32mg/ml Qi601SL、Qi601SP、Qi601SML、Qi601SMP或作为阴性对照的Qi培养基时,3x108CFU/ml时MRSA生物膜粘附的抑制。将培养物在去离子水中洗涤两次。
图2示出了当暴露于8mg/ml、16mg/ml或32mg/ml的Qi601SL或Qi601SP的水或PBS溶液时,3x108CFU/ml时MRSA生物膜粘附的抑制。培养物未在去离子水中洗涤。
图3示出了当暴露于32mg/ml的Qi601SL、Qi601SP、Qi601SML、Qi601SMP或Qi培养基作为阴性对照时,在3x108CFU/ml下MRSA生物膜粘附的抑制。将培养物在去离子水中洗涤三次。
图4示出了当暴露于3.2%的Qi601S溶液时,在3x108CFU/ml下MRSA生物膜粘附的抑制。将培养物在去离子水中洗涤一次、两次、三次或四次。
图5示出了当暴露于Qi601SL或Qi601SP的进一步稀释的溶液(包括3.2%、1.6%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%和0.025%)时,在3x108CFU/ml下MRSA生物膜粘附的抑制。将培养物在去离子水中洗涤三次。
图6示出了当暴露于Qi601SL或Qi601SML的进一步稀释的溶液(包括3.2%、1.6%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%和0.025%)时,在3x108CFU/ml下MRSA生物膜粘附的抑制。培养物未在去离子水中洗涤。
图7示出了当暴露于Qi601AM时,在1.5x106CFU/ml下MRSA生物膜粘附的抑制。将培养物在去离子水中洗涤一次、两次、三次或0次。
图8示出了当暴露于Qi601A时,在1.5x106CFU/ml下MRSA生物膜粘附的抑制。将培养物在去离子水中洗涤一次、两次、三次或0次。
图9是本发明的组合物的原子力显微镜图像。
图10示出了Qi 601S在Caco-2细胞上形成抗粘附表面,可有效对抗大肠杆菌。将细胞以每孔5x104个细胞分到24孔板中,并再生长10天以进行分化和融汇。选定的孔用Qi601S 0.1%v/v进行过夜预处理,然后用PBS洗涤。大肠杆菌K12在TSB(每孔添加1x108CFU)中过夜扩增,并培养3小时。通过PBS洗涤去除未结合的细菌。用1%Triton X-100裂解肠细胞。通过连续稀释和TSA上的标准板计数对结合的细菌进行量化,并与未处理的对照进行比较。
图11表示了Qi 601S生产的抗MRSA的抗粘附表面。将PBS中1%v/v的Qi 601S应用于培养的活的人类皮肤24小时,然后冲洗。然后将皮肤与MRSA一起培养2天,冲洗皮肤,然后培养MRSA菌落。使用Qi 601S进行预处理证明了,与未经处理的皮肤相比,MRSA负荷显著降低了60%以上。
图12是Qi611S的亲水性图。
图13示出了亲水性热稳定QI组分Qi 601S的AChE保护。在使用的所有多奈哌齐剂量下,以2%给药的Qi601S导致100%的AChE活性保护。
序列简述
SEQ ID NO:1是称为“Qi611S”的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是Qi611s,编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。
具体实施方式
本发明提供了用于产生或增强生物体或非生物物质的屏障的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供组合物及其使用方法,其包括能够以生物膜表型生长的乳杆菌属和/或其一种或多种生物活性提取物。本发明还提供了冻干、冷冻干燥和/或裂解物形式的乳杆菌属和/或其生物活性提取物的组合物。
有利地,本文提供的优选组合物和治疗方法有效地增强现有屏障或在生物体和非生物物质上产生新屏障。用这种方法处理的生物体和物质可以具有减少的污垢,特别是减少的由细菌生物膜引起的污垢。
在某些实施方式中,本发明提供自净化表面。例如,在优选的实施方式中,该组合物可以通过防止或减少微生物、病毒和/或化学粘附到包括例如动物组织的细胞的表面上来进行自净化。在优选的实施方式中,这种屏障功能是抗原和病原体无关的。
在一些实施方式中,乳杆菌属是发酵乳杆菌Qi6,在本文中称为Lf Qi6。在一个实施方式中,该方法利用生物膜表型以及生物膜表型的提取物,包括其裂解物。在优选的实施方式中,组合物包含Lf Qi6生物膜的生物活性提取物。
在优选的实施方式中,本发明提供了具有屏障功能特性的生物活性蛋白质。在一个具体的实施方式中,本发明提供了“Qi611S”,一种具有根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白质。在某些实施方式中,本发明还提供了“Qi611S蛋白质”,其包括Qi611S及其活性片段和变体。
在一些实施方式中,Qi611S蛋白质可以由细胞产生,优选由细菌细胞产生。因此,在具体实施方式中,本发明提供了生产Qi611S蛋白质的方法,该方法包括在有利于蛋白质表达的条件下,培养具有编码全部或部分SEQ ID NO.1的核苷酸序列的细胞,或其变体或片段。在优选的实施方式中,核苷酸序列是Qi611s(SEQ ID NO.2)。任选地,可以从培养物中纯化蛋白质。
在一个实施方式中,该方法利用微生物,例如具有Qi611s核苷酸序列(SEQ IDNO.2)的发酵乳杆菌Qi6。Qi611s根据SEQ ID NO.1编码氨基酸序列(Qi611S)。
在另一个实施方式中,细胞是已经被重组改变以具有表达Qi611S蛋白质的能力的微生物。在一个具体实施方式中,微生物拥有Qi611s基因的全部或部分。因此,在某些实施方式中,本发明提供了一种重组细胞,其具有根据SEQ ID NO.2的DNA序列的全部或部分,和/或能够表达具有根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列或SEQ ID NO.1的片段或变体的蛋白质。在一个示例性实施方式中,重组细胞是大肠杆菌BL21或大肠杆菌C43。
可以使用微生物领域技术人员熟知的技术来完成细胞的这种转化。在一个实施方式中,可以修饰核苷酸序列以优化Qi611S蛋白质的表达。
在优选的实施方式中,本发明提供的组合物包括Qi611S蛋白质和/或根据SEQ IDNO.2的DNA序列的全部或部分的细胞以及任选地载体。发酵乳杆菌微生物的培养物已经保藏在美国模式培养物集存库(ATCC)(美国维吉尼亚州马纳萨斯大学道10801)。该保藏已由资源库分配登录号ATCC第PTA-122195号,于2015年6月10日保藏。
该培养物已在确保在本专利申请未决期间由专利商标专员根据37 CFR 1.14和35U.S.C 122确定有权获得该培养物的人可访问该培养物的条件下保藏。根据其中本申请的同族或后代已被递交的国家中的外国专利法的要求,该保藏是可获得的。然而,应该理解的是,保藏的可获得性并不构成实施本发明以减损通过政府行为授予的专利权的许可。
此外,主题培养物保藏将根据《微生物保藏布达佩斯条约》的规定进行储存和向公众提供,即,必须格外小心地储存保藏物,使其在最近的提供保藏样品的要求后的至少五年内,在任何情况下自保藏之日起至少30(三十)年,或可能会公开培养物的任何专利的可执行期限内,保持存活和不受污染。如果保藏机构因保藏状况而无法在要求时提供样品,则保***承认有义务更换保藏。在公开它的专利被授权后,所有对本培养物保藏的公众可获得性的限制将彻底取消。
选定的定义
“Qi611S”是指具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。“Qi611S蛋白质”的单数或复数的引用是指Qi611S以及611S的活性片段和变体。
如本文所用,“基因”是指能够表达多肽和/或氨基酸链的DNA片段或核苷酸序列。在某些实施方式中,基因包括在编码区之前和/或之后的区域,例如启动子区域。
如本文所用,“生物纯培养物”是从其他生物活性材料(包括在自然界中可能与其相关的任何材料)中分离出来的。在一个优选的实施方式中,培养物已从所有其他活细胞中分离出来。在进一步优选的实施方式中,生物纯培养物具有与自然界中可能存在的相同微生物种类的培养物相比有利的特征。有利的特征可以是例如一种或多种期望的生长副产物的产量增加。
在某些实施方式中,纯化的化合物是目标化合物的至少60wt%。优选地,该制剂是目标化合物的至少75wt%,更优选至少90wt%,最优选至少99wt%。例如,纯化的化合物优选按重量是所需化合物的至少90%、91wt%、92%、93%、94%、95%、98%、99%或100%(w/w)。纯度通过任何合适的标准方法测量,例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析。
如本文所用,术语“受试者”是指需要或期望递送由活性剂(例如,药物化合物)提供的益处的动物。动物可以是例如人、猪、马、山羊、猫、小鼠、大鼠、狗、猿、鱼、黑猩猩、红毛猩猩、豚鼠、仓鼠、牛、羊、鸟(包括鸡),以及与任何其他脊椎动物或无脊椎动物。这些益处可以包括但不限于:健康状况、疾病或紊乱的治疗;健康状况、疾病或紊乱的预防;促进免疫健康;和/或增强体内器官、组织或***的功能。在本发明的上下文中,优选的受试者是人。在一些实施方式中,受试者受到健康状况、疾病或紊乱的折磨;而在一些实施方式中,受试者处于良好健康状态(例如,没有受伤或疾病),但希望特定器官、组织或身体***的健康和/或功能得到增强。受试者可以是任何年龄或发育阶段,包括婴儿、幼儿、少年、青少年、成人或老年人。
如本文所用,术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”、“有效量”和“有效剂量”用于指当施加给受试者时能够治疗或改善受试者的状况、疾病或紊乱或者能够增强器官、组织或身体***的健康或功能的化合物或组合物的量或剂量。换言之,当施用于受试者时,该量是“治疗有效的”。实际量将根据许多因素而变化,包括但不限于:正在治疗或改善的特定状况、疾病或紊乱;状况的严重程度;需要增强健康或功能的特定器官、组织或身体***;患者的体重、身高、年龄和健康状态;以及给药途径。治疗处方,例如剂量决定等,是全科医生和其他医生的责任,通常会考虑要治疗的紊乱、个体患者的状况、递送的部位、给药方法和其他从业人员已知的因素。
如本文所用,术语“治疗”是指在任何程度上地根除、减少、改善或逆转健康状况、疾病或紊乱的体征或症状,并且包括但不要求完全治愈该状况、疾病或紊乱。治疗可以是治愈、改善或部分改善紊乱。“治疗”还可以包括改善或增强状况或特征,例如,使身体中特定***的功能达到健康或体内平衡的增强的状态。
如本文所用,“预防”健康状况、疾病或紊乱是指避免、延迟、预先阻止或最小化状况、疾病或紊乱的特定体征或症状的开始。预防可以(但不是必须)是绝对的或完全的;意思是,体征或症状可能仍会在以后发展。预防可包括降低此类状况、疾病或紊乱发作的严重程度和/或抑制状况、疾病或紊乱发展为更严重的状况、疾病或紊乱。
如本文所用,对“基于微生物的组合物”或“源自微生物的组合物”的引用意味着包含由于微生物或其他细胞培养物的生长而产生的组分的组合物。基于微生物的组合物可以包含微生物本身;或者,微生物可以与培养它们的肉汤或培养基分离,因此该组合物包含残留的细胞组分和/或微生物生长的副产物。微生物生长的副产物可以是例如代谢物、细胞膜成分、合成蛋白质和/或其他细胞成分。
本发明进一步提供了“基于微生物的产品”,其是要在实践中应用以实现期望结果的产品。基于微生物的产物可以仅是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。或者,基于微生物的产物可包含已添加的其他成分。这些附加成分可以包括例如稳定剂、缓冲剂和/或合适的载体(例如水或盐溶液)。基于微生物的产物可以包含基于微生物的组合物的混合物。基于微生物的产物还可以包含已经以某种方式(例如但不限于过滤、离心、裂解、干燥和纯化)处理的基于微生物的组合物的一种或多种组分。
如本文所用,“收获”是指从生长容器中去除一些或全部的基于微生物的组合物。
如本文所用,“应用”组合物或产物是指将其与对象或部位接触,使得组合物或产物可以对该对象或部位具有效果。该效果可以是由于例如微生物生长和/或生长副产物的作用。例如,可以将基于微生物的组合物或产物喷洒到物体和/或表面上。
如本文所用,“分离的”或“纯化的”蛋白质基本上不含在自然界或在生长容器中与之相关的其他化合物,例如细胞材料。在某些实施方式中,纯化的化合物占目标化合物的至少60wt%(干重)。优选地,该制剂是目标化合物的至少75wt%,更优选至少90wt%,最优选至少99wt%。例如,纯化的化合物按照重量是所需化合物的至少90%、91%、92wt%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(w/w)的化合物。纯度通过任何合适的标准方法测量,例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析。
“代谢物”是指通过代谢产生的任何物质(即生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是作为代谢的起始材料(例如葡萄糖)、中间体(例如乙酰辅酶A)或终产物(例如正丁醇)的有机化合物。代谢物的示例包括但不限于:生物表面活性剂、酶、酸、溶剂、气体、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸和聚合物。
术语“调节”是指改变(增加或减少)。此类改变通过本领域已知的标准方法(例如本文所述的那些的)检测。
本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。例如,1至20的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20以及上述整数之间的所有中间小数值(例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9)组成的组的任何数字、数字的组合或子范围。关于子范围,从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”被具体考虑。例如,示例性范围1到50的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1到10、1到20、1到30和1到40或在另一个方向上的50到40、50到30、50到20和50到10。
“减少”是指至少1%、5%、10%、25%、50%、75%或100%的负变化。
“增加”是指至少1%、5%、10%、25%、50%、75%或100%的正变化。
“参考”是指标准或控制条件。
如本文所用,“药物”、“促进健康的化合物”或“促进健康的物质”是指为用作医疗和/或治疗药物而制造的化合物。
如本文所用,“污染物”是指导致另一种物质或物体变得脏或不纯的任何物质。污染物可以是有生命的或无生命的,可以是无机或有机的物质或沉积物。在一个实施方式中,污染物是病毒。活的有机体可以包括细菌,例如蓝藻细菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属和乳球菌属、真核生物(如藻类、酵母、真菌、藤壶和贻贝)。此外,污染物可包括但不限于水垢、碳氢化合物(例如石油、焦油砂或沥青质);脂肪、油和油脂(FOG),例如烹饪油脂和猪油;脂质;蜡,例如石蜡;树脂;生物膜;或任何其他物质,例如,污物、灰尘、淤泥、污垢、熔渣、煤尘、浮渣、斑块、堆积物或残留物。“水垢”是指由例如硫酸钡、碳酸钙、硫酸钙、草酸钙、氢氧化镁、氧化镁、硅酸盐、硫酸锶、氧化铝氢氧化物、铝硅酸盐、磁铁矿或铁酸镍、氯化钠、二氧化硅、硫化铁、氧化铁、碳酸铁、铜、磷酸盐、氧化物和任何其他可以沉淀和形成沉积物的矿物化合物的沉淀产生的任何类型的水垢。
包括生物体或非生物物质的材料的有害积累会导致“结垢”过程。“结垢”可能导致堵塞、结垢或其他不希望的堆积。“污垢”会影响物体的效率、可靠性或功能。
与“含有”或“包含”同义的过渡性术语“包括”是包容性的或开放式的,并且不排除未列举的额外元件或方法步骤。相比之下,过渡性短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡性短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及那些不会实质性影响要求保护的发明的基本和新颖特征的”,例如阻止细菌生长的能力。术语“包括”的使用设想了“由”和“基本上由”所列举的组件组成的实施方式。
除非特别说明或从上下文中显而易见,如本文所用,术语“或”被理解为具有包容性。除非特别说明或从上下文中显而易见,如本文所用,术语“一个”和“该”被理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文显而易见,如本文所用,术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内,例如在平均值的2个标准偏差内。术语“约”可以理解为在规定值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%范围内。
如本文所用,“生物膜”是微生物(例如细菌)的复杂聚集体,其中细胞使用通常由多糖材料组成但不限于此的基质相互粘附。生物膜中的细胞在生理上不同于同一生物体的浮游细胞,浮游细胞是可以在液体或气体介质中漂浮或游泳、或驻留在固体或半固体表面之上或之中的单个细胞。单个微生物细胞也可以是丝状的,在细胞链中结合在一起,而不形成不同的生物膜。虽然如此,细胞的丝状属性可以促进生物膜的产生。
在本文的变量的任何定义中,化学基团的列举的叙述包括将该变量定义为任何单个基团或所列举基团的组合。本文中对变量或方面的实施方式的叙述包括作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合的实施方式。
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一个或多个组合。
本发明的其他特征和优点根据以下对其优选实施方式的描述和权利要求将是显而易见。本文引用的所有参考文献由此通过引用并入。
乳杆菌属和Qi601S裂解物
乳杆菌属是革兰氏阳性棒。发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)Qi6(Lf Qi6)可以在37℃在MRS培养基中生长。Lf Qi6培养物可用于目前提出的公开内容,或者生物活性裂解物可从Lf Qi6培养物分离并用于本发明的抗菌和其他屏障增强/产生方法和组合物。
此外,Lf Qi6可以在生物膜表型中生长。Lf Qi6培养物可以根据本公开使用,或者包括Qi601S、Qi601SM、Qi601SP、Qi601SL、Qi601SMP、Qi601SML、Qi601ML、Qi601MP、Qi601AM和Qi601A的生物活性裂解物可以从Lf Qi6生物膜培养物中分离,并用于抗菌或其他屏障增强/产生方法和组合物。Qi601代表Lf Qi6的生物活性裂解物,每个伴随Qi601的字母代表从培养物中分离的不同部分或培养物的生长和/或加工方法。Qi601S、Qi601SM、Qi601A和Qi601AM是从Lf Qi6中分离出来的不同部分。“L”和“P”分别表示该部分的液体和粉末/冻干制剂。
在使培养物生长以形成生物膜的一种方法中,可以将培养物在37℃下在5ml的MRS肉汤中培养24小时。然后可以将1ml培养物转移到含有25ml MRS肉汤的T-150组织培养板中。然后可以每48小时更换25ml MRS培养基,以使Lf Qi6的生物膜在培养板底部像草坪一样生长。然后培养物可以生长例如7天以产生厚的生物膜层。随后可以将生长的生物膜层刮掉并悬浮在新鲜培养基中。冷冻堆可以用甘油制成并储存在-80℃。
冷冻保存中的Lf Qi6生物膜表型可在10ml新鲜MRS培养基中于37℃培养24小时。可以将10ml培养物接种到带有500g无菌玻璃棉的25L MRS培养基中。然后可以在37℃的静态条件下将生物膜培养72小时。可以每24小时轻轻摇动以混合培养物,之后可以收获培养基和玻璃棉。随后可以通过超声将生物膜细胞与玻璃棉分离。细胞可以被进一步离心以浓缩Lf Qi6的生物膜,然后将其悬浮在无菌水中。这种放大产生浓度为2g/L的生物膜培养物。
Qi611S蛋白质和编码611S蛋白质的多核苷酸序列
在优选的实施方式中,本发明提供了用于产生屏障的蛋白质及其片段和变体。本发明进一步提供了编码该蛋白质的核苷酸序列,以及其片段和变体。
在某些具体实施方式中,本发明的蛋白质,称为“Qi611S”,具有约8.0kDA的分子量。“Qi611S蛋白质”,包括Qi611S及其片段和变体,可以根据几个参数进行表征,包括,例如,创建或有助于保护表面免受例如微生物、病毒和/或化学品污染的屏障的能力。
Qi611S蛋白质可以进一步由其氨基酸序列定义。在一个具体实施方式(Qi611S)中,该蛋白质具有如SEQ ID NO:1所示的74个氨基酸序列。
在某些实施方式中,本文提供的蛋白质也可以基于与某些抗体的免疫反应性来鉴定。
在某些实施方式中,Qi611S蛋白质由发酵乳杆菌Qi6菌株产生,此时实验室生长条件用于迫使生长成生物膜表型。在优选的实施方式中,该菌株具有Qi611S DNA序列(SEQ IDNO:2),其能够在生物膜表型条件下表达具有SEQ ID NO:1的蛋白质。
发酵乳杆菌是革兰氏阳性棒。发酵乳杆菌Qi6(Lf Qi6)可以在37℃在MRS培养基中生长。
在某些实施方式中,多核苷酸序列是Qi611S,它是222个碱基对并且编码Qi611S;然而,在某些实施方式中,由于例如遗传密码的冗余,不同的DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。创建编码Qi611S蛋白质的这些替代DNA序列完全在技术人员的能力内。
如本文所用,蛋白质的“变体”是指具有一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或***的序列。在优选实施方式中,这些取代、缺失、添加或***不会对Qi611S的屏障活性产生实质性不利影响。保留屏障活性的变体在本发明的范围内。
Qi611S的“片段”及其变体也在Qi611S蛋白质的范围内,只要该片段保留Qi611S的一种或多种生物学特性。优选地,一种或多种生物活性包括屏障促进活性。优选地,片段为全长Qi611S的至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。该片段可以包含例如一个或多个Qi611S或变体的亲水域。这些域可以直接连接,***氨基酸被去除。亲水域可以使用本领域已知的标准程序容易地鉴定,如图12所示。
本发明进一步考虑融合结构体,其中Qi611S蛋白质直接或间接(例如,通过连接子)连接到另一个部分,该另一个部分例如可以是靶向部分(例如,配体、抗体或适配体)、毒素、载体、标签或活性增强剂。
本发明进一步考虑了针对Qi611S蛋白质的抗体(例如,多克隆、单克隆、嵌合和人源化的)。拥有本文提供的教导的本领域普通技术人员可以容易地制备这些抗体。这些抗体可用于例如蛋白质纯化。
在某些实施方式中,编码Qi611S蛋白质的多核苷酸可以被隔离、扩增以及将其连接到载体中。“载体”、“质粒”或“质粒载体”是用于将DNA转移到细胞的DNA分子,通常从一个细胞转移到另一个细胞(宿主细胞)。该载体可以在宿主细胞中复制;或者,载体可以是将DNA结合到细胞中(或从细胞中去除DNA)的手段。可以使用多种手段将载体引入宿主细胞。一些细胞可吸收载体,除了将载体置于细胞培养物中之外无需本领域技术人员采取任何行动。其他需要化学修饰。不管细胞可以通过何种手段吸收载体,一旦宿主细胞具有这样做的能力,它现在就是一个“感受态”细胞。
在某些实施方式中,本发明涉及宿主细胞的遗传转化,以便为这些细胞提供产生Qi611S蛋白质的能力。例如,具有Qi611S(或其他编码Qi611S蛋白质的多核苷酸)的载体可以转化成宿主细胞(例如,微生物、植物、真菌和/或动物细胞),从而允许使用重组细胞进行Qi611S蛋白质的生产。
在优选的实施方式中,宿主细胞是大肠杆菌菌株,例如大肠杆菌BL21或大肠杆菌C43。或者,将大肠杆菌以外的细胞转化为感受态细胞的能力在本领域中是众所周知的,这包括基于例如它们的转化能力、异源蛋白质表达的能力和效率、宿主中蛋白质的稳定性、辅助遗传能力的存在、哺乳动物毒性的缺乏、易于杀死和固定而不损害蛋白质、易于培养和/或配制、易于处理、经济性、储存稳定性等而选择的细胞。
本领域技术人员将认识到,本发明的DNA序列可能由于遗传密码的简并性和密码子的使用而变化。考虑了所有编码Qi611S蛋白质的DNA序列。因此,编码Qi611S蛋白质的所有多核苷酸序列都包括在本发明中,包括编码SEQ ID NO:1的DNA(任选地包括编码区之前的ATG)。本发明还包括具有被优化用于在宿主细胞(包括本文提及的任何特定类型的细胞)中表达的密码子的多核苷酸。用于创建优化序列的各种技术在本领域中是已知的。
此外,本领域技术人员将认识到,等位基因变化可能发生在DNA序列中,这不会显著改变DNA序列编码的肽的氨基酸序列的活性。所有这些变体DNA序列都包括在本发明的范围内。
本领域技术人员将理解,示例序列可用于鉴定、产生和使用编码Qi611S蛋白质的额外核苷酸序列。与所述DNA序列具有至少90%或至少95%同一性并编码Qi611S蛋白质的变体DNA序列包括在本发明内。下面提供了变体多核苷酸和氨基酸序列的其他数值范围(例如,50-99%)。遵循本文的教导并使用本领域熟知的知识和技术,技术人员将能够在不使用过度实验的情况下制造大量具有变体DNA序列的可操作实施方式。特别考虑的是来自其他菌株或物种的同系物。
本发明的多核苷酸和氨基酸序列的片段和突变、***和缺失变体可以以与示例序列相同的方式使用,只要该片段和变体与原始序列具有基本的序列相似度。如本文所用,基本序列相似度是指足以使变体或片段序列能够以与原始序列同样的能力发挥作用的核苷酸或氨基酸序列相似性的程度。优选地,该相似度大于50%;更优选地,该相似度大于75%;并且最优选地,这种相似度大于90%。变体以其预期能力发挥作用所需的相似程度将取决于序列的预期用途。进行旨在改善序列功能或以其他方式提供方法优势的突变、***和缺失突变完全在本领域受过训练的人员的能力内。与本文示例的序列相比,同一性和/或相似度也可以是49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%,。
氨基酸同一性/相似度和/或同源性通常在蛋白质的关键区域中最高,该关键区域负责生物活性和/或与最终负责生物活性的三维构型的确定相关。在这方面,某些氨基酸取代是可接受的和可预期,只要这些取代在对活性不重要的区域中或者这些取代是不影响分子三维构型的保守氨基酸取代。例如,氨基酸可以分为以下几类:非极性、不带电荷的极性、碱性和酸性。保守取代(其中一类氨基酸被相同类型的另一种氨基酸取代)属于本发明的范围,只要该取代不会实质性地改变化合物的生物活性。下面(表1)是属于每个类别的氨基酸的示例的列表。
表1.基于物理性质的氨基酸分类。
在某些情况下,也可以进行非保守取代。关键因素是这些取代不能显著降低蛋白质的生物活性。
Lf Qi6和Qi601S裂解物的配制和递送
本发明提供了用于增强屏障功能的组合物和方法。本发明的优选实施方式提供了组合物及其使用方法,其包含新的裂解物。本发明还提供了冻干和/或冷冻干燥形式的组合物。
有利地,本文提供的优选组合物和处理方法在治疗或预防细菌和/或病毒感染、防止结垢、限制或消除物体与有害物质或生物体之间的接触、灭活有害生物体或物质和/或增加屏障的耐久性方面是有效的。
在某些实施方式中,本发明提供自净化表面。
一方面,本发明提供了用于预防或减少表面的化学或微生物污染和/或用于治疗细菌和/或病毒感染的组合物,其包含生物纯细菌菌株和/或其生物活性提取物,以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。此外,该组合物可以由能够以浮游和生物膜表型生长的细菌菌株组成,该组合物具有选自一般抗菌活性的一种或多种生物活性、抑制病原生物膜生长、抑制病原生物膜粘附、促进病原生物膜脱离、促进共生生物膜生长和增强皮肤屏障功能。
在一些实施方式中,自净化表面防止微生物或病毒粘附,并且在具体实施方式中,防止随后的生物膜形成和/或分离现有的生物膜,同时增强相关基材的屏障功能。在具体的实施方式中,组合物包含一种或多种热稳定的生物膜蛋白质,当施用于诸如皮肤的表面和诸如聚苯乙烯和玻璃的生物表面时,其阻止有害生物膜和/或其他污染物的形成。这些组合物提高了皮肤的免疫力、物理凝聚力和皮肤的整体屏障功能。这些组合物为传统的化学表面净化和药理学抗菌提供了替代。由于它们对人体生物表面没有毒性,因此生物医学应用广泛,包括作为局部应用于受试者的皮肤、肠道、胃、肺、眼睛、嘴巴、鼻窦、鼻子、耳朵、气管或食道的自净化材料的用途。
如本文所用,术语“提取物”是指通过处理细菌培养物获得的组合物。该处理可以涉及例如物理和/或化学处理。物理和/或化学处理可以包括例如过滤、离心、超声处理、压力处理、辐射处理、裂解、用溶剂或其他化学品处理,以及这些处理的组合。提取物可以是例如上清液的形式,例如通过离心产生的上清液。提取物还可以包括通过离心获得的细胞群。细胞可以是完整的或不完整的、存活的或无活力的。提取物可以包含细胞膜成分和/或细胞内成分。在某些实施方式中,提取物是至少80wt%、85wt%、90wt%或95wt%的细胞群。在某些实施方式中,至少95%的完整细胞是无活力的。在某些实施方式中,提取物中的细胞群中少于10%是完整细胞。
人体皮肤包括两个隔室,深隔室(真皮)和表面隔室(表皮)。皮肤构成抵御外部攻击(特别是化学、机械和/或感染性攻击)的屏障,以及针对环境因素(例如气候、紫外线和烟草)和/或外源性因素(例如微生物)的许多防御反应。这种特性被称为皮肤屏障功能,主要由表皮的最浅层(即角质层)提供。屏障中的有害变化可以通过例如皮肤不适、感官现象和/或皮肤干燥来反映。
根据本发明一些实施方式的组合物可用于防止屏障功能降低和/或修复或再生屏障功能。与皮肤和/或粘膜屏障破坏相关的疾病包括但不限于牛皮癣、鱼鳞癣、结节病、动脉粥样硬化、炎症性肠病、痤疮(包括化脓性汗腺炎)、烧伤、尿布疹、Netherton综合征、光化性角化病、皮肤真菌病、皮肤病或外胚层发育不良、特应性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、寻常型嗜酸性食管炎、丝聚蛋白缺乏症和其他与皮肤和/或黏膜屏障损伤或破坏有关的疾病。
在一些实施方式中,本发明的方法促进屏障的修复、再生或其他增强,包括黏膜的修复或再生。黏膜包括嘴部黏膜(包括脸颊、软腭、舌头(包括舌下表面)和口底的粘膜)、鼻子黏膜、喉咙黏膜(包括咽、喉部、气管和食道的黏膜)、支气管黏膜、肺黏膜、眼睛黏膜、耳朵黏膜、胃肠道黏膜、***黏膜、***黏膜、尿道黏膜、膀胱黏膜和***黏膜。在某些实施方式中,本发明的组合物还可用于治疗急性和慢性病毒感染。特别地,本发明可用于慢性EB病毒、流感、冠状病毒(包括COVID-19)、巨细胞病毒和其他人群中普遍存在并且与免疫监视的减少有关的疱疹型病毒感染的治疗或进入壁垒。一些病毒感染会导致癌症。例如,EB病毒感染可能是霍奇金淋巴瘤(一种淋巴细胞癌)的危险因素。
有利地,本发明的优选组合物可以被加热灭菌并保持活性。在一个实施方式中,本发明的组合物即使在经受254°F和21磅/平方英寸的压力30分钟后仍保留抵抗表面微生物定殖的能力。在优选的实施方式中,活性物质保持在pH 4.0至8.0、4.5至7.5或5.0至7.5。
本文提供的组合物还可以包括本领域技术人员已知的其他药学上可接受的成分,包括但不限于药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂和着色剂。制剂还可包含其他活性剂,包括例如其他治疗剂或预防剂。
如本文所提供的,“药学上可接受的”是指由美国联邦政府或州政府的监管机构批准或可批准的,或在美国药典或其他公认的用于动物(包括人类)的药典中列出的。
“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”是指可以与活性成分一起施用于受试者的赋形剂、载体或佐剂,并且在以足以递送本文提供的组合物的治疗量的剂量施用时,不会破坏活性成分的药理活性并且无毒。
感染发生在引起疾病的微生物侵入身体组织的地方。这些微生物及其产生的毒素与身体组织发生反应,通常会引起受感染宿主的免疫反应。感染可能是由细菌、病毒、类病毒、真菌和其他寄生虫引起的。感染可能通过身体的任何组织(例如皮肤、肠道或膜)发生。在具体实施方式中,本发明提供用于治疗和/或预防身体外表面、特别是皮肤的感染的组合物。感染可能是由细菌如致病性金黄色葡萄球菌引起的。本文提供的药物组合物可以暴露于感染剂单独、顺序或同时施用。在其他实施方式中,本发明提供用于治疗肠道和其他内部疾病的材料和方法。
金黄色葡萄球菌是一种短暂的皮肤定植菌,主要分布在身体潮湿、温暖的区域,例如腹股沟、腋窝和前鼻孔。世界上多达60%的人口是间歇性携带者,而另外20%的人口可能被稳定定殖。虽然正常携带是无症状的,但金黄色葡萄球菌可能会侵入组织(例如,通过破损的皮肤),这种情况会导致疾病,从相对轻微的脓疱病和烫伤皮肤综合征到危及生命的疾病,如败血症。此外,金黄色葡萄球菌感染通常是具有潜在疾病(例如特应性皮炎(AD))的皮肤继发现象。
本发明提供的示例性组合物可用于治疗或阻止多种病原菌感染,该病原菌包括但不限于葡萄球菌属(腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus),木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus),路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis),施氏葡萄球菌(Staphylococcus schleiferi),山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae),腐生葡萄球菌,人葡萄球菌(Staphylococcus hominis),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)),假单胞菌属(Pseudomonas spp.),粪肠球菌(Enterococcus faecalis),抗万古霉素肠球菌(VRE),蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,单核细胞增生李斯特菌、化脓性链球菌、唾液链球菌、变形链球菌和肺炎链球菌。其他病原细菌将容易地被本领域技术人员识别。
在某些实施方式中,本发明提供了清洁产品、洗涤物、表面涂层或其他组合物形式的抗菌组合物,其不用于人体或动物体的医学治疗。因此,在具体实施方式中,这些组合物用于对无生命表面消毒或对针对无生命表面的微生物定殖提供屏障。在某些实施方式中,本发明提供自净化表面。
在另一个方面,本发明提供了一种治疗人类皮肤病或提供屏障以抵抗人类皮肤病的方法,包括向受试者施用有效量的组合物,该组合物优选包含Lf Qi6生物膜的一种或多种生物活性提取物。
组合物可以单独施用或与其他治疗同时或顺序地组合施用,取决于要治疗或避免的疾病。本文提供的组合物可以溶解于、悬浮于一种或多种其他可接受的成分中或与其混合。组合物也可以存在于脂质体或其他微粒中。
在优选的实施方式中,组合物被配制用于局部给药,特别是用于或应用到皮肤或皮肤上。此类制剂可用于去除、杀死或防止不希望的物质如病原菌(如MRSA)粘附、定殖和/或积聚在生物或非生物表面上,或抑制细菌的作用或生长。此外,在具体实施方式中,包含Lf Qi6的生物膜或其提取物的组合物具有促进人类皮肤微生物组中共生细菌生长的优点。共生细菌的非限制性示例包括但不限于表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、缓症链球菌、痤疮丙酸杆菌、棒状杆菌属、约氏不动杆菌和铜绿假单胞菌。
本文提供的组合物可以适当地以贴剂、橡皮膏、绷带、敷料等形式提供,其浸渍或涂布有微生物生物膜和/或其一种或多种提取物和任选的一种或多种其他可接受的成分,包括例如穿透、渗透和吸收促进剂。
根据本发明实施方式的组合物可用于在施用到受试者或受试者治疗或受试者使用之前处理生物材料、植入物和假体(包括支架、瓣膜、眼睛、助听器、胃束带、假牙和人工关节置换物)、手术器械或其他医疗装置。抗菌组合物可用于处理易于定殖或暴露于细菌或病毒的表面,例如扶手、食物制备表面、厨房表面或设备、桌子、水槽、马桶或其他浴室硬件。
除了微生物(例如Lf Qi6)生物膜或其生物活性提取物之外,所述组合物还可以包含试剂,例如清洁剂、稳定剂、阴离子表面活性剂、香料、螯合剂、酸、碱、缓冲剂和/或去污剂。此类试剂可以促进或增强组合物的抗菌和/或屏障特性,例如杀死或抑制细菌和/或病毒,或防止表面定殖。
适用于皮肤和/或经皮给药的制剂包括但不限于凝胶、糊剂、药膏、乳膏、洗剂和油,以及贴剂、橡皮膏、绷带、敷料、仓库、粘合剂、胶水和储液器。
药膏通常由本文提供的化妆品组合物和石蜡的或水溶性药膏基质制备。
乳膏通常由本文提供的化妆品组合物和水包油乳膏基质制备。如果需要,乳膏基质的水相可以包括例如至少约30%w/w的多元醇,即具有两个或更多个羟基的醇,例如丙二醇、1,3-丁烷二醇、甘露醇、山梨醇、甘油、聚乙二醇及其混合物。
如本领域技术人员将容易理解的,根据本发明的制剂还可以包含其他醇,例如异丙醇或乙醇,并且还可以涵盖其他基于醇的制剂,例如基于醇的洗手液。
局部制剂可理想地包括增强活性化合物通过皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的化合物。这种透皮增强剂的示例包括二甲亚砜和相关的类似物。
乳液通常由本文提供的化妆品组合物和油相制备,其可以任选地仅包含乳化剂(也称为乳剂),或者它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或与油或与脂肪和油的混合物。优选地,亲水性乳化剂与用作稳定剂的亲油性乳化剂一起包含。还优选包括油和脂肪。乳化剂(与稳定剂一起或没有稳定剂)构成所谓的乳化蜡,所述蜡与油和/或脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质,形成乳膏制剂的油性分散相。
合适的乳化剂和乳液稳定剂包括吐温60、司盘80、十八醇十六醇混合物、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。为制剂选择合适的油或脂肪基于实现所需的化妆品特性,因为活性化合物在可能用于药物乳液制剂的大多数油中的溶解度可能非常低。因此,乳膏应优选为不油腻、不染色和可洗的产品,具有合适的粘稠度以避免从管或其他容器中泄漏。直链或支链、一元或二元烷基酯,例如二异己二酸酯、异十六烷基硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕榈酸酯或被称为Crodamol CAP的支链酯的混合物可以被使用,最后三种是优选的酯。根据所需的性能,这些可以单独使用或组合使用。或者,可以使用高熔点脂质,例如白色软石蜡和/或液体石蜡或其他矿物油。其他制剂包括牙科喷雾剂、漱口水、牙膏、锭剂、抗菌洗剂、饮料(如牛奶、酸奶)、食品(如酸奶、冰淇淋、糖果棒)或粉状食品(如奶粉)。
本文提供的组合物可包含单(单位)剂量的益生菌或其裂解物或其提取物。益生菌(完整的、裂解的或提取的)的合适剂量可以在104至1012cfu的范围内,例如104至1010、104至108、106至1012、106至1010或106至1080cfu之一。在一些实施方式中,剂量可以每天一次或两次施用。在一些实施方式中,根据本发明使用的组合物可包含至少约0.01wt%、约0.05wt%、约0.1wt%、约0.2wt%、约0.3wt%、约0.4wt%、约0.5wt%、约0.6wt%、约0.7wt%、约0.8wt%、约0.9wt%、约1.0wt%、约1.5wt%、约2.0wt%、约3.0wt%、约4.0wt%、约5.0wt%、约6.0wt%、约7.0wt%、约8.0wt%、约9.0wt%、约10.0wt%、约11.0wt%、约12.0wt%、约13.0wt%、约14.0wt%、约15.0wt%、约16.0wt%、约17.0wt%、约18.0wt%、约19.0wt%、约20.0wt%、约25.0wt%、约30.0wt%、约35.0wt%、约40.0wt%、约45.0wt%、约50.0wt%的提取物。在一些实施方式中,组合物可包含至少约0.01wt%至约30wt%、约0.01wt%至约20wt%、约0.01wt%至约5wt%、约0.1wt%至约30wt%、约0.1wt%至约20wt%、约0.1wt%至约15wt%、约0.1wt%至约10wt%、约0.1wt%至约5wt%、约0.2wt%至约5wt%、约0.3wt%至约5wt%、约0.4wt%至约5wt%,约0.5wt%至约5wt%或约1wt%至约5wt%的Lf Qi6提取物。
为了本发明的目的,缩写cfu应表示“菌落形成单位”,其定义为如琼脂平板上通过微生物计数所揭示的细菌细胞的数量。
在一个实施方式中,主题组合物被配制成口服消耗品,例如食品、胶囊、丸剂或可饮用液体。可口服递送的促进健康的化合物是通过在胃肠道中或进入口腔黏膜的初始吸收递送的任何生理活性物质。组合物也可以配制成溶液,其可以通过例如注射给药,注射包括静脉内、腹膜内、肌肉内、鞘内或皮下。在其他实施方式中,主题组合物被配制成通过贴剂经由皮肤给药或直接施用于皮肤上,以获得局部或全身作用。组合物也可以舌下、口腔、直肠或***给药。此外,可以将组合物喷入鼻中以通过鼻膜吸收,雾化通过口或鼻吸入,或在眼或耳中给药。
根据本发明,可口服的产品是适合食用、营养、口腔保健或愉悦的任何制剂或组合物,并且是旨在引入人类或动物口腔中、在其中保持一段时间、然后被吞咽(例如,可食用的食物或药丸)或者再次从口腔中取出(例如,口香糖或口腔保健产品或医用漱口水)的产品。虽然可口服递送的药物可以配制成口服消耗品,并且口服消耗品可以包括口服递送药物,但这两个术语在本文中并不意味着可以互换使用。
口服消耗品包括所有旨在供人类或动物摄入的处于加工、半加工或未加工状态的物质或产品。这还包括在生产、处理或加工过程中添加到口服消耗品(特别是食品和药品)中并打算引入人类或动物口腔的物质。
口服消耗品还可以包括旨在被人类或动物吞咽然后以未改性、制备或加工状态消化的物质。根据本发明,口服消耗品还包括旨在与产品一起被吞咽或预期吞咽的壳体、涂层或其他封装。
在一个实施方式中,口服消耗品是胶囊、丸剂、糖浆、乳剂或液体混悬剂,其含有所需的口服递送物质。在一个实施方式中,口服消耗品可以包括粉末形式的口服递送物质,其可以与水或另一种液体混合以产生可饮用的口服消耗品。
在一些实施方式中,根据本发明的口服消耗品可以包含一种或多种旨在用于营养或愉悦的制剂。这些包括烘焙产品(例如面包、干饼干、蛋糕和其他糕点)、糖果(例如巧克力、巧克力棒产品、其他棒产品、水果口香糖、包衣片剂、硬焦糖、太妃糖和焦糖以及口香糖)、酒精或非酒精饮料(例如,可可、咖啡、绿茶、红茶、富含绿茶或红茶提取物的红茶或绿茶饮料、路易波士茶、其他花草茶、含水果的柠檬水、等渗饮料、软饮料、花蜜、水果和蔬菜汁以及水果或蔬菜汁制品)、速溶饮料(例如速溶可可饮料、速溶茶饮料和速溶咖啡饮料)、肉制品(例如火腿、新鲜或生香肠制品,以及调味或腌制的鲜肉或咸肉制品)、鸡蛋或蛋制品(例如干全蛋、蛋清和蛋黄)、谷物制品(例如早餐谷物、麦片条和预煮速煮米制品)、乳制品(例如,全脂或低脂或脱脂牛奶饮料、大米布丁、酸奶、克非尔、奶油奶酪、软奶酪、硬奶酪、干奶粉、乳清、黄油、酪乳和部分或完全水解的含有乳蛋白质的产品)、大豆蛋白质制品或其他大豆部分(例如,豆浆及其制备的产品、含有分离或酶促处理的大豆蛋白质的饮料、含有大豆粉的饮料、含有大豆卵磷脂的制剂、发酵产品,例如由其制备的豆腐或豆豉产品以及与水果制剂和可选的调味物质的混合物)、水果制品(例如,果酱、水果冰淇淋、水果酱和水果馅)、蔬菜制品(例如,番茄酱、酱汁、干蔬菜、冷冻蔬菜、预煮蔬菜和煮熟的蔬菜)、零食物品(例如,烘烤或油马铃薯片(薯片)或马铃薯面团产品和以玉米或花生为基础的挤压物)、以脂肪和油或其乳剂为基础的产品(例如,美乃滋、蛋黄酱和调味品)、其他现成的食品和汤(例如,干汤、速溶汤和预煮汤)、调味料(例如,洒上面的调味料)、甜味剂组合物(例如,片剂、香囊和其他用于增甜或增白饮料或其他食品的制剂)。本发明的组合物也可用作半成品,用于生产其他用于营养或愉悦的组合物。
主题组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂,并且可以配制成制剂,例如固体、半固体、液体或气体形式,例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
根据本发明,载体和/或赋形剂可以包括任何和所有溶剂、稀释剂、缓冲剂(例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水或任选的Tris-HCl、乙酸盐或磷酸盐缓冲液)、水包油或油包水乳液、含有或不含有适合于例如IV使用的有机共溶剂的水性组合物、增溶剂(例如聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80)、胶体、分散介质、载体、填料、螯合剂(例如、EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(例如甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂(例如卡波姆、明胶或海藻酸钠)、涂料、防腐剂(例如,硫柳汞、苯甲醇、聚季铵盐)、抗氧化剂(例如,抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、张力控制剂、吸收延迟剂、佐剂、填充剂(例如,乳糖、甘露醇)等。在药物和补充剂领域中使用载体和/或赋形剂是众所周知的。除了与目标健康促进物质或佐剂组合物不相容的任何常规介质或试剂外,可以考虑载体或赋形剂在主题组合物中的使用。
在一个实施方式中,可以将组合物制成气雾剂制剂,从而例如可以将其雾化或吸入。适合以气雾剂或喷雾剂形式给药的药物制剂是例如溶液、悬浮液或乳液。用于口服或鼻腔气雾剂或吸入给药的制剂也可以与示例性载体(包括例如盐水、聚乙二醇或乙二醇、DPPC、甲基纤维素)一起配制,或与粉末状分散剂或碳氟化合物混合配制。气雾制剂可放入加压推进剂中,例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气、碳氟化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。说明性地,递送可以通过使用一次性递送装置、雾化器、呼吸激活粉末吸入器、气溶胶计量吸入器(MDI)或任何其他本领域可用的众多雾化器递送装置。此外,也可以使用雾化帐篷或通过气管内导管的直接给药。
在一个实施方式中,可以将组合物配制成例如溶液或悬浮液,以通过注射给药。溶液或悬浮液可包含合适的无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂,例如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格溶液或等渗氯化钠溶液,或合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂,例如无菌、无刺激性、固定油,包括合成甘油单酯或甘油二酯,以及脂肪酸,包括油酸。用于静脉内使用的载体的一个示例性例子包括10%USP乙醇、40%USP丙二醇或聚乙二醇600以及余量的USP注射用水(WFI)的混合物。其他用于静脉内使用的示例性载体包括10%USP乙醇和USP WFI;0.01-0.1%三乙醇胺的USP WFI溶液;或0.01-0.2%二棕榈酰二磷脂酰胆碱的USP WFI溶液;和1-10%角鲨烯或肠胃外植物水包油乳液。水或盐溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液可优选用作载体,特别是针对可注射溶液。用于皮下或肌肉内使用的载体的示例性例子包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液、5%葡萄糖的WFI溶液和5%葡萄糖中0.01-0.1%三乙醇胺或0.9%氯化钠的USP WFI溶液,或10%USP乙醇、40%丙二醇的1:2或1:4混合物,余量为可接受的等渗溶液,例如5%葡萄糖或0.9%氯化钠;或0.01-0.2%二棕榈酰二磷脂酰胆碱的USP WFI溶液和1-10%角鲨烯或肠胃外植物水包油乳液。
在一个实施方式中,可以将组合物配制成例如局部溶液,以便通过局部施用到皮肤上施用,所述局部溶液包括冲洗液、喷雾剂、滴剂、洗剂、凝胶、软膏、霜剂、泡沫、粉末、固体、海绵、胶带、蒸气、糊剂、酊剂或透皮贴剂。除了任何药物活性载体之外,合适的局部应用制剂还可以包含润肤剂,例如巴西棕榈蜡、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、乳化蜡、含水羊毛脂、羊毛脂、羊毛脂醇、微晶蜡、石蜡、凡士林、聚乙二醇、硬脂酸、硬脂醇、白蜂蜡或黄蜂蜡。此外,该组合物可包含:保湿剂,例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、山梨醇溶液和1,2,6-己三醇;或渗透促进剂,例如乙醇、异丙醇或油酸。
本发明的一种基于细菌的产品仅仅是含有细菌和/或由细菌产生的微生物代谢物和/或任何残留营养物的生长培养基。生长产物可直接使用,无需提取或纯化。如果需要,可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术轻松实现提取和纯化。
基于细菌的产品中的细菌可以是活性或非活性形式。基于细菌的产品可以在没有进一步稳定、保存和储存的情况下使用。有利地,这些基于细菌的产品的直接使用保持了微生物的高生存能力,降低了被外来试剂和不希望的微生物污染的可能性,并保持了微生物生长副产物的活性。
在一个实施方式中,裂解物可以是纯化的形式或生长产物的混合物。可以以0.01至90重量%(wt%)、优选0.1至50wt%、更优选0.1至20wt%的浓度添加裂解物。在另一个实施方式中,裂解物可以与可接受的载体组合,因为裂解物可以以0.001至50%(v/v),优选0.01至20%(v/v),更优选0.02至5%(v/v)的浓度存在。
根据本发明有用的表面活性剂和溶剂包括甘露糖蛋白、β-葡聚糖、乙醇、乳酸和具有例如生物乳化和表面/界面张力降低特性的其他代谢物。
在从生长容器中收获基于细菌的组合物后,随着收获的产品被放置到容器和/或通过管道运输(或以其他方式运输以供使用)时,可以添加其他组分。添加剂可以是例如染料、颜料、pH调节剂、盐、粘合促进化合物、螯合剂(例如,EDTA、柠檬酸钠、柠檬酸)、溶剂(例如,异丙醇、乙醇)、杀生物剂、其他微生物和其他特定用途的成分。
有利地,螯合剂通过改变例如革兰氏阴性菌的细胞壁使其更易受表面活性剂处理而增强抗微生物屏障组合物的功效。因此,渗透革兰氏阴性菌的能力拓宽了本发明的抗微生物能力的范围。
在一个实施方式中,螯合剂选自EDTA、柠檬酸、柠檬酸盐、乙酸钠或其任何组合。螯合剂可以以至多约5g/L或更多的量添加到组合物中。在具体实施方式中,螯合剂是浓度为约0.5至3g/L的EDTA。
高达例如50wt%或更多的添加剂可以根据需要添加,用于特定应用,如改变VOC水平、增加混合物的渗透性、降低混合物的粘度、作为混合物中不溶性物质的偶联剂,以及为亲油和亲水污垢提供溶剂。
在某些实施方式中,本发明的屏障组合物包含粘合剂,主要负责将油漆中的颜料保持在一起。粘合剂可以是油基粘合剂或乳胶基粘合剂。粘合剂化合物可以选自例如丙烯酸酯、醇酸、丙烯酸、丙烯酰胺、酚醛树脂、酚醛醇酸树脂、聚丙烯酰胺、聚氨酯、硅酮醇酸、聚酯、环氧树脂、乙烯基、乙酸乙烯酯-乙烯、乙烯基醇酸、无机粘合剂(钠、硅酸乙酯钾、锂等)、有机粘合剂(碳基的)、(Daubert Chemical Company,Inc.,伊利诺伊州芝加哥市)、脂肪族氨基甲酸乙酯和油改性氨基甲酸乙酯。
在某些实施方式中,本发明的屏障组合物包含颜料或染料,其可提供油漆或其他涂层的颜色,还可额外保护表面或物体免受UV光影响。颜料或染料可以是天然的、合成的、无机的或有机的。颜料或染料可选自例如二氧化钛、氧化锌、锌黄、黄色染料、联苯胺黄、氧化铬绿、酞菁绿、酞菁蓝、群青蓝、朱红色、颜料棕6、红170、二恶嗪紫罗兰色、炭黑、氧化铁(II)、石英砂(SiO2)、滑石、重晶石(BaSO4)、高岭土和石灰石(CaCO3)。
在某些实施方式中,组合物中使用的溶剂之一选自矿物或有机溶剂,包括例如乙醇、丁醇、丙醇、脂肪烃、脂环烃、二甲苯、甲苯、酮和/或异丙醇。在一个优选的实施方式中,异丙醇以1至100ml/L、更优选地2至50ml/L的量被加入到组合物中。
在某些实施方式中,组合物还包含离子或半离子液体作为溶剂。离子液体可以充当助溶剂,并且可以防止在烃组合物中形成环键,这是烃沉淀的原因之一。适用于主题组合物的示例性离子液体包括但不限于硝酸乙基铵或甘油/七水合硫酸镁。优选地,组合物中离子液体的浓度范围为约0.1%至约5%。
离子液体完全由离子组成,离子可以包括阳离子、阴离子和/或它们的组合。许多离子液体为有机盐形式,熔点低于100℃,或者甚至通常低于室温。最常见的离子液体是由有机基阳离子和无机或有机阴离子制备的离子液体。至少一种离子具有离域电荷,并且一种成分是有机的,这阻止了稳定晶格的形成。离子液体可适用于例如在烷基化和聚合反应中以及在二聚、低聚乙酰化、置换和共聚反应中用作催化剂和溶剂。离子液体的性质,如熔点、粘度和溶解度,由有机成分上的取代基和反离子决定。
在某些实施方式中,组合物还包含氢氧化铵作为溶剂。优选地,氢氧化铵(70%溶液)以约1至50ml/L、更优选地3至10ml/L的浓度存在于组合物中。
在一个实施方式中,基于细菌的屏障产品可以进一步包含缓冲剂,包括有机和氨基酸或它们的盐。合适的缓冲剂包括柠檬酸盐、葡糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸盐、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、粘酸盐、葡萄糖酸盐、丙醇二酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其混合物。也可以使用磷酸和亚磷酸或它们的盐。合成缓冲液也适合被使用,但优选使用天然缓冲液,例如上面列出的有机酸和氨基酸或它们的盐。
在进一步的实施方式中,pH调节剂包括氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾或碳酸氢钾、盐酸、硝酸、硫酸或混合物。
基于细菌的屏障产品可以与促进基于细菌的产品粘附到待处理表面的组合物一起施用。粘附促进物质可以是基于细菌的产品的组分,或者它可以与基于细菌的产品同时或依次施用。
可以使用通常用于涂层组合物中的其他添加剂,包括水软化剂、螯合剂、腐蚀抑制剂和抗氧化剂,它们以有效量添加以执行其预期功能。这些添加剂及其用量完全在本领域的技术范围内。合适的水软化剂包括线性磷酸盐、苯乙烯-马来酸共聚物和聚丙烯酸酯。合适的螯合剂包括1,3-二甲基-2-咪唑烷酮;1-苯基-3-异庚基-1,3-丙二酮;以及2羟基-5-壬基苯乙酮肟。腐蚀抑制剂的示例包括2-氨甲基丙醇、二乙基乙醇胺苯并***和甲基苯并***。适用于本发明的抗氧化剂包括(BHT)2,6-二叔丁基对甲酚、(BHA)2,6-二叔丁基对苯甲醚、伊士曼抑制剂O A B M-草酰双(苯亚甲基酰肼)和伊士曼DTBMA 2,5-二叔丁基氢醌。
在某些实施方式中,组合物还包含选自磷、镁、钾、葡萄糖和铵的盐和/或无机盐。优选地,添加1至20g/L、更优选2至10g/L的铵盐,例如磷酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵或另一种二碱或单碱盐。
可包含在根据本发明的制剂中的其他合适的添加剂包括通常用于此类制剂的物质。添加剂可以是例如载体、在相同或不同设施中生产的其他基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、示踪剂、杀生剂、干燥剂、增塑剂、流动控制剂、消泡剂、乳化剂、紫外线稳定剂、抗结皮剂、调质剂、乳化剂、润滑剂、溶解度控制剂、防腐剂和/或稳定剂。
有利地,根据本发明,基于细菌的产品可以包括微生物在其中生长的肉汤。该产品可以是例如至少1wt%、5wt%、10wt%、25wt%、50wt%、75wt%或100wt%的肉汤。按重量计,产品中的生物质的量可以是例如从0%到100%的任意一点,包括它们之间的所有百分比。
可选地,产品可以在使用前储存。储存时间优选短。因此,储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施方式中,如果产品中存在活细胞,则将产品储存在凉爽的温度下,例如低于20℃、15℃、10℃或5℃。另一方面,基于细菌的组合物通常可以在环境温度下储存。
根据本发明的组合物可以包含多种组分,其用量可有效清洁表面、组成物和设备,和/或提供有效涂层以防止污染物、水垢和腐蚀日后的累积。
微生物及其生物膜裂解物在屏障中的用途
使用细菌衍生的屏障可以在应用于物体和/或表面时提供多种改进。
屏障的增强的性能和使用寿命
在某些实施方式中,将主题组合物或方法应用于物体提高了屏障的性能,主要是通过改变物体与其周围环境之间的相互作用。在某些实施方式中,从细菌生物膜获得的细菌和/或裂解物和/或分子(例如蛋白质)可以应用于物体的表面,这可以防止或限制生物体或非生物物质的直接接触,防止生物体或非生物物质污染,隔离生物体或非生物物质,灭活生物体或非生物物质,增强屏障耐久性,和/或增加共生生物体的浓度。在一些实施方式中,分子已经被合成产生和/或纯化。
在某些实施方式中,本发明提供了自净化表面。
在某些实施方式中,组合物可以通过将物体或表面所在的环境与物体本身物理分离来防止污染物的直接接触。油漆、清漆、涂料、抛光剂、粘液和其他屏障在环境和屏障内的物体之间提供物理分离。
在某些实施方式中,该组合物可以防止由活生物体(例如病毒和细菌细胞)造成的污染。该组合物可以防止表面定殖并防止生物膜粘附,这可以限制致病细菌的传播。该组合物还可以阻止生物体的生长或启动细胞凋亡。
在某些实施方式中,本发明的组合物可以防止无生命物质、例如盐沉积物造成的污染。
在某些实施方式中,本发明的组合物可以增强屏障的耐久性。这可以通过抵抗液体、气体或固体的摩擦磨损来实现。
在某些实施方式中,本发明的组合物可以增加物体或表面上共生生物体的浓度。这可以通过抑制共生生物体的微生物竞争者在表面上的生长或粘附来间接完成。或者,该组合物可以直接提高共生生物体的生长速度。
本发明可用于防止沉积发生。生物体或沉淀物的分散或溶解会降低表面或物体上可用的污染物浓度。因此,本发明允许延迟与去除沉淀物和沉积物有关的预防性维护或完全消除其必要性,以及允许延迟或完全消除更换或修理设备部件的需要。主题涂料组合物可进一步用于分散例如储存和运输罐、油轮、船舶、卡车、管道和出油管线、混凝土、沥青、覆盖物、金属、壁板和灰泥中的结垢堆积,而无需机械清洁溶液或有毒溶剂。
在某些实施方式中,该方法用于清洁表面,其中该表面是需要去污、去污染和/或清除堵塞的设备。有利地,本发明的方法可用于通过改进设备的维护和正常运行来提高工业操作或设备的整体生产率。
将组合物应用于表面
该组合物可以应用于无生命或有生命的表面或物体,例如皮肤、粘膜、衣服、金属表面、眼镜、防护服(包括口罩)和鞋类。
在某些实施方式中,本发明提供了自净化表面。
在某些实施方式中,该组合物可以应用于绷带;个人卫生用品;餐具和炊具;桌子和台面;服装,包括背心、衬衫、裤子、袜子、夹克、裙子、短裤、内衣、袜子、手套、围巾、盔甲、潜水服、泳衣、太空服、正装、运动服、皮衣、休闲服;鞋类,包括鞋子、靴子、凉鞋、拖鞋、脚蹼、带钉鞋、船鞋、木底鞋、带钉鞋、雪地鞋、滑雪靴、帆船靴、足尖鞋、高跟鞋;头饰,包括帽子、头盔、王冠、帽子、软帽、兜帽、面罩、头巾、面纱、披肩、假发或医疗设备;眼镜,包括眼镜、护目镜、隐形眼镜、眼罩、防护眼镜和太阳镜;服装配饰,包括手镯、戒指、包、小背包、包裹、钱包、项链、珠宝、手表、雨伞、钱包、阳伞、手扇、剑、手杖、领带、腰带、披肩、挂绳、别针、穿孔饰品和长袜。
在某些实施方式中,该组合物可应用于车辆,包括军用车辆、装甲战车、侦察车、自行防空炮、自行防空***、救护车、轿车、卡车、吉普车、悍马、大蓬货车、直升机、自行车、独轮车、滑板车、滑板、四轮运货车、公共汽车、气垫船和摩托车;船只或军舰,包括潜艇、拖网渔船、漂网渔船、巡逻舰、驱逐舰、***、护卫舰、轻巡洋舰、战列舰、战列巡洋舰、炮艇和猎雷舰;列车包括装甲列车、客运列车、货运列车、机车、磁悬浮列车、单轨列车和矿山列车;飞机,包括喷气式、螺旋桨式或火箭推进类;航天器,包括卫星、探测器、火箭、分离舱、太空舱和轨道飞行器。
可以使用例如喷雾瓶或加压喷雾装置通过喷雾将组合物施用于表面。也可以使用布或刷子来施加组合物,其中将组合物摩擦、涂抹或刷到表面上。此外,可以通过将表面浸入、浸泡或浸入其中具有组合物的容器中,将组合物施用到表面上。
在一个实施方式中,材料和/或表面被允许利用其上的组合物浸泡足够的时间,以施加涂层或从物体和/或表面上提起和/或去除污染物。例如,根据需要,浸泡可进行12至24至36至48至72小时或更长时间。
在一个实施方式中,该方法还包括从表面去除组合物和污染物的步骤。这可以通过例如将水冲洗或喷洒到表面上,和/或用布摩擦或擦拭表面直到组合物和污染物已从表面上清除来实现。可以在用布摩擦或擦拭表面之前和/或之后进行用水冲洗或喷洒。
在另一个实施方式中,可以使用机械方法从表面去除污染物和/或组合物。例如,搅拌器、钻头、锤子或刮刀可用于从由于例如污染物的量或污染物的类型而特别难以去除的表面上清除污染物。
在某些实施方式中,组合物可以药学上可接受的方式施用,包括注射(即,皮下、静脉内、腹膜内)、口服、皮肤或鼻内。
材料和方法
细菌菌株和培养基
发酵乳杆菌Qi6(Lf Qi6)在37℃在MRS培养基中生长。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC 33591(ATCC,马纳萨斯,维吉尼亚州)在-80℃下储存在含有20%(v/v)甘油的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)(Thermo Scientific,沃尔瑟姆,马塞诸塞州)中。将培养物在37℃在有氧条件下在110rpm的旋转振荡器上培养过夜。用分光光度计(SpectraMax Plus384,Molecular Devices,森尼维尔市,加利福尼亚州)读取过夜培养物的光密度并稀释至OD600为0.2。该菌株还使用既定方案进行了met和eap PCR,以确认MRSA状态(3)。
Lf Qi6生物膜的培养
Lf Qi6在MRS琼脂板中培养。然后将培养物在5ml MRS肉汤中于37℃培养24小时。将1ml培养物转移到含有25ml MRS肉汤的T-150组织培养板中。每48小时更换25ml MRS培养基,以使Lf Qi6的生物膜在培养板底部像草坪一样生长。然后使培养物生长7天以产生厚的生物膜层。随后将生长的生物膜层刮出并悬浮在新鲜培养基中。冷冻原液用甘油制成并在-80℃储存。
将冷冻原液中的Lf Qi6生物膜表型在10ml新鲜MRS培养基中于37℃培养24小时。将10ml培养物接种到具有500g无菌玻璃棉的25LMRS培养基中。然后将生物膜在37℃的静态条件下培养72小时。每24小时轻轻摇动以混合培养物,然后收获培养基和玻璃棉。随后通过超声处理将生物膜细胞与玻璃棉分离。将细胞进一步离心以浓缩Lf Qi6的生物膜,然后将其悬浮在无菌水中。这种放大产生浓度为2g/L的生物膜培养物。
Lf Qi6生物膜下游加工
将50g Lf Qi6生物膜悬浮在1L无菌水中。将悬浮液在室温下轻轻混合24小时,以使多种生物活性物质被动释放。然后使用OmniSonic Ruptor 400将混合物超声处理30分钟(50KHz,200瓦)成均匀的裂解物。然后将超声处理的裂解物冷冻并冻干成细粉。
由益生菌制备Lf Qi6
发酵乳杆菌Qi6使用专有的培养方法在MRS培养基中生长。然后再次使用专有的培养方法,将细菌接种到500ml MRS培养基中一段附加时间。对细菌进行超声处理(RelianceSonic 550,STERIS Corporation,曼托,俄亥俄州,美国),以10000x g离心,细胞团块分散在无菌水中,裂解收获的细胞(Sonic Ruptor 400,OMNI International,肯内索,乔治亚州,美国)并再次以10,000x g离心,可溶部分离心(50kDa Amicon Ultra膜过滤器,EMDMillipore Corporation,达姆施塔特,德国,Cat#UFC905008)。将所得级分分配成0.5ml等分试样,在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。
生物膜抑制试验
将MRSA添加到无菌聚苯乙烯、组织培养(TC)处理的平底板(Genesee Scientific,圣地亚哥,加利福尼亚州,Cat#25-109)的孔中。TSB用作无菌对照。生长控制孔接受等量的MRSA和培养基。添加选择浓度的Qi601S或其他测试试剂,将板在37℃下培养18小时,然后如染色和生物膜量化部分所述对生物膜进行量化。
染色和生物膜量化
使用BioTek洗板机将组织培养板用PBS洗3次,并置于47℃培养箱中1小时以热固定生物膜。将板冷却至室温,用0.1%(v/v)结晶紫染色15分钟,然后使用微板清洗机用去离子水洗涤。加入100%乙醇30分钟以溶解结晶紫染色。使用分光光度计(SpectraMax Plus384,Molecular Devices,森尼维尔市,加利福尼亚州)在590nm和600nm处读取板。
示例
从以下通过说明给出的示例可以更好地理解本发明及其许多优点。以下示例说明了本发明的一些方法、应用、实施方式和变体。它们不应被认为是限制本发明。可以对本发明进行许多变化和改进。
示例1—Qi601SL、Qi601SML、Qi601A、Qi601AM和Qi601SP抑制MRSA的粘附(图2、图6、图7、图8)
为了证明来自发酵乳杆菌Qi6的各种裂解物可以抑制MRSA的粘附,首先将MRSA培养至对数生长期,用TSB稀释,然后将各种Qi601S(Qi601SL、Qi601SML、Qi601SP、Qi601AM或Qi601A)添加到96孔或24孔板中的MRSA。将培养物培养过夜。使用结晶紫染色和酶标仪测量590nm处的吸光度,每个样品的粘附情况被可视化。
Lf Qi601裂解物可以抑制MRSA的粘附,建立了一种抑制MRSA生物膜粘附的新方法。
示例2—Qi601SL、Qi601SP、Qi601SML、Qi601A、Qi601AM和Qi601SMP在洗涤后继续抑制MRSA的粘附(图1、图3、图4、图5、图7、图8)
为了证明来自发酵乳杆菌Qi6的各种裂解物可以抑制MRSA的粘附,首先将MRSA培养至对数生长期,用TSB稀释,然后将各种Qi601S(Qi601SL、Qi601SML、Qi601SMP、Qi601SP、Qi601A或Qi601AM)添加到96孔或24孔板中的MRSA。将培养物培养过夜。使用结晶紫染色和酶标仪测量590nm处的吸光度,每个样品的粘附情况被可视化。
尽管如示例1和示例2中所证明的,裂解物可以抑制MRSA粘附是很重要的,但裂解物在洗涤后保持其效果的能力,证明了组合物的耐久性。
示例3–原子力显微镜
图9提供了本发明材料的原子力显微镜图像。
示例4–病原体附着的预防
病原体对人体组织的附着对其致病性是必不可少的,特别是对于食物中毒菌株大肠杆菌O157:H7。因此,对于模型革兰氏阴性病原体大肠杆菌,评估了Qi 601S对于人体肠道细胞的抗粘附作用。人类细胞中的这些结果(图10)表明,用Qi601S处理产生了抗大肠杆菌的抗粘附表面。
图10示出了Qi 601S如何在Caco-2细胞上形成有效对抗大肠杆菌的抗粘附表面。将细胞以每孔5x104个细胞分进24孔板,并再生长10天以进行分化和汇合。选定的孔用Qi601S 0.1%v/v进行过夜预处理,然后用PBS洗涤。大肠杆菌K12在TSB中过夜扩增,每孔添加1x108CFU,并培养3小时。通过PBS洗涤去除未结合的细菌。用1%Triton X-100裂解肠细胞。通过连续稀释和TSA上的标准板计数对结合的细菌进行量化,并与未处理的对照进行比较。
Qi 601S在48小时的抗菌抗粘附(自清洁)活性的持久性也在活的人体组织上得到证实。人类离体全厚皮肤样本(去除后立即获得的来自选择性腹壁成形术的多余组织)用于代表体内保护。
简而言之,该方法如下:通过标准培养方法将离体皮肤预定性为MRSA阴性。根据包装说明,在MRSA选择性培养基(CHROMagar,Becton Dickinson)上对菌落进行表型鉴定。腹壁成形术皮肤保持连续培养,在3天培养基更换后的手术切除2周内使用,以去除残留的术前抗生素。从单一供体外植体组织获得一厘米穿孔活检,并在24孔板中重复5次进行实验。
表皮与载体(300ul PBS)或Qi601S(300ul PBS中的1%)一起24小时。然后用PBS冲洗皮肤3次并置于新培养板的0.5微米Transwell***物中。然后将实验样品用5ul MRSA以OD=0.1(1x109CFU/ml)培养48小时,再次用PBS冲洗以去除未粘附的细菌并转移到培养皿中。将每个皮肤样品擦拭3次,将拭子尖端一起放入带玻璃珠的含有0.1%Triton-X的PBS溶液的试管中,然后涡旋15秒。将系列稀释液涂在Luria Bertani(LB)琼脂和CHROMagar上,第二天计数菌落。
图11示出了Qi 601S生产的抗MRSA的抗粘附表面。将PBS中1%v/v的Qi 601S应用于培养的活的人类皮肤24小时,然后冲洗。然后将皮肤与MRSA一起培养2天,冲洗皮肤,然后培养用于MRSA菌落。与未经处理的皮肤相比,使用Qi 601S进行的预处理示出MRSA负荷显著降低了60%以上。
示例5—防止生物威胁
除了针对MRSA生物膜的活性外,Qi 601S还表现出对其他生物威胁因素(包括病毒威胁)的活性。CDC根据生物防御、生物战和生物***风险将生物战剂分为3类。A类包括易于散播或传播的生物制剂,例如炭疽,B类包括中等容易散播或传播的生物制剂,例如沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7和金黄色葡萄球菌,特别是MRSA,C类包括新出现的制剂。C类正在不断重新评估中。例如,冠状病毒在2014年被NIAID、CDC和美国国土***添加到C类,现在包括严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、MERS-CoV和其他高致病性人类冠状病毒,包括COVID-19(NIAID新兴传染病/病原体,2018年)。
Qi 601S还表现出对乙酰胆碱酯酶((AChE)抑制的完全保护。这种酶对正常的神经反应和功能至关重要,它的抑制是神经毒气制剂的目标,神经毒气制剂是不可逆的AChE抑制剂。这种酶的不可逆抑制导致神经***过度兴奋并最终死亡。AChE在神经元突触将兴奋性神经递质乙酰胆碱(Ach)降解为胆碱和乙酸,主要存在于中枢神经***的胆碱能突触中。
微克量致死的有机磷酸酯(OP)已被用作杀虫剂和神经毒气制剂。尽管这些化学物质是已知毒性最强的化合物之一,但目前还没有对暴露的受害者进行净化的非破坏性方法。
使用标准检测试剂盒(Abcam,#138871)测试了Qi601S对多奈哌齐的酶抑制活性的潜在AChE活性保护。图13的结果说明当用增加剂量的盐酸多奈哌齐进行攻击时,利用2%Qi601S实现强的、完全的和一致水平的AChE保护。
示例6—活性和稳定性
本发明的组合物的安全特性实现了作为自净化材料的生物医学应用,局部应用到皮肤、鼻子、眼睛以及吸入肺部。单次施用1%的热稳定亲水组分Qi 601S的溶液在体外SARSCoV模型中提供5天以上的无毒抗冠状病毒保护,并在人体皮肤上提供长达2天(测试的最新时间点)的持久抗MRSA抗粘附,以及提供惰性疏水表面(聚丙烯和玻璃),尽管重复冲洗并且在至少4.5至7.5的pH范围内。与许多生物产品不同,该组分在超过121℃的温度、重复冻融和含水载体中保持稳定。当作为硫酸铵沉淀物测试时抗MRSA效果的维持和化学纯的生物表面活性剂的组成分析表明抗微生物和表面活性剂活性是蛋白质衍生的。
序列表
<110> 群体创新有限责任公司
尼古拉斯•T•蒙苏尔
埃瓦•A•贝尔克斯
弗雷德里克•T•勃姆
<120> 新型保护性屏障组合物及其用途
<130> QBR.105CXC1
<150> 62/940,598
<151> 2019-11-26
<150> 63/016,336
<151> 2020-04-28
<160> 2
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 74
<212> PRT
<213> 发酵乳杆菌
<400> 1
Met Asp Asn Arg Ile Phe Phe Asn Pro Gly Asp Ser Ile Ala Asn Ile
1 5 10 15
His Asp Tyr Asn Glu Ala Val Arg Lys Gly Gln Ile Phe Lys Lys Glu
20 25 30
Gln Gln Ala Gly Asp Leu Val Ile Ala Lys Gly Pro Asp Asp Glu Glu
35 40 45
Tyr Ala Ile Phe Tyr Ala Asn Asp Ala Leu Pro Ala Asp His Glu Gln
50 55 60
Ser Gln Pro Tyr Glu Ile Lys Lys Asn Leu
65 70
<210> 2
<211> 225
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌
<400> 2
atggataacc ggattttctt caaccccggc gactcgatcg ccaacatcca cgactacaac 60
gaagccgtcc gcaagggcca aatcttcaaa aaggaacagc aggccggcga cctcgtgatc 120
gctaagggtc ccgatgacga agaatacgcc atcttctacg ccaacgatgc cctgcccgcc 180
gaccacgagc aatcccaacc ctacgagatt aagaaaaacc tctaa 225
Claims (19)
1.一种包含作为生物膜生长的乳杆菌属和/或包含所述生物膜的提取物的组合物,其中所述生物膜和/或其提取物增强屏障功能,使得当将所述组合物施用于表面时,所述表面变得对微生物、病毒和/或化学污染不易感。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,菌株是发酵乳杆菌Qi6,其登录号为PTA-122195。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述组合物包含由所述乳杆菌产生的热稳定性蛋白质。
4.根据权利要求1所述的组合物,其包含蛋白质,其中所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列:
i)SEQ ID NO:1;
ii)SEQ ID NO: 1的变体;和
iii)i)或ii)的片段。
5.一种表面,其上施加有权利要求1的组合物。
6.根据权利要求5所述的表面,其中所述表面是受试者的皮肤、肠、胃、肺、眼、口、鼻窦、鼻、耳、气管或食道的表面。
7.根据权利要求5所述的表面,其中所述表面位于选自医疗器械、工作台面、防护服、桌子、器具、椅子、餐具、炊具、医疗植入物、绷带、个人卫生产品、衣服、眼镜、鞋类、头饰和口罩的物体上。
8.根据权利要求5所述的表面,其中所述表面位于选自车辆、小船、轮船、汽车、卡车、坦克、飞机和火车的物体上。
9.根据权利要求5所述的方法,其中施用于表面的组合物包含登录号为PTA-122195的发酵乳杆菌Qi6。
10.根据权利要求5所述的方法,其中施用于表面的组合物包含由所述乳杆菌产生的热稳定性蛋白质。
11.根据权利要求5所述的方法,其中施用于表面的组合物包含蛋白质,其中所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列:
i)SEQ ID NO:1;
ii)SEQ ID NO:1的变体;和
iii)i)或ii)的片段。
12.一种增强对抗表面的化学、病毒和/或微生物污染的屏障的方法,其中所述方法包括将权利要求1的组合物施用于表面。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述表面选自受试者的皮肤、肠、胃、肺、眼、口、鼻、耳、气管或食道。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述表面选自医疗器械、工作台面、防护服、桌子、器具、椅子、餐具、炊具、医疗植入物、个人卫生产品、绷带、衣服、眼镜、鞋类、头饰和面罩。
15.根据权利要求12所述的方法,其中无生命表面位于选自车辆、小船、轮船、汽车、卡车、坦克、飞机和火车的物体上。
16.根据权利要求12所述的方法,其中物体和/或表面的性能和/或寿命通过以下中的一种或组合来增强:
a)防止或限制生物体或非生物物质与表面的直接接触;
b)防止生物体或非生物物质对表面的污染;
c)隔离生物体或非生物物质;
d)使生物体或非生物物质失活;
e)增加屏障的耐久性、稳定性和/或寿命;和
e)增加共生生物的存在。
17.根据权利要求12所述的方法,其中施用于表面的组合物包含登录号为PTA-122195的发酵乳杆菌Qi6。
18.根据权利要求12所述的方法,其中施用于表面的组合物包含由所述乳杆菌产生的热稳定性蛋白质。
19.根据权利要求12所述的方法,其中施用于表面的组合物包含蛋白质,其中所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列:
i)SEQ ID NO:1;
ii)SEQ ID NO:1的变体;和
iii)i)或ii)的片段。
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