CN114727967A - 核酸介导的治疗剂的递送 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了包含与核酸片段复合形成纳米颗粒的一种或多种治疗化合物的组合物及其用途,在任一前述实施方案的另一个实施方案或进一步实施方案中,一种或多种治疗化合物为可以与DNA或RNA缔合或结合的小分子。在任一前述实施方案的另一个实施方案或进一步实施方案中,所述核酸片段与一种或多种治疗化合物以2:1到10:1的重量/重量比复合。
Description
本申请依据35 U.S.C.§119要求2019年9月6日提交的临时申请号为62/897,254的优先权,其公开内容通过引用并入本发明。
技术领域
本公开提供了可与DNA或RNA缔合或结合的核酸介导的治疗剂递送及其用途。
背景技术
可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂在治疗癌症和其他疾病方面具有巨大潜力,但其固有的化学结构使其完全或部分不溶,导致生物利用度有限。其中一些治疗剂虽然可溶,但会导致全身毒性,并且通常会很快从体内清除。
发明概述
本发明提供了可与DNA或RNA缔合或结合的用于治疗剂的递送平台,其比当前的制剂更有效,并且进一步具有在生产成本和易于组装方面的优点。在本发明介绍的示例性研究中,使用50至2,000个核苷酸的核酸片段的混合物作为嵌入剂阿霉素(DOX)的生物活性纳米载体。发现DOX可以以快速简便的方式与核酸片段复合。这种DOX/核酸制剂比核酸片段本身更单分散,并改善了DOX的治疗窗口。如本发明的研究中所指出的,很明显,可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂的递送通常可通过使用本发明公开的递送平台来改善。
在一个特定的实施方案中,本公开提供了包含一种或多种治疗化合物的组合物,所述治疗化合物与核酸片段复合形成纳米颗粒。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种治疗化合物是可以与DNA或RNA缔合或结合的小分子。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以2:1至10:1的重量/重量比复合。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以4:1至7:1的重量/重量比复合。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段以约6:1的重量/重量比与所述一种或多种治疗化合物复合。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述纳米颗粒的尺寸为20nm至200nm。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述纳米颗粒的尺寸为50nm至100nm。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种治疗化合物包括蒽环类、蒽二酮类、喜树碱类化合物、鬼臼类化合物、小沟结合剂、博来霉素和/或放线菌素D。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种治疗性化合物包括阿克拉霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、氨柔比星、吡柔比星、戊和/或佐柔比星。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种治疗化合物包含阿霉素。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种治疗化合物包括米托蒽醌、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、博来霉素、放线菌素D和/或倍癌霉素A。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种所述核酸片段包括将所述纳米颗粒靶向特定细胞、组织、器官或肿瘤的配体。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段包括天然存在的DNA、RNA和/或DNA-RNA杂合体的片段。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段包含化学合成的不同核苷酸长度的DNA、RNA和/或DNA-RNA杂合体。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述RNA已被修饰为用-O-烷基或卤化物取代2’核糖羟基。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段为DNA片段。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述DNA片段来自鲑鱼DNA。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段的长度为20nt至10,000nt。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述核酸片段的长度为50nt至2,000nt。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述组合物包含与长度为50nt至2,000nt的DNA片段复合的一种或多种治疗化合物的纳米颗粒。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种治疗化合物选自阿克拉霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星和佐柔比星。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述一种或多种治疗化合物为阿霉素。
在某个实施方案中,本公开还提供了一种药物组合物,其包含本发明公开的组合物和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在进一步实施方案中,所述药物组合物被配制用于肠胃外递送。
在一个特定的实施方案中,本公开进一步提供了治疗患有需要治疗的癌症患者的方法,包括:给受试者施用有效量的本发明公开的药物组合物。在进一步实施方案中,所述癌症选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肾癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、胸腺瘤(thyomas)、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、子宫肉瘤、威尔姆斯瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
在某个实施方案中,本公开提供了患有需要治疗的癌症的人类受试者,包括:施用有效量的本发明公开的组合物。在进一步实施方案中,所述癌症选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肾癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、胸腺瘤(thyomas)、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、子宫肉瘤、威尔姆斯瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述方法还包括给受试者施用一种或多种抗癌剂,所述抗癌剂选自血管生成抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PARP抑制剂、烷化剂、长春花生物碱、蒽环类、抗肿瘤抗生素、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、芳香酶抑制剂、mTor抑制剂、类视黄醇和HDAC抑制剂。在另一个实施方案或任何前述实施方案的进一步实施方案中,所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种选自米托蒽醌、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、博莱霉素、放线菌素D和倍癌霉素A的抗癌剂。
本公开的一个或多个实施方案的细节在附图和以下描述中阐述。其他特征、目的和优点将从描述和附图以及权利要求中显而易见。
附图说明
图1显示,DNA以6:1的比例(w/w)淬灭DOX荧光。首先测量DNA:DOX比值在1-100之间的荧光光谱(上图光谱),然后测量DNA:DOX比值在1-10之间的荧光光谱(下图光谱)。激发波长为490nm。负载量和包封率分别确定为~14%和~88%。研究中发现,DNA与DOX重量比是6:1。
图2显示了在水中制备的DNA(上图)或DOX/DNA(下图)的透射电子显微镜(TEM)图像。将DNA以6:1w/w的比例加入到DOX中。为自我组装分配了时间。在这种特定情况下,向混合物中加入水,让溶液再静置30分钟。最终[DNA]=6μg/mL,最终[DOX]=1μg/mL。
图3显示了DNA(上图)和DOX/DNA纳米粒子(下图)的TEM图像。DOX/DNA和DNA均在PBS中制备,然后在H2O稀释用于成像。最终[DNA]=6μg/mL,最终[DOX]=1μg/mL。DOX/DNA纳米粒子的大小约为70nm。
图4显示了冻干法重建的DOX/DNA的TEM图像。显示了DOX/DNA的较低放大率(左栏)和较高放大率(右栏)。在PBS中制备DOX/DNA,用H2O稀释,冻干过夜,然后用H2O法重建,随后成像。最终[DNA]=6g/mL,最终[DOX]=1μg/mL。
图5显示了另一组通过冻干法重建的DOX/DNA TEM图像。显示了DOX/DNA的较低放大率(左面板)和较高放大率(右面板)。最终[DNA]=6μg/mL,最终[DOX]=1μg/mL。
图6显示了冻干法重建的DOX/DNA的另一组TEM图像。显示了DOX/DNA的高倍镜(左图)和超高倍镜(右图)。最终[DNA]=6μg/mL,最终[DOX]=1μg/mL。
图7显示了在PBS中制备并在H2O稀释的DNA的两幅TEM图像。最终[DNA]=6μg/mL。
图8显示了在较低放大率下在PBS中制备并在H2O稀释的DNA的另外两幅TEM图像。最终[DNA]=6μg/mL。
图9显示了在10%FBS/PBS中进行的DNA降解试验的凝胶照片。将DNA与含血清的PBS在37℃孵育一段时间。将样本储存在-20℃下,以在每个时间点停止核酸酶的酶降解。[DNA]=100μg/mL。左侧的数字表示阶梯(L)中的碱基对。0*:新鲜DNA(无-20℃储存)。当暴露于10%FBS/PBS时,DNA会随时间降解。含血清培养基中的核酸酶可能促成了这种降解。可以推断,由于在10%胎牛血清(FBS)中DNA随时间的降解,导致了DOX的延迟释放。
图10提供了一项研究的结果,该研究观察了EL4细胞在24h、48h和72h时DOX/DNA的体外细胞毒性。EL4细胞用一系列浓度处理三次,持续24、48和72小时,然后通过MTT法进行细胞存活率分析。培养24小时时,DOX/DNA对这些细胞的细胞毒性低于DOX,差异约为3.5倍,如报告的IC50值所示:DOX/DNA IC50=1.143μg/mL或2.1M,DOX IC50=μ0.313g/mL或0.576M。培养48小时和72小时时,DOX/DNA对这些细胞的细胞毒性与DOX相似,如所报告的IC50值所示:DOX/DNA IC50=0.072μg/mL,DOX IC50=0.093μg/mL(在48小时),或DOX/DNA IC50=0.055μg/mL,DOX IC50=0.048μg/mL(在72小时)。这一结果与24小时细胞毒性数据共同表明DOX从DOX/DNA中延迟释放。此外,结果表明,与游离小分子对应物相比,纳米颗粒表现出较小的毒性。
图11显示了在接受20mg/kg DOX或与20mg/kg DOX当量的DOX/DNA静脉注射治疗的EL4荷瘤C57BL/6小鼠的药代动力学研究结果。这些小鼠是6-8周龄的雌性小鼠。发现与用DOX(DOX:T1/2=3分钟,n=3)处理的小鼠相比,DOX/DNA在EL4荷瘤的C57BL/6小鼠中具有更长的血液循环停留半衰期(DOX/DNA:T1/2=75分钟)。DOX在~15分钟内被组织吸收(如曲线的初始陡峭斜率所示),然后观察到更像肝和肾清除率的轮廓。然而,DOX/DNA的组织吸收曲线远没有那么陡,可持续1小时。从上述结果可以推断,由于DNA的存在,DOX循环和DOX保护/屏蔽增强了。之后,观察到指示肝和肾清除率的特征。因此,本公开的药物递送***改变了阿霉素的溶解和吸收,可能允许活性剂的持续释放。
图12提供了DOX与DNA的结合动力学。当[DOX]增加时,测量DOX/DNA的荧光。[DNA]在400g/mL浓度下保持恒定,n=3。
图13表明,在FBS和含血清的PBS中,与DNA结合的DOX在24小时内减少。[DNA]恒定在400g/mL。很可能DOX从DNA中释放出来是由于FBS的存在。
图14表明,培养基中的血清含量导致DOX以剂量依赖性方式随时间从DOX/DNA中释放出来,重复实验n=3。结合动力学实验得到的数据表明,随着时间的推移,DOX从DOX/DNA中释放的速度,取决于培养基中的血清含量。至少根据该模型,在72小时内,纳米粒子释放出大部分DOX。
图15提供了在接受20mg/kg DOX、与20mg/kg DOX当量的DOX/DNA、PBS或120mg/kgDNA治疗的C57BL/6小鼠中进行的全血细胞计数和肝酶小组分析,n=3。
图16提供了静脉注射后多个时间点DOX与DOX/DNA的生物分布。对EL4荷瘤C57BL/6小鼠(雌性,6-8周龄)进行20mg/kg DOX、DOXIL(20mg/kg DOX当量)或DOX/DNA(20mg/kg DOX当量)静脉注射给药后1、3、6和12小时,DOX在器官和肿瘤组织中积累。DOX/DNA组中,肺中DOX积累量较低,n=5(DOXIL 12h除外,其中n=3)。
图17提供了在EL4荷瘤C57BL/6小鼠中静脉注射后多个时间点的DOX与DOX/DNA的生物分布。对EL4荷瘤C57BL/6小鼠(雌性,6-8周龄)进行20mg/kg DOX、DOXIL(20mg/kg DOX当量)或DOX/DNA(20mg/kg DOX当量)静脉注射给药后1、3、6和12小时,DOX在器官和肿瘤中积累。DOX/DNA组中,肺中DOX积累量较低,n=5(DOXIL 12h除外,其中n=3)。
图18提供了在EL4荷瘤C57BL/6小鼠中静脉注射后多个时间点的DOX与DOX/DNA的生物分布。对EL4荷瘤C57BL/6小鼠(雌性,6-8周龄)进行20mg/kg DOX、DOXIL(20mg/kg DOX当量)或DOX/DNA(20mg/kg DOX当量)静脉注射给药后1、3、6和12小时,DOX在器官和肿瘤中累积。DOX/DNA组中,肺中DOX积累量较低,n=5(DOXIL 12h除外,其中n=3)。
图19提供了C57BL/6小鼠(雌性,6-8周,n=7)的急性毒性存活曲线。在20mg/kg或以下的剂量方案中未观察到急性毒性。DOX给药剂量为40mg/kg的小鼠发生了急性毒性(心脏骤停)。
图20显示了EL4荷瘤小鼠(2-3月龄,雌性)在接受一定剂量范围的DOX/DNA、DOX或DOXIL静脉注射治疗后定期追踪30天的肿瘤生长和存活情况。在EL4荷瘤C57BL/6小鼠(n=5)中,DOX/DNA减缓了肿瘤生长并提高了存活率。当使用纳米载体制剂时,20mg/kg剂量表现出延长的生存期和减慢的肿瘤生长。有趣的是,直到第28天,接受40mg/kg DOX/DNA治疗的小鼠肿瘤完全消退。此外,这些小鼠中有60%存活至实验结束。这些结果有效地证明了DNA具有提高DOX最大耐受剂量的功能,此外还证明了其对全身毒性具有保护作用。这可能意味着人类治疗对象存活率和生活质量的改善。在一系列剂量的DOX/DNA、DOX或DOXIL静脉注射治疗后30天内,定期追踪EL4荷瘤小鼠的体重(2-3月龄,雌性)。高剂量的DOX/DNA治疗导致EL4荷瘤C57BL/6小鼠(n=5)体重减轻。
图21提供了接受20mg/kg DOX或DOX当量的DOXIL或DOX/DNA治疗第0天、第7天和第14天的EL4荷瘤C57BL/6小鼠(6周)的体重、肿瘤生长和存活结果,n=5。与游离DOX或DOXIL相比,DOX/DNA治疗的结果更理想。DOX/DNA比游离DOX更安全。此外,DOX/DNA治疗的肿瘤生长减少幅度最明显,生存率最高。
图22表明,EL4细胞中的DOX/DNA摄取受到内吞抑制剂的抑制。阳性对照:无抑制剂。网格蛋白依赖途径:氯丙嗪(CPZ)20μM。小窝蛋白依赖途径:Filipin III 5μg/mL。大胞饮途径:EIPA 20μM。这些浓度是根据每种抑制剂的剂量反应分析来选择的。基于上述情况,细胞通过网格蛋白依赖和小窝蛋白依赖途径摄取NPs。还涉及膜融合,如DOX/DNA摄取的4℃抑制所示。
图23显示了暴露于抑制剂NaN3、PS2、Filipin III、EIPA或4℃后的EL4 DOX摄取量。抑制研究表明DOX主要通过膜融合被细胞摄取。
图24提供了用DOX/DNA-Cy5处理EL4细胞0至8小时的激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)图像。图像显示,随着时间的推移,EL4细胞摄取了DOX/DNA。这些图像进一步表明了纳米粒子的内摄,而不仅仅是单独的DOX。
图25显示了使用弱碱时DOX、DNA和DOX/DNA的滴定曲线。用1M HCl将每种溶液的pH值降至2以下。每次加入100μL或20μL 0.1M NaOH后测量pH值。DNA pKa在1(磷酸盐),6-7(磷酸盐)。DOX pKa为7.34(苯酚)、8.46(胺)、9.46(估计)。
发明详述
如本发明和所附权利要求书中所用,单数形式“一种”包括复数指代物,除非上下文另有明确说明。因此,例如,提及“一种载体”包括多种这样的载体,提及“一种核酸”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种核酸及其等同物等。
此外,除非另有说明,否则使用“或”表示“和/或”。类似地,“包括”和“包含”是可互换的,而不是限制性的。
还应当理解,在各种实施方案的描述使用术语“包括”的情况下,本领域技术人员将理解,在某些特定情况下,可以替代地使用语言“主要由……组成”或者“由……组成”来描述实施例。
除非另有定义,本发明使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管许多方法和试剂类似于或等同于本发明中所述,但本发明公开了示例性方法和材料。
本发明提及的所有出版物均以引用方式全部并入本发明,以描述和披露可能与本发明描述有关的方法。此外,关于在一个或多个出版物中出现的与在本公开中已经明确定义的术语相似或相同的任何术语,本公开中的明确提供的术语的定义将在所有方面起控制作用。
出于本公开的目的,术语“癌症”将用于包括细胞增殖性病症、肿瘤、癌前细胞病症和癌症,除非另有具体描述。因此,“癌症”是指经历异常细胞增殖的任何细胞,其可导致转移或肿瘤生长。示例性癌症包括但不限于肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、***癌、肛管直肠癌、肛管癌、阑尾癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、尿膀胱癌、骨和关节癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑肿瘤、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、胃肠、神经***癌、神经***淋巴瘤、中枢神经***癌、中枢神经***淋巴瘤、***、儿童期癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴肿瘤、蕈样肉芽肿、赛兹阿里综合征、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞瘤、胶质瘤、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、眼癌、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌、肾癌、喉癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、唇口腔癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌艾滋病相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤恶性、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、舌癌、多发性内分泌瘤形成综合征、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、***癌、直肠癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤文氏肉瘤家族肿瘤、软组织肉瘤、子宫癌、子宫肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、***状瘤、光化性角化病和角化棘皮瘤、默克尔细胞瘤、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤(thymoma)、胸腺瘤和胸腺癌(thymoma and thymiccarcinoma)、甲状腺癌、肾盂和输尿管及其他泌尿器官的移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、子宫体癌、***癌、外阴癌和肾母细胞瘤。在一个特定的实施方案中,所述癌症选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肾癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、胸腺瘤(thyomas)、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、子宫肉瘤、威尔姆斯瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
本发明所用的术语“病症”通常是同义的,并且可与术语“疾病”、“并发征”和“状况”(如在医学状况中)互换使用,因为它们都反映了人或动物身体或其部分之一的异常状况,正常功能受损,通常表现为明显的症状和体征。
本发明使用的术语“非释放控制赋形剂”是指与常规的速释放剂型相比,其主要功能不包括改变活性物质从剂型中释放的持续时间或位置的赋形剂。
本发明使用的术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或载体,例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与药物制剂的其它成分相容的意义上,每种组分都应该是“药物可接受的”。还应适合与人和动物的组织或器官接触使用,无过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症,且符合合理的受益/风险比。“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋形剂”的示例见下文,Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,21st Edition;Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,Pa.,2005;Handbook of Pharmaceutical Excipients,5th Edition;Roweet al.,Eds.,The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2005;and Handbook of Pharmaceutical Additives,3rd Edition;Ash andAsh Eds.,Gower Publishing Company:2007;Pharmaceutical Preformulation andFormulation,Gibson Ed.,CRC Press LLC:Boca Raton,Fla.,2004.
本发明所用术语“可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂”是指可与DNA或RNA缔合或结合并可用于治疗受试者的病症或疾病(通常为癌症)的小分子。“可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂”的实例包括但不限于蒽环类抗生素,如阿克拉霉素、氨柔比星、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星和佐柔比星;蒽二酮类,如米托蒽醌和吡森酮;喜树碱类化合物,如贝洛替康、喜树碱、柯西替康、艾司替康、吉美替康、伊立替康、鲁托替康、鲁比替康、硅阿替康和托普替康;鬼臼类化合物,如依托泊苷和替尼泊苷;博来霉素;放线菌素D;次要沟槽结合剂,如倍癌霉素A、阿多泽来辛、比泽来辛和卡泽来辛;嘌呤拮抗剂,如克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨、汞嘌呤、硫鸟嘌呤和戊司他丁;嘧啶拮抗剂,例如卡培他滨、卡莫福、多西立啶、氟尿苷、氟尿嘧啶、替加氟、阿糖胞苷、吉西他滨、氮杂胞苷和地西他滨;叶酸拮抗剂,如氨蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞和普拉曲酸;烷化剂,如环磷酰胺、异环磷酰胺、曲福司明、苯丁酸氮芥、美法仑、普瑞丁、苯达莫司汀、氯甲川、乌拉地尔、卡莫司汀、福替莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、拉尼莫司汀、链脲佐菌素、曼诺森、曲索司芬、卡波酮、噻替帕、三嗪环酮、三乙基内美拉明、卡铂、顺铂、双环铂、奈达铂、奥沙利铂、沙特拉普拉丁、替莫唑胺、达卡巴嗪、米托溴尼醇、匹泊罗曼和普鲁卡因。
本发明所用的术语“控释赋形剂”是指与常规的速释剂型相比,其主要功能是改变活性物质从剂型中释放的持续时间或位置的赋形剂。
术语“治疗上可接受的”是指那些化合物(或盐、前药、互变异构体、两性离子形式等),其适合用于与患者的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性,符合合理的益处/风险比,并且对于其的预期用途有效。
本发明使用的术语“治疗”是指改善与疾病或病症(例如,癌症)相关的症状,包括预防或延迟疾病或病症症状的发作,和/或减轻疾病或病症症状的严重性或频率。
本发明所用的术语“受试者”是指动物,包括但不限于灵长类动物(例如,人、猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿类动物(例如,大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂等)、兔形动物、猪(例如,猪、小型猪)、马、犬、猫等。术语“受试者”和“患者”在本发明中可互换使用。例如,哺乳动物受试者可以指人类患者。
可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂在治疗癌症和其他疾病方面具有巨大潜力,但其固有的化学结构使其不可溶,导致生物利用度低。其中一些治疗剂虽然可溶,但会导致全身毒性,并且通常会过快地从体内清除。这些问题的当前解决方案包括使用纳米载体递送此类化合物(例如,蒽环类抗生素)。然而,这些解决方案的共同缺点包括药物载量非常低、免疫原性、治疗效果差且载体清除缓慢以及成本大幅增加。例如,阿霉素(DOX)的聚乙二醇化(聚乙二醇化)脂质体制剂DOXIL就经历了所有这些限制。虽然它改善了阿霉素的安全性,但其疗效不如DOX。DOXIL在血流中的长时间循环实际上允许免疫***针对颗粒上的聚乙二醇化部分产生抗体。因此,当前解决方案的主要缺点包括纳米载体的生物相容性。此外,目前的解决方案不容易组装。直接相反,本公开的组合物和方法可以以直接的方式组装,并且更具成本效益。例如,据报道另一种DOX纳米载体HPMA-DOX(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物-阿霉素)具有比本发明所述组合物更短的循环时间(20.1小时),并且具有更复杂的组装过程,这将难以按比例放大到商业水平。其他人已经合成了用于递送化疗的核酸***(例如,用于DOX和胞嘧啶脱氨酶递送的点击核酸),但是这种制剂相当费时费钱,并且不太可能达到商业化阶段。此外,此类制剂的聚乙二醇化可能会导致类似的免疫原性问题,这在其他聚乙二醇化给药***(如DOXIL)中已有报道。
如本发明所述的体外和体内研究所示,使用核酸片段作为DOX的递送载体提高了小鼠诱发性实体瘤治疗的安全性和功效。特别是,在本发明介绍的体内研究中,与单独使用DOX治疗相比,DOX/DNA纳米颗粒治疗提高了生存率并减缓了肿瘤生长。上述有利结果可能是延长DOX/DNA纳米颗粒循环时间和DOX从DNA中释放受控的结果,24小时、48小时和72小时体外细胞毒性研究以及体内血液循环研究均证明了这一点。这两种方法都使得DOX/DNA纳米颗粒发挥出优于DOX单独治疗、也优于DOXIL治疗的化疗效果。本研究显示,DOXIL可有效降低全身毒性作用,但不会改善治疗结果。此外,研究显示DOXIL的聚乙二醇化以及该化疗制剂的重复给药会导致免疫原性。不幸的是,纳米治疗领域的其他递送载体在其配方和生产方面可能非常复杂,使其难以扩展。治疗剂和核酸已经在商业规模上生产了。因此,治疗剂/核酸配方、制剂和组合物易于生产并且可商业化扩展。
在特定实施方案中,本公开提供了包含一种或多种治疗剂的组合物、制剂或配方,所述治疗剂已经与核酸复合形成纳米颗粒。可与核酸复合形成纳米颗粒的治疗剂的实例包括但不限于去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRIs),如阿托莫西汀;多巴胺再摄取抑制剂(DARIs),如哌甲酯;血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRIs),如米那普仑;镇静剂,如***;去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂,如安非他酮;血清素-去甲肾上腺素-多巴胺-再摄取抑制剂,如文拉法辛;单胺氧化酶抑制剂,如司来吉兰;下丘脑磷脂;内皮素转化酶(ECE)抑制剂,如磷酰胺;血栓烷受体拮抗剂,如依替罗班;钾通道开放剂;凝血酶抑制剂,如水蛭素;下丘脑磷脂;生长因子抑制剂,如PDGF活性调节剂;血小板活化因子(PAF)拮抗剂;低分子量肝素,如依诺肝素;因子VIIa抑制剂和因子Xa抑制剂;肾素抑制剂;中性肽链内切酶(NEP)抑制剂;血管胃蛋白酶抑制剂(双重NEP-ACE抑制剂),如奥马曲拉和吉莫曲拉;HMGCoA还原酶抑制剂,如普伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、NK-104(也称伊伐他汀、尼伐他汀或尼司他丁)和ZD-4522(也称瑞舒伐他汀、阿伐他汀或维萨他汀);角鲨烯合成酶抑制剂;贝特类药物;胆汁酸螯合剂,如消胆胺;烟酸;抗动脉粥样硬化剂,如ACAT抑制剂;MTP抑制剂;钙通道阻滞剂,如苯磺酸氨氯地平;钾通道激活剂;α-毒蕈碱剂;β-毒蕈碱剂,如卡维地洛和美托洛尔;抗心律失常药;利尿剂,例如***、氢***、氟甲叠氮、氢氟甲基叠氮、苄氟甲基叠氮、甲基***、三氯甲叠氮、聚噻嗪、苯并噻嗪、依沙吖嗪酸、替宁酸(tricrynafen)、氯噻酮、呋喃苯胺、musolimine、布美他尼、三氨蝶呤、阿米洛利和螺内酯;抗糖尿病药,如双胍类(如二甲双胍)、葡糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖)、胰岛素、美格替尼(如瑞格列奈)、磺脲类(如格列美脲、格列本脲和格列吡嗪)、噻唑烷二酮类(如曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮)和PPAR-γ激动剂;盐皮质激素受体拮抗剂,如螺内酯和依普利酮;生长激素促分泌素;aP2抑制剂;磷酸二酯酶抑制剂,如PDE III抑制剂(如西洛他唑)和PDE V抑制剂(如西地那非、他达拉非、伐地那非);蛋白酪氨酸激酶抑制剂;抗增殖药,如甲氨蝶呤、FK506(他克莫司,普乐可复(Prograf))、霉酚酸酯;化疗药物;免疫抑制剂;抗癌剂和细胞毒性剂(例如烷基化剂,如氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、亚乙基亚胺和三氮烯);抗代谢药,如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物和吡啶类似物;抗生素,如蒽环类抗生素、博莱霉素、放线菌素、达卡霉素和褶霉素;酶,如左旋门冬酰胺酶;法呢基-蛋白质转移酶抑制剂;激素类药物,如糖皮质激素(如可的松)、***/抗***、雄激素/抗雄激素、孕激素和促***释放激素拮抗剂以及醋酸奥曲肽;微管破坏剂,例如刀鲚毒素;微管稳定剂,如紫杉醇、多西他赛和埃坡霉素A-F;植物来源的产物,如长春花生物碱、表鬼臼毒素和紫杉烷;和拓扑异构酶抑制剂;多酚化合物;聚酮化合物;异戊二烯-蛋白质转移酶抑制剂;和环孢菌素;细胞毒性药物,如硫唑嘌呤和环磷酰胺;TNF-α抑制剂,如替尼达普;抗TNF抗体或可溶性TNF受体,如依那西普、雷帕霉素和来氟米特;和环加氧酶-2(COX-2)抑制剂,如塞来昔布和罗非考昔;和各种试剂,例如羟基脲、丙卡巴嗪、米托坦、六甲基三聚氰胺、金化合物、铂配位络合物,例如顺铂、萨特拉丁和卡铂。虽然本发明所呈现的示例性研究清楚地表明本发明所公开的DOX/核酸纳米颗粒可用于有效地治疗癌症,但应理解,可由治疗剂治疗的任何疾病或病症均涵盖于本公开内容中。
在一个特定的实施方案中,本公开提供了包含多酚的治疗组合物、制剂或配方,所述多酚已经与核酸复合形成纳米颗粒。多酚是一类主要由天然、但也有合成或半合成的有机化学物质组成的结构,其特征是存在大量的酚结构单元。这些酚结构的数量和特征是该类特定成员独特的物理、化学和生物(代谢、毒性、治疗等)性质的基础。许多多酚是膳食植物作为次级代谢产物产生的微量营养素。尽管这些化合物表现出较差的生物利用度(仅吸收了一部分摄入量且***迅速),以及复杂的药效学和代谢,但它们仍具有治疗特性。大量证据(流行病学研究、动物研究和人类临床试验)表明,多酚可减少一系列与心血管疾病相关的病状,包括血栓形成(et al.,J Agric Food Chem.2008;56:2970–2976.),动脉粥样硬化(Chiva-Blanch et al.,Am J Clin Nutr.2012;95:326–334.)和炎症(Rieder et al.,Br J Pharmacol.2012;167:1244–1258.),以及显示抗癌(Gali etal.,Cancer Res.1991;51:2820–2825.)和神经保护作用(Gatson et al.,J Trauma AcuteCare Surg.2013;74:470–475)属性。这些化合物的活性是通过一系列机制实现的,包括其显著的抗氧化作用(Pignatelli et al.,Atherosclerosis.2006;188:77–83),抑制细胞内激酶活性(Wright et al.,Regen Med.2012;7:295–307),与细胞表面受体结合(Jacobsonet al.,Adv Exp Med Biol.2002;505:163–171)和破坏细胞膜的完整性(Pawlikowska-Pawlega et al.,Biochim Biophys Acta.2007;1768:2195–2204)。多酚的应用研究有所增加,特别是在功能食品、营养保健品和制药行业。然而,多酚类物质的有效性关系到人类健康的一个问题,这取决于保持生物活性化合物的稳定性、生物活性和生物利用度。此外,一些酚类化合物奇特的味道限制了它们在药物应用中的用途。本发明所公开的多酚与核酸的包封或络合可有助于解决游离多酚化合物的这些缺点。由于本发明公开的组合物和方法受控于基于平台的多酚递送***,因此预期任何类型的多酚都可被本发明公开的核酸复合或包封。这种多酚化合物的实例包括但不限于黄腐酚;黄烷醇,如表儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和原花青素;黄烷酮,如橙皮苷和柚皮素;黄酮,如芹菜素、白杨素和木犀草素;黄酮醇,如槲皮素、山柰酚、杨梅素、异鼠李素和高良姜素;异黄酮,如染料木素和大豆苷元;酚酸类,如鞣花酸、没食子酸、阿魏酸、绿原酸;木脂素,如芝麻素和亚麻木酚素二葡萄糖苷;芪类,如白藜芦醇、紫檀芪和白皮杉醇。因此,本公开提供了一种可以安全、有效和受控地递送多酚的配方、组合物或制剂的平台技术,以治疗任何可用多酚化合物治疗的疾病或病症。例如,大量研究表明多酚类物质可限制冠心病的发病率(Renaud et al.,Lancet.1992;339:1523–1526;Dubick et al.,J Nutraceut Functional&MedFoods.2001;3:67–93;Nardini et al.,Platelets.2007;18:224–243;and Vita et al.,Am J Clin Nutr.2005;81:292–297);II型糖尿病(Rizvi et al.,Clin Exp PharmacolPhysiol.2005;32:70–75;Matsui et al.,J Agric Food Chem.2002;50:7244–7248;Dembinska-Kiec et al.,Br J Nutr 20.2008;99:109–117;and Chen et al.,Eur JPharmacol.2007;568:269–277);阻塞性肺疾病(Tabak et al.,Am J Respir Crit CareMed.2001;164:61–64;and Woods et al.,Am J Clin Nutr.2003;78:414–421);和神经变性疾病(Ajami et al.,Neuoroscience&Biobehavioral Reviews 2007;73:39-47;andMandel et al.,Free Radical Biology and Medicine 2004;37(3):304-317)。应进一步注意,本发明公开的配方、组合物或制剂不仅限于递送一种特定的多酚化合物,因为任何数量的多酚化合物可与本发明公开的核酸复合以制备多酚/核酸纳米颗粒。
此外,聚酮化合物可以与本发明公开的核酸复合,或者聚酮化合物和多酚化合物都可以与本发明公开的核酸复合。聚酮化合物是一大类次级代谢产物,其中含有交替的羰基和亚甲基(-CO-CH2-),或衍生自含有这种交替基团的前体。许多聚酮化合物具有抗菌和免疫抑制的特性。与多酚化合物一样,聚酮化合物能够与本发明公开的核酸种类形成pi-pi堆积相互作用,以形成聚酮化合物/核酸纳米颗粒。
在一个特定实施方案中,本公开提供了一种组合物、制剂或配方,其包含一种或多种可与所公开的DNA或RNA缔合或结合的治疗剂,所述组合物、制剂或制剂与核酸复合形成纳米颗粒。可与核酸复合形成纳米颗粒的治疗剂的实例包括但不限于蒽环类抗生素,如阿克拉霉素、氨柔比星、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星和佐柔比星;蒽二酮类,如米托蒽醌和吡森酮;喜树碱类化合物,如贝洛替康、喜树碱、柯西替康、艾司替康、吉美替康、伊立替康、鲁托替康、鲁比替康、硅阿替康和托普替康;鬼臼类化合物,如依托泊苷和替尼泊苷;博来霉素;放线菌素D;次要沟槽结合剂,如倍癌霉素A、阿多泽来辛、比泽来辛和卡泽来辛;嘌呤拮抗剂,如克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨、汞嘌呤、硫鸟嘌呤和戊司他丁;嘧啶拮抗剂,例如卡培他滨、卡莫福、多西立啶、氟尿苷、氟尿嘧啶、替加氟、阿糖胞苷、吉西他滨、氮杂胞苷和地西他滨;叶酸拮抗剂,如氨蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞和普拉曲酸;烷化剂,如环磷酰胺、异环磷酰胺、曲福司明、苯丁酸氮芥、美法仑、普瑞丁、苯达莫司汀、氯甲川、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、拉莫司汀、链脲佐菌素、甘露糖胺、曲磺隆、卡波酮、噻替帕、三嗪酮、三乙基美拉明、卡铂,顺铂、双环铂、奈达铂、奥沙利铂、沙特拉普拉丁、替莫唑胺、达卡巴嗪、米托溴尼醇、匹泊罗马和丙卡巴嗪。在某些实施方案中,可与DNA或RNA缔合或结合的一种或多种治疗剂选自蒽环类抗生素,如阿克拉霉素、氨柔比星、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星和佐柔比星;蒽二酮类,如米托蒽醌和吡森酮;喜树碱类化合物,如贝洛替康、喜树碱、柯西替康、艾司替康、吉美替康、伊立替康、鲁托替康、鲁比替康、硅阿替康和托普替康;鬼臼类化合物,如依托泊苷和替尼泊苷;博来霉素;放线菌素D;次要凹槽结合剂,如倍癌霉素A、阿多泽来辛、比泽来辛和卡泽来辛。在另一个实施方案中,可与DNA或RNA缔合或结合的一种或多种治疗剂包括阿克拉霉素、氨柔比星、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星和/或佐柔比星。在另一个实施方案中,可与DNA或RNA缔合或结合的一种或多种治疗剂包括米托蒽醌、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、博来霉素、放线菌素D和/或倍癌霉素A。
由于本发明公开的组合物和方法受控于基于平台的治疗剂递送***,预期与DNA或RNA缔合或结合的任何类型的治疗剂化合物可被本发明公开的核酸复合或包封。这类治疗化合物的示例性实例包括但不限于蒽环类抗生素,如阿克拉比星、氨柔比星、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星和佐柔比星;蒽二酮类,如米托蒽醌和吡森酮;喜树碱类化合物,如贝洛替康、喜树碱、柯西替康、艾司替康、吉美替康、依立替康、鲁托替康、鲁比替康、硅阿替康和托普替康;鬼臼类化合物,如依托泊苷和替尼泊苷;博来霉素;和放线菌素D;因此,本公开提供了一种平台技术,其可用于安全、有效和受控地递送可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂的制剂、组合物或配方,以治疗可通过所述治疗剂治疗的任何数量的疾病或病症。虽然本发明所呈现的示例性研究清楚地表明本发明所公开的DOX/核酸纳米颗粒可用于有效地治疗癌症,但应理解,可通过可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂治疗的任何疾病或病症均涵盖于本发明公开内容中。应进一步注意,本发明公开的制剂、组合物或配方不仅仅局限于递送一种与DNA或RNA缔合或结合的特定治疗剂,因为任何数量的能与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂可与本发明公开的核酸复合来制备治疗剂/核酸纳米颗粒。
关于治疗性/核酸纳米颗粒的核酸组分,任何类型和长度的核酸物质均可用于与可与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂复合。也就是说,这种核酸种类应该能够与DNA或RNA缔合或结合的治疗剂形成pi-pi堆积相互作用。虽然DNA用于本发明所述的研究,但设想DNA、RNA、DNA-RNA杂合体或其混合物均可用于形成本发明所述的治疗剂/核酸纳米颗粒。此外,出于本发明公开的目的,“核酸”包括核酸类似物。核酸是核苷酸链,由三部分组成:磷酸主链、戊糖(核糖或脱氧核糖)和四个碱基之一。一个核酸类似物可能有任何这些改变。
DNA(脱氧核糖核酸的缩写)是一种具有复杂分子结构的有机化学物质,存在于所有原核和真核细胞以及许多病毒中。DNA为遗传特征的传递编码遗传信息。脱氧核糖核酸分子的每条链都由单体核苷酸的长链组成。DNA的核苷酸由一个连着磷酸基团的脱氧核糖糖分子和四个含氮碱基(两个嘌呤(腺嘌呤和鸟嘌呤)和两个嘧啶(胞嘧啶和胸腺嘧啶))之一组成。核苷酸通过一个核苷酸的磷酸和下一个核苷酸的糖之间的共价键连接在一起,由此形成磷酸-糖骨架,含氮碱基突出该骨架。一条链通过碱基之间的氢键接另一条链,这种结合的顺序是特定的,即腺嘌呤只与胸腺嘧啶结合,胞嘧啶只与鸟嘌呤结合。DNA分子的构型非常稳定,可以作为模板复制新的DNA分子,并产生(转录)相关的RNA(核糖核酸)分子。
RNA是核糖核酸的缩写,是一种高分子量的复合物,在细胞蛋白质合成中起作用,在某些病毒中取代DNA(脱氧核糖核酸)作为遗传密码的载体。RNA由通过磷酸二酯键连接的核糖核苷酸(附在核糖糖上的含氮碱基)组成,形成不同长度的链。RNA中的含氮碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶(取代了DNA中的胸腺嘧啶)。RNA的核糖是由五个碳和一个氧组成的环状结构。核糖分子中第二个碳原子上连接了一个具有化学反应活性的羟基(-OH)基团,这使得RNA易于水解。与在糖部分(脱氧核糖)的相同位置上没有反应性-OH基团的DNA相比,RNA的这种化学不稳定性被认为是DNA进化成为大多数生物体中遗传信息的优选载体的原因之一。在一个特定的实施方案中,RNA的具有反应活性的-OH基团可以被反应活性较低的-O-烷基基团或卤化物基团取代,以使RNA对RNA酶的作用具有抗性。
DNA-RNA杂合体在人类细胞中大量存在。它们是在转录过程中,当新生RNA非常接近其DNA模板的时候形成的。由此产生的RNA/DNA杂合体和置换的单链(ss)DNA被称为R环。RNA/DNA杂合体在结构上不同,比相应的双链DNA更稳定。在复制起点、免疫球蛋白类转换区和转录复合物中发现了RNA/DNA杂合体。RNA/DNA杂合体不采用传统的DNA B-构象或RNA A-构象,而是以混合物或异源双链体的形式存在。
出于本发明公开的目的,核酸片段可以由天然存在的核酸的酶切或物理断裂产生,化学合成各种大小的核酸,或其某些组合。可以使用任何天然存在的核酸,包括来自任何物种、来自原核生物、来自真核生物、来自真菌等的核酸。在一个特定的实施方案中,核酸片段来自鲑鱼DNA。此外,可以改变核酸片段的大小/长度以适合所使用的特定治疗剂。例如,核酸片段的长度可以是20nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、110nt、120nt、130nt、140nt、150nt、160nt、170nt、180nt、190nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、450nt、500nt、550nt、600nt、650nt、700nt、750nt、800nt、850nt、900nt、950nt、1,000nt、1,500nt、2,000nt、2,500nt、3,000nt、3,500nt、4,000nt、4,500nt、5,000nt、5,500nt、6,000nt、6,500nt、7,000nt、7,500nt、8,000nt、8,500nt、9,000nt、9,500nt、10,000nt,或者介于或包括任何两个前述长度的长度范围(例如,20nt至10,000nt,50nt至2,000nt等)。核酸的序列可以是随机的或选择的所需序列。在后一种情况下,可选择序列靶向转录因子(TFs)、TLR或其他DNA或RNA结合蛋白,或者是适体。在这种情况下,治疗剂/核酸纳米颗粒可以通过选择特定序列或肿瘤特异性抗原的配体靶向某些组织、器官或肿瘤。肿瘤特异性抗原的配体可从各种供应商处购得,因此不必从头生成(例如,参见Elabscience、Santa Cruz biotechnology、Biospacific、Novus Biologicals等)。在一个特定的实施方案中,与治疗剂/核酸纳米颗粒连接的配体与选自甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、CA15-3、CA19-9、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、ras或p53的异常产物、CTAG1B、MAGE 1和HER2/neu的肿瘤特异性抗原结合。与肿瘤特异性抗原结合的配体应具有结合靶抗原的高亲和力(Kd<10nM),以有效摄取到靶肿瘤细胞中,且免疫原性应最低。在另一个实施方案中,结合肿瘤特异性抗原的配体通过使用可切割连接子(酸不稳定连接子、蛋白酶可切割连接子和二硫键连接子)与本发明公开的治疗剂/核酸纳米颗粒连接。酸不稳定连接子设计为在血液中遇到的pH水平下稳定,但在溶酶体中遇到低pH环境时变得不稳定并降解。蛋白酶可切割连接子也设计为在血液/血浆中稳定,但会在癌细胞的溶酶体内,被溶酶体酶切割后,迅速释放游离药物。它们利用溶酶体内的高水平蛋白酶活性,并包括被这些蛋白酶识别和切割的肽序列,就像组织蛋白酶快速水解Val-Cit二肽的连接一样。第三类可用于将配体与治疗剂/核酸纳米颗粒连接的连接子含有二硫键。该连接子利用细胞内高水平的还原型谷胱甘肽在细胞内释放游离药物。试剂,如Traut试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷)、MBS(3-马来酰亚胺苯并酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)和SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯)可将这些伯胺基团转化为巯基,然后巯基可与包含半胱氨酸残基的配体形成二硫键。其他试剂,如SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)和磺基-SMCC可用作将配体连接到治疗剂/核酸纳米颗粒的核酸上的连接子。如何使用这些基团将配体连接到治疗剂/核酸纳米颗粒上的示例可在全球网站(labome.com/method/Antibody-Conjugation.html)和此处引用的参考文献中找到,包括Safdari et al.,Monoclon Antib ImmunodiagnImmunother.2013 32:409-12;Joosten V et al.,Microb Cell Fact.2003 2:1;Winteret al.,Trends Pharmacol Sci.1993 14:139-43;Arbabi et al.,Front Immunol.20178:1589;Brinkley et al.,Bioconjug Chem.1992 3:2-13;Vlasak et al.,MAbs.2011 3:253-63;Ducancel et al.,MAbs.2012 4:445-57;McCombs et al.,AAPS J.2015;17:339-51;Hondal R.,Protein Pept Lett.2005 12:757-64;Zimmerman et al.,BioconjugChem.2014 25:351-61;Traut et al.,Biochemistry.1973 12:3266-73;Knight P.,Biochem J.1979 179:191-7;Carlsson et al.,Biochem J.1978 173:723-37;Peeters Jet al.,J Immunol Methods.1989 120:133-43;Hashida et al.,J Appl Biochem.19846:56-63;Avrameas et al.,Immunochemistry.1971 8:1175-9;Richards et al.,J MolBiol.1968 37:231-3;Chandler et al.,JImmunol Methods.1982 53:187-94;Coulepiset al.,J Clin Microbiol.1985 22:119-24;White et al.,J Clin Microbiol.1989 27:2300-4;Liu et al.,J Immunol Methods.2000 234:P153-67;Tian et al.,BioconjugChem.2015 26:1144-55;Vira et al.,Anal Biochem.2010 402:146-50;Szabóet al.,Biophys J.2018 114:688-700;Hagan et al.,Lanthanide-Anal Bioanal Chem.2011400:2847-64;Han et al.Nat Protoc.2018 13:2121-2148;Bottrill et al.,Chem SocRev.200635:557-71;Ye et al.,J Clin Lab Anal.2014 28:335-40;Fernández Moreiraet al.,Analyst.2010135:42-52;Brouwers et al.,J Nucl Med.2004 45:327-37;Veraet al.,Nucl Med Biol.201239:3-13;Stein et al.,J Nucl Med.2001 42:967-74;Bratthauer G.,Methods Mol Biol.2010588:257-70;Engle et al.,Science.2019 364:1156-1162;Sano et al.,Science.1992 258:120-2;Malou et al.,TrendsMicrobiol.2011 19:295-302;Cardoso et al.,Curr Med Chem.2012;19:3103-27;Eastet al.,Methods Mol Biol.2014 1199:67-83;Tan et al.,Nanomaterials(Basel).20155:1297-1316;Geng et al.,Bioconjug Chem.2016 27:2287-2300;Pecanha et al.,JImmunol.1991 146:833-9;Pecanha et al.,J Immunol.1993 150:2160-8;and Chen Y.,Methods Mol Biol.2013 1045:267-73,其公开内容通过引入并入本发明。
虽然在本发明所述研究中公开的示例性DOX/DNA纳米颗粒由于所用天然核酸的性质而具有多分散性,但是预期可以基于核酸的选择制备单分散纳米颗粒。这种单分散纳米颗粒可赋予更好的治疗效果。此外,构成本发明公开的纳米颗粒的核酸可以使用阳离子分子(例如,PTD结构域)复合,以提供或改善纳米颗粒的控释性质(通过最大限度地减少核酸酶引起的降解)。此外,核酸的吸湿性质可用于制备装载治疗剂的水凝胶,并且所述核酸可以与蛋白质(例如胸腺素-α1)缀合,为用本发明公开的纳米颗粒治疗疾病或病症提供多模式方法。例如,治疗性/核酸纳米颗粒可以与免疫增强蛋白如胸腺素-α1缀合,通过引发免疫***对抗癌症的同时递送抗癌治疗化合物的多模式方法。
治疗剂可以与核酸以一定的重量比(wt/wt)复合形成纳米颗粒。例如,核酸片段与一种或多种治疗性化合物复合的重量/重量比为1:20、1:15、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1,或者包括或介于任何两个前述比率之间的范围,包括其分数增量(例如,2:1至10:1、4:1至7:1、4.5:1至6.5:1等)。在一个特定的实施方案中,核酸片段以约6:1的重量/重量比与一种或多种治疗化合物复合。治疗剂/核酸纳米颗粒的大小也可以根据起始材料的浓度、反应参数(例如,温度、时间等)和试剂的添加(例如表面活性剂、盐等)来控制。在一个特定的实施方案中,治疗/核酸纳米颗粒的大小为约10nm、12nm、14nm、15nm、16nm、18nm、20nm、22nm、24nm、25nm、26nm、28nm、30nm、32nm、34nm、35nm、36nm、38nm、40nm、42nm、44nm、45nm、46nm、48nm、50nm、52nm、54nm、55nm、56nm、58nm、60nm、62nm、64nm、65nm、66nm、68nm、70nm、72nm、74nm、75nm、76nm、78nm、80nm、82nm、84nm、85nm、86nm、88nm、90nm、92nm、94nm、95nm、96nm、98nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm,或包括或介于上述任意两个比率之间的范围,包括其分数增量(例如,20nm至200nm,50nm至100nm,等)。在一个特定的实施方案中,治疗剂/核酸纳米颗粒的大小为约70nm。纳米颗粒可以具有任何形状,包括常见的球形、卵形、立方体形、六边形、棱柱形、杆形、螺旋形、三角形、星形或不规则形状。
在某些实施方案中,本发明提供了包含本发明公开的治疗性/核酸纳米颗粒的药物组合物。所述药物组合物可以被配制成适于对受试者给药的形式,包括使用载体、赋形剂、添加剂或助剂。常用的载体或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其他糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂,如无菌水、醇、甘油和多元醇。静脉注射载体包括液体和营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、冷冻保护剂和惰性气体。其他药学上可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂,包括盐、防腐剂、缓冲剂等,例如,如Remington's Pharmaceutical Sciences,15th ed.,Easton:MackPublishing Co.,1405-1412,1461-1487(1975)和The National Formulary XIV.,14thed.,Washington:American Pharmaceutical Association(1975)中所述,其内容通过引用结合于此。根据本领域的常规技术调节药物组合物中各种成分的pH和精确浓度。参照Goodman和Gilman的《治疗学的药理学基础》(第7版)。
无论局部或全身,根据本发明公开的药物组合物可以以治疗有效量给药。如本发明所用,“给与治疗有效量”旨在包括将本发明公开的药物组合物给予或施用给受试者的方法,所述方法允许该组合物发挥其预期的治疗功效。治疗有效量视因素而定,如受试者的感染程度、个体的年龄、性别和体重。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如,可每日分几次给药,或根据治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。
所述药物组合物可以以便捷的方式给药,例如通过注射(例如,皮下、静脉内等)、口服给药、吸入、透皮施用或直肠给药。根据给药途径,药物组合物可以用材料包衣以保护药物组合物免受可能使药物组合物失活的酶、酸和其他自然条件作用的伤害。该药物组合物还可以肠胃外或腹膜内给药。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下,这些制剂可能含有防腐剂,以防止微生物的生长。
适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(如果可溶于水)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。该组合物通常是无菌的和流动的,达到容易注射的程度。通常,该组合物在生产和储存条件下是稳定的,并能抵抗微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质,包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如,可以通过使用包衣如卵磷脂,在分散体的情况下通过保持所需的粒度,以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用,例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下,组合物中使用等渗剂,例如糖,多元醇,如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂来实现,例如,单硬脂酸铝和明胶。
跟据需要,将所需量的药物组合物与上文列举的一种或多种成分的适当溶剂混合,随后过滤灭菌,即可制备无菌注射溶液。通常,通过将药物组合物掺入无菌载体来制备分散体,所述载体含有基本的分散介质和所需来自以上列举的其它成分。
药物组合物可以口服给药,例如,与惰性稀释剂或可吸收的可食用载体一起。药物组合物和其他成分也可以装入硬或软壳明胶胶囊中,压制成片剂,或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗剂给药,所述药物组合物可与赋形剂结合并以可吸收的片剂、***片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄饼等形式使用。此类组合物和制剂应包含至少1%重量的活性化合物。当然,组合物和制剂的百分比可以方便地在单位重量的约5%至约80%之间变化。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下物质:粘合剂,如格拉坎特树胶、***胶、玉米淀粉或明胶;赋形剂如磷酸二钙;崩解剂,如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等;润滑剂,例如硬脂酸镁;和甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精,或调味剂如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式是胶囊时,除了上述类型的材料之外,它还可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如,片剂、丸剂或胶囊可以涂上虫胶、糖或两者兼有。糖浆或酏剂可含有该试剂,作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂如樱桃或橙色调味剂。当然,用于制备任何剂量单位形式的任何材料都应该是药学上纯的,并且在使用量上基本上无毒。此外,该药物组合物可被掺入缓释制剂和配方中。
因此,“药学上可接受的载体”旨在包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在本领域中,该介质和试剂在药物活性物质上的用途是众所周知的。除了任何常规介质或试剂与药物组合物不相容的情况之外,其在治疗组合物和治疗方法中的用途也在考虑之列。补充活性化合物也可以掺入到组合物中。
以剂量单位形式配制肠胃外组合物非常有利于给药的方便和剂量的均匀性。本发明所用的“剂量单位形式”是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位;计算含有预定量的药物组合物的每个单位,以产生与所需药物载体相关的所需治疗效果。本发明公开的剂量单位形式的规格与药物组合物的特性和想要达到的特定治疗效果有关。
为了方便和有效地给药,将有效量的主要药物组合物与合适的药学上可接受的载体以可接受的剂量单位复合。在组合物含有辅助活性成分的情况下,通过参考所述成分的常规剂量和给药方式确定剂量。
在一个特定的实施方案中,本发明公开的治疗剂/核酸纳米颗粒可以与本领域已知的抗癌剂联合施用以治疗患有癌症的受试者。本发明公开的治疗剂/核酸纳米颗粒可以与抗癌剂同时或依次给药,以治疗患有癌症的受试者。本发明公开的治疗剂/核酸纳米颗粒与抗癌剂的使用提供了多模式疗法,与单独使用抗癌剂或单独使用治疗剂/核酸纳米颗粒相比,该疗法能提供一种更有效的癌症治疗方法。可与本发明公开的治疗剂/核酸纳米颗粒一起使用的抗癌剂的实例包括但不限于烷化剂,例如塞替派和环磷酰胺;烷基磺酸盐,例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮杂环丙烷衍生物如苯佐替派、卡巴醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa);乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine),包括六甲密胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine);乙酰精宁(acetogenins)(例如,泡番荔枝辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(包括合成类似物拓扑替康);苔藓抑素;卡利他汀、CC-1065(包括阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物);隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉斯他丁;倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1);软珊瑚醇;水鬼蕉硷;匍枝珊瑚醇;海绵抑制素;氮芥类,如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、盐酸氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲怜胺、尿嘧啶氮芥;亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀;长春花生物碱类;表鬼臼毒素;抗生素如烯二炔类抗肿瘤抗生素(例如,卡奇霉素,特别是卡里奇霉素γ(calicheamicingammall)和卡里奇霉素ω(calicheamicinomegall);左旋天冬醋胺酸酶;蒽二酮取代的脲;甲基肼衍生物;达内霉素(dynemicin),包括达内霉素A;双膦酸盐类,如氯膦酸盐;一种埃斯培拉霉素(esperamicin)以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色蛋白二炔抗生物发色团(related chromoprotein enediyne antiobiotic chromophores))、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉霉素、洋红霉素嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯烷酮-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和抗代谢药)、表柔比星、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂毒素类如丝裂毒素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星;抗代谢剂如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物如去甲蝶呤(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲氧蝶呤;嘌呤类似物如氟达拉滨、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿嘧啶、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷;雄激素类,如二***、甲雄烷醇酮、环硫雄醇、美雄烷、睾丸内脂;抗肾上腺激素如安鲁米特、密妥坦、曲洛司坦;叶酸补充剂如氟芬那酸(frolinic acid);醋葡醛内酯;醛磷酰胺配醣;氨基戊酮酸;恩尿嘧啶;安吖啶;阿莫司汀;比山群;依达曲沙;地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺;地吖醌;鸟氨酸;醋酸羟吡咔唑;埃博霉素;乙环氧啶;硝酸镓;羟基脲;蘑菇多糖;氯尼达明;美登素类化合物如美登素和安丝菌素;米托胍腙;米托蒽醌;单哌潘生丁(mopidanmol);二胺硝吖啶;喷司他丁;蛋氨氮芥;吡柔比星;洛索葱醌;鬼臼酸;2-乙基吡嗪;甲基苄肼;多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.);丙亚胺;根瘤菌素;西佐喃;锗螺胺;交链孢菌酮酸;三亚胺醌、2,2’-三氯钛乙胺(2,2 2”-trichlorotiiethylamine);单端孢菌毒素(特别是T-2毒素、疵抱菌素A、杆抱菌素霉素A和蛇形菌素);尿烷;长春碱酰胺;达卡巴嗪;甘露糖胺;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;加西托星(gacytosine);***糖苷(“Ara-C”);环磷酰胺;塞替派;紫杉类药物如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、不含克烈弗罗(Cremophor)的白蛋白工程化紫杉醇纳米粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和(多西他赛)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;(吉西他滨);6-硫代鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲氨蝶呤;铂配位络合物如顺铂、奥沙利铂和卡铂;长春花碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱;(长春瑞滨);诺安托(novantrone);替尼泊苷;依达曲沙;道诺霉素(daunomycin);氨喋呤;希罗达;伊班膦酸盐;伊立替康(例如,CPT-11);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DFMO);类视黄醇类如视黄酸;卡培他滨;亚叶酸(LV);伊立替康(irenotecan);肾上腺皮质抑制剂;肾上腺皮质类固醇;孕激素;***;雄激素类;***释放激素类似物以及上述任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。抗癌剂还包括调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂,如抗***和选择性***受体调节剂(SERMs)包括,例如,他莫昔芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛西芬、4-羟基他莫昔芬、三氟昔芬、雷洛昔芬盐酸盐(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥诺前列素和法乐通-托瑞米芬,抑制调节肾上腺中***产生的芳香酶的芳香酶抑制剂,例如,4(5)-咪唑类、安鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、福美斯坦、法屈唑(fadrozole)、伏氯唑、来曲唑和阿纳托唑,和抗雄激素如氟硝丁酰胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林,以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物),反义寡核苷酸特别是那些抑制与畸变(abherant)细胞增殖有关的信号通路中基因表达的寡核苷酸,例如PKC-α、Ralf和H-Ras;核酶,如VEGF-A表达抑制剂(如血管酶核酶)和HER2表达抑制剂;疫苗,例如基因治疗疫苗,例如,疫苗、疫苗和疫苗,rJL-2、拓扑异构酶1抑制剂、rmRH;抗体如曲妥珠单抗;和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一个特定的实施方案中,本发明公开的治疗剂/核酸纳米颗粒与一种或多种抗癌剂组合使用,所述抗癌剂选自环磷酰胺、他莫昔芬、替加氟、紫杉醇、阿帕替尼、顺铂、多西他赛、5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、长春瑞滨、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨、伊沙匹隆、艾日布林、异环磷酰胺、利妥昔单抗、长春新碱、***、博来霉素和达卡巴嗪。
为了用于本发明所述的治疗或生物应用,本发明还描述了试剂盒和制品。这种试剂盒可以包括载体、包装或容器,其被分隔以容纳一个或多个容器,例如小瓶、管等,每个容器都包含了本发明所述方法中使用的分离元件之一。合适的容器包括,例如,瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料制成,例如玻璃或塑料。
例如,容器可以包含一种或多种本发明所述的治疗剂/核酸纳米颗粒,任选地与本发明所公开的另一种试剂(例如mRNA和/或ssRNA)组合或复合。可选地容器具有无菌接入端口(例如,容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。此类试剂盒任选地包含与其在本发明所述方法中的用途相关的鉴别描述或标签或说明书。
试剂盒通常包括一个或多个附加的容器,每个容器具有一个或多个的各种从商业和用户的角度来看期望使用的本发明所述化合物的材料(例如试剂,任选地以浓缩形式,和/或装置)。这种材料的非限制性实例包括但不限于缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器;列出内容物和/或使用说明的载体、包装、容器、小瓶和/或试管标签,以及带有使用说明的包装插页。通常还包括一组说明。
标签可以在容器上或与容器相关联。当形成标签的字母、数字或其它字符被附着、模制或蚀刻到容器本身中时,标签可以在容器上。当标签存在于也容纳容器的容器或载体内时,标签可以与容器相关联,例如作为包装插页。标签可用于指示内容物用于特定治疗应用。标签还可以指示内容物的使用说明,例如本发明所述的方法。这些其他治疗剂可以以例如医师案头参考(PDR)中所示的量使用,或由本领域普通技术人员以其他方式确定的量使用。
本公开进一步提供本发明所述的方法和组合物可进一步由以下方面(方面1至29)限定:
1.一种组合物,其包含与核酸片段复合形成纳米颗粒的一种或多种治疗化合物,其中所述一种或多种治疗化合物为能够与DNA或RNA缔合或结合的小分子。
2.如方面1所述的组合物,其中核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以2:1至10:1的重量/重量比复合。
3.如方面1或方面2所述的组合物,其中核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以4:1至7:1的重量/重量比复合。
4.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以约6:1的重量/重量比复合。
5.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中纳米颗粒的尺寸为20nm至200nm。
6.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中纳米颗粒的尺寸为50nm至100nm。
7.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中一种或多种治疗化合物包括蒽环类、蒽二酮类、喜树碱类化合物、鬼臼类化合物、小沟结合剂、博来霉素和/或放线菌素D。
8.根据前述方面中任一方面所述的组合物,其中一种或多种治疗化合物包括阿克拉霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星和/或佐柔比星。
9.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中所述一种或多种治疗化合物包含阿霉素。
10.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中一种或多种治疗化合物包括米托蒽醌、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、博来霉素、放线菌素D和/或倍癌霉素A。
11.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中核酸片段包含将所述纳米颗粒靶向特定细胞、组织、器官或肿瘤的配体。
12.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中核酸片段包括天然存在的DNA、RNA和/或DNA-RNA杂合体的片段。
13.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中核酸片段包括化学合成的不同核苷酸长度的DNA、RNA和/或DNA-RNA杂合体。
14.如前述方面中任一方面所述的组合物,所述RNA已被修饰为用-O-烷基或卤化物取代2’核糖羟基。
15.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中核酸片段是DNA片段。
16.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中所述DNA片段来自鲑鱼DNA。
17.如前述任一方面所述的组合物,其中核酸片段的长度为20nt至10,000nt。
18.如前述任一方面的组合物,其中核酸片段的长度为50nt至2,000nt。
19.前述方面中任一方面所述的组合物,其中组合物包含与长度为50nt至2,000nt的DNA片段复合的一种或多种治疗化合物的纳米颗粒。
20.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中一种或多种治疗化合物选自阿克拉霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星和/或佐柔比星。
21.如前述方面中任一方面所述的组合物,其中一种或多种治疗化合物是阿霉素。
22.一种药物组合物,其包含前述方面中任一方面所述的组合物和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
23.如方面22所述的药物组合物,其中药物组合物经配制用于肠胃外递送。
24.一种治疗患有需要其治疗的癌症的受试者的方法,包括:向受试者施用有效量的如方面22或方面23所述的药物组合物。
25.如方面24的方法,其中癌症选自急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肾癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、子宫肉瘤、威尔姆斯瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
26.一种治疗患有需要其治疗的癌症的人类受试者的方法,包括:向所述受试者施用有效量的如方面1至21中任一方面所述的组合物。
27.如方面26所述的方法,其中癌症选自急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肾癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、子宫肉瘤、威尔姆斯瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
28.如方面26或方面27所述的方法,其中方法还包括向所述受试者施用一种或多种选自血管生成抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PARP抑制剂、烷化剂、长春花生物碱、蒽环类、抗肿瘤抗生素、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、芳香酶抑制剂、mTor抑制剂、类视黄醇和HDAC抑制剂的抗癌剂。
29.如方面26至28中任一方面所述的方法,其中方法还包括向所述受试者施用一种或多种选自米托蒽醌、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、博来霉素、放线菌素D和倍癌霉素A的抗癌剂。
具体实施方式
以下实施例旨在说明而非限制本发明。虽然它们是可能使用的典型,但是本领域技术人员已知的其它方法也可以替代地使用。
材料。阿霉素(DOX)和溴化乙锭均购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)。脱氧核糖核酸(DNA)(50-2000个核苷酸片段,MW范围为16.88kDa-1350kDa)由PharmaResearch Products Ltd(Seong Nam,Korea)提供。3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)购自Millipore Sigma(Burlington,MA)。ULYSISTM Alexa FluorTM 488核酸标记试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。标签核酸标记试剂盒、购自Mirus Bio。EL4细胞(ATCC,Rockville,MD)在Dulbecco改良的Eagle’s培养基(DMEM)(MediaTech,Manassas,VA)中培养,含10%胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals,FloweryBranch,GA)和1%抗生素(100单位/mL青霉素;100μg/mL链霉素)(Gibco,Grand Island,NY)。所有材料均按购买时的原样使用。
DNA的DOX猝灭。为优化包封率,进行了猝灭研究。首先测量DNA:DOX比值在1-100之间的荧光光谱,然后测量DNA:DOX比值在1-10之间的荧光光谱。在490nm进行激发,在590nm进行发射。使用氙激光和Synergy H1混合多模式读取器(Biotek Instruments,Winooski,VT)读取荧光。
DOX/DNA纳米粒子的制备。简而言之,将以6:1w/w的比例将DNA加入到DOX中。为自我组装分配了时间。最后,向混合物中加入磷酸盐缓冲液(PBS),再分配30分钟使络合物的离子稳定。
将等体积的DNA移液至等体积的DOX中,上下混匀。反应物和反应保持在70℃。然后,静置15分钟,以允许自组装。然后,将等体积的2X PBS移液至反应容器中,并上下吹打混匀。静置30分钟后,使用DOX/DNA纳米颗粒进行进一步实验。对于25mL以下的小体积,使用96孔板。对于超过25mL的大体积,使用圆底烧瓶,并通过在多板式搅拌器(IKA Works,Inc.,Wilmington,NC)上以500RPM旋转的磁性搅拌棒诱导混合。在本实施例中,使用玻璃移液管将DNA逐滴添加到DOX中。为了验证纳米颗粒的形成,使用透射电子显微镜(TEM)拍摄了DOX/DNA图像。
DOX/DNA和DNA的透射电子成像。将等体积的DNA移液至等体积的DOX中,并上下混匀。反应物和反应保持在70℃。然后,静置15分钟,以允许自组装。然后,将等体积的2X PBS移液至反应容器中,并上下混匀。在使用DOX/DNA纳米颗粒进行进一步实验之前,提供了30分钟的静置时间。对于25mL以下的小体积,使用96孔板。对于超过25mL的大体积,使用圆底烧瓶,并通过在多板式搅拌器(IKA Works,Inc.,Wilmington,NC)上以500RPM旋转的磁性搅拌棒诱导混合。在本实施例中,使用玻璃移液管将DNA逐滴添加到DOX中。为了验证纳米颗粒的形成,使用透射电子显微镜(TEM)拍摄了DOX/DNA图像。
将DOX/DNA溶液(10μL)滴在涂有碳的网格上(Thermo Fisher Scientific),并在室温下干燥过夜。用JEOL 2800透射电子显微镜(JEOL,Peabody,MA)在200kV下观察纳米粒子的形态和大小。
在10%胎牛血清/PBS中DNA降解。使用在含1μg/mL溴化乙锭的1X Tris醋酸盐EDTA(TAE)中的1%(w/v)琼脂糖凝胶来描述DNA在10%FBS/PBS中48小时的降解情况。将DNA与含血清的PBS在37℃孵育一段时间。将样本储存在-20℃下,以停止每个时间点的核酸酶解。DNA浓度=100μg/mL。凝胶在100V下运行40分钟,DNA在紫外线透照器(Fotodyne,Heartland,WI)上成像。
结合动力学。通过观察基于DOX浓度的DOX/DNA荧光,测量了DOX与DNA的结合动力学。当DOX增加时,测量DOX/DNA的荧光。DNA在400μg/mL浓度下保持不变。使用多模式读取器测量荧光。在PBS、含血清的PBS或FBS中研究了DOX与DOX/DNA的结合动力学。
EL4细胞毒性。将EL4细胞(ATCC,Rockville,MD)在96孔板中以每孔10k个细胞铺板。用浓度范围为0.001μg/mL至10μg/mL的DOX或DOX等同物处理平板细胞三次,持续24、48或72小时,然后通过MTT法进行细胞存活率分析。细胞在37℃、5%CO2和100%湿度下培养。在571nm处读取吸光度。
内吞抑制。在暴露于抑制剂NaN3(120mM)、PS2(12μg/mL)、Filipin III(5μg/mL)、CPZ(20μM)、EIPA(20μg/mL)或4℃后,使用流式细胞术或荧光光谱法测定DOX或DOX/DNA处理的EL4的DOX摄取量。简言之,在用DOX或DOX/DNA处理细胞1小时之前,先用抑制剂对细胞进行15分钟的预处理。用流式细胞仪以黄色荧光计数含DOX或DOX/DNA的细胞,用荧光光谱法计数含DOX/DNA的细胞。使用easyCyteTM流式细胞仪(Millipore Sigma,Burlington,MA)或多模式读取器(Biotek Instruments,Winooski,VT)测量荧光。
共焦成像。首先将EL4细胞以每毫升200k细胞置于35mm Ibidiμ-Dish(Ibidi USAInc.,Fitchburg,WI)平板上。然后,对细胞核进行染色并培养15分钟。在用DOX/DNA-Cy5处理3小时之前,旋转细胞并用DPBS洗涤。最后在置于DMEM之前,在500×g下旋转细胞,并用DPBS洗涤,并使用徕卡TCS SP8共焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems,BuffaloGrove,IL)对细胞进行活体成像。
体内研究。所有动物研究均采用IACUC批准的程序进行。通过向6-12周龄雌性C57BL/6/027小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA,USA)的右后侧皮下注射1E6 EL4细胞(存在于约100μL PBS中)建立了EL4肿瘤。一旦肿瘤为2mm可见并可测量,通过尾静脉注射对小鼠进行给药。使用数字测径器测量肿瘤大小,并使用以下公式计算肿瘤体积:V=W2L/2,其中V为肿瘤体积,W为肿瘤宽度,L为肿瘤长度。小鼠自由采食和饮水。
药代动力学。在接受20mg/kg DOX或20mg/kg DOX等量的DOX/DNA静脉注射的EL4荷瘤的C57BL/6小鼠(雌性,6-8周龄)中进行了药代动力学研究,n=3。在每个时间点从小鼠的隐静脉收集血液样品,在血清收集管中离心,使用多模式阅读器在酸化的乙醇中分析所得上清液的DOX荧光。
血液毒性和肝酶组。本研究中使用的小鼠为6-12周龄雌性C57BL/6/027小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA,USA)。小鼠采用尾静脉注射给药。24小时后,测定全血细胞计数(CBC)和肝酶水平。通过隐静脉采集CBC血液,与EDTA混合,并使用血液学分析仪分析白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hgb)、血小板(Plt)和血细胞比容(HCT)。对于肝酶组,从血液中分离血清并送至IDEXX Laboratories,Inc.(Westbrook,ME)进行碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素分析。
结合动力学。通过观察基于DOX浓度的DOX/DNA荧光,测量了DOX与DNA的结合动力学。当[DOX]增加时,测量DOX/DNA的荧光。[DNA]维持在400μg/mL的恒定水平。使用多模式读取器测量荧光。在PBS、含血清的PBS或FBS中研究了DOX与DOX/DNA的结合动力学。
生物分布。20mg/kg DOX或DOX/DNA(20mg/kg DOX当量)静脉注射给药EL4荷瘤C57BL/6小鼠(雌性,6-8周龄)后1、3、6和12小时测量器官和肿瘤中的DOX积累,n=5。简言之,采集器官和肿瘤,在离心前,进行低温冷冻,并在酸化乙醇中匀浆。使用多模式读取器分析所得上清液的DOX荧光。
急性毒性。在C57BL/6小鼠(雌性,6-8周)中,在注射后24小时观察到急性毒性,剂量为10至40mg/kg DOX或DOX当量,n=7。
肿瘤生长和存活。在使用一定剂量范围的DOX、DOX/DNA或DOXIL进行静脉注射给药30天后,定期跟踪EL4荷瘤小鼠的肿瘤生长和存活情况(6-12周龄雌性小鼠),n=5。最初的肿瘤攻击由小鼠右后侧皮下注射1E6 EL4细胞组成。当可测量到2mm的肿瘤生长时,通过尾静脉给药。当肿瘤超过15mm、出现肿瘤病变或体重降至初始体重的75%以下时,对小鼠实施安乐死。
重复给药肿瘤生长和存活。在最初第0天20mg/kg剂量的DOX、DOX/DNA或DOXIL静脉注射处理22天后,跟踪EL4荷瘤小鼠(6周,雌性)的肿瘤生长、重量和存活率。随后,在第7和第14天,进行20mg/kg剂量的DOX、DOX/DNA或DOXIL给药处理,n=5。最初的肿瘤攻击由小鼠右后侧皮下注射1E6 EL4细胞组成。当可测量到2mm的肿瘤生长时,通过尾静脉给药。当肿瘤超过15mm、出现肿瘤病变或体重降至初始体重的75%以下时,对小鼠实施安乐死。
DOX/DNA复合物的物理特性。DOX对DNA的负载能力和效率:使用DNA进行了DOX猝灭研究,以评估DOX/DNA纳米颗粒的负载能力和包封效率(见图1)。测定DOX/DNA的负载量和包封率分别为~14%和~88%。首先测量1-100之间的DNA:DOX比值的荧光光谱(图1,上图),然后使用490nm激发测量1-10之间的DNA:DOX比值的荧光光谱(图1,下图)。由此确定最有利的DNA比DOX的重量比为6:1。
DOX/DNA复合物的尺寸表征。透射电子显微镜用于评估DOX/DNA的大小和形态。如前所述制备DOX/DNA纳米颗粒,然后在水(见图2)或PBS(见图3)中稀释至1μg/mL(DOX当量)的浓度。将溶液再静置30分钟,然后滴在碳网格上进行TEM成像。DOX/DNA的透射电镜显示纳米颗粒大小约为70nm。这些表征研究表明,颗粒可携带化疗剂如DOX,并且尺寸表征特别证明了这些颗粒到达癌细胞的能力。
DOX/DNA纳米粒子的长期储存潜力。简言之,在PBS中制备DOX/DNA,用H2O稀释,冻干过夜,然后用H2O法重建,随后成像。最终[DNA]=6μg/mL,最终[DOX]=1μg/mL。DOX/DNA的稳定性在很大程度上不受冻干过程的影响(见图4-6)。
DNA在水和PBS中的稳定性。DNA在PBS中制备,在H2O中稀释,然后成像。最终[DNA]=6μg/mL。DNA在水或PBS中基本保持稳定(见图7-8)。
在10%胎牛血清/PBS中的DNA降解。为了测定DNA对血清暴露的稳定性,将DNA(100μg/mL)与含血清的PBS在37℃下孵育0至48h。将样本储存在-20℃下,以停止各时间点核酸酶解。DNA以时间依赖的方式被血清降解(见图9)。含血清培养基中的核酸酶可能有助于DNA的降解。可以推断,由于在10%胎牛血清(FBS)中DNA随时间的降解,导致了DOX的延迟释放。
DOX/DNA复合物在体外24小时、48小时和72小时的细胞毒性。进行了一项研究,观察DOX/DNA在24小时(左曲线)、48小时(中曲线)和72小时(右曲线)对EL4细胞中的体外细胞毒性。使用一系列浓度对EL4细胞进行三次处理,分别持续24、48和72小时,然后通过MTT法进行细胞存活率分析。培养24h时,DOX/DNA对这些细胞的细胞毒性比DOX小约3.5倍,如报告的IC50值所示:DOX/DNA IC50=1.143μg/mL或2.1μM,DOX IC50=0.313μg/mL或0.576μM(见图10)。与DOX相比,DOX/DNA在培养48和72小时对这些细胞表现出相似的细胞毒性,如报告的IC50值所示:48h时,DOX/DNA IC50=0.072μg/mL,DOX IC50=0.093μg/mL,或48h时,DOX/DNAIC50=0.055μg/mL,DOX IC50=0.048μg/mL。该结果与24小时细胞毒性数据相结合,表明DOX从DOX/DNA中的释放延迟。此外,结果表明,与游离小分子对应物相比,纳米颗粒表现出较小的毒性。
DOX/DNA在体内的药代动力学。对接受20mg/kg DOX或20mg/kg DOX当量DOX/DNA静脉注射治疗的EL4荷瘤C57BL/6小鼠进行的药代动力学研究的结果(见图11)。这些小鼠是6-8周龄的雌性小鼠。发现与用DOX(DOX:T1/2=3min)处理的小鼠相比,DOX/DNA在EL4荷瘤C57BL/6小鼠中具有更长的血液循环停留半衰期(DOX/DNA:T1/2=75min),n=3。DOX在~15分钟内被组织吸收(如曲线的初始陡峭斜率所示),然后观察到更像肝和肾清除率的轮廓。然而,DOX/DNA显示出持续1小时的低得多的组织吸收曲线。从上述结果可以推断,DNA增强了DOX的循环和DOX保护/屏蔽。之后,观察到指示肝和肾清除率的特征。因此,本公开的药物递送***改变了阿霉素的溶解和吸收,可能允许活性剂的持续释放。
DOX/DNA体外解离动力学。通过观察基于DOX浓度的DOX/DNA荧光,测量了DOX与DNA的结合动力学。当[DOX]增加时,测量DOX/DNA的荧光。[DNA]维持在400μg/mL的恒定水平。使用多模式读取器测量中的荧光。在PBS、含血清的PBS或FBS中研究了DOX与DOX/DNA的结合动力学。DOX/DNA的DOX解离随着血清含量的增加和时间的增加而增加(见图12-13)。该数据与DNA降解分析的数据相符。在PBS、10%FBS、25%FBS、50%FBS和FBS中,DOX从DOX/DNA解离的Kd值分别计算为76.8nM、152.7nM、317.7nM、565.1nM和1329.7nM。该实验清楚地表明,FBS会使DOX从DNA中释放出来。
DOX从DOX/DNA释放的研究。DOX从DOX/DNA的累积释放在100%PBS、10%FBS/PBS、25%FBS/PBS、50%FBS/PBS或100%FBS中进行72小时。当使用FBS时,发现DOX/DNA的DOX释放量最高(见图14)。与结合动力学实验得到的数据结合表明,随着时间的推移,DOX会从DOX/DNA中释放出来,这取决于培养基中的血清含量。至少根据这个模型,大部分DOX应该在72小时内从纳米粒子中释放出来。
DOX/DNA和DOX的全血细胞计数和肝酶组。在接受20mg/kg DOX、20mg/kg DOX当量的DOX/DNA、PBS或120mg/kg DNA给药的C57BL/6小鼠中进行了全血细胞计数和肝酶分析,n=3。本研究中使用的小鼠为6-12周龄雌性C57BL/6/027小鼠(Charles RiverLaboratories,Wilmington,MA,USA)。小鼠采用尾静脉注射给药。24小时p.i.后,测量全血细胞计数(CBC)和肝酶水平。通过大隐静脉采集血液,与EDTA混合,并使用血液分析仪分析白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hgb)、血小板(Plt)和血细胞比容(HCT)。对于肝酶学组,从血液中分离出24h p.i.血清,并将其送至IDEXX Laboratories,Inc.(Westbrook,ME)进行碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素分析。与DOX/DNA和DOXIL相比,DOX对循环血细胞和肝酶的影响更大。基于这些组,DOX/DNA对血液成分和肝酶的调节作用显著不同于单独使用DOX(见图15)。
DOX/DNA和DOX在体内的生物分布。在对EL4荷瘤的C57BL/6小鼠(雌性,6-8周龄)进行20mg/kg DOX、DOXIL(20mg/kg DOX当量)或DOX/DNA(20mg/kg DOX当量)静脉注射给药后1、3、6和12小时,器官和肿瘤组织中具有DOX积累的特征。DOX/DNA组的肺中DOX积累量较低,n=5(DOXIL 12h除外,其中n=3)(见图16-18)。在用DOX/DNA处理的小鼠中发现DOX的肿瘤累积量最大。因此,DOX/DNA改善了药物向肿瘤部位的递送。此外,DOX/DNA的器官毒性较小,尤其是在肺和脾中。肝脏和肾脏清除的DOX水平较高也突显了这一点。DOX/DNA等较大颗粒允许巨噬细胞摄取并从肺中清除,因此当以DOX/DNA形式给药时,DOX的肺毒性较小。
C57BL/6小鼠的急性毒性存活曲线。在20mg/kg或以下剂量方案中未观察到急性毒性,n=7。DOX处理的小鼠由于给药剂量为40mg/kg而出现急性毒性(心脏骤停)(见图19)。因此,DOX/DNA比DOX更安全。DOX/DNA比DOX有更大的治疗窗口。关于DOXIL,与DOXIL相比,DOX/DNA的组装过程更为简便,生产效率也更高。
在EL4-癌模型中,DOX、DOX/DNA和DOXIL处理对肿瘤生长和生存率的影响。为了验证这种给药***的安全性和有效性,在用一定剂量范围的DOX或DOX/DNA(2-3月龄的雌性小鼠)静脉内处理后,定期跟踪EL4荷瘤的小鼠的肿瘤生长和存活30天。在EL4荷瘤的C57BL/6小鼠(n=5)中,DOX/DNA减缓肿瘤生长并提高存活率,优于单独DOX处理(见图20)。当使用纳米载体制剂时,20mg/kg剂量表现出延长的生存期和减慢的肿瘤生长。有趣的是,在接受40mg/kg DOX/DNA处理的小鼠中,直到第28天,观察到肿瘤完全消退。此外,这些小鼠中有60%存活至实验终点。DOX/DNA处理导致EL4荷瘤的C57BL/6小鼠(n=5)在高剂量处理中体重减轻(见图21)。这些结果有效地证明了DNA增加DOX最大耐受剂量的能力,此外还证明了其对全身毒性的保护作用。此外,单独DNA处理与PBS处理相似,这突出了药物递送载体在该鼠实体瘤模型中的安全性。
内吞抑制以及对DOX/DNA和DOX摄取的影响。针对DOX/DNA评估了抑制剂CPZ(20μM)、Filipin III(5μM)、EIPA(20μM)及其各种组合或4℃对EL4细胞摄取的影响(见图22)。氯丙嗪(Chlorpromazine,CPZ)是一种网格蛋白依赖性途径抑制剂。而Filipin III是一种小窝蛋白依赖性途径抑制剂。EIPA是一种巨噬细胞增多途径抑制剂。使用每种抑制剂的剂量-反应分析法确定了试验所选的浓度。发现细胞通过网格蛋白依赖和小窝蛋白依赖途径吸收DOX/DNA。膜融合也参与其中,如DOX/DNA摄取的4℃抑制所示。
使用抑制剂检测EL4细胞的DOX摄取量。NaN3(120mM)、PS2(12μg/mL)、Filipin III(5μg/mL)、EIPA(20μM)和4℃。使用流式细胞术测量摄取量。简而言之,在用DOX处理1小时之前,用抑制剂对细胞进行15分钟的预充。使用黄色荧光,用流式细胞仪计数含有DOX的细胞。与DOX/DNA相反,抑制研究表明DOX摄取主要是通过膜融合进行的(见图23)。
用DOX/DNA处理的EL4细胞的共焦成像显示了EL4细胞中处理的定位。CLSM图像显示,随着时间的推移,EL4细胞摄取了DOX/DNA(见图24)。CLSM图像也表明了纳米粒子的内在化,而不仅仅是DOX。
使用弱碱滴定DOX、DNA和DOX/DNA。在初始体积为1mL的水中制备DOX、DNA或DOX/DNA。DOX当量为600μg/mL。然后用1M HCl将pH值降至2以下,然后用少量体积(100μL或20μL)0.1M NaOH将pH值调至更高。DOX、DNA和DOX/DNA均表现出相似的滴定曲线(见图25)。
这里已经描述了许多实施方案。然而,应当理解,在不脱离本发明公开的精神和范围的情况下,可以进行各种修改。因此,其他实施方案在权利要求的范围内。
Claims (29)
1.一种组合物,其包含与核酸片段复合形成纳米颗粒的一种或多种治疗化合物,其特征在于,所述一种或多种治疗化合物为能够与DNA或RNA缔合或结合的小分子。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以2:1至10:1的重量/重量比复合。
3.如权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以4:1至7:1的重量/重量比复合。
4.如权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段与所述一种或多种治疗化合物以约6:1的重量/重量比复合。
5.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述纳米颗粒的尺寸为20nm至200nm。
6.如权利要求5所述的组合物,其特征在于,所述纳米颗粒的尺寸为50nm至100nm。
7.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种治疗化合物包括蒽环类、蒽二酮类、喜树碱类化合物、鬼臼类化合物、小沟结合剂、博来霉素和/或放线菌素D。
8.如权利要求7所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种治疗化合物包括阿克拉霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星和/或佐柔比星。
9.如权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种治疗化合物包括阿霉素。
10.如权利要求7所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种治疗化合物包括米托蒽醌、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、博来霉素、放线菌素D和/或倍癌霉素A。
11.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种的核酸片段包含将所述纳米颗粒靶向特定细胞、组织、器官或肿瘤的配体。
12.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段包括天然存在的DNA、RNA和/或DNA-RNA杂合体的片段。
13.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段包括化学合成的不同核苷酸长度的DNA、RNA和/或DNA-RNA杂合体。
14.如权利要求13所述的组合物,其特征在于,所述RNA已被修饰为用-O-烷基或卤化物取代2’核糖羟基。
15.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段为DNA片段。
16.如权利要求15所述的组合物,其特征在于,所述DNA片段来自鲑鱼DNA。
17.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段的长度为20nt至10,000nt。
18.如权利要求17所述的组合物,其特征在于,所述核酸片段的长度为50nt至2,000nt。
19.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物包含与长度为50nt至2,000nt的DNA片段复合的一种或多种治疗化合物的纳米颗粒。
20.如权利要求19所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种治疗化合物选自阿克拉霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星和/或佐柔比星。
21.如权利要求20所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种治疗化合物为阿霉素。
22.一种药物组合物,其包含权利要求1~21任一项所述的组合物和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
23.如权利要求22所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物经配制用于肠胃外递送。
24.一种治疗患有需要治疗的癌症的受试者的方法,包括:向所述受试者施用有效量的如权利要求22所述的药物组合物。
25.如权利要求24所述的方法,其特征在于,所述癌症选自急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肾癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、子宫肉瘤、威尔姆斯瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
26.一种治疗患有需要治疗的癌症的人类受试者的方法,包括:向所述受试者施用有效量的如权利要求1~21任一项所述的组合物。
27.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述癌症选自急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肾癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、子宫肉瘤、威尔姆斯瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
28.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种选自血管生成抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PARP抑制剂、烷化剂、长春花生物碱、蒽环类、抗肿瘤抗生素、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、芳香酶抑制剂、mTor抑制剂、类视黄醇和HDAC抑制剂的抗癌剂。
29.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种选自米托蒽醌、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、博来霉素、放线菌素D和倍癌霉素A的抗癌剂。
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