CN114674947A - 一种快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，它是通过液相色谱法建立特征图谱，并以野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚为含量指标成分。本发明方法操作简单，重现性、稳定性好，回收率可靠，检测成本低，检测效率高，以期为规范半夏厚朴汤物质基准、制剂质量及合理开发提供依据。

Description

一种快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的检测方法，具体为一种快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法。

背景技术

半夏厚朴汤出自汉代张仲景的《金匮要略》中，在2018年被列入经典名方第一批目录第17首，是治疗“梅核气”的临床经典验方，全方由半夏、厚朴、茯苓、干紫苏及生姜组成，具有行气散结，降逆化痰之功效。现代临床研究表明，半夏厚朴汤在治疗胃食管反流病、慢性胃炎、功能性消化不良、支气管哮喘、咳嗽、慢性咽炎及抗抑郁症等方面具有显著疗效。

标准汤剂是用于衡量中药复方制剂与临床汤剂质量一致的物质基准，是经典名方研究的核心理念，即标准汤剂的质量高低直接关系到生产转化后中药复方制剂的质量优劣。在质量标准控面，半夏厚朴汤的已有文献大部分表征的药味主要集中在臣药厚朴，多以厚朴酚、和厚朴酚为主要质控指标，缺少对处方其它药味或多个指标成分的检测和控制。在特征或指纹图谱方面，目前少有文献关于半夏厚朴汤特征或指纹图谱的研究。

专利CN113341010A建立了半夏厚朴汤质量控制方法，分别用于控制半夏厚朴汤制剂的含量和特征图谱方法，其含量测定建立了厚朴酚、和厚朴酚、迷迭香酸、6-姜辣素4个指标成分的测定方法，其中6-姜辣素成分不具有专属性，会受到姜半夏(生姜炮制品)的干扰，难以有效控制复方中姜半夏和生姜的质量；其特征图谱采用HPLC检测，时间较长(150分钟)，检测成本较高，且个别特征的峰分离度不佳，有待优化。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，通过所述方法测定4个含量指标成分及12个特征峰的特征图谱，为经典名方半夏厚朴汤物质基准和复方制剂的质量控制提供了简便、快捷、有效的检测方法。

技术方案：本发明所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取半夏厚朴汤标准汤剂，加有机溶剂提取，摇匀，滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液；

(2)参照物溶液的制备：取野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加溶剂溶解，即得所述参照物溶液；

(3)进样检测：用液相色谱仪检测供试品溶液和参照物溶液，分别采用以下两种色谱条件(a)、(b)；

(4)计算含量：采用(3)中(a)的色谱条件所得图谱通过外标法计算迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的含量，采用(3)中(b)的色谱条件所得图谱通过外标法计算野黄芩苷含量；

(5)特征图谱的建立：检测多批次的半夏厚朴汤标准汤剂供试品溶液，取采用(3)中(a)的色谱条件所得图谱，选择不同批次的半夏厚朴汤标准汤剂中均存在的色谱峰作为特征峰，制定特征图谱。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，所述半夏厚朴汤标准汤剂包括半夏厚朴汤的水煎液或称提取液、浸膏或称浓缩液、冻干粉。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，两种色谱条件具体为：

(a)十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～4min，2％～7％A；4～13min，7％～17％A；13～19min，17％A；19～23min，17％～23％A；23～38min，23％～34％A；38～42min，34％A；42～55min，34％～45％A；55～68min，45％～90％A)；(b)十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈-0.2％甲酸为流动相等度洗脱。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，还包括：(6)将待测的供试品溶液进行步骤(3)的进样检测，将采用(3)中(a)的色谱条件所得图谱与特征图谱进行比较，识别所具有的特征峰数量，确定相似度；同时，以野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚为含量指标成分综合评价标准汤剂质量。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，(1)中所述有机溶剂为体积浓度为30～75％甲醇水溶液，提取时间为15～45分钟，提取方式为超声处理、振摇提取、加热回流；提取体积为15ml～50ml。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，(3)中所述液相色谱仪为超高效液相色谱仪。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，(3)中(a)采用紫外检测器，柱温为20～30℃，流速为每分钟0.25～0.4ml，检测波长280nm-330nm；(b)采用紫外检测器，柱温为20～30℃，流速为每分钟0.25～0.4ml，检测波长280nm-330nm。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，(5)中所述特征图谱具有12个特征峰F1-F12，以相对保留时间F2为1，F1的相对保留时间为0.330-0.385，以相对保留时间F9为1，F3-F12的相对保留时间分别为0.580-0.620、0.640-0.652、0.655-0.680、0.700-0.730、0.790-0.820、0.830-0.865、1.000、1.370-1.420、1.430-1.495、1.470-1.530。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，在液相色谱法检测后再进行薄层检测。

所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，所述薄层检测，具体包括以下步骤：

(1)薄层供试品溶液的制备：取半夏厚朴汤标准汤剂，加有机溶剂提取，摇匀，滤过，蒸干，加甲醇溶解，即得所述供试品溶液；

(2)薄层对照溶液的制备：紫苏叶对照药材溶液、生姜对照药材溶液；按照半夏厚朴汤组方，配置缺紫苏叶、缺生姜阴性对照组，加甲醇溶解，作为阴性对照品溶液；

(3)测定：吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光下检视。

本发明所述的半夏厚朴汤标准汤剂包括水煎液(提取液)、浸膏(浓缩液)、冻干粉，具体的制备方法如下：称取姜半夏15g、姜厚朴9g、茯苓12g、紫苏叶6g、生姜15g，分别置于各煎药壶中，加水1200～1600mL，浸泡30-40min，武火煮沸，文火保沸至煎液600～800mL，停止加热，200～350目标准筛过滤，得提取液。将提取液进行减压浓缩(55～75℃)至比重为1.01～1.05，得浓缩液。将浓缩液冷冻干燥，得半夏厚朴汤冻干粉。

有益效果：(1)本发明采用超高液相色谱法，并对色谱条件进行合理优化，建立半夏厚朴汤冻干粉的12个特征峰的特征图谱并检测指标成分含量，为半夏厚朴汤物质基准的质量控制提供新的分析手段，是半夏厚朴汤标准汤剂整体质量控制的有效手段。(2)本发明方法以野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚为含量指标成分并建立其特征图谱、薄层鉴别，适用于采用水煎煮或提取制备的经典名方半夏厚朴汤物质基准。(3)本发明方法操作简单，重现性、稳定性好，回收率可靠，检测成本低，检测效率高，以期为规范半夏厚朴汤物质基准及制剂市场和合理开发提供依据。(4)较发明较专利CN113341010A，新增野黄芩苷含量指标的检测，对半夏厚朴汤物质基准及其制剂的质量控制指标具有重要意义。样品处理方法简单，采用一套供试品处理方法，同时满足4个指标成分和特征图谱的检测需求。所建立得特征图谱测定方法，可测定4个药味中的12个特征，不仅能表征君药姜半夏、臣药厚朴和佐使药紫苏叶、生姜的成分，并能够同时测定厚朴和紫苏叶中的3个专属性成分(厚朴酚、和厚朴酚、迷迭香酸)。

附图说明

图1为半夏厚朴汤冻干粉特征图谱对照品检测图；

图2为野黄芩苷含量测定对照品检测图；

图3为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定采用不同提取溶剂色谱图；

图4为野黄芩苷含量测定采用不同提取溶剂的色谱图；

图5为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定采用不同提取方式的色谱图；

图6为野黄芩苷含量测定采用不同提取方式的色谱图；

图7为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定采用不同提取体积的色谱图；

图8为野黄芩苷含量测定采用不同提取体积的色谱图；

图9为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定采用不同提取时间的色谱图；

图10为野黄芩苷含量测定采用不同提取时间的色谱图；

图11为15批半夏厚朴汤物质基准特征图谱色谱图；

图12为野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚线性关系图；

图13为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定专属性考察色谱图；

图14为野黄芩苷含量测定专属性考察色谱图；

图15为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定不同流速考察色谱图；

图16为野黄芩苷含量测定不同流速考察色谱图；

图17为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定不同色谱柱温度考察色谱图；

图18为野黄芩苷含量测定不同色谱柱温度考察色谱图；

图19为迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定不同色谱柱考察色谱图；

图20为半夏厚朴汤中紫苏、生姜的不同制备方法薄层鉴别；其中1～3-半夏厚朴汤(JDG-BXHP-20210525-F1-3)，S1～S3-紫苏叶对照药，S4～S6-干姜对照药材；

图21为半夏厚朴汤中紫苏、生姜的不同点样量薄层鉴别，其中1-半夏厚朴汤(JDG-BXHP-20210525-F1-3)：1(1μl)、2(3μl)、3(5μl)、4(8μl)5；4-缺紫苏阴性对照，6-缺生姜阴性对照，S1-紫苏对照药材，S2-干姜对照药材；

图22为半夏厚朴汤中紫苏、生姜的专属性薄层鉴别，其中1-半夏厚朴汤(F1)2-半夏厚朴汤(F2)，3-半夏厚朴汤(F3)，4-缺紫苏阴性对照，5-缺生姜阴性对照，S1-紫苏对照药材，S2-干姜对照药材；

图23为半夏厚朴汤中紫苏、生姜的不同温度薄层鉴别，其中1-半夏厚朴汤(F1)2-半夏厚朴汤(F2)，3-半夏厚朴汤(F3)，4-缺紫苏阴性对照，5-缺生姜阴性对照，S1-紫苏对照药材，S2-干姜对照药材；

图24为半夏厚朴汤中紫苏、生姜的不同湿度薄层鉴别，其中1-半夏厚朴汤(F1)2-半夏厚朴汤(F2)，3-半夏厚朴汤(F3)，4-缺紫苏阴性对照，5-缺生姜阴性对照，S1-紫苏对照药材，S2-干姜对照药材；

图25为半夏厚朴汤中紫苏、生姜的不同厂家薄层板鉴别，其中1-半夏厚朴汤(F1)2-半夏厚朴汤(F2)，3-半夏厚朴汤(F3)，4-缺紫苏阴性对照，5-缺生姜阴性对照，S1-紫苏对照药材，S2-干姜对照药材。

具体实施方式

实施例1

半夏厚朴汤标准汤剂含量测定方法及指纹图谱的构建

1.试剂与样品

野黄芩苷(批号110842-201709)购自中国食品药品检定研究所，供含量测定用，含量以91.7％计，使用前无须处理。

迷迭香酸(批号111871-201505)购自中国食品药品检定研究所，供含量测定用，含量以98.5％计，使用前无须处理。

厚朴酚(批号110729-201714)购自中国食品药品检定研究所，供含量测定用，含量以100.0％计，使用前无须处理。

和厚朴酚(批号110730-201614)购自中国食品药品检定研究所，供含量测定用，含量以99.3％计，使用前无须处理。

咖啡酸(批号110885-200102)购自中国食品药品检定研究所，供含量测定用，含量以99.7％计，使用前无须处理。

6-姜辣素(批号111833-202007)购自中国食品药品检定研究所，供含量测定用，含量以99.3％计，使用前无须处理。

药材、饮片、半夏厚朴汤冻干粉由江阴市天江药业有限公司提供。

2.对照品溶液的制备

取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含野黄芩苷10μg的溶液，即得野黄芩苷对照品溶液。取迷迭香酸对照品、厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含22μg迷迭香酸、10μg厚朴酚、10μg厚朴酚、10μg野黄芩苷的混合对照品溶液。取野黄芩苷对照品，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含9μg的对照品溶液。另外称取咖啡酸对照品、6-姜辣素对照品适量，加50％甲醇制成10μg咖啡酸和10μg 6-姜辣素对照品溶液。

3.供试品溶液的制备

取本品冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，50％甲醇补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.分析方法的确定

4.1特征及含量测定色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～4min，2％～7％A；4～13min，7％～17％A；13～19min，17％A；19～23min，17％～23％A；23～38min，23％～34％A；38～42min，34％A；42～55min，34％～45％A；55～68min，45％～90％A)，流速0.3ml·min-1，柱温25℃，进样量2μl，检测波长280nm。

将含有野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、厚朴酚的混合对照品溶液、咖啡酸、6-姜辣素进样检测，图谱见图1。结果显示，检测基线平稳，目标成分分离度良好。

4.2野黄芩苷含量测定色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为2.2μm)，以乙腈-0.2％甲酸(18∶82)洗脱，流速0.35ml·min^-1，柱温25℃，进样量2μl，检测波长330nm。

将上述野黄芩苷对照品溶液进样检测，图谱见图2。结果显示，检测基线平稳，目标成分分离度良好，检测时间15分钟内可完成。

4.3供试品溶液的制备

(1)提取溶剂的考察

结论：采用甲醇、75％甲醇、50％甲醇、10％甲醇作为提取溶剂时，在甲醇中野黄芩苷及迷迭香酸含量偏低，在10％甲醇中厚朴酚及和厚朴酚的含量偏低，50％甲醇与75％甲醇含量差别不大；考虑到迷迭香酸是水溶性成分，厚朴酚与和厚朴酚是脂溶性成分，兼顾各成分的溶解性，因此选择50％甲醇作为半夏厚朴汤野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚含量测定的提取溶剂。

考察方法：取本品粉末约0.2g，平行4组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇各25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量，结果见表1、图3，按“4.2”项下色谱条件进样，计算野黄芩苷含量，结果见表2、图4。

表1迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定不同提取溶剂的比较

表2野黄芩苷含量测定不同提取溶剂的比较

(2)提取方式的考察

结论：当采用超声处理、加热回流、振摇提取时，野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚含量无显著差异，表明不同时间提取效率相近，考虑到超声处理操作简便，因此选择超声处理。

考察方法：取本品粉末约0.2g，共3组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流、振摇提取30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量，结果见表3、图5，按“4.2”项下色谱条件进样，计算野黄芩苷含量，结果见表4、图6。

表3迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定提取方式的比较

表4野黄芩苷含量测定提取方式的比较

(3)提取溶剂体积的考察

结论：当提取体积为15ml、25ml、50ml时，野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的含量相差不大，说明提取溶剂为15ml时已经提取较为充分。考虑到不同批次样品差异，为确保提取充分，因此溶剂加入量选择25ml。

考察方法：取本品粉末约0.2g，共3组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇15ml、25ml、50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量，结果见表5、图7，按“4.2”项下色谱条件进样，计算野黄芩苷含量，结果见表6、图8。

表5迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定提取体积的比较

表6野黄芩苷含量测定提取体积的比较

(4)提取时间的考察

结论：不同超声处理时间，野黄芩苷、迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量相差不大，说明提取时间为15分钟时已经提取较为充分。考虑到不同批次样品差异，为确保提取充分，提取时间采用30分钟。

考察方法：取本品粉末约0.2g，共3组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2μl，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量，结果见表7、图9，按“4.2”项下色谱条件进样，计算野黄芩苷含量，结果见表8、图10。

表7迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定提取时间的比较

表8野黄芩苷含量测定提取时间的比较

最终确定供试品溶液的制备方法为：

取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(5)不同批次的检测

取不同批次样品15批，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按“4.1”项下色谱条件进样分析，测定迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的峰面积及及共有峰的特征数据，计算其含量、相对峰面积、相对保留时间，结果见表9～13、图11，按“4.2”项下色谱条件进样分析，记录野黄芩苷峰面积，计算其含量，见表9中野黄芩苷含量。具体结果如下：

表9不同批次半夏厚朴汤物质基准野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚与和厚朴酚的总量含量结果

表10不同批次半夏厚朴汤物质基准特征峰面积数据

表11不同批次半夏厚朴汤物质基准特征相对峰面积数据

表12不同批次半夏厚朴汤物质基准特征保留时间数据

表13不同批次半夏厚朴汤物质基准特征相对保留时间数据

实施例2

含量测定构建方法的方法学验证

1.线性关系

结果表明：野黄芩苷进样量在0.00186～0.05574μg范围内，迷迭香酸进样量在0.00432～0.12967μg范围内，厚朴酚进样量0.00196～0.05868μg范围内，和厚朴酚进样量0.00197～0.05922μg范围内，其进样量与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取迷迭香酸对照品溶液(浓度为21.6109μg/ml)、厚朴酚对照品溶液(浓度为9.78μg/ml)、和厚朴酚对照品溶液(浓度为9.8704μg/ml)0.2、0.5、1.0、1.5、2、3、4、5、6μl，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：迷迭香酸Y＝-5669.0013x+6161960.758，R＝0.99999，厚朴酚Y＝-1615.9369x+4197770.926，R＝0.99998，和厚朴酚Y＝-1504.4128x+4429822.829，R＝0.99998，结果见表14、图12。精密吸取野黄芩苷对照品溶液(浓度为18.5784μg/ml)0.1、0.2、0.5、1、2、3μl，注入液相色谱仪，按“4.2”项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线。求得回归方程：野黄芩苷Y＝143.32x+0.0246，R＝0.99998，结果见表15、图12。

表14迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚对照品峰面积与进样量关系

表15野黄芩苷对照品峰面积与进样量关系

2.精密度试验

2.1仪器精密度试验

结果：峰面积RSD＜2.0％，仪器精密度试验良好。

精密半夏厚朴汤物质基准供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，连续进样6次，记录迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的测量值，按“4.2”项下色谱条件进样，连续进样6次，记录野黄芩苷峰面积的测量值，计算相对标准偏差，结果见表16。

表16仪器精密度试验

2.2重复性试验

结果：野黄芩苷、迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量RSD＜2.0％，重复性试验良好。

取同一批次样品约0.2g，精密称定，平行6份，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按“4.1”项下色谱条件进样分析，测得迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的峰面积，计算迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量及RSD值，结果见表17，按“4.2”项下色谱条件进样分析，测得野黄芩苷的峰面积，计算野黄芩苷含量及RSD值，结果见表18。

表17迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定的重复性试验

表18野黄芩苷含量测定的重复性试验

2.3中间精密度

结果：野黄芩苷、迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含量RSD＜2.0％，中间精密度试验良好。

取同一批次样品3份，分别由不同实验员按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按“4.1”项下色谱条件分别于不同时间在相同仪器上分别进样2μl，测定迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚面积值，并计算迷迭香酸含量、厚朴酚及和厚朴酚总含含量及RSD，结果见表19。按“4.2”项下色谱条件分别于不同时间在不同仪器上分别进样2μl，测定野黄芩苷面积值，并计算野黄芩苷含量及RSD，结果见表20。

表19迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定中间精密度试验

表20野黄芩苷含量测定中间精密度试验

3.准确度试验

结果：野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚平均回收率为92～105％，RSD＜3.0％，准确度试验良好。

取已知含量的样品(迷迭香酸含量0.29％、厚朴酚含量0.10％、和厚朴酚含量0.12％)0.1g，平行9份，精密称定，分别加入与0.1g样品所含迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚相对应的混合对照品溶液，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制成加样回收供试品溶液，按“4.1”项下色谱条件进样，分别进样2μl，以下列公式计算迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚回收率及RSD，结果见表21～23。取已知含量的样品(野黄芩苷含量0.11％)0.1g，平行9份，精密称定，分别加入与0.1g样品所含野黄芩苷对照品溶液，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制成加样回收供试品溶液，按“4.2”项下色谱条件进样，分别进样2μl，以下列公式计算野黄芩苷回收率及RSD，结果见表24。

表21迷迭香酸准确度试验

表22厚朴酚准确度试验

表23和厚朴酚准确度试验

表24野黄芩苷准确度试验

4.专属性试验

结论：由结果可知，空白溶剂对野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的测定没有干扰，该方法专属性强。

取空白溶剂、对照品溶液、半夏厚朴汤物质基准供试品溶液，按“4.1”项下色谱条件进样，结果见图13。按“4.2”项下色谱条件进样，结果见图14。

5.耐用性试验

5.1稳定性试验

结果：供试品溶液在48小时内稳定性良好(RSD％＜2.0％)。

取样品1份，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试液，在0、2、4、6、8、12、18、24、48h小时按“4.1”项下色谱条件进样，进样2μl，测定峰面积值，计算其RSD值。结果见表25。在0、2、4、6、8、12、18、24、48h小时按“4.2”项下色谱条件进样，进样2μl，测定峰面积值，计算其RSD值。结果见表26。

表25迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定供试品稳定性试验测定结果

表26野黄芩苷含量测定供试品稳定性试验测定结果

5.2不同流速考察

结果：流速0.25～0.35ml·min^-1之间，测定结果无差异，耐用性良好。

取样品1份，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察0.25ml·min^-1、0.30ml·min^-1、0.35ml·min^-1三个流速下对色谱峰分离及含量结果的影响。结果见表27、表28、图15、图16。

表27迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定不同流速考察

表28野黄芩苷含量量测定不同流速考察

5.3柱温考察

结果：柱温在20℃～30℃之间，测定结果无显著差异，耐用性良好。

取样品1份，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察20℃、25℃、30℃三个温度，结果见表29、表30、图17、图18。

表29迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定不同柱温的考察

表30野黄芩苷含量测定不同柱温的考察

5.4色谱柱考察

结果：三种不同型号色谱柱的分离效果均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。

取样品1份，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试液，分别采用柱1：HSST3(2.1×100mm，1.8μm)、柱2：Eclipse Plus RRHD C18(2.1×100mm，1.8μm)、柱3：Poroshell C18(2.1×100mm，1.9μm)三种色谱柱进行按“4.1”项下色谱条件进样分析迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚含量，分析结果见表31、图19。另取一根Acclaim^TMRSLCPolarAdvantage II(PA2)按“4.2”项下色谱条件进样分析野黄芩苷含量，分析结果见表32。

表31迷迭香酸含量、厚朴酚与和厚朴酚的总量测定不同色谱柱的比较

表32野黄芩苷含量测定不同色谱柱的比较

实施例3

特征构建方法的方法学验证

1.精密度试验

1.1仪器精密度试验

结果：共有峰相对峰面积、相对保留时间RSD＜5.0％，仪器精密度试验良好。

精密半夏厚朴汤物质基准供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，连续进样6次，记录12个共有峰峰面积、保留时间的测量值，计算相对标准偏差，结果见表33～36。

表33精密度试验峰面积结果

表34精密度试验相对峰面积结果

表35精密度试验保留时间结果

表36精密度试验相对保留时间结果

1.2重复性试验

结果：共有峰相对峰面积、相对保留时间RSD＜5.0％，重复性试验良好。

取同一批次样品约0.2g，精密称定，平行6份，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按“4.1”项下色谱条件进样分析，测得12个共有峰的峰面积、保留时间，计算相对峰面积、相对保留时间的RSD值，结果见表37～40。

表37重复性试验峰面积结果

表38重复性试验相对峰面积结果

表39重复性试验保留时间结果

表40重复性试验相对保留时间结果

1.3中间精密度

结果：共有峰相对峰面积、相对保留时间RSD＜5.0％，中间精密度试验良好。

取同一批次样品3份，分别由不同实验员按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按“4.1”项下色谱条件分别于不同时间在相同仪器上分别进样2μl，测得12个共有峰的峰面积、保留时间，计算相对峰面积、相对保留时间的RSD值，结果见表41～44。

表41中间精密度试验峰面积结果

表42中间精密度试验相对峰面积结果

表43中间精密度试验保留时间结果

表44中间精密度试验相对保留时间结果

2.专属性试验

结论：由结果可知，空白溶剂对特征的测定没有干扰，该方法专属性强。

取空白溶剂、阴性对照溶液、半夏厚朴汤物质基准供试品溶液，按“4.1”项下色谱条件进样，结果见图13。

3.稳定性试验

结果：供试品溶液在48小时内稳定性良好(RSD％＜5.0％)。

取样品1份，按“4.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试液，在0、2、4、6、8、12、18、24、48h小时按“4.1”项下，进样2μl，测得12个共有峰的峰面积、保留时间，计算相对峰面积、相对保留时间的RSD值，结果见表45～48。

表45稳定性试验峰面积结果

表46稳定性试验相对峰面积结果

表47稳定性试验保留时间结果

表48稳定性试验相对保留时间结果

实施例4：标准汤剂的含量测定结果

1.标准汤剂的制备

称取姜半夏15g、姜厚朴9g、茯苓12g、紫苏叶6g、生姜15g，分别置于各煎药壶中，加水1200ml，浸泡30min，武火煮沸，文火保沸至煎液600ml，停止加热，200目标准筛过滤，得提取液。将提取液进行减压浓缩(60℃)至比重为1.01～1.05，得浓缩液。将浓缩液冷冻干燥，得半夏厚朴汤冻干粉。

2.供试品溶液的制备

提取液供试品溶液制备：精密吸取半夏厚朴汤提取液15ml至25ml的容量瓶中，加甲醇，超声处理，定容至刻度线，摇匀，取续滤液，即得。

浓缩液供试品溶液制备：精密称半夏厚朴汤浓缩液3g至20ml的容量瓶中，加50％甲醇，超声处理，用50％甲醇定容至刻度线，摇匀，取续滤液，即得。

冻干粉供试品溶液制备：取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.参照物溶液的制备

取野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含野黄芩苷40μg、迷迭香酸40μg、厚朴酚60μg、厚朴酚20μg的混合对照品溶液。

4.含量测定

采用特征色谱条件检测供试品溶液和参照物溶液，记录峰面积，计算复方提取液、浓缩液、冻干粉野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚含量、转移率。

表49提取液、浓缩液、冻干粉含量结果

实施例5

半夏厚朴汤标准汤剂薄层鉴别测定方法的构建

1.仪器、试剂与样品

薄层自动成像仪(CAMAG TLC VISUALIZER)；超声波清洗器(KQ-250E，昆山市超声仪器有限公司)；千分之一天平(AR223CN，奥豪斯)；硅胶G薄层板(国药集团化学试剂有限公司)；GKC控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；HY-4调速多用振荡器(金坛市科兴仪器厂)。

甲苯(上海凌峰化学试剂有限公司)、硫酸(上海凌峰化学试剂有限公司)、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司)、甲酸(国药集团化学试剂有限公司)、甲醇(国药集团化学试剂有限公司)均为分析纯、水。

紫苏叶对照药材(120914-201712)购于中国食品药品检定研究院。

干姜对照药药材(120942-201911)购于中国食品药品检定研究院。

半夏厚朴汤冻干粉、阴性对照冻干粉由江阴市天江药业有限公司提供。

2.对照溶液的制备

取紫苏叶对照药材1g，加水20ml溶解，过滤，滤液乙酸乙酯萃取两次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇0.5ml溶解，作为紫苏对照药材溶液。

取干姜对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理(功率250W，40kHz)30分钟，滤过，蒸干，加甲醇0.5ml溶解，作为干姜对照药材溶液。

取缺紫苏叶、缺生姜阴性对照各1g，加甲醇20ml，超声处理(功率250W，40kHz)30分钟，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为阴性对照品溶液。

3.供试品溶液的制备

取半夏厚朴汤冻干粉1g，加甲醇20ml，超声处理(功率250W，40kHz)30分钟，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。

4.分析方法的确定

4.1薄层鉴别的测定

吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视。

结果显示，紫苏叶、生姜的鉴别具有专属性。

4.2供试品溶液的制备

(1)制备方法的考察

结论：半夏厚朴汤供试品、干姜对照药材的不同制备方法色谱中，各斑点清晰，相差不大。紫苏叶对照药材中超声、加热回流色谱斑点一致，与供试品溶液相差较大，萃取所得对照品溶液与供试品色谱斑点一致。因此选用超声处理作为半夏厚朴汤供试品、干姜对照药材、阴性对照制备方法，选用乙酸乙酯萃取作为紫苏对照药材制备方法。

考察方法：取半夏厚朴汤冻干粉各1g，平行2份，加甲醇20ml，超声处理(功率250W，40kHz)、加热回流30分钟，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。取半夏厚朴汤冻干粉1g，加水20ml溶解，乙酸乙酯萃取两次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。取紫苏叶对照药材、生姜对照药材各1g，平行3份，同法制得对照药材溶液。吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视，如图20。

(2)不同点样量的考察

结论：半夏厚朴汤的点样量在3～5μl时，色谱斑点清晰，无其他干扰，因此选择半夏厚朴汤的点样量为5μl。

考察方法：取半夏厚朴汤冻干粉1g，加甲醇20ml，超声处理(功率250W，40kHz)、加热回流30分钟，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。取缺紫苏叶、缺生姜、干姜对照药材各1g，同法制得阴性对照、干姜对照药材溶液。取紫苏叶对照药材1g，加水20ml溶解，乙酸乙酯萃取两次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为紫苏叶对照药材溶液。吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视，如图21。

确定半夏厚朴汤中紫苏、生姜的薄层鉴别方法为：

取半夏厚朴汤冻干粉、缺紫苏阴性对照、缺生姜阴性对照1g，加甲醇20ml，超声处理(功率250W，40kHz)30分钟，滤过，蒸干，加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。取干姜对照药材1g，同法制得1ml的干姜对照药材溶液。取紫苏叶对照药材1g，加水20ml溶解，过滤，滤液乙酸乙酯萃取两次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇0.5ml溶解，作为紫苏对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例6

薄层构建方法的方法学验证

1.样品的专属性试验

结果：半夏厚朴汤色谱、缺紫苏阴性、缺生姜阴性、对照药材色谱相应的位置显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。该薄层方法专属性好

吸取半夏厚朴汤、缺紫苏阴性对照、缺生姜阴性对照、紫苏对照药材、干姜对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视，如图22。

2.耐用性试验

2.1不同温度的考察

结果：温度对半夏厚朴汤中紫苏、生姜薄层鉴别无显著影响，说明该薄层鉴别方法对不同温度的耐用性好。

吸取半夏厚朴汤、缺紫苏阴性对照、缺生姜阴性对照、紫苏对照药材、干姜对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，分别在低温和常温条件下展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视，如图23。

2.2不同湿度的考察

结果：湿度对半夏厚朴汤中紫苏、生姜薄层鉴别无影响，该薄层鉴别方法对不同湿度的耐用性好。

吸取半夏厚朴汤、缺紫苏阴性对照、缺生姜阴性对照、紫苏对照药材、干姜对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，分别在不同湿度条件下展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视，如图24。

2.3不同厂家薄层板的考察

结果：不同厂家薄层板对半夏厚朴汤中紫苏、生姜薄层鉴别无影响，说明该薄层鉴别方法对不同厂家薄层板的耐用性好

吸取半夏厚朴汤供试品、缺紫苏阴性对照、缺生姜阴性对照、紫苏对照药材、干姜对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶2∶1)为展开剂，分别在不同厂家薄层板条件下展开，取出，晾干，置紫外光(365nm)下检视，如图25。

Claims (10)

1.一种快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取半夏厚朴汤标准汤剂，加有机溶剂提取，摇匀，滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液；

(2)参照物溶液的制备：取野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加溶剂溶解，即得所述参照物溶液；

(3)进样检测：用液相色谱仪检测供试品溶液和参照物溶液，分别采用以下两种色谱条件(a)、(b)；

(4)计算含量：采用(3)中(a)的色谱条件所得图谱通过外标法计算迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的含量，采用(3)中(b)的色谱条件所得图谱通过外标法计算野黄芩苷含量；

(5)特征图谱的建立：检测多批次的半夏厚朴汤标准汤剂供试品溶液，取采用(3)中(a)的色谱条件所得图谱，选择不同批次的半夏厚朴汤标准汤剂中均存在的色谱峰作为特征峰，制定特征图谱。

2.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，所述半夏厚朴汤标准汤剂包括半夏厚朴汤的水煎液或称提取液、浸膏或称浓缩液、冻干粉。

3.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，两种色谱条件具体为：

(a)十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～4min，2％～7％A；4～13min，7％～17％A；13～19min，17％A；19～23min，17％～23％A；23～38min，23％～34％A；38～42min，34％A；42～55min，34％～45％A；55～68min，45％～90％A)；(b)十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈-0.2％甲酸为流动相等度洗脱。

4.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，还包括：(6)将待测的供试品溶液进行步骤(3)的进样检测，将采用(3)中(a)的色谱条件所得图谱与特征图谱进行比较，识别所具有的特征峰数量，确定相似度；同时，以野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚为含量指标成分综合评价标准汤剂质量。

5.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，(1)中所述有机溶剂为体积浓度为30～75％甲醇水溶液，提取时间为15～45分钟，提取方式为超声处理、振摇提取、加热回流；提取体积为15ml～50ml。

6.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，(3)中所述液相色谱仪为超高效液相色谱仪。

7.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，(3)中(a)采用紫外检测器，柱温为20～30℃，流速为每分钟0.25～0.4ml，检测波长280nm-330nm；(b)采用紫外检测器，柱温为20～30℃，流速为每分钟0.25～0.4ml，检测波长280nm-330nm。

8.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，其特征在于，(5)中所述特征图谱具有12个特征峰F1-F12，以相对保留时间F2为1，F1的相对保留时间为0.330-0.385，以相对保留时间F9为1，F3-F12的相对保留时间分别为0.580-0.620、0.640-0.652、0.655-0.680、0.700-0.730、0.790-0.820、0.830-0.865、1.000、1.370-1.420、1.430-1.495、1.470-1.530。

9.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，在液相色谱法检测后再进行薄层检测。

10.根据权利要求1所述的快速全面控制半夏厚朴汤标准汤剂质量的检测方法，其特征在于，所述薄层检测，具体包括以下步骤：

(1)薄层供试品溶液的制备：取半夏厚朴汤标准汤剂，加有机溶剂提取，摇匀，滤过，蒸干，加甲醇溶解，即得所述供试品溶液；

(2)薄层对照溶液的制备：紫苏叶对照药材溶液、生姜对照药材溶液；按照半夏厚朴汤组方，配置缺紫苏叶、缺生姜阴性对照组，加甲醇溶解，作为阴性对照品溶液；

(3)测定：吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光下检视。

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