CN114740055A - 一种线性范围可调的精准免疫传感方法及便携式生物电阻传感测量装置 - Google Patents

一种线性范围可调的精准免疫传感方法及便携式生物电阻传感测量装置 Download PDF

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CN114740055A CN202210225500.XA CN202210225500A CN114740055A CN 114740055 A CN114740055 A CN 114740055A CN 202210225500 A CN202210225500 A CN 202210225500A CN 114740055 A CN114740055 A CN 114740055A
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Abstract

本发明涉及一种线性范围可调的精准免疫传感方法及便携式生物电阻传感测量装置，该检测装置包括检测管道，检测管道一端通过螺纹连接真空泵，检测管道另一端设有吸液头，检测管道内部设有微通道，检测管道侧面设有电池，电池给浓度测量模块提供动力，测量模块内有两根检测电极，检测电极分别连接在微通道两侧，检测管道与枪头的连接处内部设有试剂盒，试剂盒外侧检测管道上设有震动装置。本发明检出限线性范围可调，灵敏度高、稳定性好、检测成本低、检测速度快，微孔滤膜可对大分子物质和各种杂质进行过滤，真空泵产生的高压配合微孔滤膜过滤能很好的解决大颗粒非待测物质在微通道中的堵塞和待测物在微通道中的吸附、聚集、堵塞现象。

Description

一种线性范围可调的精准免疫传感方法及便携式生物电阻传 感测量装置
技术领域
本发明属于食品安全、生物传感领域，具体涉及一种线性范围可调的精准免疫传感方法及便携式生物电阻传感测量装置。
背景技术
生物传感***主要包括生物识别分子、信号转换装置、光电信号放大装置等部分。常见的生物传感器可分为光学生物传感器、电化学生物传感器和压电免疫生物传感器三类。光学生物传感器具有样品用量少、响应速度快等优点，但是仪器体积较大、频率信号处理复杂，价格昂贵且操作过程较为复杂。压电免疫传感器分析时间短且稳定性好，但是该类传感器需要在检测基底上偶联生物识别分子，偶联时间较长且偶联过程复杂，需要对检测到的谐振波形进行处理，处理过程需要复杂的信号电路板，不能满足现场快速检测的要求。电化学生物传感器成本低廉、操作简单、灵敏度高、检测线性范围广，但是该类传感器需要在电极表面作修饰，电极表面会发生钝化、待测样本易受电极活性物质干扰、长期使用稳定性差。
现有技术中，一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的生物传感检测方法(公开号CN112595759A)公开了在微通道两端施以恒定的电压或电流，反应液中的绝缘微球在会在高压产生的电渗流作用下通过微通道产生阻塞效应，导致微通道两端电阻值的改变，微球的聚集状态不同，电阻变化量也就不同，通过测量微通道两端电流的变化值可检测绝缘微球浓度，从而间接得到待测目标物含量。该发明专利基于电化学生物传感原理，但该方法的分辨率较低，样品浓度之间需要差一个数量级才能检测到明显的信号改变，导致使用该方法在实际样品检测中准确性并不高。此外，一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法(公开号CN111413264A)公开了通过在箱体上设置多个小孔试管，在小孔试管上开有小孔，小孔内外装有正负电极，利用升降机构来控制小孔试管的升降，样品池中的目标物进入小孔的过程中会引起第一电极和第二电极之间的电阻信号发生改变，经过信号转换后将电阻信号转换为数字信号输出，该发明可以实现多个样品的同时检测，检测效率高且能够降低检测成本，但该装置成本高，仪器体积较大，携带不便并且每次都需要清洗小孔和电极，降低了检测效率，电极采集到的信号需要经信号处理***的多重放大和滤波后才能得到明显的电压脉冲信号，信号易受到外界复杂因素的干扰。
发明内容
本发明根据现场快速检测的实际需求和现有仪器设备存在的缺陷，基于电化学生物传感原理的基础上提供了一种针对不同待测物对灵敏度的要求不同，实现方法线性范围可调的精准免疫传感方法及便携式生物电阻传感测量装置。
本发明技术方案如下：
一种便携式生物电阻传感测量装置，该检测装置包括检测管道，检测管道一端通过螺纹连接真空泵，检测管道另一端设有吸液头，检测管道内部设有微通道，检测管道侧面设有电池，电池给浓度测量模块提供动力，测量模块内有两根检测电极，检测电极分别连接在微通道两侧，检测管道与吸液头的连接处内部设有试剂盒，试剂盒外侧检测管道上设有震动装置。
优选地，所述吸液头内部有微孔滤膜；吸液头上部与试剂盒的连接方式为过盈连接。优选地，所述吸液头设有圆锥尖端。
优选地，所述微通道为微流控芯片，微流控芯片上下分别设有两个第二孔分别连接检测管道和试剂盒，中间设有两个第三孔连接检测电极，检测电极通过伸入第三孔与微流控芯片内通道连接形成闭合回路。
优选地，所述微通道为弹性石英毛细管，毛细管通过硅胶垫片固定，硅胶垫片两端为拧紧装置，拧紧装置分别连接检测管道和试剂盒，拧紧装置侧方开有两个第一孔，检测电极通过伸入第一孔与毛细管连接形成闭合回路。
优选地，所述真空泵另一端连接废液池；所述测量模块侧面为液晶显示屏。
进一步优选地，所述废液池内部设置导液通道。
更进一步优选地，所述废液池内部设置U型导液通道。
一种线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法，所述方法为将反应液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物含量。
所述便携式生物电阻传感测量装置用于线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法。
优选地，针对不同待测物的含量和限量标准不同，提供了一组针对不同检出限要求的危害因子，实现线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法，具体过程如下：S1-A方案1：当待测目标物的浓度为高于500ng/mL时，选用方案1作为检测方案，包括以下步骤：
S1-A.1在磁珠表面偶联生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体；
S1-A.2使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体和待测物发生特异性反应；
S1-A.3向反应后的混合液中加入对应生物识别分子B修饰的聚苯乙烯微球，反应完成后磁分离取上清液，将上清液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物含量。
S1-B方案2：当待测目标物的浓度为50ng/mL-500ng/mL时，选用方案2作为检测方案，包括以下步骤：
S1-B.1在磁珠表面偶联生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体；
S1-B.2使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体和待测物发生特异性反应；
S1-B.3向反应后的混合液中加入点击试剂Ⅰ修饰的生物识别分子B，反应完成后磁分离弃去上清液重悬；
S1-B.4向重悬后的复合物溶液中加入点击试剂Ⅱ修饰的聚苯乙烯微球，反应完成后磁分离取上清液，将上清液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物浓度；
S1-C方案3：当待测目标物的浓度低于50ng/mL时，选用方案3作为检测方案，包括以下步骤：
S1-C.1将制备好的点击试剂Ⅰ修饰的待测物生物识别分子B和点击试剂Ⅱ修饰的辣根过氧化物酶偶联物混合发生点击反应；
S1-C.2在磁珠表面偶联待测物特异性生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体；
S1-C.3使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体和待测物发生特异性反应；
S1-C.4向反应后的混合液中加入S1-C.1中点击反应后的混合物，反应完成后磁分离弃去上清液后重悬；
S1-C.5向S1-C.4中磁分离后的重悬液中加入过氧化氢和多巴胺(DA)的混合溶液，反应一段时间后磁分离弃去上清液后重悬；
S1-C.6向S1-C.5中磁分离后的重悬液中加入氨基修饰的PS微球，反应一段时间后磁分离取上清液，将上清液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物浓度；
优选地，生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
所述生物识别分子A和生物识别分子B分别为待测物特异性抗体和待测物完全抗原、检测抗体和捕获抗体、抗体和抗原、抗原和抗体、DNA捕获探针和DNA检测探针、DNA检测探针和DNA捕获探针。
优选地，所述聚苯乙烯微球粒径为100nm-5000nm；所述磁颗粒粒径为50nm-5000nm；
所述点击反应中的点击反应功能基团包括叠氮-炔、四嗪基团(TZ)-反式环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)-叠氮(Azide)或半胱氨酸(Cys)-氰基苯并噻唑(CBT)或其他。
优选地，所述震动搅拌装置为一个偏心震动马达，马达震动功率多级可调。
优选地，所述检测管道、废液池材质为聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯等，但不仅限于此类材料。
所述微流控芯片基板材料为石英玻璃、聚丙乙烯、聚氯乙烯中的任意一种；与基板键合的空腔材料为HTL高精度光敏树脂、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、石英玻璃中任意一种。
所述检测电极为正负检测电极，为两根直径1mm，长5mm的铂丝或AgCl电极，电极一端伸入微通道，另外一端与测量模块相连。
本发明工作原理如下：
参考附图5A，对于检测浓度含量高、对方法检出限要求低的待测物，以检测呕吐毒素为例(国标GB2761-2011中规定了谷物及谷物制品中呕吐毒素DON的限量标准为1μg/mL)，采用如下检测方法：制备好的磁珠-呕吐毒素抗体偶联物(MNP1000-Ab)和呕吐毒素标准品发生抗原抗体反应，反应后的混合液中有未反应完的MNP1000-Ab偶联物和反应产物MNP1000-Ab-DON复合物，然后向混合液中加入BSA-呕吐毒素修饰的PS微球(PS3000-BSA-DON)，PS3000-BSA-DON会和上述混合液中未反应的MNP1000-Ab偶联物发生抗原抗体反应生成MNP1000-Ab-PS3000-BSA-DON，此时混合液中含有三种偶联物：反应产物MNP1000-Ab-DON、MNP1000-Ab-PS3000-BSA-DON和未反应完的PS3000-BSA-DON。将上述混合液磁分离后取上清液，则上清液中只含有PS3000-BSA-DON偶联物。当待测液中不含有呕吐毒素时，MNP1000-Ab会全部和PS3000-BSA-DON结合生成MNP1000-Ab-PS3000-BSA-DON，磁分离后上清液中的PS3000-BSA-DON会减少，当样品中有呕吐毒素时，MNP1000-Ab会先和呕吐毒素发生抗原抗体反应生成MNP1000-Ab-DON复合物，此时未反应的MNP1000-Ab复合物会减少，向混合液中加入PS3000-BSA-DON后，未反应的MNP1000-Ab所消耗的PS3000-BSA-DON减少，则磁分离后上清液中的PS3000-BSA-DON会增加。因此，样品中的呕吐毒素浓度与最终反应磁分离后上清液中的PS3000-BSA-DON浓度正相关。将上清液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的呕吐毒素浓度。
参考附图5B，对于检测浓度含量中等、对方法检出限要求中等的待测物，以检测黄曲霉毒素AFT-B1为例(国标GB2761-2011中规定了谷物及谷物制品中黄曲霉毒素AFT-B1的限量标准为200ng/mL)，采用如下检测方法：制备好的磁珠-黄曲霉毒素抗体偶联物(MNP1000-Ab)和黄曲霉毒素标准品发生抗原抗体反应，反应后的混合液中有未反应完的MNP1000-Ab偶联物和反应产物MNP1000-Ab-AFT复合物，然后向混合液中加入BSA-黄曲霉毒素修饰的点击试剂Ⅰ(BSA-AFT-TCO)，BSA-AFT-TCO会和上述混合液中未反应的MNP1000-Ab偶联物发生抗原抗体反应生成MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO，此时混合液中含有三种偶联物：反应产物MNP1000-Ab-AFT、MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO和未反应完的BSA-AFT-TCO。将上述混合液磁分离后弃去上清液，则沉淀物中含有MNP1000-Ab-AFT、MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO两种偶联物。向重悬后的复合物溶液中加入点击试剂Ⅱ修饰的PS微球(TZ-PS3000)，此时反应产物MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO中的反式环辛烯基团(TCO)会和TZ-PS1000中的四嗪基团(TZ)发生点击反应生成MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO-TZ-PS3000复合物，由于点击化学反应的高效性，MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO复合物表面可以迅速结合大量的TZ-PS3000，即为一重信号放大策略。当待测液中不含有黄曲霉毒素时，MNP1000-Ab会全部和BSA-AFT-TCO结合生成MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO，磁分离后沉淀物中的MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO会增加，向重悬后的复合物溶液加入TZ-PS3000后发生点击反应所消耗的TZ-PS3000也会增加，最终磁分离后的上清液中未反应的TZ-PS3000会减少。当样品中有黄曲霉毒素时，MNP1000-Ab会先和黄曲霉毒素发生抗原抗体反应生成MNP1000-Ab-AFT复合物，此时未反应的MNP1000-Ab复合物会减少，向混合液中加入BSA-AFT-TCO后，未反应的MNP1000-Ab所消耗的BSA-AFT-TCO减少，磁分离后沉淀物中的MNP1000-Ab-BSA-AFT-TCO会减少，则向重悬后的复合物溶液加入TZ-PS3000后发生点击反应所消耗的TZ-PS3000也会减少，最终磁分离后的上清液中未反应的TZ-PS3000会增加。因此，样品中的黄曲霉毒素浓度与最终反应磁分离后上清液中的TZ-PS3000浓度正相关。将上清液中的复合物通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的黄曲霉毒素浓度。
参考附图5C，对于检测浓度含量低、对方法检出限要求高的待测物，以检测赭曲霉毒素OTA为例(国标GB2761-2011中规定了谷物及谷物制品中赭曲霉毒素OTA的限量标准为5ng/mL)，采用如下检测方法：
首先将制备好的点击试剂Ⅰ-赭曲霉毒素完全抗原偶联物(BSA-OTA-TCO)和点击试剂Ⅱ-辣根过氧化物酶(TZ-HRP)二者混合反应生成BSA-OTA-TCO-TZ-HRP复合物，由于点击化学反应的高效性，BSA-OTA-TCO复合物表面可以迅速结合大量的TZ-HRP，即为一重信号放大策略；然后将制备好的磁珠-赭曲霉毒素抗体偶联物(MNP1000-Ab)和赭曲霉毒素标准品发生抗原抗体反应，反应后的混合液中有未反应完的MNP1000-Ab偶联物和反应产物MNP1000-Ab-OTA复合物，然后向混合液中加入上述经点击反应放大后的BSA-OTA-TCO-TZ-HRP复合物，BSA-OTA-TCO-TZ-HRP会和上述混合液中未反应的MNP1000-Ab偶联物发生抗原抗体反应生成MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP，此时混合液中含有三种偶联物：反应产物MNP1000-Ab-OTA、MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP和未反应完的BSA-OTA-TCO-TZ-HRP。磁分离后向沉淀物溶液中加入过氧化氢和多巴胺(DA)的混合溶液，MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP中的辣根过氧化物酶(HRP)会催化过氧化氢发生氧化还原反应产生氧气，氧气会催化多巴胺聚合成聚多巴胺(PDA)吸附在磁珠复合物(MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP@PDA)表面，聚多巴胺表面丰富的官能团大大增加了磁珠自身表面与PS微球结合的位点，即为第二重信号放大。磁分离后的沉淀物溶液中有反应产物MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP和MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP@PDA复合物。向磁分离后的复合物重悬液中加入氨基修饰的PS微球(3微米)，MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP@PDA复合物中的聚多巴胺会吸附PS微球表面的氨基，从而形成MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP@PDA-PS3000复合物，由于聚多巴胺含有丰富的官能团，因此可以与氨基PS微球进行有效地结合，通过使用PS微球作为信号探针，搭配本专利中的便携式生物电阻传感装置可对其进行高灵敏检测。将上述混合液磁分离后取上清液，则上清液中只含有未反应完氨基化PS微球。当待测液中不含有赭曲霉毒素时，MNP1000-Ab会全部和BSA-OTA-TCO-TZ-HRP结合生成MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP，使溶液中的MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP增加，对应的和HRP发生催化反应后生成的MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP@PDA也会增加，该复合物结合的氨基微球增加，最终磁分离后上清液中未反应的氨基微球含量降低。当样品中有赭曲霉毒素时，MNP1000-Ab、BSA-OTA-TCO-TZ-HRP、赭曲霉毒素三者会发生竞争反应，样品中的赭曲霉毒素含量越高，则与其反应的MNP1000-Ab就越多，生成的MNP1000-Ab-BSA-OTA-TCO-TZ-HRP复合物含量就会越少，对应的和HRP发生催化反应后生成的MNP1000-Ab-BSA-OTA-HRP@PDA也会减少，该复合物结合的氨基微球减少，则最终磁分离后上清液中未反应的氨基微球含量增加。因此，样品中的赭曲霉毒素浓度与最终反应磁分离后上清液中的的PS微球浓度正相关。将上清液中的复合物通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的赭曲霉毒素浓度。
与现有的现场快速检测方法和装置相比，本发明具有如下优点：
本精准检测方法，适用于不同检出要求的目标物，其线性范围可以灵活调节：对于含量较高、对方法检出限要求低的待测物，分别在磁珠和聚苯乙烯(PS)微球上偶联生物识别分子，加入目标物反应后进行磁分离取上清液中的未反应的PS微球进行检测；对于含量中等、对方法检出限要求中等的目标物，采用点击反应作为信号放大策略，进一步改变磁分离后上清液中PS微球的数量的变化，从而实现方法灵敏度的提升；对于含量较低、检出限要求高的待测物，则采用点击反应+酶促多巴胺聚合反应+氨基PS微球吸附的二重信号放大策略，反应结束后加入氨基化PS微球进行反应，磁分离后取剩余氨基化PS微球进行检测。具有如下创新点：
(1)检出限线性范围可调，灵敏度高：对检出限要不同的待测物，分别采用不同信号放大策略，有效的提高了检测灵敏度，能满足检测不同检出限要求的痕量物质检测的需求。(2)稳定性好：PS微球、磁珠等试剂在缓冲液中悬浮性好，比表面积大，配好的反应试剂可在定制试剂盒中长时间储存。(3)检测成本低：整个反应过程不需要标记酶、底物等的参与，参与反应的试剂价格低廉。(4)反应时间快，应用广泛：磁分离、抗原抗体反应和PS微球的高效信号读出结合，反应时间短，能广泛应用于各种检测领域。
本方法的便携式电阻生物传感测量装置，其利用生化反应后上清液中剩余的PS微球作为信号探针，在真空泵产生的负压作用下进入微通道中，由于PS微球的浓度、粒径、电性以及运动状态等的不同，会使微通道内部导电介质发生改变，导致微通道的导电性发生变化，从而引起微通道电阻发生改变，而电阻的变化量与PS微球浓度、粒径有关，通过对微通道施加恒定电流，检测闭环电路的电压变化量可计算剩余液体中未反应的PS微球浓度从而间接得到待测目标物含量。具有如下创新点：
(1)一次微孔滤膜和真空泵结合，滤膜可对大分子物质和各种杂质进行过滤，真空泵作为驱动力，产生的高压配合微孔滤膜过滤能很好的解决大颗粒非待测物质在微通道中的堵塞和待测物在微通道中的吸附、聚集、堵塞现象，使待测物在微通道中分布更均匀。(2)检测吸液头、微孔滤膜、定制试剂盒均为一次性，每个样品测完后更换新的备件，省去检测过程中的洗涤步骤，能避免样品间的交叉污染，减少检测时间，提高检测效率。(3)定制试剂盒和震动装置结合，预先在试剂盒中放置反应试剂，待测液经由滤膜过滤后进入试剂盒并在其中反应，震动马达可通过调节振动频率来控制反应速度，能减少操作步骤，大大缩短反应时间。(4)对于不同的反应体系，采用不同的微通道(弹性石英毛细管或微流控芯片)，微流控芯片可满足对更小检测体系的需求，毛细管可多次使用，减少实验成本。(5)只需在微通道两端的电极上施加恒定电流，检测微通道两端的电压即可对待测物进行精准测量，对电路要求低，只需安装一个高精度的电压表即可读出信号，搭配可反复充电式锂电池提供电力，无需外接电源线，使整个仪器更加小巧，携带方便。(6)检测时间短、灵敏度高，抗干扰能力强：该装置以电压的变化为信号，电压信号与复合物的浓度、粒径、电性等相关，测量过程中无需进行其他生化反应，检测时间≤10s，跟传统的检测信号相比，灵敏度更高且具有更强的抗干扰能力。(7)操作简单：只需将反应液抽入定制试剂盒中反应完成后即可进行反应和检测过程。
附图说明
图1：便携式生物传感测量装置总体结构示意图。
图2：当微通道为弹性石英毛细管时测量装置的结构示意图。
图3：当微通道为微流控芯片时测量装置的结构示意图。
图4：该便携式生物电阻传感测量装置控制原理图。
图5：使用该精准免疫传感方法检测致病菌的原理图。
图6：对该便携式生物电阻传感测量装置施加电流的优化。
图7：对该便携式生物电阻传感测量装置真空泵流速的优化。
图8：对该便携式生物电阻传感测量装置毛细管长度的优化。
图9：对该便携式生物电阻传感测量装置毛细管内径的优化。
图10：使用无信号放大策略方法检测呕吐毒素，磁珠与呕吐毒素抗体的质量比的优化。
图11：使用无信号放大策略方法检测呕吐毒素，磁珠和呕吐毒素抗体的偶联物浓度的优化。
图12：使用无信号放大策略方法检测呕吐毒素，免疫反应时间的优化。
图13：使用无信号放大策略方法检测呕吐毒素的标准曲线及线性范围。
图14：使用一重信号放大策略方法检测呕吐毒素，磁珠与呕吐毒素抗体的质量比的优化。
图15：使用一重信号放大策略方法检测呕吐毒素，磁珠和呕吐毒素抗体的偶联物浓度的优化。
图16：使用一重信号放大策略方法检测呕吐毒素，点击反应时间的优化
图17：使用一重信号放大策略方法检测呕吐毒素的标准曲线及线性范围。
图18：使用二重信号放大策略方法检测呕吐毒素，磁珠与呕吐毒素抗体的质量比的优化。
图19：使用二重信号放大策略方法检测呕吐毒素，对多巴胺浓度的优化。
图20：使用二重信号放大策略方法检测呕吐毒素，对酶促多巴胺反应时间的优化。
图21：使用二重信号放大策略方法检测呕吐毒素的标准曲线及线性范围。
图22：使用不同检测策略对呕吐毒素检测的标准曲线及线性范围。
图23：使用一重信号放大策略检测黄曲霉毒素的标准曲线及线性范围。
图24：使用二重信号放大策略检测赭曲霉毒素的标准曲线及线性范围。
图25：使用一重信号放大策略检测毒死蜱的标准曲线及线性范围。
图26：使用二重信号放大策略检测氯霉素的标准曲线及线性范围。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明做进一步详细说明，本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明专利，不应视为对本发明专利的具体限制。
试验材料及相关术语说明
氨基修饰的聚苯乙烯微球(直径3μm；50mg/mL)：购自德国micromod公司。羧基修饰的磁性纳米颗粒(直径1um；10mg/mL)：购自Thermo Fisher Scientific公司。呕吐毒素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素及其对应的完全抗原和抗体：购自山东蓝都。反式环烯烃(TCO-PEG4-NHS Ester，TCO)和四嗪基团(Tetrazine-PEG4-NHS Ester，TZ)：购自Click ChemistryTools。NaCl(分析纯)：购自国药集团化学试剂有限公司。乙腈、甲醇(均为分析纯)：购自上海阿拉丁生化科技有限公司。PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4)：取8.00g NaCl,0.20g KCl,0.20gKH2PO4和2.90g Na2HPO4·12H2O于1000mL容量瓶中定容，摇匀。MES缓冲液(0.1M,pH＝6.0)：取21.325g MES溶于去离子水中定容至1000mL，为A液；取4g NaOH溶于去离子水中定容至1000mL，为B液；取1000mL A液和400mL B液混合，摇匀。PBST、MEST：在配制好的PBS或MES缓冲液中加入0.05％Tween-20。
实施例1便携式生物电阻传感测量装置搭建
本发明提供了一种便携式生物电阻传感测量装置。
参见图1-3所示，一种便携式生物电阻传感测量装置，该检测装置包括检测管道1，检测管道1一端通过螺纹连接真空泵2，检测管道1另一端设有吸液头3，检测管道1内部设有微通道4，检测管道1侧面设有电池5，电池5给浓度测量模块6提供动力，测量模块6内有两根检测电极7，检测电极7分别连接在微通道4两侧，检测管道1与吸液头3的连接处内部设有试剂盒8，试剂盒8外侧检测管道1上设有震动装置9。
优选地，所述吸液头3内部有微孔滤膜11；吸液头3上部与试剂盒8的连接方式为过盈连接，吸液头3设有圆锥尖端。
优选地，所述微通道4为微流控芯片405，微流控芯片405上下分别设有两个第二孔406分别连接检测管道1和试剂盒8，中间设有两个第三孔407连接检测电极7，检测电极7通过伸入第三孔407与微流控芯片405内通道连接形成闭合回路。
优选地，所述微通道4为弹性石英毛细管401，毛细管通过硅胶垫片402固定，硅胶垫片402两端为拧紧装置403，拧紧装置403分别连接检测管道1和试剂盒8，拧紧装置403侧方开有两个第一孔404，检测电极7通过伸入第一孔404与毛细管401连接形成闭合回路。
优选地，所述真空泵2另一端连接废液池11；所述测量模块6侧面为液晶显示屏12。
进一步优选地，所述废液池11内部设置U型导液通道。
所述便携式生物电阻传感测量装置用于线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法。
参见图4所示，该便携式生物电阻传感装置检测原理如下：
含有微球的溶液在真空泵的负压作用下经微孔滤膜过滤后进入定制试剂盒中，在试剂盒内完成反应，调节震动搅拌装置的振动频率可对不同的反应液进行震荡搅拌，从而加快反应速度，反应完成后的待测液通过微通道(弹性石英毛细管或微流控芯片)，微通道两端有正负检测电极，待测液在通过微通道的过程由于反应后的复合物的浓度、粒径、电性等的不同，会在微通道内占据一定的空间，使微通道内部原有的导电介质发生改变，致使微通道的导电性发生变化，从而引起微通道的电阻发生改变，而电阻的变化量与复合物的浓度、粒径、电性等有关，在通道两端的检测电极上施加恒定电流，测量模块测得的电压值变化量和毛细管的电阻值变化量成正比，测得的电压值通过液晶显示屏输出，因此可通过检测电路的电压的变化值计算出复合物的浓度从而间接得到待测目标物含量。测量完成后的废液通过枪身内部管路流向废液槽中，实现废液的收集，充电式锂电池可为整个检测过程提供动力。
实施例2微通道导电性与施加电流、微通道长度、微通道内径、流速的相关性探究
采用实施例1装置，进行如下实验：
试验1)：向微通道中通入不同直径的PS微球(1μm、3μm)溶液，检测在不同电流(0、100、200、300、400μA)下闭环电路的电压差值，考察PS微球粒径与毛细管导电性的关系，结果如图6所示。
试验2)：向微通道中通入不同直径的PS微球(1μm、3μm)溶液，检测在不同流速(50μL/min、100μL/min、150μL/min、200μL/min、250μL/min)下闭环电路的电压差值，考察PS微球粒径与毛细管导电性的关系，结果如图7所示。
试验3)：向微通道中通入不同直径的PS微球(1μm、3μm)溶液，检测在不同微通道长度(2mm、3mm、4mm、5mm)下闭环电路的电压差值，考察PS微球粒径与毛细管导电性的关系，结果如图8所示。
试验4)：向微通道中通入不同直径的PS微球(1μm、3μm)溶液，检测在不同微通道内径(50μm、75μm、100μm)下闭环电路的电压差值，考察PS微球粒径与毛细管导电性的关系，结果如图9所示。
根据以上试验结果，PS微球浓度与微通道导电性具有良好的相关性，能够通过检测电路的电压值得到PS微球浓度。不同的微球流经微通道时引起的微通道导电性变化程度也会有所不同，当微通道内有微球时，微通道和微球可以等效为一个可变电阻，该电阻的电阻值与微通道的长度、内径以及微球的浓度、粒径有关。浓度越大，所引起的微通道导电性变化程度也就越大；微通道导电性随着施加恒定电流的增大而增大，随着通道本身长度的增加逐渐减小、内径的增大逐渐增大。由此可验证不同浓度、粒径的微球的确会引起微通道导电性发生不同程度的改变。
实施例3利用生物识别分子修饰磁珠、PS微球和点击试剂
1、磁珠的活化
(1)取2mg磁珠(平均直径1μm)于离心管中，用500μL MEST(10mM MES,0.05％Tween20,pH 6.0)洗涤2次，磁分离移除上清液；(2)用10mM MES(pH 6.0)配制5mg/mL EDC溶液和5mg/mL NHS溶液；(3)向装有磁珠的离心管中分别加入100μL EDC(5mg/mL)和50μL NHS(5mg/mL)，使用涡旋器混匀使磁珠充分悬浮，用MES稀释至500μL，放置于旋转混匀仪上，37℃活化30min；(4)磁分离，除去上层清液，用500μL MEST洗涤2次，磁分离，除去上层清液。经上述步骤，磁珠表面的羧基已被活化。
2、PS微球的活化
(1)取2mg PS微球(平均直径为1～10μm)于离心管中，用500μL MEST(10mM MES，0.05％Tween 20，pH 6.0)洗涤2次，离心(10000rpm，6min)，除去上层清液；(2)用10mM MES(pH 6.0)配制5mg/mL EDC溶液和5mg/mL NHS溶液；(3)向装有PS微球的离心管中分别加入100μL EDC(5mg/mL)和50μL NHS(5mg/mL)，使用涡旋器混匀使PS微球充分悬浮，用MES稀释至500μL，放置于旋转混匀仪上，37℃活化30min；(4)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，用500μL MEST洗涤3次；(5)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液。经上述步骤，PS微球表面的氨基已被活化。
3、磁珠与生物识别分子的偶联
以呕吐毒素抗体为例，对偶联过程进行说明，其余生物识别分子包括黄曲霉毒素抗体、赭曲霉毒素抗体等也能采用类似的方法。
磁珠-呕吐毒素抗体偶联物(MNP1000-Ab)的制备
(1)将100μg呕吐毒素抗体加入到上述装有磁珠的离心管中，用PBST调节总体积至500μL，轻摇混匀磁珠和抗体；(2)将上述混合物置于旋转混匀仪上，37℃反应3h；(3)磁分离，除去上层清液，加入含1％BSA的PBST(pH 7.4)500μL，重新悬浮磁珠，置于旋转混匀仪上，37℃封闭30min；(4)磁分离，除去上层清液，500μL PBST洗涤3次；(5)磁分离，除去上层清液，所得到的呕吐毒素抗体修饰的磁珠用1mL PBST(pH 7.4，含0.02％NaN3，0.5％BSA)重新悬浮，置于4℃保存。
4、PS微球与生物识别分子的偶联
以PS微球-呕吐毒素完全抗原偶联物为例，对偶联过程进行说明，其余生物识别分子包括黄曲霉毒素完全抗原、赭曲霉毒素完全抗原等也能采用类似的方法。
PS微球-呕吐毒素完全抗原偶联物(PS3000-BSA-DON)的制备
(1)将100μg呕吐毒素完全抗原加入到上述装有PS微球的离心管中，用PBST调节总体积至500μL，轻摇混匀PS微球和呕吐毒素完全抗原；(2)将上述混合物置于旋转混匀仪上，37℃反应3h；(3)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，加入含1％BSA的PBST(pH 7.4)500μL，重新悬浮PS微球，置于旋转混匀仪上，37℃封闭30min；(4)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，500μL PBST洗涤3次；(5)离心(10000rpm，6min)，除去上层清液，所得到的呕吐毒素完全抗原修饰的PS微球用1mL PBST(pH 7.4，含0.02％NaN3，0.5％BSA)重新悬浮，置于4℃保存。
5、点击试剂与生物识别分子、PS微球和辣根过氧化物酶(HRP)的偶联
以点击试剂Ⅰ-呕吐毒素完全抗原偶联物和点击试剂Ⅱ-PS微球偶联物为例，对偶联过程进行说明，其余生物识别分子包括黄曲霉毒素完全抗原、赭曲霉毒素完全抗原等也能采用类似的方法。
点击试剂Ⅰ-呕吐毒素完全抗原偶联物(BSA-DON-TCO)的制备
点击反应选用点击试剂Ⅰ为反式环辛烯(TCO)，相对应的点击试剂Ⅱ为四嗪基团(TZ)，形成的复合物为反式环辛烯-呕吐毒素完全抗原偶联物(BSA-DON-TCO)。
(1)取10μLTCO(2mg/mL)溶解于DMF中；(2)取100μL呕吐毒素完全抗原(3.5mg/mL)至10mMPBS(PH＝7.4)；(3)按照摩尔比20:1(TCO与呕吐毒素完全抗原)室温下混合搅拌1h；(4)反应完成后，在上述混合液中加入100μLTris-HCl(50mM)终止反应10min；(5)将上述混合液加入透析袋中4℃透析12h；(6)将制备好的TCO-BSA-DON联物(5mg/mL)重悬于1mL的PBS中，保存于4℃冰箱备用。
点击试剂Ⅱ-PS微球偶联物的制备(TZ-PS3000)
点击反应选用点击试剂Ⅱ为四嗪基团(TZ)，相对应的点击试剂Ⅰ为反式环辛烯(TZ)，形成的复合物为反式环辛烯-PS微球偶联物(TZ–PS3000)。
(1)取10μLTZ(2mg/mL)溶解于DMF中；(2)取100μL上述PS微球至10mMPBS(PH＝7.4)；(3)按照摩尔比20:1(TZ与PS微球)室温下，混合搅拌1h；(4)反应完成后，在上述混合液中加入100μLTris-HCl(50mM)终止反应10min；(5)将上述混合液加入透析袋中4℃透析12h；(6)将制备好的TZ-PS3000偶联物(5mg/mL)重悬于1mL的PBS中，保存于4℃冰箱备用。
点击试剂Ⅱ-辣根过氧化物酶的制备(TZ–HRP)
点击反应选用点击试剂Ⅱ为四嗪基团(TZ)，相对应的点击试剂Ⅰ为反式环辛烯(TZ)，形成的复合物为反式环辛烯-辣根过氧化物酶偶联物(TZ–HRP)。
(1)取10μLTZ(2mg/mL)溶解于DMF中；(2)取100μL上述HRP至10mMPBS(PH＝7.4)；(3)按照摩尔比20:1(TZ与HRP)室温下，混合搅拌1h；(4)反应完成后，在上述混合液中加入100μLTris-HCl(50mM)终止反应10min；(5)将上述混合液加入透析袋中4℃透析12h；(6)将制备好的TZ–HRP偶联物(5mg/mL)重悬于1mL的PBS中，保存于4℃冰箱备用。
实施例4以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量高、对方法检出限要求低的待测物反应条件(磁珠与呕吐毒素抗体的质量比)的优化
对上述实施例2中磁珠与生物识别分子的偶联过程中的磁珠与呕吐毒素抗体的质量比进行优化，分别设置质量比例为5:1、10:1、20:1，其余反应条件不变。
对呕吐毒素进行检测步骤如下：(1)分别将将三种不同质量比的呕吐毒素抗体修饰的磁珠用PBS稀释至100μg/mL；(2)用甲醇配制1mg/mL的呕吐毒素标准储备液，并用PBS配制成浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL的标准工作溶液；
(3)分别向三个反应装置内中加入100μL不同质量比的呕吐毒素抗体修饰的磁珠稀释液(100μg/mL)和100μL呕吐毒素标准品溶液(0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL)，于37℃振荡反应30min；
(4)将BSA-呕吐毒素完全抗原修饰的PS微球用PBS稀释至100μg/mL；
(5)向三个反应装置中加入100μL BSA-呕吐毒素完全抗原修饰的PS微球(直径3μm)稀释液(100μg/mL)，于37℃振荡反应30min；
(6)反应结束后磁分离后取上清液，使用200μLPBS洗涤两次，并入洗液；
(7)分别用便携式生物传感装置吸取上清液(300～400μL)进行检测；
(8)以呕吐毒素浓度的对数值为横坐标，电压变化量ΔU(ΔU＝U1样品-ΔU2空白)为纵坐标，对三种优化结果作标准曲线，如图10所示；
实施例5以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量高、对方法检出限要求低的待测物反应条件(磁珠和呕吐毒素抗体的偶联物浓度)的优化
根据上述实施例4中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，对磁珠与生物识别分子的偶联物浓度进行优化，分别设置浓度梯度为75μg/mL、100μg/mL和125μg/mL，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的三种优化结果作标准曲线，如图11所示；
实施例6以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量高、对方法检出限要求低的待测物反应条件(免疫反应时间)的优化
根据上述实施例4、5中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，浓度为100μg/mL，对免疫反应时间进行优化，分别设置反应时间为10min、20min、30min，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的三种优化结果作标准曲线如图12所示；
实施例7以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量高、对方法检出限要求低的待测物进行详细说明
根据上述实施例4、5、6中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，浓度为100μg/mL，反应时间为30min，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的标准曲线和线性范围如图13所示；
实施例8以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量中等、对方法检出限要求中等的待测物反应条件(磁珠与呕吐毒素抗体的质量比)的优化
对上述实施例2中磁珠与生物识别分子的偶联过程中的磁珠与呕吐毒素抗体的质量比进行优化，分别设置质量比例为5:1、10:1、20:1，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测步骤如下：(1)分别将三种不同质量比的呕吐毒素抗体修饰的磁珠用PBS稀释至100μg/mL；(2)用甲醇配制1mg/mL的呕吐毒素标准储备液，并用PBS配制成浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL的标准工作溶液；(3)分别向三个反应装置内中加入100μL呕吐毒素抗体修饰的磁珠稀释液(100μg/mL)和100μL呕吐毒素标准品溶液(0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL)，于37℃振荡反应30min；(4)将BSA-呕吐毒素完全抗原修饰的点击试剂Ⅰ用PBS稀释至100μg/mL；(5)向三个反应装置中加入100μL BSA-呕吐毒素完全抗原修饰的点击试剂Ⅰ稀释液(100μg/mL)，于37℃振荡反应30min；(6)反应结束后，磁分离弃去上清，使用PBS洗涤一次，使用100μLPBS重悬复合物，然后加入100μL点击试剂Ⅱ修饰的PS微球(100μg/mL)，于37℃振荡反应30min；(7)反应结束后磁分离后取上清液，使用200μLPBS洗涤两次，并入洗液；(8)用便携式生物传感装置吸取上清液(300～400μL)进行检测；(9)以呕吐毒素浓度的对数值为横坐标，电压变化量ΔU(ΔU＝U1样品-ΔU2空白)为纵坐标，对三种优化结果作标准曲线，如图14所示。
实施例9以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量中等、对方法检出限要求中等的待测物反应条件(磁珠和呕吐毒素抗体的偶联物浓度)的优化
根据上述实施例中8中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，对磁珠与生物识别分子的偶联物浓度进行优化，分别设置浓度梯度为75μg/mL、100μg/mL和125μg/mL，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的三种优化结果作标准曲线如图15所示。
实施例10以检测呕吐毒素为例，对使用精准免疫传感方法检测浓度含量中等、对方法检出限要求中等的待测物反应条件(点击反应时间)的优化
根据上述实施例8、9中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，浓度为100μg/mL，对点击反应时间进行优化，分别设置反应时间为10min、20min、30min，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的三种优化结果作标准曲线如图16所示；
实施例11以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量中等、对方法检出限要求中等的待测物进行详细说明
根据上述实施例8、9、10中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，浓度为100μg/mL，反应时间为30min，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的标准曲线和线性范围如图17所示。
实施例12以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量低、对方法检出限要求高的待测物反应条件(磁珠和呕吐毒素抗体的偶联物浓度)的优化
对上述实施例2中磁珠与生物识别分子的偶联物浓度进行优化，分别设置浓度梯度为75μg/mL、100μg/mL和125μg/mL，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测步骤如下：(1)分别将呕吐毒素抗体修饰的磁珠用PBS稀释至75μg/mL、100μg/mL和125μg/mL；(2)用甲醇配制1mg/mL的呕吐毒素标准储备液，并用PBS配制成浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL的标准工作溶液；(3)分别向三个反应装置内中加入100μL呕吐毒素抗体修饰的磁珠稀释液(100μg/mL)和100μL呕吐毒素标准品溶液(0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL)，于37℃振荡反应30min；(4)将经点击反应放大后的辣根过氧化物酶修饰的BSA-呕吐毒素完全抗原(BSA-DON-TCO–TZ–HRP)用PBS稀释至100μg/mL；(5)向三个反应装置中加入100μL辣根过氧化物酶修饰BSA-呕吐毒素完全抗原稀释液(100μg/mL)，于37℃振荡反应30min；(6)反应结束后，磁分离弃去上清，使用PBS洗涤一次，使用100μLPBS重悬复合物，然后加入100μL含有1M过氧化氢的多巴胺溶液(1mg/mL)，37摄氏度反应15min；(7)反应结束后，磁分离弃去上清，使用纯水洗涤一次，然后加入100μL的氨基化PS微球(100μg/mL)，37℃震荡反应20min；(8)反应结束后，磁分离收集上清，使用400μLPBS定容，用便携式生物传感装置吸取上清液(300～400μL)进行检测；(9)以呕吐毒素浓度的对数值为横坐标，电压变化量ΔU(ΔU＝U1样品-ΔU2空白)为纵坐标，作标准曲线，如图18所示。
实施例13以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量低、对方法检出限要求高的待测物反应条件(多巴胺浓度)的优化
根据上述实施例12中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，对多巴胺浓度进行优化，分别设置多巴胺浓度梯度为1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的三种优化结果作标准曲线如图19所示。
实施例14以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量低、对方法检出限要求高的待测物反应条件(聚多巴胺反应时间)的优化
根据上述实施例12、13中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，多巴胺浓度为5mg/mL，对聚多巴胺反应时间进行优化，分别设置反应时间为10min、20min、30min，其余反应条件不变。对结果作标准曲线如图20所示。
实施例15以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法检测浓度含量低、对方法检出限要求高的待测物进行详细说明
根据上述实施例8、9、10中的标准曲线，选用磁珠与呕吐毒素抗体的质量比为10:1，多巴胺浓度为5mg/mL，反应时间为20min，其余反应条件不变。对呕吐毒素进行检测的标准曲线和线性范围如图21所示。
实施例16以检测呕吐毒素为例，对使用本精准免疫传感方法中的三种不同的信号放大策略检测待测物的标准曲线和线性范围进行对比说明
在三个反应容器中采用上述三种不同的信号放大策略检测呕吐毒素，反应条件均为优化后的条件；作线性范围曲线和标准曲线，如图22所示。
实施例17以检黄曲霉毒素为例，对使用本精准免疫传感方法中的三种不同的信号放大策略检测待测物的含量中等、对方法检出限要求中等的待测物进行详细说明
对于国标中检出限要求中等的待测物，以检测黄曲霉毒素AFT-B1为例(国标GB2761-2011中规定了谷物及谷物制品中黄曲霉毒素AFT-B1的限量标准为200ng/mL)，本实施例中所述检测过程和反应条件均和实施例11相同。对黄曲霉毒素进行检测的标准曲线和线性范围如图23所示；采用标准加入法对小麦样品中的黄曲霉毒素残留进行检测，过程同上，结果如表1所示。
表1.采用标准加入法对小麦中黄曲霉毒素进行检测的结果
Figure BDA0003535508240000181
Figure BDA0003535508240000191
此外，从分析性能方面，包括灵敏度、稳定性、分析时间等，对该检测方法与传统的ELISA方法进行了对比，结果如表2所示，表明该方法不仅具有较高的灵敏度，而且稳定性更好，结合该装置进行测量的分析时间也从2～3小时缩短到0.5小时之内。
表2.本方法和ELISA对赭曲霉的分析性能对比
分析性能 检出限(pg/mL) RSD(％) 分析时间(min)
本方法 2.85 ＜8.0 ＜30
ELISA 250 ＜12.0 ＞120
实施例18以检测赭曲霉毒素为例，对使用本精准免疫传感方法中的三种不同的信号放大策略检测浓度含量低、对方法检出限要求高的待测物进行详细说明
对于国标中检出限要求中等的待测物，以检测赭曲霉毒素为例(国标GB2761-2011中规定了谷物及谷物制品中呕吐毒素OTA的限量标准为5ng/mL)，本实施例中所述检测过程和反应条件均和实施例15相同。对赭曲霉毒素进行检测的标准曲线和线性范围如图24所示,采用标准加入法对小麦样品中的赭曲霉毒素残留进行检测，过程同上，结果如表3所示。
表3.采用标准加入法对小麦中的赭曲霉毒素进行检测的结果
Figure BDA0003535508240000192
实施例19使用上述所述的一重信号放大策略检测毒死蜱
本实施例中所述检测过程和反应条件均和上述实施例相同。对毒死蜱进行检测的标准曲线和线性范围如图25所示。
实施例20使用上述所述的一重信号放大策略检测氯霉素
本实施例中所述检测过程和反应条件均和上述实施例相同。对氯霉素进行检测的标准曲线和线性范围如图26所示。
上述实施例来解释本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述具体实施例才能实施。所属领域的技术人员在本发明基础上进行的任何改进，或者对本发明所选用的材料的等效替换等，均落在专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种便携式生物电阻传感测量装置，其特征在于：该检测装置包括检测管道（1），检测管道（1）一端通过螺纹连接真空泵（2），检测管道（1）另一端设有吸液头（3），检测管道（1）内部设有微通道（4），检测管道（1）侧面设有电池（5），电池（5）给浓度测量模块（6）提供动力，测量模块（6）内有两根检测电极（7），检测电极（7）分别连接在微通道（4）两侧，检测管道（1）与吸液头（3）的连接处内部设有试剂盒（8），试剂盒（8）外侧检测管道（1）上设有震动装置（9）。
2.根据权利要求1所述一种便携式生物电阻传感测量装置，其特征在于：所述吸液头（3）内部有微孔滤膜（11）；吸液头（3）上部与试剂盒（8）的连接方式为过盈连接，吸液头（3）设有圆锥尖端。
3.根据权利要求1所述一种便携式生物电阻传感测量装置，其特征在于：所述微通道（4）为微流控芯片（405），微流控芯片（405）上下分别设有两个第二孔（406）分别连接检测管道（1）和试剂盒（8），中间设有两个第三孔（407）连接检测电极（7），检测电极（7）通过伸入第三孔（407）与微流控芯片（405）内通道连接形成闭合回路。
4.根据权利要求1所述一种便携式生物电阻传感测量装置，其特征在于：所述微通道（4）为弹性石英毛细管（401），毛细管通过硅胶垫片（402）固定，硅胶垫片（402）两端为拧紧装置（403），拧紧装置（403）分别连接检测管道（1）和试剂盒（8），拧紧装置（403）侧方开有两个第一孔（404），检测电极（7）通过伸入第一孔（404）与毛细管（401）连接形成闭合回路。
5.根据权利要求1所述一种便携式生物电阻传感测量装置，其特征在于：所述真空泵（2）另一端连接废液池（11）；所述测量模块（6）侧面为液晶显示屏（12）。
6.根据权利要求5所述一种便携式生物电阻传感测量装置，其特征在于：所述废液池（11）内部设置导液通道。
7.一种线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法，其特征在于，所述方法为将待测液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物含量。
8.权利要求1-6任意一项所述便携式生物电阻传感测量装置用于线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法。
9.根据权利要求8所述的线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法，其特征在于：针对不同待测物的含量和限量标准不同，提供了一组针对不同检出限的危害因子，实现线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法，具体过程如下：
S1-A方案1：当待测目标物的浓度为高于500ng/mL时，选用方案1作为检测方案，包括以下步骤：
S1-A.1在磁珠表面偶联生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体；
S1-A.2使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体和待测物发生特异性反应；
S1-A.3向反应后的混合液中加入对应生物识别分子B修饰的聚苯乙烯微球，反应完成后磁分离取上清液，将上清液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物含量；
S1-B方案2：当待测目标物的浓度为50ng/mL-500ng/mL时，选用方案2作为检测方案，包括以下步骤：
S1-B.1在磁珠表面偶联生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体；
S1-B.2使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体和待测物发生特异性反应；
S1-B.3向反应后的混合液中加入点击试剂Ⅰ修饰的生物识别分子B，反应完成后磁分离弃去上清液重悬；
S1-B.4向重悬后的复合物溶液中加入点击试剂Ⅱ修饰的聚苯乙烯微球，反应完成后磁分离取上清液，将上清液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物浓度；
S1-C方案3：当待测目标物的浓度低于50ng/mL时，选用方案3作为检测方案，包括以下步骤：
S1-C.1将制备好的点击试剂Ⅰ修饰的待测物生物识别分子B和点击试剂Ⅱ修饰的辣根过氧化物酶偶联物混合发生点击反应；
S1-C.2在磁珠表面偶联待测物特异性生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体；
S1-C.3使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体和待测物发生特异性反应；
S1-C.4向反应后的混合液中加入S1-C.1中点击反应后的混合物，反应完成后磁分离弃去上清液后重悬；
S1-C.5向S1-C.4中磁分离后的重悬液中加入过氧化氢和多巴胺（DA）的混合溶液，反应一段时间后磁分离弃去上清液后重悬；
S1-C.6向S1-C.5中磁分离后的重悬液中加入氨基修饰的PS微球，反应一段时间后磁分离取上清液，将上清液通入微通道，通过检测微通道两端的电压差值即可间接得到样品中的待测物浓度；
所述生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
所述生物识别分子A和生物识别分子B分别为待测物特异性抗体和待测物完全抗原、检测抗体和捕获抗体、抗体和抗原、抗原和抗体、DNA捕获探针和DNA检测探针或DNA检测探针和DNA捕获探针。
10.根据权利要求9所述的线性范围可调的精准检测的新型免疫传感方法，其特征在于：所述聚苯乙烯微球粒径为100 nm-5000 nm；
所述磁颗粒粒径为50 nm-5000 nm；
所述点击反应中的点击反应功能团包括叠氮-炔、四嗪基团-反式环辛烯、二苯并环辛炔-叠氮或半胱氨酸-氰基苯并噻唑或其他。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114720515A (zh) * 2022-03-07 2022-07-08 华中农业大学 一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用
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