CN114686607B - 棒状杆菌作为尿液微生物标志物在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了棒状杆菌作为尿液微生物标志物在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用。本发明发现了棒状杆菌在健康人群与膀胱癌患者中的强相关性，且具有较高的预测概率，因此，将棒状杆菌作为尿液中的微生物标志物，来制备用于检测膀胱癌的检测产品，具有低成本且无创的优势。
Description
技术领域
本发明涉及膀胱癌诊断领域，具体而言，涉及棒状杆菌作为尿液微生物标志物在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用。
背景技术
膀胱癌是男性中第四大常见的癌症(占男性实性恶性肿瘤的7％)，近10年来，伴随烟草消费，工业化水平增加以及人口老龄化，中国人膀胱癌发病率不论是男性还是女性，都呈增长趋势。膀胱癌监测的金标准是白光内镜，然而，这个方法具有侵入性且较为昂贵，可导致病人显著不适，同时还由于需要在监测过程中反复的进行内镜检测，导致昂贵的费用支出。这些因素会导致膀胱癌病人的依从性降低。此外，还可以通过尿脱落细胞学检查来筛选膀胱癌，但脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。
尿液肿瘤标记物在概念上是非常适合进行监测的，因为尿液是直接与肿瘤相接触的，并且肿瘤会将代谢物释放到尿中。在低危的膀胱癌患者中，生物标记物能够协助减少内镜的检测频率。而对于高危患者，生物标记能够更加及时地发现肿瘤的早期复发及进展。
目前针对膀胱癌尿液的研究主要集中在脱落细胞、尿上清cfDNA、microRNA、外泌体等生物标志物的筛查，而尿液菌群在泌尿***肿瘤的作用是一个新兴的研究领域，尿液及膀胱在过去被认为是无菌的，但通过16S rDNA测序发现，尿液中有细菌存在。因此，如果能从膀胱癌尿液中的微生物菌群中寻找到与膀胱癌诊断或监测相关的标记物，则能最大程度地推动膀胱癌诊断和/或复发进展过程的监测。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种棒状杆菌作为尿液微生物标志物在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用，以提供一种无创低成本的能够诊断和监测膀胱癌的检测产品。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了棒状杆菌作为尿液微生物标志物在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用。
进一步地，尿液微生物标志物为棒状杆菌属的特异性序列，优选地，特异性序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5中的任一种；优选地，特异性序列为SEQ ID NO:1。
进一步地，检测产品包括检测特异性序列的检测引物；优选地，检测引物选自如下引物对中的任意一对：(1)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；(2)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；(3)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；(4)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7以及(5)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；优选地，检测引物为引物对SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7。
进一步地，检测包括诊断检测、进展监测及预后检测中的一种或多种；优选地，采用荧光定量PCR的方法进行检测。
进一步地，相关检测产品为试剂或试剂盒。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括检测尿液中的棒状杆菌的试剂。
进一步地，试剂盒包括检测尿液中的棒状杆菌的特异性序列的检测试剂；优选地，特异性序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5中的任一种；更优选地，特异性序列为SEQ ID NO:1；优选地，检测试剂包括检测特异性序列的检测引物；更优选地，检测引物选自如下引物对中的任意一对：(1)SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7；(2)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；(3)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；(4)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7以及(5)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；进一步优选地，检测引物为引物对SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7。
进一步地，试剂盒还包括如下任意一种或多种：阳性标准品、PCR反应相关试剂、尿液采集器以及提取尿液中DNA相关试剂；优选地，阳性标准品为质粒标准品，更优选质粒标准品为含有SEQ ID NO:1所示序列的质粒标准品，进一步优选地，质粒标准品以干粉形式保存；优选地，PCR反应相关试剂为荧光定量PCR反应相关试剂；更优选地，PCR反应相关试剂包括如下任意一种或多种：DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTPs、荧光染料及可选的去离子水；进一步优选地，DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液及dNTPs以DNA聚合酶预混液的形式存在，荧光染料为ROX Reference Dye；更进一步优选地，DNA聚合酶选自TAKARA的SYBR PremixEx Taq II。
应用本发明的技术方案，根据本申请的研究结果，发现了棒状杆菌在健康人群与膀胱癌患者中的强相关性，且具有较高的预测概率，因而将棒状杆菌作为尿液中的微生物标志物，来制备用于检测膀胱癌的检测产品，具有低成本且无创的优势。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例筛选到的棒状杆菌在膀胱癌患者与健康人中存在显著差异。
图2A和图2B分别示出了根据本发明的实施例中棒状杆菌特异靶基因序列为SEQID NO：1、4和/或5时，利用最佳引物(所用引物为Cor-F4/Cor-R4)对16例肿瘤患者与16例健康人检测结果的箱形图(boxplot)和ROC曲线。
图3A和图3B分别示出了根据本发明的实施例中棒状杆菌特异靶基因序列为SEQID NO：1、4和/或5时，利用引物对为Cor-F1/Cor-R1对16例肿瘤患者与16例健康人检测结果的箱形图和ROC曲线。
图4A和图4B分别示出了根据本发明的实施例中棒状杆菌特异靶基因序列为SEQID NO：1、4和/或5时，利用引物对Cor-F2/Cor-R2对16例肿瘤患者与16例健康人检测结果的箱形图和ROC曲线。
图5A和图5B分别示出了根据本发明的实施例中棒状杆菌特异靶基因序列为SEQID NO:2和/或3时，利用引物对Cor-F5/Cor-R5对16例肿瘤患者与16例健康人检测结果的箱形图和ROC曲线。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
根据目前已开展的研究，人们对尿液中的微生物的存在与膀胱癌之间的关系的基本认知是，膀胱癌患者与健康个体之间的微生物菌种丰度会发生变化，但不同的研究结论不同，因而目前尚无膀胱癌标志物的定论。
为了改善上述现状，并从尿液中寻找到潜在的膀胱癌标志物，本申请发明人开展了一项关于膀胱癌尿液菌群的研究，采用16S rDNA扩增子测序对46例膀胱癌患者和47例健康个体的尿液菌群进行了分析比对，分析显示：
(1)菌群多样性和整体组成在两组间有显著性差异(而目前已公开的文章多数认为尿液菌群多样性和整体组成在两组间无显著差异，发明人经过分析认为，导致这种结果差异的原因可能与文章所用样本量少有关)；
(2)并且鉴定出两组间存在显著丰度差异的菌属。发现其中棒状杆菌(Corynebacterium)与膀胱癌有很强的相关性。
由于研究疾病的不同阶段中微生物组成分的改变能够作为一种新的用于癌症诊断及预后监测的手段，因此本研究进一步通过测定膀胱癌中棒状杆菌的特定基因，寻找到了与膀胱癌的发生与发展进行诊断和监测的标志物。
在此基础上，在有健康对照的人群中，对棒状杆菌的多个特异性基因进行了定量PCR(qPCR)检测，确定基因的量，分析并验证了这些基因预测膀胱癌的概率。综合上述研究结果，发现对棒状杆菌特异性基因进行检测，能够用来开发膀胱癌患者的尿液微生物基因检测试剂盒，为广大人群提供快速简便的膀胱癌诊断的产品。
因此，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种尿液微生物标志物在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用，尿液微生物标志物为尿液中的棒状杆菌。根据本申请的研究结果，发现了棒状杆菌在健康人群与膀胱癌患者中的强相关性，且具有较高的预测概率，因而将棒状杆菌作为尿液中的微生物标志物，来制备用于检测膀胱癌的检测产品，具有低成本且无创的优势。
以尿液中的棒状杆菌为微生物标志物，能够用来开发检测膀胱癌的多种相关检测产品，根据不同需要可以开发出检测试剂、检测试剂盒或者检测芯片等。具体开发可以围绕尿液微生物菌群中该棒状杆菌所具有的特异性的分子进行开发。比如特异性基因序列。在本申请中，优选围绕该尿液棒状杆菌特异性的基因序列进行开发。
在一种优选的实施例中，上述尿液微生物标志物为棒状杆菌属的特异性序列。具体的特异性序列可以通过序列比对进行选择，尤其是通过能够区分菌种类别的16S rDNA的序列来进行开发。但此处并不局限于16S rDNA的序列，任何能够特异性标志棒状杆菌属的序列均可以用来进行检测。
本申请中，通过对健康人群和膀胱癌患者人群的尿液微生物的16S rDNA进行测序分析，发现了在膀胱癌样本的测序结果中有5条序列频率相对较高的棒状杆菌属的特异性序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5的序列)。因此，在本申请一种优选的实施例中，特异性序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5中的任一种。这5条序列均可以用来作为检测膀胱癌的检测对象，或检测试剂开发的基础。这5条序列在分析结果中的检出频率(此处指的是16s rDNA测序检测到该特异序列的数目)如下：SEQID NO:1为18,060；SEQ ID NO:2为7,300；SEQ ID NO:3为7,149；SEQ ID NO:4为6,575；；SEQID NO:5为5,845。更优选的特异性序列为SEQ ID NO:1。
上述5条序列的检测频率在所有棒状杆菌属的序列中排序为前5，因而，这5条序列中的任意一条序列即可特异性地代表棒状杆菌属。根据实际应用时具体选择的序列，可以设计相应的检测引物进行检测。具体地，在设计引物时，可以针对这5条序列中单一的一条进行引物设计，也可以针对这5条序列中的两条或两条以上进行引物设计。引物设计时，参照现有设计引物的原则及注意事项进行设计即可。设计好的具体引物可以通过对膀胱癌患者人群及健康人群进行检测比较来确认其检测的灵敏度和特异性。
在本申请一种优选的实施例中，检测产品包括检测特异性序列的检测引物，尤其是针对SEQ ID NO:1所示的特异性序列的检测引物。具体的检测引物可以针对该序列设计多种，比如，检测引物包括但不限于如下引物对中的任意一对：(1)SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7；(2)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；(3)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；(4)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7以及(5)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。在本申请中，根据对膀胱癌的预测准确性，优选(4)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7组成的引物对的检测引物。
上述的应用中，提及的检测包括诊断检测、进展监测及预后检测中的一种或多种；优选地，采用荧光定量PCR的方法进行检测。
目前通过尿液菌群来筛查膀胱癌(或扩大到泌尿***)的仅限于文献研究，而且报道文章数量也是有限，且文献中提到的筛查方法都是基于测序，本发明使用的qPCR的检测方法(检测步骤可见实施例)的检测成本相当低，每个反应50元人民币。而且，检测准确率相对高。以第(1)对检测引物对为例，检测准确率AUC为0.898(灵敏度和特异性分别为87.5％和81.2％)，明显优于膀胱癌临床上的现有筛查方法(尿脱落细胞学筛查)。
在上述应用中，除了利用棒状杆菌及其特异性序列开发出第一代检测产品外，还可以在第一代检测产品的基础上，以第一代检测产品为参照，进一步开发新的检测产品。即优选上述应用还包括：以检测尿液中的棒状杆菌的相关检测产品为参照，筛选或开发新的检测产品。
以针对棒状杆菌属特异性序列SEQ ID NO:1开发了第(4)对检测引物对为例，还可以以该引物对扩增待测尿液样品中的检测结果为对照，来筛选其他潜在的能够作为膀胱癌尿液微生物检测的标志物。
如上述，以棒状杆菌作为尿液微生物标志物能够开发的相关检测产品可以为试剂、试剂盒或芯片。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种检测膀胱癌的试剂盒或芯片，该试剂盒或芯片包括检测尿液中的棒状杆菌的试剂。
在一种优选的实施例中，该试剂盒或芯片包括检测尿液中的棒状杆菌的特异性序列的检测试剂；优选地，特异性序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4及SEQ ID NO:5中的任一种。最优选为SEQ ID NO:1。
在另一种优选的实施例中，检测试剂包括检测特异性序列的检测引物，更优选检测引物选自如下引物对中的任意一对：(1)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；(2)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；(3)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；(4)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7以及(5)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。最优选为第(4)对。
为使检测更方便，在一种优选实施例中，该试剂盒进一步包括如下任意一种或多种：阳性标准品、PCR反应相关试剂、尿液采集器以及提取尿液中DNA相关试剂；优选地，阳性标准品为质粒标准品，更优选质粒标准品为含有SEQ ID NO:1所示序列的质粒标准品，进一步优选地，质粒标准品以干粉形式保存；优选地，PCR反应相关试剂为荧光定量PCR反应相关试剂；更优选地，PCR反应相关试剂包括如下任意一种或多种：DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTPs、荧光染料及可选的去离子水；进一步优选地，DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液及dNTPs以DNA聚合酶预混液的形式存在，荧光染料为ROX Reference Dye；更进一步优选地，DNA聚合酶选自TAKARA的SYBR Premix Ex Taq II。
上述尿液采集器可以是采集管或采集杯，可以是有刻度的，也可以是无刻度的，可以是手动的，也可以是自动的。尿液中DNA提取的相关试剂可以采用现有的DNA提取试剂盒或自行配制的DNA提取液。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1筛选与膀胱癌相关的尿液微生物
对46例膀胱癌患者和47例健康个体的尿液菌群的16S r DNA进行了测序分析，分析显示：菌群多样性和整体组成在两组间有显著性差异，且鉴定出两组间存在显著丰度差异的菌属，其中，棒状杆菌与膀胱癌有很强的相关性(具体参见图1，其中，纵坐标代表菌的丰度的百分比，P＜0.5说明两组间具有显著差异)。
根据上述相关性强弱，挑选了5个检测频率相对较高的棒状杆菌属特异序列(具体见表1)，并选择这5个棒状杆菌16S r DNA的序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO：5)作为特异性序列进行了验证(见实施例2)。
表1：Corynebacterium菌筛选的特异基因序列
上述5条特异性序列的检出频率如下：SEQ ID NO:1为18,060；SEQ ID NO:2为7,300；SEQ ID NO:3为7,149；SEQ ID NO:4为6,575；SEQ ID NO:5为5,845。
实施例2验证棒状杆菌属特异性序列与膀胱癌的相关性
1.本实施例采用的验证方法为：扩大群体验证，小试采用23例膀胱癌患者和24例健康个体来验证筛选出的特异性序列。
2.原材料准备包括：引物设计及测试；阳性标准品的订购，具体如下：
1)引物设计：采用oligo7软件对筛选得到的特异菌群的特异序列进行引物设计，尽可能满足重要原则的基础上，要求上下引物扩增产物在70bp～200bp，每个基因设计各2～6套引物，表2示出了针对特异靶基因序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5设计出的引物序列SEQ ID NO：6-12；以及针对特异靶基因序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3设计出的引物序列SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。
2)引物测试：引物测试通过普通PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测其条带，若目的条带大小与预期一致且条带单一，说明引物特异性好。
3)阳性标准品的订购：商业公司合成本发明提供的特异菌的基因序列，作为阳性标准品；阳性标准品加入一定量的超纯水，采用Q-bit定量后，-20℃保存；用时进一步等梯度稀释到工作液浓度。
表2：针对SEQ ID NO:1至SEQ ID NO：5所示的特异靶基因序列的检测引物
3.qPCR实验检测：根据现有流程进行试剂配置及上机操作。具体步骤如下：
使用23例膀胱癌病人尿液DNA和24例健康人尿液DNA进行qPCR检测(所使用的试剂为：SYBR Premix Ex Taq(TM)II(Perfect Real Time)货号:DRR081A)。
本实施例使用的是标准曲线法，采用的标准品为含有SEQ ID NO:1的序列，阳性标准品即为将这些序列克隆到载体上的质粒，具体由商业公司合成(南京金斯瑞公司，标准载体pUC57)。商业公司寄过来的质粒标准品为干粉，将干粉离心后稀释，测定其浓度后换算为对应的拷贝数，然后进行梯度稀释，稀释6个梯度作为标准曲线(标准曲线的横坐标为拷贝数，纵坐标为CT值)。
实验具体操作步骤如下：
1)配制反应液：将引物、DNA模板、ROX Reference Dye、SYBR Premix Ex Taq II(品牌：TAKARA；货号：RR820A)配制成10ul反应液，加入到96孔反应板上，具体如下：
2)qPCR扩增：将96孔板放在qPCR仪(Applied Biosystems公司)上，进行扩增检测；扩增程序为：S1：95℃-30sec预变性；S2：95℃-5sec变性，60℃-30sec退火；S3：重复S2 40次；S4：4℃维持。
3)分析数据：使用qPCR软件(StepOne Software v2.1)导出结果，根据qPCR的定量结果使用R语言对数据进行分析作图，按照病人和健康人画出箱形图(box plot)和ROC曲线；
各检测引物对的具体结果见下表3至表6，以及图2A至图5B。其中，表3和图2A、图2B显示的是Cor-F4/Cor-R4引物对的检测结果。表4和图3A、图3B显示的是Cor-F1/Cor-R1引物对的检测结果。表5和图4A、图4B显示的是Cor-F2/Cor-R2引物对的检测结果。表6和图5A、图5B显示的是Cor-F5/Cor-R5引物对的检测结果。引物对Cor-F3/Cor-R3的PCR扩增特异性较差，此处不再展现具体数据。
表3：所用引物为Cor-F4/Cor-R4时，16例健康人和16例病人的qPCR检测结果。
注：表中“-”代表检测结果高于cut off值，判断结果为正常；“+”代表检测结果低于cut off值，判断结果为膀胱癌肿瘤患者。
其中，图2A是箱形图，显示膀胱癌病人和健康人两组数据的分散情况；图中横坐标代表膀胱癌和健康人两类人群，纵坐标代表富集度。1)每个箱的最下面一条线代表下四分位数；中间那条线代表中位数；最上面那条线代表上四分位数；两个人群的中位数差距越大，代表两个人群区分的越开，该肿瘤标志物的检测效率越高。2)图中每个点代表QPCR检测结果经过进一步计算对应的值。
图2B是接收者操作特征曲线(ROC曲线)，图中横坐标代表特异性，纵坐标代表敏感性；中间那条对角线代表AUC＝0.5的情况，图中得到的AUC为0.898，说明该肿瘤标志物检测效果较好。图中圈起来的点即为灵敏度和特异性最佳的点，灵敏度和特异性分别为87.5％和81.2％，对应的qPCR的cut off值为367.829(qPCR得到的数量(quantity值)小于等于该值即可判断为膀胱癌病人，大于该值可判断为正常，此处qPCR所得的数量(quantity值)，即为标准曲线得出的绝对值。
表4：所用引物对为Cor-F1/Cor-R1时，24例健康人和23例膀胱癌病人的qPCR检测结果。
注：表中“-”代表检测结果高于cut off值，判断结果为正常；“+”代表检测结果低于cut off值，判断结果为膀胱癌肿瘤患者。
图3A显示的是引物对为Cor-F1/Cor-R1对健康人和膀胱癌患者检测的箱形图，从图3A可以看出，两组的中位数有一定的差距，但与图2A中的差距相比较小。
图3B显示的ROC曲线，其中AUC为0.724(灵敏度和特异性最佳的点，分别为45.8％和95.8％)。
表5：引物对为Cor-F2/Cor-R2时，16例健康人和16例膀胱癌病人的qPCR检测结果
注：表中“-”代表检测结果高于cut off值，判断结果为正常；“+”代表检测结果低于cut off值，判断结果为膀胱癌肿瘤患者。
图4A显示的是引物对为Cor-F2/Cor-R2对健康人和膀胱癌患者检测的箱形图，从图4A可以看出，两组的中位数差距较小。图4B显示的是ROC曲线，其中AUC为0.520(灵敏度和特异性最佳的点，分别为43.8％和81.2％)。
表6：所用引物为Cor-F5/Cor-R5时，16例正常人和16例膀胱癌病人的qPCR检测结果如下：
注：表中“-”代表检测结果高于cut off值，判断结果为正常；“+”代表检测结果低于cut off值，判断结果为膀胱癌肿瘤患者。
图5A显示的是引物对为Cor-F5/Cor-R5对健康人和膀胱癌患者检测的箱形图。图5B显示的是ROC曲线，其中AUC为0.612(灵敏度和特异性最佳的点，分别为40.3％和82％)。
4.分析评估：计算这些基因标志物，预测膀胱癌的灵敏度和特异性。
从上述五个引物对对SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5的特异性序列进行qPCR扩增预测膀胱癌的灵敏度和特异性可以看出，5条特异性序列都能作为棒状杆菌属的特异性基因序列进行检测产品的开发和利用。
进一步比较所设计的五对引物可见，除了Cor-F3/Cor-R3因qPCR扩增特异性差外，其余三对引物对健康人群和膀胱癌患者群体的检测特异性均能达到81％以上，因而均能从一定程度上区分健康人群和膀胱癌患者群体，尽管在检测灵敏度上存在一些差异。其中，引物对Cor-F4/Cor-R4的检测效果最佳，灵敏度和特异性均比较高。
由此可见，在一种最佳的实施方案中，以相对丰度最高的SEQ ID NO:1所示的棒状杆菌的特异性序列作为尿液中膀胱癌的微生物标志物(此处也可以是以SEQ ID NO：1、SEQID NO：4及SEQ ID NO：5中任意一条、两条或三条作为微生物标志物)，并利用引物对Cor-F4/Cor-R4通过qPCR检测的数量(quantity值)经过进一步计算得到的AUC为0.898(灵敏度和特异性分别为87.5％和81.2％)，表明使用该特异性序列及该检测引物对组合来检测尿液中的棒状杆菌属，能够高效、低成本无创地实现对膀胱癌的检测，且检测效果优于传统的脱落细胞筛查法。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过以尿液微生物中棒状杆菌(Corynebacterium)为标志物，开发相应的检测引物等相应的检测产品来筛查膀胱癌，无创、成本低、操作简单、灵敏度高且检测周期快。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 棒状杆菌作为尿液微生物标志物在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用
<130> PN140274HDSM
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 320
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<400> 1
tacgtagggt gcgagcgttg tccggaatta ctgggcgtaa agagctcgta ggtggtttgt 60
cgcgtcgtct gtgaaattcc ggggcttaac tccgggcgtg caggcgatac gggcataact 120
tgagtgctgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 180
ggaacaccga tggcgaaggc aggtctctgg gcagtaactg acgctgagga gcgaaagcat 240
gggtagcgaa caggattaga aaccccagta gtccaagtcg gaggccaagc gttagaagac 300
aaataaggca gtcaactcct 320
<210> 2
<211> 320
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<400> 2
tacgtagggt gcgagcgttg tccggattta ctgggcgtaa agggctcgta ggtggtgtgt 60
tgcgtcgtct gtgtaatcca ggggcttaac ttttggttgg caggcgatac gggcattgct 120
tgagtgctgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 180
ggaacaccga tggcgaaggc aggtctctgg gcagttactg acgctgagga gcgagagcat 240
gggtagcgaa caggattaga taccccagta gtccaagtcg gaggcggtct taggaagaca 300
acatcatttt tcaactcctt 320
<210> 3
<211> 320
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<400> 3
tacgtagggt gcgagcgttg tccggattta ctgggcgtaa agggctcgta ggtggtgtgt 60
tgcgtcgtct gtgtaatcca ggggcttaac ttttggttgg caggcgatac gggcattgct 120
tgagtgctgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 180
ggaacaccga tggcgaaggc aggtctctgg gcagttactg acgctgagga gcgagagcat 240
gggtagcgaa caggattaga aaccccagta gtccaagtcg gacagcggtc ttaggaagac 300
aatacaccag ttcaactcct 320
<210> 4
<211> 320
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<400> 4
tacgtagggt gcgagcgttg tccggaatta ctgggcgtaa agagctcgta ggtggtttgt 60
cgcgtcgtct gtgaaattcc ggggcttaac tccgggcgtg caggcgatac gggcataact 120
tgagtgctgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 180
ggaacaccga tggcgaaggc aggtctctgg gcagttactg acgctgagga gcgaaagcat 240
gggtagcgaa caggattaga taccccagta gtccaagtcg gaggccaagc ttaggaagac 300
aagactcact gacaactcct 320
<210> 5
<211> 320
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<400> 5
tacgtagggt gcgagcgttg tccggaatta ctgggcgtaa agggctcgta ggtggtttgt 60
cgcgtcgtct gtgaaattcc ggggcttaac tccgggcgtg caggcgatac gggcataact 120
tgagtactgt aggggtaact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 180
ggaacaccga tggcgaaggc aggttactgg gcagttactg acgctgagga gcgaaagcat 240
gggtagcgaa caggattaga aacccgagta gtccaagtcg gaccagcggt cttagggaga 300
caaggcatat tatcaactcc 320
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> Cor-F1
<400> 6
gcagatatca ggaggaacac cgat 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> Cor-R1/Cor-R4
<400> 7
taatcctgtt cgctacccat gctt 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> Cor-F2
<400> 8
cgcgtcgtct gtgaaattcc g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> Cor-R2
<400> 9
cgcatttcac cgctacacca g 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> Cor-F3
<400> 10
atacgggcat aacttgagtg ctgt 24
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> Cor-R3
<400> 11
ttctaacgct tggcctccga ct 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> Cor-F4
<400> 12
atatcaggag gaacaccgat ggc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> Cor-F5
<400> 13
ttgcgtcgtc tgtgtaatcc a 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 棒状杆菌(corynebacterium)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> Cor-R5
<400> 14
cgcatttcac cgctacacc 19
Claims (16)
1.一种检测膀胱癌的标志物，其特征在于，所述标志物为尿液微生物标志物，所述尿液微生物标志物为棒状杆菌属的特异性序列，所述特异性序列如下：ATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTA。
2.尿液微生物标志物的检测试剂在制备用于检测膀胱癌的相关检测产品中的应用，所述尿液微生物标志物为棒状杆菌属的特异性序列，所述特异性序列为ATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测产品包括检测所述特异性序列的检测引物，所述检测引物如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性序列存在于SEQ ID NO:1所示的靶标基因序列内。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测包括诊断检测、进展监测及预后检测中的一种或多种。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用荧光定量PCR的方法进行所述检测。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的应用，其特征在于，所述相关检测产品为试剂盒。
8.一种检测膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测尿液中的棒状杆菌属的特异性序列的检测引物，所述特异性序列为
ATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTA，
所述检测引物为如下引物对：SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:7。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下任意一种或多种：阳性标准品、PCR反应相关试剂、尿液采集器以及提取所述尿液中DNA的相关试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为质粒标准品。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒标准品为含有SEQ ID NO:1所示序列的质粒标准品。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒标准品以干粉形式保存。
13.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应相关试剂为荧光定量PCR反应相关试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，
所述PCR反应相关试剂包括如下任意一种或多种：DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTPs、荧光染料及可选的去离子水。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，
所述DNA聚合酶、所述DNA聚合酶缓冲液及所述dNTPs以DNA聚合酶预混液的形式存在，荧光染料为ROX Reference Dye。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，
所述DNA聚合酶选自TAKARA 的SYBR Premix Ex Taq II。
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