CN114706208B - 受激辐射损耗光学显微镜及其显微成像*** - Google Patents
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Abstract
本发明提供了受激辐射损耗光学显微镜及其显微成像***,后者包括物镜和模块阵列;模块阵列包括呈阵列设置的多个模块单元;模块单元包括沿光路传输方向依次设置的模块单元包括沿光路传输方向依次设置的如下部件:偏振光分束器,入射光束经偏振光分束器后,第一偏振光束反射后被丢弃;第一1/4波片,从偏振光分束器透射的第二偏振光束经过1/4波片转化为圆偏振光;第一二向色性元件,圆偏振光通过第一二向色性元件分解为第一光束和第二光束,其中,第一光束为被反射的,第二光束为被透射的;光程延迟单元,光程延迟单元的远端设置有位相板,第二光束入射光程延迟单元后,通过位相板将第二光束引入相位差,并将引入相位差的第二光束原路返回。
Description
技术领域
本发明涉及显微成像技术领域,特别是涉及一种受激辐射损耗光学显微镜及其显微成像***。
背景技术
当今生命科学中的显微成像研究大约80%仍然使用光学显微镜,可以说生命科学的进步伴随着光学显微镜的发展。然而由于光学衍射极限的存在,使得光学显微镜的空间分辨率被限制在半个波长左右,这样的分辨率严重阻碍了生物学家们对亚细胞结构的精细研究。STED(受激辐射损耗,Stimulated Emission Depletion-受激辐射损耗)光学显微镜使用一束损耗光通过位相板的调制,形成损耗光斑,将激发光衍射光斑周围的荧光分子通过受激辐射耗尽转化为非辐射态,实现了好于50nm的空间分辨率。由于使用全光设置,图像采集时间与共聚焦显微镜相同,对样品准备没有特殊要求,因此可以实现活细胞内亚细胞结构的实时成像和动态跟踪。
受激辐射损耗光学显微镜发明以来,已经被广泛应用于生物学和生命医学科学研究中。但在实际应用中受激辐射损耗光学显微镜有四项问题,一、光路复杂,难以实现小型化;二、难以维持激发光斑与受激辐射损耗光斑的高精度长时间稳定对准(纳米级);三、受激辐射损耗光学显微镜对于生物样品的光毒性较大,往往经过受激辐射损耗光学显微镜成像后的生物样品会出现失活、光漂白等现象;四、受激辐射损耗光学显微镜采用点扫描的方式进行成像,该种成像方式速度较慢,时间分辨率较低,无法被用来进行高帧率成像。
发明内容
本发明的目的是至少解决激发光斑和损耗光斑无法长时间稳定对准的问题,该目的是通过以下技术方案实现的。
本发明提供了一种受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,包括物镜,还包括:
模块阵列,所述模块阵列包括呈阵列设置的多个模块单元;
所述模块单元包括沿光路传输方向依次设置的如下部件:
偏振光分束器,入射光束经所述偏振光分束器后,第一偏振光束反射后被丢弃;
第一1/4波片,从所述偏振光分束器透射的第二偏振光束经过所述第一1/4波片转化为圆偏振光;
第一二向色性元件,所述圆偏振光通过所述第一二向色性元件分解为被反射的第一光束和被透射的第二光束;
光程延迟单元,所述光程延迟单元的远端设置有位相板,所述第二光束入射所述光程延迟单元后,通过所述位相板将所述第二光束引入相位差,并将所述引入相位差的第二光束原路返回,与被反射的第一光束在所述第一二向色性元件靠近所述第一1/4波片的一端汇合并共轴形成第三光束;
第二1/4波片,所述第三光束通过所述第一1/4波片和所述第二1/4波片后转化为圆偏振光;以及
组合光楔,所述组合光楔将所述转化为圆偏振光的第三光束引入偏转角,并聚焦至所述物镜的后口,形成点阵光阵列;
所述聚焦至所述物镜的后口的第三光束在所述物镜的焦面处形成有光斑,所述光斑包括所述第一光束的激光光斑和所述第二光束的损耗光斑。
进一步地,所述模块单元的数量为九个及以上。
进一步地,所述位相板为反射式位相板,所述位相板用于对入射的所述第二光束的波前进行调制。
进一步地,所述组合光楔为消色差组合光楔,所述第三光束通过所述消色差组合光楔引入偏转角。
进一步地,所述第一二向色性元件为选择性透射介质膜,所述介质膜镀设在所述光程延迟单元的入射端;或者,所述第一二向色性元件为二向色性板。
进一步地,所述入射光束与所述模块单元的数量一致。
进一步地,所述相位差为2π相位差。
本发明还提供了一种受激辐射损耗光学显微镜,包括:
照明***,所述照明***产生入射光束;
如上面所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,所述入射光束通过所述显微成像***发出荧光光束;以及
探测***,所述荧光光束进入所述探测***。
进一步地,所述照明***包括沿光路传输方向依次设置的激光器、第一滤波片、第一透镜、单模保偏光纤、第二透镜以及光束分束器;
所述光束分束器将投射入所述光束分束器的光束分为与模块单元的数量相等的光束集,并入射模块阵列。
进一步地,所述探测***包括沿光束传播方向包括:
第二二向色性元件,所述荧光光束通过所述第二二向色性元件滤出;
第二滤波片,所述第二滤波片用于滤除荧光光束中的激发光和受激辐射损耗光;
反射镜,所述反射镜对滤除激发光和受激辐射损耗光的荧光光束进行反射;
第三透镜及荧光信号探测器,所述第三透镜用于对反射得到的荧光光束汇聚收集至所述荧光信号探测器。
本发明的优点如下:
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,通过模块阵列调制受激辐射损耗光学显微镜发出的第一光束和第二光束,优化了照明***的光路,减少了光学元件,避免了单元器件相互几何关系的物理调节以及机械调节机构所固有的温度和振动不稳定性,避免了激发光斑和损耗光斑偏移等现象,使受激辐射损耗仪器设备能够在各种环境下长期可靠工作。
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,能够大幅提高超分辨受激辐射损耗显微***的成像速率,提高受激辐射损耗***时间分辨率。拍摄同样大小照片需要更短的曝光时间,降低了受激辐射损耗***所固有光毒性对生物样品所带来的不利影响。
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,通过模块阵列使得第一光束和第二光束可以在共轴的情况下进行相位调制和引入光程延迟。并且经该模块阵列调制后的第一光束的激发光斑和第二光束的损耗光斑,长时间、稳定、严格中心重合。
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,其模块阵列的体积较小,极大的缩小了受激辐射损耗成像***的体积,使得模块阵列可以嵌入至其他仪器作为核心部件进行联用,使得本发明可以应用于多场景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述,各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的,而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中,用相同的参考符号表示相同的部件。
图1为本发明实施例提供的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***的结构示意图;
图2为本发明实施例提供的显微成像***的模块单元的结构示意图;
图3为本发明实施例提供的受激辐射损耗光学显微镜的结构示意图;
图4为根据现有的共聚焦显微镜照射40nm荧光微球样品获得的共聚焦成像图;
图5为本发明实施例提供的受激辐射损耗光学显微镜的照明***照射40nm荧光微球样品在图3的同一区域获得的受激辐射损耗成像图;
图中附图标记如下:
100-照明***;
200-显微成像***;
300-探测***;
1-激光器;
2-第一滤波片;
3-第一透镜;
4-单模保偏光纤;
5-第二透镜;
6-光束分束器;
7-模块阵列;71-模块单元;
8-第二二向色性元件;
9-第二滤波片;
10-反射镜;
11-第三透镜;
12-荧光信号探测器;
13-物镜;
14-偏振光分束器;
15-第一1/4波片;
16-第一二向色性元件;
17-光程延迟单元;
18-位相板;
19-第二1/4波片;
20-组合光楔;
101-入射光束;
102-第一光束;
103-第二光束;
104-第三光束;
105-荧光光束。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式,然而应当理解,可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开,并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如图1至图5所示,本发明提供了一种受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,包括物镜13,还包括:
模块阵列7,模块阵列7包括呈阵列设置的多个模块单元71;
模块单元71包括沿光路传输方向依次设置的如下部件:
偏振光分束器14,入射光束101经偏振光分束器14后,第一偏振光束反射后被丢弃;
第一1/4波片15,从偏振光分束器14透射的第二偏振光束经过第一1/4波片15转化为圆偏振光;
第一二向色性元件16,圆偏振光通过第一二向色性元件16分解为被反射的第一光束102和被透射的第二光束103;
光程延迟单元17,光程延迟单元17的远端设置有位相板18,第二光束103入射光程延迟单元17后,通过位相板18将第二光束103引入相位差,并将引入相位差的第二光束103原路返回,与被反射的第一光束102在第一二向色性元件16靠近第一1/4波片15的一端汇合并共轴形成第三光束104;
第二1/4波片19,第三光束104通过第一1/4波片15和第二1/419波片后转化为圆偏振光;以及
组合光楔20,组合光楔20将转化为圆偏振光的第三光束104引入偏转角,并聚焦至物镜13的后口,形成点阵光阵列;
聚焦至物镜13的后口的第三光束104在物镜13的焦面处形成有光斑,光斑包括第一光束102的激光光斑和第二光束103的损耗光斑。
入射光束101经偏振光分束器14后,第一偏振光束反射后被丢弃,其中,第一偏振光束为S偏振光束。第二偏振光束为P偏振光束。
模块阵列7由多个模块单元71粘结得出,模块单元71由光学加工技术加工而成。
除了上面提到的过程外,第三光束104通过第一1/4波片15后,由P偏振光转化为S偏振光,再由第二1/4波片19将S偏振光转化为圆偏振光。
第三光束104在物镜13汇聚的作用下能够形成点阵光阵列,激发被检测样品中的荧光物质,使样品发射荧光,点阵光阵列中的光斑由第一光束102的光斑和第二光束103的光斑中心重合而成,其中,第一光束102为激发光,第二光束103为受激辐射损耗光,也就是损耗光。经该模块阵列7调制后的激发光斑和损耗光斑能够长时间、稳定、严格中心重合,以用于后续荧光激发。
模块单元71的数量为九个及以上,其中,当模块单元71的数量为九个时,可采用三行三列的设置方式。多个模块单元71也可以采用四行四列的设置方式等。为了形成更多的光斑,就需要更多的模块单元71,激发样品中的荧光物质发射更多的荧光。
位相板18为反射式位相板,该反射式位相板通过二元光学加工获得或者使用位相变换板与反射镜组合,设置在光程延迟单元17的远端,第二光束103进入光程延迟单元17后入射至位相板18上,经反射后能够沿原光路返回至光程延迟单元17的入射端,并且,位相板18能够对入射的第二光束103的波前进行调制。合理地设计光程延迟单元17的光学长度,使得第一光束102和第二光束103产生固定的脉冲时间延迟。
具体实施中,光程延迟单元17和位相板18可以为一体式结构,也可以为分体式结构。优选实施中,将光程延迟单元17和位相板18设置为一体式结构,在光程延迟单元17的出射端的表面加工位相板18,通过集成化设计,使光学元件的布置更紧凑,同时还能够减少温度、振动等外界环境对光路的影响,提高光学***的可靠性。
组合光楔20为消色差组合光楔,第三光束104通过消色差组合光楔引入偏转角,使得第三光束104聚焦,形成点阵光阵列。消色差组合光楔所引入的偏转角应当与最终的点阵光的光斑分布相匹配,也就是说第三光束104的光斑分布与最终的点阵光的阵列分布一致。
第一二向色性元件16为选择性透射介质膜,介质膜镀设在光程延迟单元17的入射端;或者,第一二向色性元件16为二向色性板。这些都是现有技术中的常见产品,能够使得反射第一光束102并透射第二光束103即可。
入射光束101的数量与模块单元71的数量一致,如当模块单元71的数量为九个时,入射光束101的数量也为九个,并分别入射到模块单元71,从而实现入射光束101与模块单元71的对应设置,能够形成点阵光阵列。
相位差为2π相位差。这里通过光程延迟单元17可对第二光束102进行延时,相位差根据光程延迟单元17的光学长度确定,也可以根据需要采用其他相位差,如π相位差或者4π相位差等。
在图2中,出于使图清晰的原因,对第一光束102和第二光束103进行垂直偏移,通常在实际中尽可能地使各光束严格同轴。
在显微成像***中,模块阵列7的每个模块单元71都具有调制激发光和损耗光的功能,同时实现光束的相位调制、偏振调节、脉冲延迟及光束入射角调控,即四功能一体,避免了各单元器件相互几何关系的物理调节、以及机械调节机构所固有的温度和振动不稳定性,保证激发光和受激辐射损耗光的稳定同轴,使得所研制的受激辐射损耗光学显微镜可在各种环境下长期可靠工作。
本发明还提供了一种受激辐射损耗光学显微镜,包括照明***100、探测***300和上面所提到的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***200。照明***100产生入射光束101,入射光束101通过显微成像***200激发出荧光光束105,荧光光束105进入探测***300。
照明***100包括沿光路传输方向依次设置的激光器1、第一滤波片2、第一透镜3、单模保偏光纤4、第二透镜5以及光束分束器6,光束分束器6将投射入光束分束器6的光束分为与模块单元71的数量相等的光束集并入射模块阵列7。其中,第一透镜3和第二透镜5均采用消色差透镜,避免色差所带来的影响。第一滤波片2采用带通滤波片。在照明***100中,激光器1为超连续光源,其发出的光束经第一滤波片2滤出受激辐射损耗超分辨***所需要的激发光和损耗光,经第一透镜3聚焦耦合进单模保偏光纤4,光束射出单模保偏光纤4后经第二透镜5准直为平行光束,之后入射光束分束器6将光束分为与模块阵列7的模块单元71数量相等的入射光束101并入射模块阵列7。
探测***包括沿光束传播方向包括第二二向色性元件8、第二滤波片9、反射镜10、第三透镜11及荧光信号探测器12,被激光的荧光光束105经过第二二向色性元件8滤出,然后经过第二滤波片9、反射镜10和第三透镜11后汇聚至荧光信号探测器12。其中,第二滤波片9进一步地去除荧光光束105中的激发光和受激辐射损耗光。
该模块阵列7能够对调制受激辐射损耗光学显微镜发出的第一光束102和第二光束103,也就是激发光和受激辐射损耗光,形成能够满足超分辨成像要求的光束集,经该模块阵列7调制后的激发光斑和损耗光斑能够长时间、稳定、严格中心重合,以用于后续荧光激发。模块阵列7优化了照明***100的光路,减少了光学元件,同时避免了单元器件相互几何关系的物理调节以及机械调节机构所固有的温度和振动不稳定性,避免了激发光斑和损耗光斑偏移等现象,使受激辐射损耗仪器设备能够在各种环境下长期可靠工作。
光束分束器6发出多个入射光束101,每个入射光束101经过偏振光分束器14后,S偏振光束反射后被丢弃;透射的P偏振光束经过第一1/4波片15转化为圆偏振光,圆偏振光通过第一二向色性元件16分解为被反射的第一光束102和被透射的第二光束103,被透射的第二光束103进入光程延迟单元17,通过位相板18将第二光束103引入相位差,并将引入相位差的第二光束103原路返回,与被反射的第一光束102在第一二向色性元件16靠近第一1/4波片15的一端汇合并共轴形成第三光束104,第三光束104通过第一1/4波片15,由P偏振光转化为S偏振光,S偏振光通过第二1/4波片19后转化为圆偏振光,圆偏振光通过组合光楔20引入盘转角,使得光束集能够聚焦至物镜13的后口,光束集在物镜13汇聚的作用下能够形成点阵光阵列。点阵光阵列激发样品中的荧光物质,使其发射荧光,形成荧光光束105,荧光光束105分别依次通过第二二向色性元件8、第二滤波片9、反射镜10、第三透镜11后汇聚至荧光信号探测器12。
从说明书附图中可以看出传统的共聚焦成像不能分辨的纳米微球,见图4中的虚线框内。而本发明的受激辐射损耗光学显微镜可清晰地辨认出三个荧光微球,见图5中虚线框内,经测量荧光微球显微成像的半高全宽小于50nm,且受激辐射损耗点阵光扫描成像所用时长为普通受激辐射损耗超分辨显微镜的1/9。由上述对比可知,采用本发明提供的受激辐射损耗光学显微镜能够大大提高成像的分辨率,获得超分辨成像的效果,且大幅提高受激辐射损耗光学显微镜的时间分辨率。
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,通过模块阵列7调制受激辐射损耗光学显微镜发出的激发光和损耗光,优化了照明***100的光路,减少了光学元件,避免了单元器件相互几何关系的物理调节以及机械调节机构所固有的温度和振动不稳定性,避免了激发光斑和损耗光斑偏移等现象,使受激辐射损耗光学显微镜等仪器设备能够在各种环境下长期可靠工作。
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,能够大幅提高超分辨受激辐射损耗显微***的成像速率,提高受激辐射损耗***时间分辨率。拍摄同样大小照片需要更短的曝光时间,降低了受激辐射损耗***所固有光毒性对生物样品所带来的不利影响。
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,通过模块阵列7使得激发光和损耗光可以在共轴的情况下进行相位调制和引入光程延迟。并且经该模块阵列7调制后的激发光斑和损耗光斑长时间、稳定、严格中心重合。
本发明中的受激辐射损耗光学显微镜,其模块阵列7的体积较小,极大地缩小了受激辐射损耗成像***的体积,使得模块阵列7可以嵌入至其他仪器作为核心部件进行联用,使得本发明可以应用于多场景。
需要指出的是,在本发明的描述中,术语“第一”、“第二”仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,包括物镜,其特征在于,还包括:
模块阵列,所述模块阵列包括呈阵列设置的多个模块单元;
所述模块单元包括沿光路传输方向依次设置的如下部件:
偏振光分束器,入射光束经所述偏振光分束器后,第一偏振光束反射后被丢弃;
第一1/4波片,从所述偏振光分束器透射的第二偏振光束经过所述第一1/4波片转化为圆偏振光;
第一二向色性元件,所述圆偏振光通过所述第一二向色性元件分解为被反射的第一光束和被透射的第二光束;
光程延迟单元,所述光程延迟单元的远端设置有位相板,所述第二光束入射所述光程延迟单元后,通过所述位相板将所述第二光束引入相位差,并将所述引入相位差的第二光束原路返回,与被反射的第一光束在所述第一二向色性元件靠近所述第一1/4波片的一端汇合并共轴形成第三光束;
第二1/4波片,所述第三光束通过所述第一1/4波片和所述第二1/4波片后转化为圆偏振光;以及
组合光楔,所述组合光楔将所述转化为圆偏振光的第三光束引入偏转角,并聚焦至所述物镜的后口,形成点阵光阵列;
所述聚焦至所述物镜的后口的第三光束在所述物镜的焦面处形成有光斑,所述光斑包括所述第一光束的激光光斑和所述第二光束的损耗光斑。
2.根据权利要求1所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,其特征在于,所述模块单元的数量为九个及以上。
3.根据权利要求1所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,其特征在于,所述位相板为反射式位相板,所述位相板用于对入射的所述第二光束的波前进行调制。
4.根据权利要求1所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,其特征在于,所述组合光楔为消色差组合光楔,所述第三光束通过所述消色差组合光楔引入偏转角。
5.根据权利要求1所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,其特征在于,所述第一二向色性元件为选择性透射介质膜,所述介质膜镀设在所述光程延迟单元的入射端;或者,所述第一二向色性元件为二向色性板。
6.根据权利要求1所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,其特征在于,所述入射光束与所述模块单元的数量一致。
7.根据权利要求1所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,其特征在于,所述相位差为2π相位差。
8.一种受激辐射损耗光学显微镜,其特征在于,包括:
照明***,所述照明***产生入射光束;
如权利要求1至7中任一项所述的受激辐射损耗光学显微镜的显微成像***,所述入射光束通过所述显微成像***激发出荧光光束;以及
探测***,所述荧光光束进入所述探测***。
9.根据权利要求8所述的受激辐射损耗光学显微镜,其特征在于,所述照明***包括沿光路传输方向依次设置的激光器、第一滤波片、第一透镜、单模保偏光纤、第二透镜以及光束分束器;
所述光束分束器用于将投射入所述光束分束器的光束分为与所述模块单元的数量相等的入射光束,并入射所述模块阵列。
10.根据权利要求8所述的受激辐射损耗光学显微镜,其特征在于,所述探测***沿光束传播方向包括:
第二二向色性元件,所述荧光光束通过所述第二二向色性元件滤出;
第二滤波片,所述第二滤波片用于滤除荧光光束中的激发光和受激辐射损耗光;
反射镜,所述反射镜对滤除激发光和受激辐射损耗光的荧光光束进行反射;
第三透镜及荧光信号探测器,所述第三透镜用于对反射得到的荧光光束汇聚收集至所述荧光信号探测器。
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