CN114706023A - 生物分子相互作用的磁学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供生物分子相互作用的磁学检测方法，包括以下步骤：a.通过超顺磁颗粒标记或捕获生物样品中的生物分子相互作用对，从而将所述生物分子相互作用对结合在功能化的含有系综NV色心传感器的金刚石表面上；b.利用宽场磁成像显微镜对含有系综NV色心传感器的金刚石表面的超顺磁颗粒进行磁成像；和c.通过深度学习模型建立所得磁图像与超顺磁颗粒分布的映射关系，对超顺磁颗粒分布进行反解和重构，然后统计金刚石表面的超顺磁颗粒的数目，通过所述超顺磁颗粒的定量数据对目标生物分子的相互作用进行分析。本发明可以实现对生物分子相互作用的高灵敏、低背景、高稳定和高特异检测，检测灵敏度可以达到单分子。

Description

生物分子相互作用的磁学检测方法
技术领域
本发明属于磁学检测领域，具体地涉及生物分子相互作用的磁学检测方法。
背景技术
以蛋白质-蛋白质相互作用为代表的生物分子相互作用是生命活动正常进行的关键，揭示生物分子相互作用对于理解生命体中复杂的生理过程、筛选和开发药物、诊断与治疗疾病等有着重大的意义。生物分子相互作用的检测可以简单分为体内和体外检测。就体外检测而言，目前以免疫共沉淀（Co-IP）技术作为研究生理条件蛋白相互作用方法的金标准，除此之外，表面等离子体激元共振（SPR）、单分子荧光技术等方法也在生物分子相互作用检测上有着广泛的应用。
Co-IP是通过琼脂糖珠或磁珠对待测样品中感兴趣的蛋白质相互作用对进行捕获和分离，然后通过Western-Blot或质谱对相互作用进行分析，能够分析天然的蛋白质相互作用，但是这种方法的样品需求量大，灵敏度较低，并且只能定性和半定量分析。表面等离子体激元共振技术（SPR）利用了生物分子结合在金属基底上引起的光折射率的变化来研究相互作用，它能够无标记的研究生物分子间相互作用的动力学，然而对纯化蛋白的需求以及高成本的实验装置限制了这种方法的应用。单分子荧光技术是利用荧光显微镜，对荧光标记的生物分子在溶液或基底上进行监测，它可以实现单分子水平的生物分子相互作用定量鉴别，且无需纯化的样品，不过荧光标签的光稳定性较差，限制了长时程的蛋白质相互作用研究。无法满足基础科研和临床诊断上生物分子相互作用研究对兼顾样品需求量小、高灵敏度和特异性、稳定高效的要求。
纳米磁颗粒具有稳定性高，背景低，生物相容性好等特点，并可以利用外磁场进行磁分离进而实现磁纯化、磁富集等功能。利用这样的特性，能够有效提高生物分子相互作用检测的特异性和灵敏度。现有技术中，只有Hall探头和巨磁阻（GMR）等少数方法能够兼顾检测成本和灵敏度，而由于他们在空间分辨能力上的缺陷，使得他们目前只能在系综（多个分子的整体效应）层面上研究生物分子间的相互作用，缺少单分子信息。
因此，需要对生物分子相互作用实现高灵敏、低背景、高稳定和高特异检测的方法。
发明内容
近年来发展起来的金刚石中氮-空位色心（NV色心）兼顾了在室温大气环境下测磁的高灵敏度和高空间分辨率，是一种非常有吸引力的量子磁传感器。而金刚石良好的生物相容性使得这一体系适合在生物医学上的应用。针对现有生物分子相互作用检测技术的不足，本发明提出一种使用单颗粒磁成像的生物分子相互作用体外检测新方法。本发明利用金刚石NV色心作为基底与传感器，以磁颗粒为标签，通过用于生物样品检测的宽场磁成像显微镜装置对免疫识别于金刚石表面的磁颗粒进行成像、识别与统计，进而实现对生物分子相互作用的高灵敏、低背景、高稳定和高特异检测，检测灵敏度可以达到单分子。
具体来说，本发明的目的在于使用金刚石中的NV色心作为一种灵敏的磁传感器，通过金刚石的表面功能化处理、待测生物分子对的捕获与磁标记、宽场磁成像和磁图像分析，实现针对生物分子相互作用的磁学检测技术。本发明具有磁背景低、信号稳定、单分子可视化、高灵敏度和高特异性的优势，可以在很大程度上弥补上述现有生物分子相互作用检测方法的不足，为生物分子相互作用的研究及相关高灵敏生物医学检测提供一种强大的技术。
在一些实施方案中，通过对含有NV色心的块材金刚石进行修饰和免疫功能化处理，使得金刚石表面可以对样品中的待测相互作用对进行捕获。采用超顺磁颗粒替代目前被广泛应用的荧光标签对感兴趣的生物分子相互作用对进行标记，提供背景低、稳定性高的信号源。利用磁颗粒在外磁场下可以操控的特性，还能够根据需要进行磁富集磁纯化提高检测的灵敏度和特异性。在宽场磁显微镜上，采用连续波谱方式进行磁检测，对金刚石表面的磁颗粒进行单颗粒磁成像。使用基于深度学习的图像处理方法对原始磁场图像中的单颗粒信号进行反解和统计，进而得出待检测分子的定量信息。
本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供生物分子相互作用的磁学检测方法，其特征在于，包括以下步骤
a. 通过超顺磁颗粒标记或捕获生物样品中的生物分子相互作用对，从而将所述生物分子相互作用对结合在功能化的含有系综NV色心传感器的金刚石表面上；
b. 利用宽场磁成像显微镜对含有系综NV色心传感器的金刚石表面的超顺磁颗粒进行磁成像；和
c. 通过深度学习模型建立所得磁图像与超顺磁颗粒分布的映射关系，对超顺磁颗粒分布进行反解和重构，然后统计金刚石表面的超顺磁颗粒的数目，通过所述超顺磁颗粒的定量数据对目标生物分子的相互作用进行分析。
在一些实施方案中，含有系综NV色心传感器的金刚石表面的功能化通过生物素/链霉亲和素改造实现。
在一些实施方案中，含有系综NV色心传感器的金刚石表面的功能化还包括通过PEG化修饰实现对金刚石表面的钝化处理。
在一些实施方案中，含有系综NV色心传感器的金刚石表面的功能化包括含有系综NV色心传感器的金刚石表面的羟基化、氨基化、钝化及生物素修饰和链霉亲和素修饰，任选地还包括利用生物素化抗体处理含有系综NV色心传感器的金刚石表面。
在一些实施方案中，羟基化通过食人鱼溶液进行。
在一些实施方案中，氨基化通过氨基硅烷进行。
在一些实施方案中，氨基化通过氨基硅烷：乙酸：甲醇体积比为1-5:5:100，优选地1：5：100进行。
在一些实施方案中，钝化通过甲基化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯或者甲氧基聚乙二醇活性酯（mPEG-NHS）进行。
在一些实施方案中，生物素修饰通过生物素化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯或者生物素化聚乙二醇活性酯（Biotin-PEG-NHS）进行。
在一些实施方案中，超顺磁颗粒的尺寸为50 nm-1000 nm，优选地100nm。
在一些实施方案中，对所述超顺磁颗粒进行功能化，使所述超顺磁颗粒表面携带氨基或羧基，以与生物分子相互作用对（例如核酸或抗体）的羧基或氨基进行反应。
在一些实施方案中，生物样品的标记或捕获方式选自基底捕获法和超顺磁颗粒捕获法。
在一些实施方案中，基底捕获法包括将生物样品滴加在含有系综NV色心传感器的金刚石表面进行反应，然后滴加超顺磁颗粒进行反应。
在一些实施方案中，超顺磁颗粒捕获法包括将超顺磁颗粒滴加到生物样品中进行反应，然后滴加至含有系综NV色心传感器的金刚石表面进行反应。
在一些实施方案中，超顺磁颗粒捕获法还包括将磁铁放置在反应容器侧边和底部对所述超顺磁颗粒进行磁纯化与磁富集。
在一些实施方案中，系综金刚石NV色心传感器的制备方法为：对一块尺寸为2 mm× 2 mm × 0.5 mm，晶向为[100]的电子级纯度块材金刚石中以15 keV能量注入14N+离子，剂量为2×1013 cm-2，然后在1000℃经过4个小时的退火，在大约20 nm深度的金刚石近表面形成的一层高密度NV色心，其浓度大约为1.7 × 1011/cm2。
在一些实施方案中，使用100 nm级磁颗粒既是磁分离的工具又是磁成像的信号源，一方面能实现分钟级的磁分离，另一方面能提供合适强度和空间延展的磁场，保障了高对比度的磁图像和较高的检测通量。
在一些实施方案中，对磁颗粒进行生物功能化修饰，方便后续的生物分子识别和单颗粒磁成像。
在一些实施方案中，首先目标生物分子经过磁分离被富集和纯化，然后磁颗粒-生物分子复合体经过超声等处理恢复单颗粒分散性，最后进行单颗粒磁成像检测，这一过程在保障磁成像的单颗粒特性的同时提高检测特异性和灵敏度。
在一些实施方案中，以金刚石NV色心作为二维磁传感器，使用宽场磁显微镜对金刚石表面的磁颗粒进行磁成像，得到单颗粒磁图像。
在一些实施方案中，使用深度学习模型对单颗粒磁图像中的单颗粒磁场进行智能识别，并进行统计，通过定量数据对目标生物分子相互作用进行分析。
在一些实施方案中，深度学习模型为条件对抗生成模型 (cGANs)。
在一些实施方案中，统计金刚石表面磁颗粒数目的软件为ImageJ。
在一些实施方案中，本发明除了在生物医学研究上对蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、核酸-核酸等的相互作用进行检测，还可以用于临床、海关等场景下蛋白质、核酸、病毒等各类生物分子的检验。
本发明提出的基于单颗粒磁成像的生物分子相互作用磁学检测方法，可以广泛应用于各类生物分子的相互作用，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、核酸-核酸等，为相关生物医学基础研究和临床诊断提供一种新的技术手段。特别是，很多生物标志物的检测是依赖于生物大分子相互作用进行的，本发明在临床，海关下对各类生物大分子的检测对于诊断具有重大意义。例如，通过抗原-抗体相互作用，可以对血液中诸如新冠病毒等疾病的抗原或抗体进行高灵敏检测，从而能够实现快速诊断；通过互补DNA分子间的相互作用，可以设计合适的DNA序列，对体液中的ctDNA进行检测，从而能够有助于癌症的早期诊断。
定义
磁学检测：对样品的磁场强度，方向等磁学性质进行的检测。
系综金刚石NV色心传感器：金刚石体内的氮-空位色心被称为NV色心。通过面注入方式，在金刚石内产生大量的NV色心，这样的金刚石称为系综金刚石NV色心传感器。
超顺磁颗粒：超顺磁性指在外磁场作用下表现出顺磁性质，产生的磁场方向与外磁场方向一致，但是其磁化率远远高于一般的顺磁性物质。超顺磁颗粒就是具有超顺磁性的磁性颗粒。
生物分子相互作用对：一对相互作用的生物分子，比如抗原-抗体就可以称为生物分子相互作用对。
深度学习模型：用于深度学习训练的模型，主要包括卷积神经网络模型（CNN）、深度信任网络模型（DBN）、生成对抗网络（GAN）等。
磁纯化：超顺磁颗粒上的分子只与复杂体系中和它相互作用的一类物质进行反应固定在磁颗粒表面，而和体系内的其他物质不发生反应。在外磁场的作用下可以使磁颗粒从体系中分离出来，从而仅将需要的一类物质进行提取，实现对物质的纯化。而利用磁颗粒完成的这个过程称之为磁纯化。
磁富集：超顺磁颗粒与体系中的一类低浓度物质进行反应固定在磁颗粒表面，在外磁场的作用下可以使磁颗粒从体系中分离出来，同时低浓度的这类物质也分离了出来，由于此时的体积远远小于原体系，这类物质的浓度大大提高，实现对物质的富集。而利用磁颗粒完成的这个过程称之为磁富集。
单颗粒磁图像：由金刚石表面的磁颗粒产生的磁场分布图，由于单个磁颗粒的磁场分布十分集中，所以图像可以反映单磁颗粒在金刚石表面的分布，称为单颗粒磁图像。
宽场磁成像显微镜：宽场指的是相对于共聚焦而言，是直接对视场进行成像而不是单点扫描。宽场磁成像显微镜是指对宽场荧光显微镜进行改造，使得它可以对磁场分布进行成像。
标记：将标记物（如放射性同位素、荧光分子或荧光蛋白、纳米颗粒等）共价连接到待检测物上，使得被标记的待检测物可以通过适当的手段鉴定和检测。
捕获：通过某种方式，将样品中的感兴趣的一类物质与基底，分子或颗粒结合。
钝化：本意是指对金属表面进行氧化处理提高其耐腐蚀性能，这里是指通过化学手段对基底表面进行处理，使得它能够有效抵抗非特异吸附。
单个分子的相互作用：就是参与相互作用的分子只有一个，例如磁颗粒上的一个抗体和金刚石表面的一个抗原之间的相互作用就是单个分子的相互作用。单个分子可以小到几个至几十个碱基的寡聚核苷酸或几个氨基酸残基的短肽。
有益效果
本发明基于金刚石NV色心的磁测量提供了生物分子相互作用检测的高灵敏度、高特异性方法，可在众多场合得到应用。本发明的有益效果详细说明如下：
单分子灵敏度：利用NV色心磁成像，能够对单个磁颗粒分辨与成像。由于单个分子间的相互作用就可以保证磁颗粒结合在金刚石表面上，因此本发明具有单分子灵敏度。
高灵敏度：一方面，利用磁富集的手段，可以有效的提高待检测生物分子相互作用对的浓度，使得样本中更低浓度的生物分子相互作用对也能够产生与之间没有相互作用的分子的对照组具有显著差异的信号；另一方面，与荧光标签相比，磁标签具有的高稳定性，低背景，高激发效率的特点，能够实现接近100%的信号检出率，从而提高灵敏度。
高特异性：一方面，与基于其他标签的类似方案相比，除了生物分子间特征性识别与结合的特异性以及对表面PEG的钝化处理带来的特异性外，本发明还可以利用磁纯化手段，提纯样品中的待检测生物分子相互作用对，很大程度上消除样本中存在的其他生物分子的干扰，从而进一步提高特异性；另一方面，生物样本中磁背景低，读出的单颗粒磁信号可以保证来自于磁标签。
本发明提出的基于单颗粒磁成像的生物分子相互作用磁检测方法，能弥补其它磁检测手段在灵敏度和空间分辨方面的不足，能够在单分子层面上对生物分子相互作用进行研究。本发明提出的方法样品需求量小，具有高灵敏、低背景、高稳定、高特异和高效的特点。因此，本发明能在生物分子相互作用检测方面提供一种新的技术手段，对包括复杂生理条件下的生物分子相互作用研究及相关疾病的机理研究和临床诊疗都具有重要意义。本发明提出了从金刚石表面生物功能化到生物样品准备、单颗粒磁成像到数据处理与分析的全套方案，容易推广使用。
附图说明
图1示出了金刚石中的氮-空位色心（NV色心）的能级结构。
图2示出了NV色心的连续波谱。
图3示出了超顺磁颗粒在外磁场下沿NV轴向的分布。
图4示出了根据本发明的实施方案的流程图。
图5示出了根据本发明的实施方案的金刚石表面的功能化处理的流程图。
图6示出根据本发明的实施方案的生物样品的反应与结合方案，其中： a为基底捕获法；b为磁颗粒捕获法。
图7示出了根据本发明实施方案的单颗粒磁成像的流程图。
图8示出了利用单颗粒磁图像得到单磁颗粒分布。
图9示出了利用本发明演示RBD抗原与其抗体相互作用的实施例。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
如图4所示，本发明利用功能化的金刚石表面对待测样品中的生物分子相互作用对进行捕获，通过超顺磁颗粒进行标识，使用宽场磁显微镜对金刚石表面的磁颗粒进行光学分辨率的磁成像，通过数据处理识别并统计图像中的单颗粒，进而对被检测的生物分子的相互作用进行定量分析。
方案原理：
金刚石中的氮-空位色心（NV色心）被我们用来进行磁场探测，其能级结构如图1所示。|0>态和|±1>态之间存在2.87 GHz的零场劈裂。通过532 nm的激光可以将NV从基态激发。在激发态，|0>态直接弛豫至基态并辐射光子，而|±1>态除了上述的跃迁过程外，还存在一部分通过非辐射跃迁的方式经由亚稳态（单态）弛豫至基态，这一过程无光子辐射。因此，可以通过光学手段对NV的量子态进行读出。在沿轴外磁场下，简并的|±1>态会发生塞曼***（劈裂与外磁场成正比，为Δ = 2γeB0，其中γe为NV的旋磁比）。如图2所示，本发明中采用连续波的方式对磁场进行探测，在激光持续激发的过程中，扫描微波频率，并收集NV发出的荧光，在共振处会出现显著的荧光计数下降，从而获得共振频率，进而根据塞曼劈裂得出外磁场大小。在本发明中，我们利用系综金刚石NV色心进行磁场测量与磁成像。
在沿轴外磁场下，超顺磁颗粒磁化从而表现出沿轴的磁性信号。测到是磁场是外磁场和磁颗粒磁场的总磁场，磁颗粒的磁场分布需要减掉外磁场的影响才能够得到。如图3所示，超顺磁颗粒的信号是磁偶极信号。它的强度随着和信号源距离的延长而迅速衰减，而宽场磁成像显微镜的外磁场是一个较为均匀，变化较小的磁场，通过对测得磁场分布的二次项拟合就可以较好的提取出外磁场的分布，将外磁场减掉就可以得到磁颗粒的磁分布图像。磁颗粒的磁分布图像呈现出一个个的花瓣状分布，这里称为单颗粒磁图像。通过对单颗粒磁图像中的磁颗粒进行识别与统计，就能够对检测的生物分子的相互作用进行定量分析。
实施例1 金刚石表面功能化处理
如图5所示，本发明对金刚石样品的表面处理依次包括羟基化、氨基化及聚乙二醇（PEG）和生物素（Biotin）化。PEG分子可以削弱金刚石表面和溶液中的分子之间的静电相互作用和疏水相互作用，因此PEG化可以实现对金刚石表面的钝化，从而消除非特异性吸附。与此同时，生物素-PEG可以实现金刚石表面的功能化修饰，使得链霉亲和素能够通过生物素-链霉亲和素相互作用结合到金刚石表面，由于一个链霉亲和素上有四个生物素的结合位点，因此，后续任何标记了生物素的生物分子都能以链霉亲和素作为桥梁结合到金刚石表面。处理的具体流程如下：
1. 羟基化：将金刚石加入到食人鱼溶液（浓硫酸：双氧水 = 3：1）中，180 ℃下反应2 h。将金刚石取出，用去离子水进行冲洗，吹干。根据需要可以选择重复此步骤（通常一次反应就可以实现羟基化，增加处理次数可以进一步提高效果）。
2. 氨基化：将金刚石加入氨基硅烷（体系按照氨基硅烷：乙酸：甲醇体积比为1：5：100进行配制）中，室温避光反应1 h。反应结束后，取出金刚石，用甲醇润洗三次去除未反应的氨基硅烷，再用超纯水冲洗5次，吹干。
3. 钝化及生物素修饰：把1 mg甲基化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG-SVA,Laysan Bio. Inc., MW 5,000或20,000）和9 mg生物素化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯（Biotin-PEG-SVA, Laysan Bio. Inc., MW 5,000或20,000）溶解在50 μl碳酸氢钠溶液（0.1 M）中（SVA是一种活化了的羧基，在水溶液内极易水解而失效，因此请注意溶液要现用现配。PEG和Biotin-PEG的比例和用量可以根据表面生物分子相互作用对的密度进行调整。只有Biotin-PEG可以引出特异性的结合位点，位点过多会使得表面分子过于密集，难以区分单分子和进行统计，位点过少会影响方法的灵敏度，对于较低浓度的样品捕获效率不够。在不熟悉金刚石和待测样品的情况下，这类实验需要进行一定的预实验以确定合适的条件。由于不同批次的金刚石的表面情况不同，不同的实验情况下样品不同，所以需要调整PEG和Biotin-PEG的比例和用量），滴加到氨基化处理的金刚石表面，在湿润盒（在废弃的1ml枪头盒内装入1/2-3/5体积的去离子水，以保湿，防止样品干在金刚石表面）中室温反应4h或者在4 ℃冰箱内过夜，用去离子水冲洗5次，吹干。根据需要可以选择重复此步骤（通常一次反应就可以实现PEG化，增加处理次数可以进一步提高效果）。
4. 链霉亲和素修饰：钝化及生物素修饰完成后，在金刚石表面滴加0.6 mg/ml的链霉亲和素（Sigma-Aldrich, S0677）溶液反应30 min，用磷酸盐溶液（1×PBS，pH = 7.4）冲洗5次。
5. （可选）在金刚石表面滴加生物素化抗体（在链霉亲和素修饰后再加生物素抗体，因为本发明是通过生物素-链霉亲和素相互作用将抗体固定在金刚石表面）反应30min，用磷酸盐溶液冲洗5次。如果待检测生物分子相互作用对中含有生物素标签，此步骤可以省略。
实施例2 样品准备
本发明通过双夹心方式，也即俗称的“三明治法”对生物分子相互作用进行识别。在这一方案中，除了对金刚石的功能化处理外，磁颗粒也需要进行相应的功能化修饰。本发明中的功能化磁颗粒，既可以通过一步法或两步法的EDC/NHS交联，使磁颗粒表面的氨基或羧基与生物样品（例如核酸或抗体）的羧基或氨基进行反应获得，也可以直接购买（例如Ocean nanotech）。综合考虑磁颗粒在一定外磁场下的信号强度及分布范围、磁分离效率和空间位阻等因素，本发明中使用的磁颗粒通常为100 nm级尺寸。
一步法或两步法的EDC/NHS交联的步骤与其他应用中对磁颗粒的处理是相同的，按照文献中的操作步骤或购买公司提供的说明书操作即可。详细步骤如下：
一步法：
1. 取出0.25 ml 的磁颗粒（10 mg/mL）于1.5 ml Ep管中，将Ep 管放在磁分离器上。
2. 移走上清液。加入0.4 ml activation buffer ( 25 mM MES（4-吗啉乙磺酸），pH=6.0)对磁颗粒进行重分散。
3. 加入20 µl EDC溶液(10 mg/mL)（EDC是羧基和胺反应性零长度交联剂）。
4. 在持续混合下室温反应15分钟。向磁珠加入0.25 ml 蛋白（常是被捕获的生物分子相互作用对的抗体，比如A和B的相互作用待检测。如果金刚石上是A的抗体，修饰磁珠的就是B的抗体）（1 mg/ml）。
5. 持续混合下室温反应2.5小时。
6. 将反应的管子放在磁分离器上分离5分钟使磁颗粒完全分离（具体的磁分离时间取决于磁分离器的磁场）。
7. 移走上清液，加入PBST缓冲液。通过振荡和超声对磁颗粒重分散。
8. 重复步骤6-7三次。最终将磁颗粒重分散于PBST中，定容至磁颗粒浓度为1 mg/mL，保存于4℃冰箱内。
两步法：
1. 取出0.25 ml 的磁颗粒（10 mg/mL）于1.5 ml Ep管中，将Ep 管放在磁分离器上。
2. 移走上清液。加入0.4 ml activation buffer ( 25 mM MES，pH=6.0)对磁颗粒进行重分散。
3. 加入12.5 µl Sulfo-NHS 溶液 (10 mg/mL)和4.5 µl EDC溶液(10 mg/mL)。
4. 在持续混合下室温反应15分钟。
5. 通过磁分离去除上清液，然后超声将磁颗粒重新分散于activation buffer内。
6. 向磁珠加入0.25 ml 蛋白（常是被捕获的生物分子相互作用对的抗体，比如A和B的相互作用待检测。如果金刚石上是A的抗体，修饰磁珠的就是B的抗体）（1 mg/ml）。
5. 持续混合下室温反应2.5小时。
6. 将反应的管子放在磁分离器上分离5分钟使磁颗粒完全分离（具体的磁分离时间取决于磁分离器的磁场）。
7. 移走上清液，加入PBST缓冲液。通过振荡和超声对磁颗粒重分散。
8. 重复步骤6-7三次。最终将磁颗粒重分散于PBST中，定容至磁颗粒浓度为1 mg/mL，保存于4℃冰箱内。
如图6所示，本发明提供了两种方案实现金刚石表面的“三明治结构”：一种方案是先让功能化磁颗粒与样品混合，使得样品中待检测的相互作用对被磁颗粒捕获，然后与金刚石表面进行反应。这里称为磁颗粒捕获法。利用磁颗粒在外磁场下磁分离的特性，可以选择对磁颗粒与待测样品反应后的体系进行磁纯化和磁富集以提高灵敏度和特异性。另一种方案是先让样品与功能化的金刚石表面进行反应，使得待检测相互作用对首先被捕获在金刚石表面，然后利用功能化磁颗粒对金刚石表面的相互作用对进行标记，这里称为基底捕获法。反应具体流程如下，根据实验的目的和需求，可以选择任意一种方案：
a) 基底捕获法：
1. 将待检测样品滴加在金刚石表面（为得到单颗粒分布，应使用合适的生物样品浓度，合适的样品浓度根据表面生物分子相互作用对的实际密度进行调整。浓度过高会使得表面分子过于密集，难以区分单分子和进行统计，过低浓度的样品在金刚石表面结合效率太低，几乎测不到信号），室温下反应1 h。用磷酸盐缓冲液（1×PBS）冲洗5次。
2. 滴加0.02 mg/ml相应的抗体或核酸修饰的磁珠反应30 min，用磷酸盐缓冲液（1×PBS）冲洗5次。用超纯水快速换洗一次，将金刚石吹干，以便于进行单颗粒磁成像。
b) 磁颗粒捕获法：
1. 将适量的（根据待检测样本的体积与浓度决定，一般是待检测样本内待捕获的相互作用分子物质的量的1/5-1/50之间，以保证有足够的磁颗粒可以富集，且每个磁颗粒上面有捕获）磁珠滴加到待检测样品中充分混合，反应30 min。
2. （可选）磁纯化与磁富集：将磁铁放置在反应容器侧边和底部约5-10 min，待磁颗粒完全吸附至磁铁附近后，尽可能吸取上清液，然后加入100 μl PBST缓冲液（1×PBS，0.01%Tween20，pH = 7.4），充分震荡，重复上述步骤5次。最后一次吸取上清液并定容至 5-100 μl。对定容后的样品超声5 min以保证充分分散磁颗粒，根据实验需要可酌情延长时间。然后静置反应30 min以确保由于超声而部分脱落的生物分子重新结合在磁颗粒上。
3. 将步骤1或2中反应后的样品经过合理的稀释滴加至金刚石表面反应1 h，用磷酸盐缓冲液冲洗5次。用超纯水快速换洗一次，将金刚石吹干，以便于进行单颗粒磁成像。
实施例3 单颗粒磁成像
在将生物分子相互作用对和磁颗粒固定于金刚石表面后，需要利用二维量子磁传感器在宽场磁成像显微镜上对金刚石表面的磁颗粒进行磁成像（二维量子磁传感器就是前面提到的系综金刚石NV传感器的一种，NV色心在整个金刚石面内单层分布），进而进行统计和分析。
本发明中的二维量子磁传感器制备过程如下：对一块尺寸为2 mm × 2 mm ×0.5 mm，晶向为[100]的电子级纯度块材金刚石（Element Six）中以15 keV能量注入14N+离子，剂量为2×1013 cm-2（这个能量和剂量都是通过离子注入机实现的），然后在1000℃经过4个小时的退火，在大约20 nm深度的金刚石近表面形成的一层高密度NV色心，其浓度大约为1.7 × 1011/cm2。这保证了本发明中使用的二维磁量子传感器的高灵敏度以及亚微米分辨率，从而保证了检测效率和检测通量。
测量流程如图7所示。本发明使用宽场磁成像显微镜装置（CN114113151A）获得单颗粒磁图像。由于外磁场可以引起NV能级的塞曼***，从而使其共振频率发生改变，通过扫描微波得到其共振频率的变化就可以探测磁场，因此进行连续波谱（CW）探测，就可以获得单颗粒磁图像，下面阐述其具体的流程：
1. 将样品台固定到物镜的底座上，对焦样品。
2. 调整前端光路使得光路达到全内反射。
3. 电脑控制微波输出定频，同时控制相机采集荧光图像（采集金刚石内的NV色心的荧光图像）。
4. 改变微波频率，重复步骤3，扫描共振频率附近的多个频率点，并采集荧光图像。
5. 重复步骤2和3多次，以获得高信噪比与高对比度的磁图像。重复的次数与金刚石样品NV色心的性质有关。NV色心性质越好，测磁灵敏度越高，获得高信噪比与高对比度的磁图像所需时间越短，重复次数越少。测磁灵敏度指的是单位时间内测得的磁场变化，连续波测磁的灵敏度为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中Δf指的是半高宽，C指的是对比度，R指的是光子计数率。NV色心性质越好，对比度越高，半高宽越窄，对应测磁灵敏度越高，那么对同样磁场测量所需时间越短。
6. 对收集到每个频率下对应的荧光图像进行平均。
7. 用洛伦兹峰拟合（通过L-M（Levenberg-Marquarelt）算法对洛伦兹峰的参数进行拟合使得与实验数据之间的误差最小。也可以利用matlab origin里面非线性拟合的其他方式）平均后荧光图像中的每一个像素的连续波谱，获得共振频率分布图并转换为磁分布图。
8. 对金刚石表面上的磁场进行二阶多项式拟合，将原图扣除拟合图，得到磁信号分布图。
9. （可选）根据需要获得金刚石上多个不同区域的单颗粒磁图像。
实施例4 数据处理与分析
因为磁场表现出南北极，所以原始的磁场图像会显得信号较为混乱。为了直观获取金刚石表面磁颗粒的数量信息，本发明使用一种称为条件生成对抗网络的深度学习模型（T.-C. Wang et al., in Proceedings of the IEEE conference on computer visionand pattern recognition. (2018), pp. 8798-8807），经过对模型进行训练，建立磁图像与对应的单磁颗粒分布的映射关系，实现对单颗粒磁场信号的识别和反解，得到单磁颗粒分布图像。对反解重构的图像，可以利用ImageJ等常用软件对图像中的单颗粒数量进行快速的批量统计，例如在相同浓度下，不同强度的相互作用下同样面积内的磁信号数目不同，通过统计磁信号密度就可以比较不同分子之间的相互作用强度，通过定量数据对目标生物分子的相互作用进行分析，从而指导其生物功能的研究和临床医学的诊断。
实施例5 新冠病毒RBD抗原—抗体相互作用分析
下面以新冠病毒RBD抗原—抗体相互作用为具体实施例，对本发明进行进一步说明。
获得系综金刚石NV色心传感器
将两块尺寸为2 mm × 2 mm × 0.5 mm，晶向为[100]的同批次电子级纯度块材金刚石（Element Six）放在离子注入机内，以15 keV能量注入14N+离子，剂量为2×1013 cm-2，然后取出在1000 ℃经过4个小时的退火。在距离金刚石表面大约20 nm的深度形成一层高密度NV色心，其浓度大约为1.7 × 1011/cm2。
金刚石表面功能化
取两块金刚石，进行相同处理。
1. 羟基化：将金刚石加入到食人鱼溶液（浓硫酸：双氧水 = 6 ml：2 ml）中，180℃下反应2 h。将金刚石取出，用去离子水进行冲洗，吹干。上述步骤重复一次。
2. 氨基化：将金刚石加入氨基硅烷（比例为氨基硅烷 50 μl，甲醇5 ml，乙酸 250μl）中，室温避光反应1 h。反应结束后，取出金刚石，用甲醇润洗三次以去除未反应的氨基硅烷，再用超纯水冲洗5次，吹干。
3. 钝化及生物素修饰：5 mg生物素化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯（Biotin-PEG-SVA，Laysan Bio. Inc.，MW 20,000）溶解在50 μl碳酸氢钠溶液（0.1 M，pH = 8.3）中，滴加到氨基化处理的金刚石表面，在湿润盒中在4 ℃冰箱内过夜，用去离子水冲洗5次，吹干。上述步骤重复一次。
4. 链霉亲和素修饰：钝化及生物素修饰完成后，在金刚石表面滴加的2μl链霉亲和素（0.6 mg/ml ，Sigma-Aldrich，S0677）溶液反应30 min，用磷酸盐溶液（1×PBS，pH =7.4）冲洗5次。
磁颗粒标记
1. 取出0.02 ml 的磁颗粒（10 mg/mL，Ocean nanotech，SC0100，100 nm）于1.5ml Ep管中，将Ep 管放在磁分离器上。
2. 移走上清液。加入0.1 ml activation buffer ( 25 mM MES，pH=6.0)对磁颗粒进行重分散。
3. 加入5 µl Sulfo-NHS 溶液（10 mg/mL）和10 µl EDC溶液（10 mg/mL）。
4. 在持续混合下室温反应15分钟。
5.通过磁分离去除上清液，然后超声将磁颗粒重新分散于activation buffer内。
6. 向磁珠加0.02 ml 羊抗兔抗体（2.3 mg/ml，Jackson ImmunoResearch，111-005-003）。
5. 持续混合下4 ℃过夜。
6. 将反应的管子放在磁分离器上分离5分钟使磁颗粒完全分离。
7. 移走上清液，加入PBST缓冲液。通过振荡和超声对磁颗粒重分散。
8. 重复步骤6-7五次。最终将磁颗粒重分散于PBST中，定容至磁颗粒浓度为1 mg/mL，保存于4 ℃冰箱内。
样品准备
1. 向两块金刚石表面滴加2 μl生物素化RBD（0.1 mg/ml，Sino Biological，40592-V08B-B）反应30 min，用磷酸盐溶液冲洗5次。
2. 实验组金刚石滴加2μl兔源RBD抗体（100 ng/ml，Genetex，GTX635792）反应30min，用磷酸盐溶液冲洗5次。对照组金刚石保存在磷酸盐缓冲液内。
3. 向两块金刚石滴加0.02 mg/ml羊抗兔抗体修饰的磁珠反应15 min，用磷酸盐缓冲液（1×PBS）冲洗5次。用超纯水快速换洗一次，吹干。
单颗粒磁成像
对两块金刚石进行同样操作
1. 将金刚石固定在样品台上，样品台固定到物镜的底座上，用100倍空气镜（Olympus，MPLFLN 100×，numerical aperture（NA）0.9）对焦到金刚石表面。
2. 调整前端光路使得光路达到全内反射。通过532 nm的激光对金刚石NV色心进行激发。
3. 电脑控制微波输出定频，同时控制相机以0.1 s曝光时间采集金刚石NV色心产生的荧光图像
4. 改变微波频率，重复步骤3，扫描共振频率附近的多个频率点，并采集荧光图像。
5. 重复步骤2和步骤3 50次，以获得高信噪比与高对比度的磁图像。
6. 对收集到的每个频率下对应的荧光图像进行平均。这样就获得了随着微波频率而改变的一组荧光图，对应每个像素点荧光强度随着频率的变化就是每个像素的连续波谱。
7.通过L-M（Levenberg-Marquarelt）算法对平均后荧光图像中的每一个像素对应的连续波谱进行洛伦兹峰的拟合，获得共振频率分布图，根据塞曼劈裂频率Δ=γe B . （γe= 2.80 MHz/gauss）将共振频率图转换为磁分布图。
8. 对金刚石表面的磁场进行二阶多项式拟合得到外磁场分布图，将原图扣除拟合图，得到单颗粒磁图像。
数据处理与分析
1. 对一定分布的磁颗粒产生的信号按照偶极场模拟金刚石表面的磁场分布，利用模拟图像对条件生成对抗网络的深度学习模型进行训练，其步骤包括获取真实磁矩数据；根据真实磁矩数据，获得与真实磁矩数据对应的磁场数据；根据磁场数据和真实磁矩数据，获取训练样本集；利用训练样本集对待训练的磁场重构模型进行训练，得到训练后的磁场重构模型；以及，其中，利用训练样本集对待训练的磁场重构模型进行训练包括：将磁场数据输入条件生成对抗网络的生成器，以使生成器生成模拟磁矩数据，将真实磁矩数据和模拟磁矩数据输入条件生成对抗网络的判别器，以使判别器判别模拟磁矩数据的真伪。
2. 如图8，将单颗粒磁图像导入训练好的神经网络中反解重构出单磁颗粒分布图像。
3. 利用ImageJ统计反解重构的图像的磁信号数目。
如图9所示，本实施例展示了本发明的大部分有益效果。本发明的图像中的信号是单颗粒信号，由于单分子间的相互作用就可以将单个磁颗粒固定在金刚石表面，所以本发明是单分子灵敏度的。本发明中的信号没有背景，并且具有良好的稳定性，可以保证几乎100%读出。本发明中的对照组几乎没有信号，展示了表面PEG的钝化处理和磁标签具有的高特异性。
本实施例演示了RBD与其抗体之间存在较强的相互作用，和二抗之间几乎没有相互作用。利用RBD与其抗体之间存在较强的相互作用，可以采用本方案对血清中是否含有新冠病毒的抗体进行检测，通过血清流行病学在大量人群中对每个人是否感染新型冠状病毒进行快速的诊断，判断人群中存在的感染风险和对可能存在的感染者进行追踪，以阻断疾病的传播。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.生物分子相互作用的磁学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 通过超顺磁颗粒标记或捕获生物样品中的生物分子相互作用对，从而将所述生物分子相互作用对结合在功能化的含有系综NV色心传感器的金刚石表面上；
b. 利用宽场磁成像显微镜对含有系综NV色心传感器的金刚石表面的超顺磁颗粒进行磁成像；
c. 通过深度学习模型建立所得磁图像与超顺磁颗粒分布的映射关系，对超顺磁颗粒分布进行反解和重构，然后统计金刚石表面的超顺磁颗粒的数目，通过所述超顺磁颗粒的定量数据对目标生物分子的相互作用进行分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有系综NV色心传感器的金刚石表面的功能化通过生物素/链霉亲和素改造实现。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有系综NV色心传感器的金刚石表面的功能化还包括通过PEG化修饰实现对金刚石表面的钝化处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有系综NV色心传感器的金刚石表面的功能化包括含有系综NV色心传感器的金刚石表面的羟基化、氨基化、钝化及生物素修饰和链霉亲和素修饰，任选地还包括利用生物素化抗体处理含有系综NV色心传感器的金刚石表面。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述羟基化通过食人鱼溶液进行，所述氨基化通过氨基硅烷进行。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述钝化通过甲基化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯或者甲氧基聚乙二醇活性酯进行。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物素修饰通过生物素化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯或者生物素化聚乙二醇活性酯进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述超顺磁颗粒进行功能化，使所述超顺磁颗粒表面携带氨基或羧基，以与生物分子相互作用对的羧基或氨基进行反应。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物样品的标记或捕获方式选自基底捕获法和超顺磁颗粒捕获法，所述基底捕获法包括将生物样品滴加在含有系综NV色心传感器的金刚石表面进行反应，然后滴加超顺磁颗粒进行反应；超顺磁颗粒捕获法包括将超顺磁颗粒滴加到生物样品中进行反应，然后滴加至含有系综NV色心传感器的金刚石表面进行反应。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超顺磁颗粒捕获法还包括将磁铁放置在反应容器侧边和底部对所述超顺磁颗粒进行磁纯化与磁富集。
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