CN114712345B

CN114712345B - 四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN114712345B
Application number: CN202210386813.3A
Authority: CN
Inventors: 徐静; 周董董; 冯婷; 韦成文
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-04-14
Filing date: 2022-04-14
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-04-14
Also published as: CN114712345A

Abstract

本发明提供四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述四氢呫吨酮二聚体类化合物的结构式如(1)所示：R＝H或Ac。本发明在红树林内生真菌Phomopsis asparagi DHS‑48里添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠，从大米培养发酵物中分离得到2种四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrol A(DD‑38)和dicerandrol C(DD‑9)，对其结构通过应用质谱、核磁共振波谱、紫外光谱等技术进行表征。实验证明该化合物具有显著的抗肿瘤活性，可用于制备靶向Wnt/β‑catenin信号通路的抗肝癌和抗***药物。

Description

四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物领域，特别涉及四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是仅次于心脑血管疾病的人类健康的第二大杀手，在中国的一二线城市癌症死亡数在所有死因中排名第一，现有的治疗方法普遍对患者本身产生较大的副作用和预后效果不好的情况。Wnt/β-catenin信号通路在细胞凋亡的调控上发挥重要作用，能够特异性抑制Wnt信号通路、激活肿瘤细胞凋亡的天然小分子化合物的发现对药物靶向递送抗肿瘤药物的研发具有重大意义。

发明内容

鉴于此，本发明提出四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述四氢呫吨酮二聚体类化合物的结构式如(1)所示：

R＝H或Ac。

进一步，所述化合物在制备抗肝癌和\或抗***药物中的应用。更进一步，所述化合物在制备靶向Wnt/β.catenin信号通路的抗肝癌和\或抗***药物中的应用。

进一步，所述化合物由真菌Phomopsis asparagi DHS-48产生，该真菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2021318，保藏日2021年3月31。

进一步，所述化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)选取大红树内生真菌Phomopsis asparagi为目标菌株，在50μM丁酸钠条件下进行发酵，用PDA培养基在无菌条件下接种菌，在恒温28℃下培养14d；

(2)将步骤(1)通过真菌Phomopsis asparagi发酵获得的菌丝体浸入乙酸乙酯3次，每次72小时，将提取物浓缩并合并，获得总提取物；

(3)将步骤(2)总提取物与100-200目正向硅胶粉研磨混合，硅胶粉质量和提取物的质量比为1.5∶1，并以体积比为100∶0-0∶100的二氯甲烷：甲醇作为洗脱液，进行梯度洗脱，共得到A1-A6共6个组分；将组分A3经硅胶柱色谱层析梯度洗脱，洗脱试剂为体积比12∶1～ 3∶1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.1-A3.12共12个组分；将组分A3.2经硅胶柱色谱层析等度洗脱，洗脱试剂为体积比4∶1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.2.1-A3.2.7共7个组分；将组分A3.2.3经硅胶柱色谱层析等度洗脱，洗脱试剂为体积比2∶1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.2.3.1-A3.2.3.7共7个组分，减压浓缩，干燥后得到化合物DD-9，即得四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrol C；将组分A3.7经硅胶柱色谱层析等度洗脱，洗脱试剂为体积比3∶1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.7.1-A3.7.5共5个组分；将组分A3.7.3经SephadexLH-20柱分离，洗脱试剂为体积比1∶1的氯仿和甲醇，共得到A3.7.3.1-A3.7.3.16共16个组分，减压浓缩，干燥后得到化合物DD-38，即得四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrol A。

更进一步，步骤(3)中，所述二氯甲烷和甲醇的具体洗脱梯度为体积比100∶0、100∶2、 100∶4、100∶6、100∶8、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、0∶100。所述体积比12∶1～3∶1的石油醚和乙酸乙酯，该洗脱试剂的具体洗脱梯度为体积比12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供两种四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，包括抗肝癌和抗***药物。本发明在红树林内生真菌Phomopsis asparagi DHS-48里添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠，从大米培养发酵物中分离得到2种四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrolA(DD-38)和dicerandrol C(DD-9)，对其结构通过应用质谱、核磁共振波谱、紫外光谱等技术进行表征。实验证明该化合物具有显著的抗肿瘤活性，可用于制备靶向Wnt/β-catenin信号通路的抗肝癌和抗***药物。

附图说明

图1经不同浓度DD-9处理后细胞存活率；

图2 DD-9处理24h和48h后细胞的IC50值；

图3 DD-9抑制Hela和HepG2细胞的迁移；

图4 DD-9抑制Hela和HepG2细胞的侵袭；

图5 DD-9抑制Hela和HepG2细胞的克隆形成能力；

图6 DD-9促进Hela细胞凋亡；

图7 DD-9促进HepG2细胞凋亡；

图8 DD-9抑制Wnt信号通路的激活水平；

图9 DD-9在Hela细胞中抑制Wnt信号通路成员的蛋白水平；

图10 DD-9在HepG2细胞中抑制Wnt信号通路成员的蛋白水平；

图11 DD-9抑制Hela细胞中β-catenin的表达水平；

图12 DD-9抑制HepG2细胞中β-catenin的表达水平；

图13 DD-9降低Hela细胞中Wnt信号通路相关基因的mRNA水平；

图14 DD-9降低HepG2细胞中Wnt信号通路相关基因的mRNA水平；

图15经不同浓度DD-38处理后细胞存活率；

图16不同浓度下DD-38处理后克隆形成结果；

图17 DD-38抑制HepG2细胞的迁移；

图18 DD-38促进细胞凋亡；

图19β-catenin在HepG2的胞质胞核蛋白中的表达降低；*β-Actin为细胞质蛋白提取物的内参蛋白， #Histone为细胞核蛋白提取物的内参蛋白。

图20 DD-38和DD-9的化学结构式；

图21 DD-38的¹H-NMR图谱；

图22 DD-38的¹³C-NMR图谱；

图23 DD-38的HR-ESI-MS图谱；

图24 DD-9的¹H-NMR图谱；

图25 DD-9的¹³C-NMR图谱；

图26 DD-9的HR-ESI-MS图谱。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、研究方法

1.1菌株来源

内生真菌Phomopsis asparagi从采自于海南省红树林大红树拟茎点霉属。通过对菌株形态特征的观察以及用分子生物学方法(ITS-rDNA序列比对)，最终鉴定该菌株为Phomopsis sp.现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(PDA培养基，-20℃保存)。选取大红树内生真菌Phomopsis asparagi为目标菌株。菌株名称：Phomopsis asparagi DHS-48，该真菌保藏于中国典型培养物保藏中心，该保藏中心地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2021318，保藏日2021年3月31。

1.2表观遗传修饰剂及发酵

在50μM丁酸钠条件下进行大规模发酵，用配好的PDA培养基在无菌条件下接种菌，在恒温28℃下培养14d。

1.3目标菌株的提取

将通过真菌Phomopsis asparagi发酵获得的菌丝体浸入乙酸乙酯(浸没)3次，每次72小时，将提取物浓缩并合并，称重以获得20g总提取物。

1.4代谢产物的分离与纯化

将提取物与100-200目正向硅胶粉充分研磨混合(硅胶粉质量∶提取物质量＝1.5∶1)，并以二氯甲烷∶甲醇(V∶V 100∶0-0∶100)作为洗脱液，具体地，以二氯甲烷∶甲醇(V∶V)＝100∶0、100∶2、100∶4、100∶6、 100∶8、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、0∶100进行梯度洗脱硅胶柱，薄层色谱(TLC)点板检测后，合并类似组分，共得到A1-A6共6个组分。化合物DD-9，DD-38均从组分A3分离得到。组分A3经硅胶柱色谱层析梯度洗脱(石油醚∶乙酸乙酯12∶1～3∶1)，具体地，该梯度洗脱中石油醚∶乙酸乙酯(V∶V)＝12∶1、 11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1，通过TLC点板检测后合并类似组分，得到A3.1-A3.12 共12个组分。组分A3.2为120mg棕黄色粉末经硅胶柱色谱层析等度洗脱(石油醚∶乙酸乙酯4∶1)，通过 TLC点板检测，合并类似组分，得到A3.2.1-A3.2.7共7个组分。组分A3.2.3为棕黄色粉末(80mg)。组分A3.2.3经硅胶柱色谱层析等度洗脱(石油醚∶乙酸乙酯2∶1)，通过TLC点板检测，合并类似组分，得到A3.2.3.1-A3.2.3.7共7个组分，减压浓缩，干燥后得到50mg化合物DD-9。组分A3.7也为60mg棕黄色粉末，经硅胶柱色谱层析等度洗脱(石油醚∶乙酸乙酯3∶1)，通过TLC点板检测，合并类似组分，得到 A3.7.1-A3.7.5共5个组分。组分A3.7.3为淡黄色粉末(30mg)。组分A3.7.3经SephadexLH-20柱分离，氯仿∶甲醇1∶1洗脱，共得到A3.7.3.1-A3.7.3.16共16个组分，通过TLC点板合并，减压浓缩，干燥后得到20mg化合物DD-38。

1.5代谢产物的结构表征

DD-38(dicerandrol A)

黄色无定型粉末(甲醇)；[α]²⁰ _D-90(c 0.0001，MeOH)；UV(MeOH)λ_max 211，212，213nm；阴离子 HR-ESI-MS m/z 665.1881[M-H]-(calcd for C₃₄H₃₃O₁₄)，因此该化合物的分子式为C₃₄H₃₄O₁₄。¹H NMR(400 MHz，CDCl₃)δ_H 13.98(2H，s，8-OH，8′-OH)，11.89(2H，s，1-OH，1′-OH)，7.35(2H，d，J＝8.5Hz，H-3，H-3′)， 6.48(2H，d，J＝8.5Hz，H-4，H-4′)，5.72(2H，s，H-5，H-5′)，4.10(2H，d，J＝13.1Hz，Ha-12，Ha-12′)，3.53(2H，d， J＝13.1Hz，Hb-12，Hb-12′)，2.42(2H，m，H-6，H-6′)，2.35-2.48(4H，m，H-7，H-7′)，2.08(6H，s，H₃-14，H₃-14′)，1.06(6H，d，J＝5.6，H₃-11，H₃-11′)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ_C 187.7(C-9，C-9′)，177.9(C-8，C-8′)，170.8(C-13， C-13′)，159.4(C-1，C-1′)，157.1(C-4a，C-4a′)，140.0(C-3，C-3′)，117.8(C-2，C-2′)，107.9(C-4，C-4′)，106.4(C-9a， C-9a′)，100.4(C-8a，C-8a′)，82.5(C-10a，C-10a′)，70.4(C-5，C-5′)，65.5(C-12，C-12′)，33.3(C-7，C-7′)，27.9(C-6， C-6′)，20.9(C-14，C-14′)，17.5(C-11，C-11′)。经波谱数据分析及与文献数据比较^[1]，鉴定化合物DD-38为 dicerandrol A，结构如图20所示。

DD-9(dicerandrol C)

黄色无定型粉末(甲醇)；[α]²⁰ _D-90(c 0.0001，MeOH)；UV(MeOH)λ_max 205，206，207nm；阴离子 HR-ESI-MS m/z 749.2073[M-H]-(calcd for C₃₈H₃₇O₁₆)，因此该化合物的分子式为C₃₈H₃₈O₁₆。¹H NMR(400 MHz，CDCl₃)δ_H14.04(2H，s，8-OH，8′-OH)，11.80(2H，s，1-OH，1′-OH)，7.39(2H，d，J＝8.5Hz，H-3，H-3′)，6.46(2H，d，J＝8.5Hz，H-4，H-4′)，5.56(2H，s，H-5，H-5′)，4.49(2H，d，J＝12.8Hz，Ha-12，Ha-12′)，4.18(2H，d， J＝13.1Hz，Hb-12，Hb-12′)，2.40-2.49(4H，m，H₂-7，H₂-7′)，2.40(2H，m，H-6，H-6′)，2.09(12H，s，H₃-14，H₃-14′， H₃-16，H₃-16′)，1.06(6H，d，J＝5.9，H₃-11，H₃-11′)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ_C 187.8(C-9，C-9′)，177.7(C-8， C-8′)，170.4(C-13，C-13′)，170.4(C-15，C-15′)，159.3(C-1，C-1′)，157.4(C-4a，C-4a′)，140.2(C-3，C-3′)，117.8(C-2， C-2′)，108.1(C-4，C-4′)，106.3(C-9a，C-9a′)，100.4(C-8a，C-8a′)，80.5(C-10a，C-10a′)，70.4(C-5，C-5′)，65.3(C-12， C-12′)，33.4(C-7，C-7′)，27.7(C-6，C-6′)，20.8(C-14，C-14′)，20.7(C-16，C-16′)，17.6(C-11，C-11′)。经波谱数据分析及与文献数据比较^[1]，鉴定化合物DD-9为dicerandrol C，结构如图20所示。

[1]Wagenaar，M.M.，＆Clardy，J..(2001).Dicerandrols，new antibiotic andcytotoxic dimers produced by the fungus phomopsis l ongicolla isolated froman endangered mint.Journal of Natural Products，64(8)，1006-1009.

DD-38的¹H-NMR图谱如图21所示。

DD-38的¹³C-NMR图谱如图22所示。

DD-38的HR-ESI-MS图谱如图23所示。

DD-9的¹H-NMR图谱如图24所示。

DD-9的¹³C-NMR图谱如图25所示。

DD-9的HR-ESI-MS图谱如图26所示。

经过对所分离的2个化合物的抗肿瘤活性进行的评估，实验结果表明DD-9(dicerandrol C) 抑制人肝癌细胞HepG2和人***细胞Hela的活力、增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，促进凋亡。DD-38(dicerandrol A)抑制人肝癌细胞HepG2的活力、增殖、克隆形成和迁移能力，促进凋亡。通过对DD-9抗肿瘤作用的机制机理探究发现DD-9调控HepG2和Hela细胞的生物学行为可能通过促进降解复合物稳定降解游离β-catenin从而抑制经典Wnt/β-catnein 信号通路及靶基因表达来实现的，为开发新型的高效低毒的抗肿瘤制剂提供了可能。

1、DD-9在体外抑制Hela和HepG2细胞的活力和增殖

细胞系：HepG2、Hela细胞

实验试剂：MEM培养基(博士德)、胎牛血清(四季青)、MTT(Sigma)、细胞专用DMSO(Boster)和PBS(博士德)等。

实验步骤：

(1)配制待测样品

化合物样品用无血清培养基配制并用于筛选。针对初筛中对肿瘤细胞的抑制率超过50％的样品，配制浓度梯度来进行半数抑制浓度IC50值的测定。采用无血清培养基配制不同浓度待测化合物。

(2)样品测定

HepG2和Hela细胞接种于96孔细胞培养板，过夜贴壁后弃上清液并加入不同浓度化合物且每个浓度三个复孔，置于培养箱中分别培养24h和48h。培养时间达到后，每孔加入100μL 新鲜培养基和MTT工作液20μL，然后用锡箔纸包被并置于细胞培养箱中孵育4小时。孵育完成后弃上清，加入DMSO孵育30分钟后在570nm测得吸光度值，计算抑制率。

实验结果：

表1

实验分析：用DD-9(0、0.1、0.5、1、3、5、10μg/mL)处理Hela和HepG2细胞24h和48h后，与空白对照组的细胞存活比较结果如图1所示，DD-9明显抑制Hela和HepG2细胞活力和增殖，并呈现出明显的时间和浓度依赖性。在药物处理48h与24h相比，处理时间越长，高浓度DD-9对细胞增殖抑制更明显。DD-9对Hela细胞的半数抑制浓度(IC50)在24h和 48h分别为(23.4260±6.9791)μM、(5.1776±0.5595)μM；对HepG2细胞的半数抑制浓度在24h和48h分别为(13.9904±1.1366)μM、(4.1656±0.4958)μM(图2)。*P≤0.05，**P≤0.01。

2.DD-9抑制Hela和HepG2癌细胞迁移与侵袭

细胞系：HepG2、Hela细胞

实验试剂：MEM培养基(博士德)、胎牛血清(四季青)、Transwell小室(Corning)、Matrigel基质胶(BD)、结晶紫染色液(Solarbio)、细胞专用DMSO(Boster)和PBS(博士德)等。

实验步骤：

(1)将HepG2和Hela细胞消化离心富集于15mL离心管中，然后用无血清培养基重悬铺被于6孔细胞培养板。细胞贴壁后取灭菌后的200μL枪头在板底部沿直线划出均匀的划痕，并用新鲜培养基清洗周围的细胞碎片，同时在孔板上标记划痕位置。然后加入对应浓度的 DD-9在恒温培养箱中培养，之后用显微镜以培养0、12、24和48h为时间节点进行拍照观察。

(2)Transwell小室在进行细胞铺被前，需要将待铺被的HepG2和Hela细胞以不加胎牛血清的培养基培养饥饿处理15小时。然后用胰蛋白酶(含EDTA)将细胞消化离心富集于离心管并吹打成单细胞悬液。经细胞计数后，制备成细胞悬液并取120μL细胞悬液铺被于Transwell上室，下室加入含20％胎牛血清的培养基。细胞铺被好后，在上室加入化合物并继续培养24小时。培养完成后，用镊子将Transwell小室的上室取出并置于4％PFA中固定25分钟。固定完成后先用棉签清除小室内壁未迁移细胞，然后采用0.1％结晶紫染色液染色细胞并用PBS清洗多余的染色液。所有工作完毕后，用显微镜观察并拍照。然后用150μL无水乙醇溶解每个小室上的结晶紫，并在570nm处测量吸光度值进行定量分析。

不同于迁移，检测侵袭前需要在上室内铺被20μL稀释的Matrigel(基质胶)并置于37℃培养箱，培养4小时后聚合成凝胶。其他步骤相同。

实验结果分析：划痕实验(图3A)和Transwell实验(图3B)结果均表明：与空白对照组相比，DD-9抑制Hela和HepG2细胞的迁移。并且划痕实验中，通过观察划痕的愈合程度可以明显观察到DD-9呈时间依赖性抑制Hela和HepG2细胞的迁移能力(图3A)。迁移检测完毕后，用1∶8稀释后的基质胶铺满Transwell小室底部，然后培养4小时后聚合成凝胶。之后铺被细胞于凝胶上层，检测通过Transwell上室的细胞数来进一步评价DD-9对细胞的侵袭能力的影响。结果提示，与空白对照组比较，经DD-9处理后的实验组穿越Transwell的细胞数明显降低。因此，DD-9可以显著降低两种细胞的侵袭能力(图4)。

3.DD-9抑制癌细胞克隆形成能力

实验试剂：MEM培养基(博士德)、胎牛血清(四季青)、细胞专用DMSO(Boster)、结晶紫染色液(Solarbio)和4％多聚甲醛(博士德)等。

实验步骤：

将HepG2和Hela细胞用胰酶(含EDTA)消化并离心收集，以每皿3×10⁴个细胞铺于100mm细胞培养皿中，并加入完全培养基至7mL使细胞分散均匀。隔日细胞贴壁之后，吸弃旧培养基每皿加入5mL不同浓度化合物培养。在此后培养期间每隔2天更换完全培养基， 14天后取出细胞培养皿吸弃旧培养基并用4％多聚甲醛固定25min，固定完成后再用0.1％结晶紫染色20min，然后用PBS洗去多余的染色液并置于显微镜下取10个随机视野计数克隆数量。

实验结果分析：如图5所示两种癌细胞经不同浓度的DD-9(0、2、4、8μM)处理后的结果提示：与空白对照组相比较，DD-9可以显著降低Hela和HepG2细胞的克隆形成能力，并呈现浓度依赖性的降低。进一步说明DD-9对Hela和HepG2的成细胞团能力和增殖有较强的抑制效果。

4.DD-9促进Hela和HepG2癌细胞凋亡

实验试剂：MEM培养基(博士德)、胎牛血清(四季青)、Annexin V-FITC/PIApopptosis Detection Kit(诺唯赞)、胰蛋白酶(Gibco)等。

实验步骤：

用胰蛋白酶(含EDTA)把HepG2和Hela细胞富集于15mL离心管经离心收集并计数。在24孔细胞培养板中以每孔2×10⁵个细胞铺被，贴壁后加入不同浓度化合物处理24小时。然后用胰蛋白酶(不含EDTA)消化富集，以600g离心收集细胞。收集的细胞弃上清液后加入结合缓冲液并重悬成单细胞。在进行上机检测前每个待测样品在避光条件下加入5μAnnexin V-Fluorescein Isothiocyanate(Annexin V-FITC)和5μL Propidium Iodide(PI)，并在室温避光条件下孵育15分钟。孵育完成后，用Guava easy Cyte5微毛细管细胞分析仪进行检测。

实验结果分析：经DD-9处理后的结果显示，Hela细胞早期凋亡与晚期凋亡之和分别为 4.76±1.50％、40.47±3.49％、42.37±5.52％和44.87±6.09％(图6)；HepG2细胞早期凋亡与晚期凋亡之和分别为10.96±1.63％、15.61±3.80％、28.72±8.19％和54.00±8.85％(图7)。与空白组比较发现经DD-9处理后的癌细胞凋亡率明显提高并呈现浓度依赖性促进凋亡。

5.DD-9抑制Wnt/β-catenin通路的激活水平

实验试剂：MEM培养基(博士德)、胎牛血清(四季青)、SuperTOPFlash/FOPFlash、pRL-TK 质粒、Dual-Lumi^TM II双荧光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天)、胰蛋白酶(Gibco)等。

实验步骤：

(1)SuperTOPFlash、SuperFOPFlash和pRL-TK质粒转染

在六孔细胞培养板中每孔铺被5×10⁵HEK293T细胞，培养24h后换液。取两个无菌的离心管、其中一管加入5μL Lipo293^TM转染试剂、125μL无血清培养基，另一管250ngSuperTOPFlash，共转染2.5μg内参质粒pRL-TK、125μL无血清培养基，用移液枪轻柔吹打混匀，并避免使用振荡仪。然后将含有质粒的培养液加入含转染试剂的离心管中，在室温下静置15min。重复上述操作制备SuperFOPFlash质粒混合液。静置完成后每孔加入250μL上述混合液体放入恒温培养箱进行转染，培养24h后加入不同浓度的化合物处理24h，用于后续实验。

(2)双萤光素酶报告基因实验

取转染后并经化合物处理后的HEK293T细胞，每孔加入500μL报告基因裂解液裂解3min。充***解后用无菌无酶的细胞刮刀将HEK293T细胞收集至无菌1.5mL离心管中，置于高速离心机15000g离心5min，吸取上清液。然后取无菌96孔酶标板，将上清液按药物浓度和空白对照，依次加入至96孔酶标板中，每个样本3个复孔。同时从-20℃冰箱取出萤光素酶检测试剂至室温下溶解，并准备1个15mL离心管，按照1∶100加入海参萤光素酶检测底物(100×)配制成工作液。所有试剂准备完成后，将样品以及试剂装入有冰块的保温盒内。随后用微孔板发光检测仪检测，使用时严格遵守仪器使用方法，设置测定间隔为2s，测定时间为10s。样品开始检测前仪器先进行清洗，然后将两个荧光素酶溶液充满整个上样管道，每个荧光素酶上样量为100μL，测得的数值用于后续结果分析。

实验结果分析：以SuperTOP/FOPFlash比值，来评定DD-9对Wnt信号通路的激活水平的影响。结果表明，DD-9呈浓度梯度抑制Wnt/β-catenin信号通路激活水平(图8)。

6.DD-9抑制Hela和HepG2细胞中Wnt/β-catenin信号通路

实验试剂：MEM培养基(博士德)、胎牛血清(四季青)、彩色预染中分子蛋白质分子量标准(10-180KDa)、特超敏ECL化学发底物、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、PMSF、PVDF 膜(0.45μm)(博士德)、Axin1、β-catenin、p-GSK3β、GSK3β、Cyclin D1、c-Myc antibody、Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(Cell Signaling Technology)、β-actinantibody(华安生物)等

实验步骤：

(1)蛋白的制备

用胰蛋白酶(含EDTA)消化细胞经离心收集后用培养基重悬细胞并计数，然后用完全培养基调整细胞密度为5×10⁶/mL后重悬细胞接种于100mm细胞培养皿中。细胞贴壁后用PBS清洗三遍，然后加入不同浓度的化合物处理48h。培养完毕后弃旧培养基，用无菌无酶的细胞刮刀和移液枪收集细胞于离心管并用PBS重悬细胞，然后细胞计数取5×10⁶个细胞于15mL离心管中离心弃上清后加入0.5ml预冷的RIPA裂解液(含PMSF)吹打混匀后置于冰上孵育30min。孵育完成后10000g离心10min，所得的上清液为细胞全蛋白提取物。

(2)蛋白浓度测定

将蛋白标准品(2mg/mL)稀释为特定浓度梯度并加入96孔板中，在检测孔中加入待测样品每个样品三个复孔，之后加入配置好的工作液。加入工作液后，振荡30s充分混匀，置培养箱中孵育30min。孵育完成后，复温30分钟用570m波长检测吸光度值，在Excel中根据蛋白标准品计算蛋白浓度。

(3)蛋白定量

计算好蛋白浓度后，用RIPA裂解液和上样缓冲液(Loading buffer 1∶5使用)调整所有蛋白样品至统一浓度，然后放入沸水中15min进行蛋白变性。变性完成后复温至室温，可直接上样开始Western blot实验。

(4)制备分离胶与浓缩胶

取无菌无酶的离心管，并按表2选取适宜凝胶浓度：

表2凝胶浓度选择表

按表3配方配制分离胶和浓缩胶：

表3电泳凝胶配方

a)向胶板中加入新配的分离胶后要及时加超纯水液封；

b)当分离胶凝固后倾倒多余的超纯水，并用滤纸吸干槽内剩余的水；

c)加入新配的浓缩胶并插上孔梳，凝固过程中不断加入新胶防止出现空隙；

d)约15min后浓缩胶凝固转移至电泳仪中。

(5)电泳

将制备好的凝胶放入电泳槽中并沿竖直方向轻柔拔离梳子防止破坏泳道。加样过程中，先用移液枪加Marker 5μL，待测蛋白样品每个泳道定量加入待测样品。所有样品上样完毕后，装好电泳装置，浓缩胶部分电泳的电源参数为：U＝80V，I＝120mA，P＝50W，T＝15min。当溴酚蓝标记的蛋白电泳至分离胶上方边缘时改变电源参数为：U＝120V，I＝150mA，P＝50W， T＝50min。当蛋白电泳至胶板底部时，关闭电泳，将凝胶裁剪后转移至转膜液中。

(5)转膜

在进行转膜操作前，裁剪所需尺寸的PVDF膜，放置于无水甲醇中激活PVDF膜。之后将玻璃板从电泳槽中取出，根据Marker裁去不需要的凝胶。然后按负极到正极顺序依次放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜和海绵。放置过程中，转膜液要浸没海绵并且严禁在凝胶与PVDF之间出现气泡，所有操作完成后用转膜夹夹住转移至转膜槽中。槽中要加满转膜液与降温冰盒，按照正负极连接电源，设置参数为：U＝220V，I＝250mA，P＝50W，T＝90min。

(6)封闭及抗体孵育

实验步骤如下：

a)封闭：将购买的10xTBST缓冲液，稀释成1×TBST工作液，常温保存。然后将转膜完成的PVDF膜用装有5％脱脂奶粉的孵育盒浸没孵育1小时，孵育过程中要将孵育盒放入摇床中慢摇孵育。

b)一抗孵育：孵育完成后清洗三遍，每次10分钟。清洗完毕后，将一抗按1：1000比例用5％脱脂奶粉稀释至10mL然后加入孵育盒并置于摇床上4℃环境下慢摇过夜孵育。

c)二抗孵育：一抗孵育完成后，复温1小时并回收一抗并置于4℃保存。然后用TBST清洗3次，每次10分钟。清洗完毕后，用脱脂奶粉按1∶3000比例稀释对应的二抗，即取 3.3μL二抗加入至10mL 5％脱脂奶粉溶液中。在室温慢摇条件下孵育1小时。

(8)凝胶成像

在室温下，将二抗孵育完成后清洗3次，每次10分钟。加入新的TBST溶液浸没PVDF膜，同时准备一个干净的显影盒，将ECL化学发光底物按A液B液等体积混合配制成工作液然后将PVDF浸没其中显影1分钟。显影完成后转移至凝胶成像仪，设置曝光时间并拍照保存所有照片，用ImageJ软件进行后续的灰度分析。

(9)免疫荧光检测

用胰蛋白酶(含EDTA)消化细胞经离心收集后用5mL培养基重悬细胞并计数调整密度为5×10⁴/mL，然后取400μL悬液加入到共聚焦培养皿中要使细胞均匀的铺被在共聚焦皿底部的玻片上，过夜培养贴壁。

第二天吸弃培养基将细胞用PBS清洗3遍，每次需用手放在桌面沿十字方向晃动清洗5 分钟。随后，加入4％PFA进行固定细胞20分钟。固定完成后加入500μL PBS清洗3遍。然后用PBS根据铺被的样品数来稀释10％Triton X-100至0.5％Triton X-100。每个共聚焦培养皿加入500μL 0.5％Triton X-100通透15分钟，然后用500μL PBS清洗3次。清洗完成后采用 PBS溶解的5％BSA进行封闭1小时，封闭完成后直接加入200μL一抗(稀释比例为1∶100)并用封口膜包裹共聚焦皿，防止皿内液体蒸发使抗体覆盖不了细胞，包裹好后置于4℃冰箱过夜孵育12小时。

次日，取出孵育完成的共聚焦培养皿置于室温中复温30分钟，然后用500μL PBS清洗3次。清洗完毕后，在黑暗条件下用荧光二抗(稀释比例1∶150)孵育1小时，孵育完成后用PBS 清洗3次，清洗的过程中也要避光防止荧光猝灭。随后加入400μL DAPI溶液进行细胞核染色，染色完成后用PBS清洗3次。清洗完成后转移至避光盒中移至共聚焦显微镜进行观察拍照。

实验结果分析：DD-9上调了Hela和HepG2细胞中Wnt/β-catenin信号通路上游蛋白GSK3β的表达水平而Axin1的表达水平几乎不变，并且磷酸化p-GSK3β的表达水平降低。这提示，在经DD-9处理后，细胞内的存在大量未磷酸化的GSK3β，可能促进其并与APC和 Axin1等蛋白形成降解复合物募集细胞质中的β-catenin，然后β-catenin被CK1和GSK3β磷酸化，从而导致其进入泛素化和蛋白酶体的降解途径。在进一步检测β-catenin的表达水平发现，DD-9处理后也下调β-catenin表达水平。同时DD-9也抑制Hela和HepG2细胞中信号通路的下游靶基因cyclin D1和c-Myc的表达水平并呈现出浓度依赖性。在浓度达到4μM时，抑制蛋白表达效果较为明显。这些结果提示，DD-9可能通过上调GSK3β的表达促进降解复合物的形成从而稳定细胞质中β-catenin的含量，导致其不向细胞核内转移与TCF/LEF形成转录复合物导致靶基因如c-Myc和cyclin D1等的表达抑制从而影响细胞的生物学行为。

图11-12的免疫荧光结果呈现出与Western blot的结果一致，进一步证实DD-9可以下调 Hela和HepG2细胞中β-catenin的表达。

7.DD-9抑制Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达

实验试剂：MEM培养基(博士德)、胎牛血清(四季青)、正反引物(天一辉远)、FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit、 III All-in-one RTSuperMix Perfect for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞)等。

实验步骤：

(1)细胞总RNA提取

将HepG2和Hela细胞用胰蛋白酶消化离心富集于15mL离心管中，用无血清培养基重悬细胞并计数。在6孔细胞培养板中按每孔2×10⁶个细胞铺被。细胞贴壁后，吸弃旧培养基并用PBS清洗三次，然后加入0、2、4、8μM的化合物继续培养48小时。培养时间达到后用胰蛋白酶消化收集2×10⁶个细胞，然后采用FastPure Cell/Tissue Total RNA IsolationKit试剂盒提取总RNA。

(2)逆转录反应

提取的总RNA先进行浓度测定，然后取无菌无酶的离心管用RNA提取液调整总RNA浓度为1μg/μL。之后采用诺唯赞公司的 III All-in-one RT SuperMix Perfectfor qPCR 进行逆转录为cDNA进行后续实验。

在RNase-free离心管中按下表配制混合液：

表4逆转录反应体系

逆转录反应程序按下表设置：

表5逆转录反应程序

程序结束后得到的逆转录产物直接进行qPCR反应，或于-20℃、-80℃冰箱保存。

(1)实时荧光定量PCR

目的基因及内参基因的引物从已报道文章中获得，由广州天一辉远公司合成ultra-page级引物。各个引物序列如下表所示：

表6引物序列

/>

将合成好的引物采用诺唯赞公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂进行反应体系的配制。要提前准备无菌无酶的qPCR管，将各个试剂加入至无菌无酶的管中。具体配制体系如下表：

表7 qPCR反应体系

将配置好的qPCR反应体系置于冰上放置，在进行qPCR反应时用离心机离心5min，然后设置如下反应程序：

表8 qPCR反应程序

结合上述两表，按照设定好的反应体系与程序针对经化合物处理后的人肝癌HepG2和人***Hela细胞中的相关通路基因和靶基因进行实时荧光定量检测，根据反应结果的Ct值进行数据分析。

实验结果分析：Wnt/β-catenin信号通路处于激活时会上调靶基因如cyclin D1、LEF1等的表达。在Wnt信号通路高表达的Hela和HepG2细胞中，本研究采用了实时定量PCR的方法检测DD-9对两种细胞中Wnt/β-catenin信号通路的靶基因和β-catenin的mRNA水平影响。图13-14结果显示，DD-9可以有效地降低Hela和HepG2细胞中β-catenin和靶基因cyclinD1、 LEF1的mRNA转录水平，降低其表达。

8.DD-38体外抑制HepG2细胞增殖

实验试剂、实验步骤：与上文同。

实验结果分析：用DD-38(0、0.1、0.5、1、2、5、8μg/mL)处理HepG2细胞12h和24h 后，与空白对照组的细胞存活率比较结果如图15所示，DD-38对HepG2细胞有明显的增殖和活力抑制，并呈现出明显的时间和浓度依赖性抑制。在DD-38处理12h与24h相比，处理时间越长、浓度越高对细胞增殖抑制越明显。DD-38对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50) 在12h和24h分别为(23.1272±2.1365)μM、(4.8273±0.2216)μM(图15)。*P≤0.05， **P≤0.01。

9.DD-38抑制HepG2细胞克隆形成

实验试剂、实验步骤：与上文同。

实验结果分析：结果显示，HepG2细胞经不同浓度的DD-38(0、2、4、8μM)处理后，DD-38可以显著降低HepG2细胞的克隆形成能力。与空白组的染色情况对比，DD-38在8μM 的抑制效果最明显，且浓度越高对HepG2的菌落形成能力抑制越强，并呈现浓度依赖性抑制，这进一步表明DD-38对HepG2的增殖和成团能力抑制(图16)。

10.DD-38抑制HepG2细胞迁移

实验试剂、实验步骤：与上文同。

实验结果分析：结果显示，与未经DD-38处理的HepG2细胞对比，在用5μMDD-38对HepG2细胞作用48h后，其划痕宽度远远高于空白对照组，划痕愈合能力明显降低(图17)，空白组迁移率为(77.09±2.16)％，加药组迁移率为(12.14±5.32)％。由此提示DD-38可以显著降低HepG2细胞的迁移能力。*P≤0.05，**P≤0.01。

11.DD-38促进HepG2细胞凋亡

实验试剂、实验步骤：与上文同。

实验结果分析：本研究用DD-38处理HepG2细胞24小时，然后使用AnnexinV-FITC/PI 染色法进行双染后经流式细胞仪分析分析，其中Annexin V-FITC+(Q3)和Annexin V-FITC+/PI+(Q2)染色的细胞代表凋亡细胞。结果表明，不同浓度的DD-38(0、2、4、8μM)处理HepG2细胞24h后，可以诱导HepG2凋亡并呈现出浓度依赖性(图18)。

12.DD-38下调β-catenin在细胞质细胞核表达

实验试剂、实验步骤：与上文同。

实验结果分析：Western blot结果提示，DD-38在肝癌细胞中显示出抑制Wnt/β-catenin 信号通路的能力。在不同浓度的DD-38(0、2、4、8μM)处理HepG2细胞后，DD-38可以显著降低Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin在细胞质和细胞核中的表达。与空白组比较，抑制效果明显并呈浓度梯度依赖性。*P≤0.05，**P≤0.01。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 四氢呫吨酮二聚体类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgaccccg cacgatttc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaggttcag gccttgcac 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccagaacatc atccctgcct ctact 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtttttcta gacggcaggt caggt 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catctacaca gtttgatgct gct 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagttttgt cagttcaggg a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggaacatcc ccacactgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtcttttt ggctcctgct 20

Claims

1.四氢呫吨酮二聚体类化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物的制备方法包括以下步骤：

（1）选取大红树内生真菌Phomopsis asparagi为目标菌株，在50μM丁酸钠条件下进行发酵，用PDA培养基在无菌条件下接种菌，在恒温28℃下培养14d；

（2）将步骤（1）通过真菌Phomopsis asparagi发酵获得的菌丝体浸入乙酸乙酯3次，每次72小时，将提取物浓缩并合并，获得总提取物；

（3）将步骤（2）总提取物与100-200目正向硅胶粉研磨混合，硅胶粉质量和提取物的质量比为1.5:1，并以体积比为100:0-0:100的二氯甲烷和甲醇作为洗脱液，进行梯度洗脱，共得到A1-A6共6个组分；

将组分A3经硅胶柱色谱层析梯度洗脱，洗脱试剂为体积比12:1~ 3:1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.1-A3.12共12个组分；

将组分A3.2经硅胶柱色谱层析等度洗脱，洗脱试剂为体积比4:1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.2.1-A3.2.7共7个组分；

将组分A3.2.3经硅胶柱色谱层析等度洗脱，洗脱试剂为体积比2:1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.2.3.1-A3.2.3.7共7个组分，减压浓缩，干燥后得到化合物DD-9，即得四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrol C；

将组分A3.7经硅胶柱色谱层析等度洗脱，洗脱试剂为体积比3:1的石油醚和乙酸乙酯，得到A3.7.1-A3.7.5共5个组分；

将组分A3.7.3经 SephadexLH-20柱分离，洗脱试剂为体积比1:1的氯仿和甲醇，共得到A3.7.3.1-A3.7.3.16共16 个组分，减压浓缩，干燥后得到化合物DD-38，即得四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrol A；

Phomopsis asparagi DHS-48保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2021318，保藏日2021年3月31；

所述四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrol A的结构式如（1）所示：

（1），R=H；

所述四氢呫吨酮二聚体类化合物dicerandrol C的结构式如（2）所示：

（2），R=Ac。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述二氯甲烷和甲醇的具体洗脱梯度为体积比100:0、100:2、100:4、100:6、100:8、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:100。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述体积比12:1~ 3:1的石油醚和乙酸乙酯，该洗脱试剂的具体洗脱梯度为体积比12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1。