CN114736939B - 一种促进酶法制备（2r,3s）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法 - Google Patents

一种促进酶法制备（2r,3s）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进酶法制备（2R,3S）‑对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，涉及兽药及酶催化反应技术领域，对甲砜基苯甲醛和甘氨酸反应后一次性或者分批加入钙、镁离子，钙、镁离子与反应产物络合沉淀析出移走产物促进反应的进行，提高有限时间内底物的转化率。本发明反应条件温和，温度维持在28℃～35℃，后续处理简单，醛缩酶反应前期的选择性高，此时（2R,3S）‑对甲砜基苯丝氨酸的浓度更高，从而更易与钙、镁离子络合沉淀从而可以加强选择性，最后反应产物的de值高。

Description

一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的 方法
技术领域
本发明涉及兽药及酶催化反应技术领域，具体涉及一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法。
背景技术
氟苯尼考又名氟甲砜霉素，是人工合成的甲砜霉素的单氟衍生物，是目前常用的兽用抗生素。具有抗菌谱广，抑菌作用强，最小抑菌浓度低，安全性高等特点。对沙门氏菌、大肠杆菌、变形杆菌、膜肺炎放线杆菌、住肺炎支原体、猪链球菌、猪巴氏杆菌、支气管败血博氏杆菌、金黄色葡萄球菌等均敏感。近年来，随着畜牧养殖业的发展其需求逐年增加。
（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸是制备氟苯尼考的关键中间体，以前多通过化学法合成，但污染大、成本高，近年来研究者们尝试通过各种手段筛选获得可以催化羟醛缩合反应的酶通过温和、环保、低成本的方式催化（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸的合成。
醛缩酶在磷酸吡哆醛作用下可以催化甘氨酸和醛一步合成具有两个手性中性的β-羟基-α-氨基酸，具有环境友好，反应条件温和等优点，有很大应用前景，特别是在绿色合成氟苯尼考关键中间体（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸方面，不过该反应的应用瓶颈是β位的立体选择性不高，需要较大当量比的甘氨酸，该酶催化反应随着时间进行转化率增大选择性降低，需要选择收率最大的有限反应时间。
生物学家们尝试通过基因修饰、筛选的方法，选择制备具有高β位选择性的酶制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸，但需要较多人力、时间、资金的投入，且目前进展有限。故急需一种简便、有效且能提高产物的收率、降低生产成本的方法以便酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸的推广和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，通过反应产物与钙、镁离子在一定pH下络合成难溶盐沉淀析出移走，从而促进反应的进行。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，其特征在于包括以下步骤：
A：在反应容器中分别加入对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，并加入甲醇或乙醇水溶液，所述对甲砜基苯甲醛和所述甘氨酸的加入量摩尔比为1：4～1：8，所述甲醇或乙醇水溶液与所述对甲砜基苯甲醛的质量比为25:1；
B：调节反应容器中混合液的pH至碱性；
C：向反应容器中加入磷酸吡哆醛和醛缩酶，搅拌、反应2～8h，所述对甲砜基苯甲醛和所述磷酸吡哆醛的质量比为1000:1，所述对甲砜基苯甲醛和所述醛缩酶的质量比为10:1；
D：继续加入占反应容器中料液质量0.1%～0.5%的钙、镁离子，搅拌并保温2～4h后调节pH至10，得沉淀盐。
优选的，所述甲醇或乙醇水溶液的体积比为0%～40%。
优选的，步骤B中调节后物料的pH为7～10。
优选的，步骤C中反应温度维持在28℃～35℃。
优选的，步骤C和步骤D中的搅拌转速为200rpm。
优选的，步骤D中保温温度为28℃～35℃。
优选的，步骤D中的钙、镁离子一次性或者分批加入。
具体的工艺路线为：
Figure 191769DEST_PATH_IMAGE001
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、钙、镁离子与反应产物络合沉淀析出移走产物促进反应的进行，提高有限时间内底物的转化率。
2、醛缩酶反应前期的选择性高，此时（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸的浓度较高，从而更易与离子络合沉淀从而可以加强选择性，最后反应产物的de值高。
3、原料对甲砜基苯甲醛和甘氨酸廉价易得，同时加入的钙、镁离子价格低廉，降低了生产成本。
4、反应条件温和，温度维持在28℃～35℃，后续处理简单，且产生的危废少，钙、镁离子处理后可以重复利用，节约了成本，同时产生的危废少，对环境友好。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
在配有温度计和机械搅拌的两个250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至7，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌2h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率37.4%，de值98.2%。
一次性加入无水氯化镁2.90g（纯度99%），再继续200rpm下保温搅拌4h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率60.1%，de值97.5%。
实施例2
在配有温度计和机械搅拌的两个250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至9，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌6h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率62.3%，de值96.0%。
一次性加入无水氯化镁2.90g（纯度99%），再继续200rpm下保温搅拌2h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率65.3%，de值94.7%。
实施例3
在配有温度计和机械搅拌的两个250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率50.7%，de值97.5%。
一次性加入无水氯化镁2.90g（纯度99%），再继续200rpm下保温搅拌2h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率64.8%，de值97.2%。
实施例4
在配有温度计和机械搅拌的两个250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至28℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率50.5%，de值97.6%。
一次性加入无水氯化镁2.90g（纯度99%），再继续200rpm下保温搅拌2.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率65.0%，de值97.0%。
实施例5
在配有温度计和机械搅拌的两个250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率50.7%，de值97.5%。
一次性加入无水氯化镁2.90g（纯度99%），再继续200rpm下保温搅拌2.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率65.1%，de值97.0%。
实施例6
在配有温度计和机械搅拌的两个250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至35℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率51.0%，de值97.3%。
一次性加入无水氯化镁2.90g（纯度99%），再继续200rpm下保温搅拌2.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率65.8%，de值96.5%。
实施例7
在配有温度计和机械搅拌的250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率50.9%，de值97.5%。
加入无水氯化镁（纯度99%）0.58g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.58g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.58g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.58g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.58g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率70.1%，de值96.5%。
实施例8
在配有温度计和机械搅拌的250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸8.10g（108mmol），甲醇水溶液125g（体积比为30%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率48.3%，de值97.2%。
加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率67.4%，de值96.0%。
实施例9
在配有温度计和机械搅拌的250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸12.15g（162mmol），甲醇水溶液125g（体积比为20%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率48.3%，de值97.1%。
加入无水氯化镁（纯度99%）0.56g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.56g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.56g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.56g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.56g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率67.6%，de值96.2%。
实施例10
在配有温度计和机械搅拌的250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸8.10g（108mmol），乙醇水溶液125g（体积比为20%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率48.1%，de值97.2%。
加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化镁（纯度99%）0.55g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率67.2%，de值96.2%。
实施例11
在配有温度计和机械搅拌的250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸8.10g（108mmol），乙醇水溶液125g（体积比为20%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率48.0%，de值97.2%。
加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率67.3%，de值96.2%。
实施例12
在配有温度计和机械搅拌的250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸8.10g（108mmol），乙醇水溶液125g（体积比为20%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率48.3%，de值97.2%。
加入无水氯化钙（纯度96%）0.40g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化钙（纯度96%）0.40g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化钙（纯度96%）0.40g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化钙（纯度96%）0.40g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水氯化钙（纯度96%）0.40g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率63.8%，de值95.0%。
实施例13
在配有温度计和机械搅拌的250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸8.10g（108mmol），纯化水125g，少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌4h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率46.7%，de值97.0%。
加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h后再加入无水硫酸镁（纯度98%）0.70g，再继续200rpm下保温搅拌0.5h，少量氢氧化钠调pH至10，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率65.8%，de值95.9%。
对比例1
在配有温度计和机械搅拌的两个250ml反应瓶中加入对甲砜基苯甲醛5.00g（27mmol），加入甘氨酸16.20g（216mmol），甲醇水溶液125g（体积比为40%），少量氢氧化钠调pH至8，磷酸吡哆醛5mg，醛缩酶0.5g（取自山东国邦药业有限公司按照与宁波酶赛生物工程有限公司的合作协议以中国专利CN110914288A中公开的工程化醛缩酶多肽及其应用为基础进行生产），200rpm搅拌混合均匀，水浴升温至30℃，保温搅拌2h，取样检测计算，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率35.5%，de值98.8%。
继续200rpm下保温搅拌2h，取样检测，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率50.8%，de值97.5%。
继续200rpm下保温搅拌2h，取样检测，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率61.8%，de值96.0%。
继续200rpm下保温搅拌2h，取样检测，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率64.2%，de值94.0%。
继续200rpm下保温搅拌2h，取样检测，产物（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸收率66.0%，de值91.3%。
通过上述实施例和对比例的数据可以看出，钙、镁离子的加入提高了（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸的收率和de值，产品的纯度高，且随着钙、镁离子的加入量增加，（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸的收率呈增长趋势，且钙、镁离子分批次加入比一次性加入对（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸的收率增长更加明显。同时甲醇/乙醇水溶液比单纯使用纯化水对（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸的收率增长更加明显。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，其特征在于包括以下步骤：
A：在反应容器中分别加入对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，并加入甲醇或乙醇水溶液，所述对甲砜基苯甲醛和所述甘氨酸的加入量摩尔比为1：4～1：8，所述甲醇或乙醇水溶液与所述对甲砜基苯甲醛的质量比为25:1；
B：调节反应容器中混合液的pH至碱性；
C：向反应容器中加入磷酸吡哆醛和醛缩酶，搅拌、反应2～8h，所述对甲砜基苯甲醛和所述磷酸吡哆醛的质量比为1000:1，所述对甲砜基苯甲醛和所述醛缩酶的质量比为10:1；
D：继续加入占反应容器中料液质量0.1%～0.5%的钙、镁离子，搅拌并保温2～4h后调节pH至10，得沉淀盐，钙、镁离子一次性或者分批加入。
2.如权利要求1所述的一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，其特征在于：所述甲醇或乙醇水溶液的体积比为0%～40%。
3.如权利要求1所述的一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，其特征在于：步骤B中调节后物料的pH为7～10。
4.如权利要求1所述的一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，其特征在于：步骤C中反应温度维持在28℃～35℃。
5.如权利要求1所述的一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，其特征在于：步骤C和步骤D中的搅拌转速为200rpm。
6.如权利要求1所述的一种促进酶法制备（2R,3S）-对甲砜基苯丝氨酸反应进行的方法，其特征在于：步骤D中保温温度为28℃～35℃。
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