CN114716540A - 一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用，所述单抗是针对CPV的特异性抗体，其与CDV、RV、CAV和CCV均不发生交叉反应。经鉴定，所述单克隆抗体的轻链CDR1‑3分别如SEQ ID NO.1‑3所示和重链CDR1‑3分别如SEQ ID NO.4‑6所示。本发明还提供了基于犬细小病毒单克隆抗体的荧光抗体，本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象，所制备的荧光抗体具有特异性，该荧光抗体的最适工作浓度确定为1:120。直接荧光检测法在荧光显微镜下可见病变细胞呈现明显黄绿色荧光，易于分辨；而正常细胞没有荧光出现。

Description

一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及犬细小病毒检测技术领域，更具体地，涉及一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用。
背景技术
犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)是细小病毒科细小病毒属成员，单链小DNA病毒，在1977年首先在美国被发现的，1978年首次从患有肠炎的病犬体内分离获得该病毒，随后在世界各地的犬科动物中相继被发现。病犬以剧烈呕吐、腹泻、白细胞显著减少和病死率较高为主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎。本病发病率和死亡率为均很高，对养犬业、经济动物养殖业危害很大，也威胁到了野生动物的生存。
犬细小病毒病的诊断包括临床诊断和实验室诊断，临床诊断首先根据发病迅速，传染性强，往往呈局部暴发性等流行病学调查结果，再结合临床表现症状如呕吐、脱水、腹泻等肠炎综合征，并且排出的稀粪恶臭带血，最后结合病理剖检结果可怀疑是CPV感染。但本病与犬冠状病毒病、轮状病毒病、细菌性肠炎等病临床症状相近似，只有实验室作病原诊断才能确诊。
近年来国内外有关犬细小病毒病实验室诊断技术包括常用的CPV抗原的检测方法有动物感染试验、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、病毒分离(VI)、电镜(EM)与免疫电镜(ME)、免疫色谱法(IC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、免疫荧光试验(FA)、核酸探针检测等。但是这些方法存在特异性差、灵敏度低、耗时长、操作繁琐等不足之处，不便于实现现场检疫。
因此，开发一种新的检测方法，快速、敏感、特异、准确地检测犬细小病毒对该疾病预防和治疗具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用。本研究以纯化的犬细小病毒单克隆抗体制备荧光抗体，对该荧光抗体的检测效果进行鉴定。并用该荧光抗体建立了CPV抗原的直接免疫荧光检测方法。
具体而言，本发明首先是分离纯化了一种犬细小病毒单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链CDR1-3分别如SEQ DI NO.1-3所示，所述单克隆抗体的重链CDR分别如SEQ DINO.4-6所示。
优选地，本发明还提供了一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，采用荧光基团标记所述犬细小病毒单克隆抗体，其中所述犬细小病毒单克隆抗体的轻链CDR1-3分别如SEQ DI NO.1-3所示，所述单克隆抗体的重链CDR分别如SEQ DI NO.4-6所示。
优选地，本发明提供的所述荧光标记为FITC标记。
优选地，本发明提供的所述荧光抗体的最适工作浓度确定为1:120。
进一步地，本发明还提供了一种非诊断目的的犬细小病毒抗原的直接免疫荧光检测方法，该方法包括采用所述荧光标记的单克隆抗体接触待检样本，并在荧光显微镜下观察结果。
进一步地，本发明还提供了上述单克隆抗体在制备检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
进一步地，本发明还提供了所述荧光标记的单克隆抗体在制备直接免疫荧光检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
进一步地，本发明还提供了一种犬细小病毒试剂盒，其特征在于，其包括上述的单克隆抗体。
进一步地，本发明还提供了一种直接免疫荧光检测犬细小病毒试剂盒，其包括上述任一项荧光标记的单克隆抗体。
本发明的优点如下：本发明提供的犬细小病毒单克隆抗体是针对CPV的特异性抗体，其与CDV、RV、CAV和CCV均不发生交叉反应。经鉴定，所述单克隆抗体的轻链CDR1-3分别如SEQ ID NO.1-3所示和重链CDR1-3分别如SEQ ID NO.4-6所示。本发明提供的基于犬细小病毒单克隆抗体的荧光抗体，本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象，所制备的荧光抗体具有特异性，该荧光抗体的最适工作浓度确定为1:120。直接荧光检测法在荧光显微镜下可见病变细胞呈现明显黄绿色荧光，易于分辨；而正常细胞没有荧光出现。
附图说明
图1为单抗的间接免疫荧光图；
图2为120倍稀释的单抗与CPV感染的F81细胞免疫荧光图；
图3为120倍稀释的单抗与未感染的F81细胞免疫荧光图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1犬细胞病毒单克隆抗体
1.1杂交瘤细胞系制备
动物的免疫选取4只6周龄雌性BALB/c小鼠，用纯化的犬细小病毒对其进行免疫注射。首免用200μL的犬细小病毒与等量的弗氏完全佐剂混合做成乳化抗原后，对小鼠进行皮下免疫注射，400μL/只；于首免后第14d进行第二次免疫注射，换成弗氏不完全佐剂与等量病毒混合，充分乳化后，皮下免疫注射小鼠，剂量同首免；二免后第14d进行第三次免疫注射，方法与与剂量同二免。三免后第10d对小鼠断尾采血，用间接ELISA方法监测血清抗体效价。当抗体水平达到要求后，于三免第14d后，选择效价最高的免疫小鼠，用纯的抗原液尾静脉加强免疫，3d后无菌采取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。
在融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞并扩大培养。融合时将正处于对数***期SP2/0骨髓瘤细胞回收，1000r/min离心5min，用1640不完全培养液悬浮，重复洗2次，最后用10mL 1640不完全培养液重新悬浮细胞并计数。
取加强免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10mL不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围***。将脾脏移入另一盛有10mL不完全培养基的平皿中，用5mL的注射器吸取培养液反复吹打脾，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基，制成脾细胞悬液。用移液器将悬液移入小试管中。直立小试管3min，使大块的***下沉，把细胞悬液移入离心管中。用1640不完全培养液洗涤细胞两次(1000rpm，5min)，10mL 1640不完全培养液重新悬浮细胞并计数。
将已制备好的SP2/0骨髓瘤细胞及脾细胞混合于灭菌的50mL圆筒离心管内，两种细胞之比为1:10，1200rpm离心8min，去上清，轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。将离心管倾斜，1min内加入40℃预热的50％PEG(分子量4000)边加边轻微摇动。40℃水浴作用1min后迅速700rpm离心3min。加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔1min分别加入1ml、1ml、1ml、1ml、10ml。1000rpm离心5min，同样的方法再洗涤一次，以彻底去除PEG。弃上清，沉淀细胞用HAT培养液重悬。将上述细胞加入前日铺有饲养细胞的96孔板中，100μL/孔，将培养板放置37℃5％的CO2培养箱中培养。融合后第3、6、9日换入含HAT的完全1640培养液。换液方法为每孔吸去100μL培养液上清，然后加入100μL新鲜的HAT培养液，注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出。于第10、12日换液时改用含有HT的完全1640培养液。仔细观察细胞的生长情况，凡有污染的孔立即滴加1％的NaOH，以免污染扩散。温度及CO2浓度的改变会影响到融合细胞的生长，所以细胞融合后的1～2d内不宜把培养板从培养箱内拿出长时间的观察。每次换液前首次换液前用倒置显微镜观察细胞的生长、死亡状况。在融合后的第3d，可见瘤细胞基本破碎消失，在巨噬细胞周围聚集着大量的细胞碎片，少数细胞浑圆透亮，呈葡萄状，形成集落，形似骨髓瘤细胞。集落间细胞数目不等，而且细胞数增长很快。一般1个孔里有一个细胞集落，但也有的孔里有两个以上的细胞集落。融合细胞集落生长速度很快，生长快的，6～7d就能布满培养孔的面积1/5～1/2，此时可取上清进行抗体检测。一般在10d左右检测，两周以上未长出融合细胞的细胞孔应放弃。
1.2杂交瘤细胞系筛选
用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞(长至孔底的1/2以上)分泌抗体的情况，以筛选出阳性细胞株。具体方法为取杂交瘤细胞培养上清100μL加入前日包被好的酶标板孔中，同时设立阳性、阴性对照和空白对照。判定标准为OD490值阳性孔与对照孔比值≥2.1判定为阳性。阴性孔3d后再检测一次，如仍为阴性则弃之。
1.3单克隆抗体免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定
取杂交瘤细胞株培养上清，采用IsoStrip Mouse MonoclonalAntibodyIsotyping试剂盒(Roche公司)测定抗体重链、轻链类型。
1.4单克隆抗体的特性鉴定
A.单抗效价的测定
用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价。提纯的犬细小病毒作为包被抗原，将冻存的腹水溶解后以1:10开始倍比稀释，同时以同等稀释度的注射SP2/0细胞的小鼠腹水作为阴性对照。以平行稀释的单抗OD490值/对照OD490≥2.1的最高稀释倍数为单抗的效价。
B.间接免疫荧光试验
将ELISA试验检测阳性的单抗，进行间接免疫荧光实验，IFA操作步骤如下：
(1)将F81细胞加入96孔细胞培养板内，同步接种CPV细胞毒，同时设未感染病毒的正常F81细胞作为阴性对照，放入37℃细胞培养箱内进行培养。
(2)细胞病变达30％左右时，甩去板内上清，PBST洗液洗涤3次，每孔加入100μL-20℃预冷80％的丙酮液，-20℃冰箱内(在此环境下可保存半年内)过夜固定，抑或常温固定半小时。
(3)固定后甩去板内丙酮，PBST洗液洗涤3次，200μL/孔，每次3min。
(4)分别滴加1:1000稀释的腹水单抗或单抗上清100μL，置于温箱，37℃温育60min。
(5)以PBST同上洗涤。
(6)每孔加入100μL FITC标记的羊抗鼠二抗(以PBS稀释到工作浓度，并加入0.01％的伊文思蓝)，同(4)温育。
(7)弃去荧光二抗之后，同上洗涤。于倒置荧光显微镜下观察。
(8)结果判定：出现特异的亮绿色荧光者为阳性，反之判为阴性。
C.与其他病毒的交叉反应
用间接ELISA方法测定单克隆抗体与犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病毒(RV)、犬腺病毒(CAV)和犬冠状病毒(CCV)的交叉反应。用CDV、RV、CAV和CCV作为包被抗原，分别与所述单抗作用，设立CPV阳性对照和阴性腹水对照。
表1所述单抗与CDV、RV、CAV和CCV的ELISA反应
单抗 CPV CDV RV CAV CCV 阴性对照
MAb8 1.336 0.060 0.061 0.065 0.060 0.065
D.非竞争性ELISA测定CPV单克隆抗体的相对亲和力
包被抗原为纯化CPV-VLPs，按1、0.5、0.25、0.125μg/ml包被酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜；加入配制好的BSA，每孔150μl，37℃封闭2h；PBST洗涤后，按确定的单抗浓度，将单抗从80ng/ml开始进行倍比稀释，以抗体浓度的对数值为横坐标，以其对应的OD450值为纵坐标，在一个坐标系中做出4条S形曲线。找出S曲线的顶部，设定为ODmax。在曲线中分别找出4条曲线各自50％ODmax对应的抗体浓度。按4个浓度两两一组，根据公式(1-1)计算单抗的亲和常数。
结果显示：三免后两只小鼠的血清效价在105以上，达到融合要求。选取血清效价最高的小鼠加强免疫并进行融合。杂交瘤细胞长至一个视野(100×)的1/2以上时开始检测ELISA效价，挑选效价高的细胞进行亚克隆，三次亚克隆后获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为MAb8。采用间接ELISA测定了单抗的细胞上清、腹水效价，结果显示MAb8杂交瘤细胞株的细胞上清抗体效价>105，腹水效价>107。间接荧光实验验证，结果见图1，图A是CPV感染F81细胞的IFA染色结果，可见感染CPV的F81细胞的特异性绿色荧光；图B是阴性对照F81细胞IFA染色图，未见绿色特异性荧光。IFA结果表明所述单抗是针对CPV的特异性抗体。间接ELISA方法测定所述单抗与CDV、RV、CAV和CCV均不发生交叉反应，结果见表1。证明此所述单抗对犬细小病毒具有良好的特异性。经鉴定，鼠源CPV基因工程抗体亚型为IgGa2b/kappa。经鉴定，所述单克隆抗体的轻链CDR1-3分别如SEQ ID NO.1-3所示和重链CDR1-3分别如SEQ ID NO.4-6所示。
实施例2单克隆抗体荧光学检测方法
2.1荧光抗体的制备
取一定量的纯IgG液，对0.5mol/L pH9.0～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，按荧光素与蛋白质质量比1︰20称取适量FITC，加入二甲亚砜(DMSO)，使终浓度为1mg FITC/1mLDMSO；将IgG液置于电磁搅拌器上，轻轻搅拌，以不起沫为准。按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入IgG液中，磁力搅拌器4℃避光搅拌12h；加完后，随时用试纸测定搅拌液的pH值，若低于9.0，则应以碳酸钠溶液调整。置4℃搅拌12h即可。用Sephadex G25柱过滤标记的荧光抗体，以去除游离荧光素。
2.2荧光抗体的鉴定
F/P比值的测定
用紫外分光光度计测定标记抗体在280nm、495nm波长下的OD值，根据公式F/P＝(2.87×OD495)/(OD280-0.35×OD495)计算出荧光色素与球蛋白的结合率，评定标记抗体的质量。
2.3特异性鉴定
交叉试验：在一块96孔板上用犬细小病毒(CPV)、狂犬病病毒(RV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCV)分别接种F81细胞、Vero细胞和MDCK细胞做直接免疫荧光试验(dFA)。
吸收试验：以过量CPV抗原加入荧光抗体中，感作2h后，4℃过夜，3000r/min离心30min，取上清液染CPV阳性标本，镜检。
阻断试验：将不同稀释倍数的CPV高免血清和PBS分别滴加在CPV细胞培养片上，37℃作用1h，经充分洗涤后，再用已制备的CPV荧光抗体染色，镜检观察结果。
2.4抗体工作浓度的确定
将荧光抗体自1:30～1:960倍比稀释，分别用各稀释度对CPV感染细胞和阴性对照F81细胞做染色。以能清晰显示特异荧光(+++)、且无非特异染色的最高稀释度为该荧光抗体的工作浓度。实际应用时，可取低1个或2个稀释度，如染色效价为1:64，实际应用时可取1:32或1:16。
2.5荧光抗体的初步应用
在96孔微量培养板中加入10倍系列稀释CPV，每个稀释度的病毒样品分别做8个孔，其中4个重复孔用于直接免疫荧光检测，4个孔按照传统的观察细胞病变作对比实验。并设一排培养液作细胞对照用，同步接种F81细胞。放入37℃细胞培养箱内培养。连续观察72h，计算CPV TCID50。甩去板内培养液，PBST洗液洗涤3次，200μL/孔，每次3min。每孔加入100μL-20℃预冷80％的丙酮液，-20℃冰箱内过夜固定过夜。弃丙酮，同上洗涤。加入抗犬细小病毒荧光抗体(以PBS稀释至工作浓度，并加入0.01％的伊文思蓝)，100μL/孔，37℃孵育60min，PBST洗涤3次。最后用三蒸水洗1min，于荧光显微镜下观察结果。计算样品的TCID50。
结果显示：用紫外分光光度计测定荧光抗体在280nm波长下的光密度值为0.913，在495nm波长下的光密度值为0.529。根据公式计算出荧光抗体的F/P值为2.086。表明本试验标记的荧光抗体没有过度标记的现象。交叉试验：将犬细小病毒(CPV)、狂犬病病毒(RV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCV)接种相应的细胞60h后，经荧光染色，阳性样品CPV染色结果呈阳性，阴性样品染色结果呈阴性。吸收试验：以过量的CPV加入荧光抗体中，感作2h，4℃过夜，离心取上清再对CPV标本染色，结果无荧光出现。阻断试验：用不同稀释度的抗CPV高免血清及PBS对荧光抗体和CPV抗原作阻断试验。结果显示：原液，以及1:5、1:10倍稀释的抗CPV高免血清均能完全阻断荧光抗体与CPV抗原相互作用，样本片上无特异性荧光出现；1:20倍稀释的血清有部分阻断作用；而1:40倍稀释的抗CPV高免血清和PBS完全没有阻断荧光抗体与CPV抗原相互作用，即样本片上有特异性荧光出现。以上结果表明所制备的荧光抗体具有特异性。
取荧光抗体用PBS做一系列稀释，分别对CPV感染细胞和F81细胞做对照染色。当对荧光抗体做1:60稀释时，阴性对照细胞出现少量的非特异性荧光；为保证荧光抗体的特异性荧光亮度，并且消除与正常细胞的非特异性反应，将荧光抗体的最是工作浓度确定为1:120。具体检测结果见表2.1。
表2 CPV荧光抗体最适工作浓度的测定
Figure BDA0003602601020000101
用犬细小病毒同步接种F81细胞，感染72h。用自制的抗CPV荧光抗体对CPV进行TCID50测定，并同传统的观察细胞病变测定CPV TCID50相比较。结果见图2和3，结果显示直接荧光检测法在荧光显微镜下可见病变细胞呈现明显黄绿色荧光，易于分辨；而正常细胞没有荧光出现。计算结果表明，本发明所建立的直接免疫荧光方法要比传统的直接观察细胞病变测定CPV TCID50要高1～2个滴度。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003602601020000121
Figure BDA0003602601020000131
Figure BDA0003602601020000141
序列表
<110> 哈尔滨元亨生物药业有限公司
<120> 一种犬细小病毒单克隆抗体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Lys Ala Ser Gln Arg Val Asp Tyr Asp Gly Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Ala Ala Ser Asp Leu Glu Ser
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Gln Gln Ser Asn Tyr Asp Pro Trp
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Asp Tyr Ile Met Val
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Asn Ile Asn Pro Tyr His Gly Arg Thr Ala Tyr Asn Leu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Arg Lys Gly Tyr Val Glu Gly Gly Gly Leu Asp Tyr
1 5 10

Claims (9)

1.一种犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链CDR1-3分别如SEQID NO.1-3所示，所述单克隆抗体的重链CDR分别如SEQ ID NO.4-6所示。
2.一种荧光标记的犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，采用荧光基团标记权利要求1所述的犬细小病毒单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述荧光标记为FITC标记。
4.根据权利要求2-3任一项所述的犬细小病毒单克隆抗体，其特征在于，所述荧光抗体的最适工作浓度确定为 1:120。
5.一种非诊断目的的犬细小病毒抗原的直接免疫荧光检测方法，其特征在于，所述方法中采用权利要求2-4任一项所述的单克隆抗体接触待检样本，并在荧光显微镜下观察结果。
6.权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体在制备检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
7.权利要求2-4任一项所述的单克隆抗体在制备直接免疫荧光检测犬细小病毒试剂盒中的应用。
8.一种犬细小病毒试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体。
9.一种直接免疫荧光检测犬细小病毒试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2-4任一项所述的单克隆抗体。
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