CN114672583B - 一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记及其开发和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位置为Chr05：19338016，其中野生型基因组碱基为G，AsA含量高于200mg/100g，为AsA类型；杂合突变型基因组碱基为G/A，AsA含量151‑200mg/100g，为中间型AsA类型；纯和突变型基因组碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型。本发明还公开了一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的开发和应用方法。猕猴桃叶片AsA含量高低在现代育种工作中仍是一个重要的选育性状，此标记的开发利用可为猕猴桃分子标记辅助育种奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于毛花猕猴桃叶片抗坏血酸（AsA）含量鉴定领域，具体涉及一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记。本发明还涉及该SNP分子标记的开发和应用方法。
背景技术
猕猴桃是原产于中国的猕猴桃科猕猴桃属的特色浆果，果实营养密度较高，花色多样极具观赏性，是鲜食与观赏兼备的多年生落叶藤本果树。目前，全世界共有猕猴桃属植物54个种及21个变种。猕猴桃的鲜果富含AsA和氨基酸，目前市场上主要以鲜食为主，也可加工成果脯、果酒、果汁等，均具有独特的风味，因此深受大众青睐。毛花猕猴桃为中国特有的猕猴桃属中的一个重要种类，广泛分布于浙江、福建、江西、湖南、广西、广东和贵州等地，是继中华猕猴桃和美味猕猴桃之后极具开发潜力的特色浆果，野生种质资源十分丰富，具有丰富的遗传多样性，可为猕猴桃种质创新与新品种培育提供宝贵的原始素材。毛花猕猴桃为典型的雌雄异株果树，在生产上需要配置相应的授粉雄株，才能保障果园产量。雄株花粉质量及适配性对雌株果实具有重要影响。雄株叶片组织也具有较高的AsA等营养保健物质，在采集完花粉后，其叶片可以制成茶，供人饮用。随着高通量测序技术的发展，基于全基因组重测序的单核苷酸多态性位点（Single nucleotide polymorphism，SNP）越来越受到关注，SNP分子标记具有在基因组内分布广泛、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等优点。目前在葡萄、苹果、草莓、香蕉、柑橘、梨上已有应用。因此，开展基于高通量测序数据开发的SNP分子标记特异性引物研究，可为猕猴桃重要抗性性状以及经济性状定位、遗传多样性分析、分子标记辅助育种奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记，本发明要解决的另一个问题是提供一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的应用方法，通过本发明可为猕猴桃重要抗性性状以及经济性状定位、遗传多样性分析、分子标记辅助育种奠定基础。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，
一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的位置为Chr05：19338016，其中野生型基因组碱基为G，AsA含量高于200mg/100g，为AsA类型；杂合突变型基因组碱基为G/A，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；纯和突变型基因组碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型。
本发明要解决的另一个问题是提供一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的开发方法，其特征在于，基于所述SNP分子标记设计特异性引物，并将PCR产物进行桑格测序，在Chr05：19338016位点处碱基为G时，AsA含量高于200mg/100g，为高AsA类型；杂合突变型基因组碱基为G/A，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；纯和突变型基因组碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型。
为了获得更好的技术要求，所述特异性引物包括上游引物F-5’和下游引物R-5’，其中，上游引物F-5’的核苷酸序列为gctagttactgtagactagt；下游引物R-5’的核苷酸序列为ttggtcatctggaatgcaat。
本发明要解决的另一个问题是提供一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的应用方法，其特征在于，应用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低。
本发明利用重测序SNP数据进行全基因组关联分析，将控制叶片AsA含量高低的基因定位到5号染色体，并通过进一步查找结构变异，确定了决定叶片AsA含量高低的基因及其关键变异位点，并根据变异位点设计分子标记引物，扩大群体验证了此引物确定叶片AsA含量高低的准确率。猕猴桃叶片AsA含量高低在现代育种工作中仍是一个重要的选育性状，此标记的开发利用可为猕猴桃分子标记辅助育种奠定基础。
附图说明
图1为参考基因组PCR产物桑格测序结果；
图2为杂合突变型基因组PCR产物桑格测序结果；
图3为纯和突变型基因组PCR产物桑格测序结果；
其中，参考基因组亦为野生型，在Chr05：19338016处碱基为G，AsA含量高于200mg/100g，为高AsA类型；杂合突变型基因组在Chr05：19338016处碱基为G/A，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；纯和突变型基因组在Chr05：19338016处碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均为来源于商业或公开的渠道。
实施例1
一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位置为Chr05：19338016，其中野生型基因组碱基为G，AsA含量高于200mg/100g，为高AsA类型；杂合突变型基因组碱基为G/A，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；纯和突变型基因组碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型。
实施例2
一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的开发，基于所述SNP分子标记设计特异性引物，并将PCR产物进行桑格测序，在Chr05：19338016位点处碱基为G时，AsA含量高于200mg/100g，为高AsA类型；杂合突变型基因组碱基为G/A，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；纯和突变型基因组碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型；
所述SNP分子标记特异性引物包括上游引物F-5’和下游引物R-5’，其中，上游引物F-5’的核苷酸序列为gctagttactgtagactagt；下游引物R-5’的核苷酸序列为ttggtcatctggaatgcaat。
实施例3
实施例1所述用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的应用，用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低，SNP分子标记的位置为Chr05：19338016，若基因组碱基为G，表示为野生型，AsA含量高于200mg/100g，为AsA类型；若基因组碱基为G/A，表示为杂合突变型，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；若基因组碱基为A，表示为纯和突变型，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型。
实施例4
一种用于辅助选择毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的提取和判断AsA含量高低的方法，其步骤包括，
（1）按照CTAB法分别提取143份毛花猕猴桃雄株的DNA样品，并且稀释至150 ng/μl；
（2）基于步骤（1）提取的DNA，构建DNA文库，利用Illumina HiSeqTM 2000（Illumina，San Diego，CA，USA）进行测序；
（3）获得的原始数据经Base calling转化为序列数据，去除低质量序列和测序接头后得到clean reads；
测序出来的序列每个碱基都对应有一个质量值，这个质量值代表测出的这个碱基的准确性，如测出质量值为20的话代表这个碱基有1%可能是错误的。如果这条序列普遍质量值较低或平均质量值小于20，获取未知的碱基即为低质量序列；
（4）采用MEM算法将clean reads通过BWA v0.7.12 软件将clean reads比对到毛花猕猴桃参考基因组上；
（5）使用变异检测软件Genome Analysis Toolkit（GATK）进行群体SNP检测，利用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点，根据缺失率小于或等于0.5、杂合率小于或等于0.80、最小等位基因频率（Minor allele frequency，MAF）大于或等于0.05进行过滤，最终得到高质量群体SNP分子标记；
（6）将上述获得的高质量群体SNP分子标记，使用GEMMA v0.98.1软件对叶片AsA数量性状进行全基因组关联分析，最终每个SNP位点都能得到一个关联值P值，根据P值显著性水平确定是否和叶片AsA数量性状关联，将叶片AsA含量相关的显著性SNP位点定位到5号染色体；
（7）其中SNP位点Chr05：19338016与叶片AsA含量极显著相关，参考基因组为G，突变碱基为A；基因组碱基为G，表示为野生型，AsA含量高于200mg/100g，为AsA类型；若基因组碱基为G/A，表示为杂合突变型，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；若基因组碱基为A，表示为纯和突变型，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型；
（8）利用Primer 5在显著性SNP位点附近设计特异性引物，SNP分子标记特异性引物包括上游引物F-5’和下游引物R-5’，其中，上游引物F-5’的核苷酸序列为gctagttactgtagactagt；下游引物R-5’的核苷酸序列为ttggtcatctggaatgcaat；
（9）参照表1和表2，对AsA含量高和AsA含量低的材料分别进行PCR扩增和桑格测序，结果如图所示，图1所述参考基因组为野生型，为公共数据已经进行基因组测序的基因组，在Chr05：19338016处碱基为G，AsA含量高于200mg/100g，为高AsA类型；图2所述杂合突变型基因组碱基为G/A，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；图3所述纯和突变型基因组碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型。
纯合突变和杂合突变为发生碱基突变的类型，在本实施例143份毛花猕猴桃雄株的DNA样品中，发现杂合突变型有11份样品，剩下均为纯和突变型。
在图1中，测序图看最高的曲线为哪个碱基则测序部位为该碱基，如杂合突变同时测到了G和A碱基，但是G碱基峰更高，则该部位为G碱基。至于纯和突变只测到A碱基，说明在低AsA含量的品种上，该部位碱基已经完全突变为A碱基了，也正是因为该部分碱基发生了突变，所以AsA含量发生了下降。
因此，通过检测这个部位的碱基是否发生了突变即可区分AsA高、低品种。
表1 PCR反应体系
；
表2 PCR反应程序
。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记及其开发和应用方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 20
<212> DNA
<213> 毛花猕猴桃(actinidia eriantha)
<220>
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<222> (19338016)
<223> 5号染色体，第19338016个碱基
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序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记及其开发和应用方法
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ttggtcatct ggaatgcaat 20
Claims (1)
1.一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记的应用方法，SNP分子标记的核苷酸序列为AATCTAGAA，其中第七位碱基为G/A突变，其特征在于，
基于所述SNP分子标记设计特异性引物，并将PCR产物进行桑格测序，
在上述位点处碱基为G时，AsA含量高于200mg/100g，为高AsA类型；
杂合突变型基因组碱基为G/A，AsA含量151-200mg/100g，为中间型AsA类型；
纯和突变型基因组碱基为A，AsA含量低于150mg/100g，为低AsA类型；
所述特异性引物包括上游引物F-5’和下游引物R-5’，其中，上游引物F-5’的核苷酸序列为gctagttactgtagactagt；下游引物R-5’的核苷酸序列为ttggtcatctggaatgcaat。
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| CN202210379092.3A CN114672583B (zh) | 2022-04-12 | 2022-04-12 | 一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记及其开发和应用方法 |
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| CN202210379092.3A CN114672583B (zh) | 2022-04-12 | 2022-04-12 | 一种用于鉴定毛花猕猴桃叶片AsA含量高低的SNP分子标记及其开发和应用方法 |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN101460611A (zh) * | 2006-06-08 | 2009-06-17 | 巴斯福植物科学有限公司 | 具有改良生长特性的植物及其制备方法 |
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-
2022
- 2022-04-12 CN CN202210379092.3A patent/CN114672583B/zh active Active
Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN101460611A (zh) * | 2006-06-08 | 2009-06-17 | 巴斯福植物科学有限公司 | 具有改良生长特性的植物及其制备方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Molecular Characterisation of a Supergene Conditioning Super-High Vitamin C in Kiwifruit Hybrids";John McCallum et al.;《Plants》;第8卷;第1-24页 * |
| "野生毛花猕猴桃叶片和果实AsA含量的SSR标记关联分析";汤佳乐等;《园艺学报》;第41卷(第5期);第833-840页 * |
Also Published As
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