CN114657116B - 一种噻唑烷形成化学介导的细胞表面多功能化修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种噻唑烷形成化学介导的细胞表面多功能化修饰方法，它通过氧化唾液酸的邻二醇基，将醛基引入细胞表面并作为与1,2‑氨基硫醇发生反应的特异位点，从而在生物兼容的条件下成功将携带该1,2‑氨基硫醇化学官能团的不同功能分子偶联到细胞表面，为制备酶‑细胞偶联物和调控细胞间特异相互作用研究提供了新方法。同时，本发明还提供了在活细胞界面上实现可控、可逆的化学修饰技术，切断细胞表面上形成的噻唑烷基。因此，本发明不仅拓展了噻唑烷形成化学在生物医学研究中的应用范围，还进一步丰富了现有细胞表面化学修饰的工具箱，从而为肿瘤免疫治疗、干细胞治疗、组织再生工程以及活细胞药物递送等研究提供了新工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种噻唑烷形成化学介导的细胞表面多功能化修饰方法。
背景技术
细胞表面是由磷脂双分子层、糖类和蛋白质所组成的生物界面，在维持稳定的细胞内代谢环境，调控细胞内外物质的交换等许多种生命过程中发挥重要作用。例如，细胞响应外界生化微环境主要是由细胞膜上的特定分子(如膜蛋白)完成的，它们可以通过控制细胞间的相互作用、选择性黏附和物质运输来影响细胞行为。因此，开发新型细胞表面修饰技术方法以此精准调控细胞表面功能组分，不仅为探究细胞表面分子功能及其调控机制提供研究方法，还能够为肿瘤免疫治疗，干细胞靶向治疗、组织再生工程等临床应用提供更有效的技术支撑。
在过去的十几年中，细胞表面修饰技术为细胞生物学、分子医学及生化分析的飞速发展创造了前所未有的条件。其中，基因工程依然是目前调控细胞表面组分的常用手段。然而，该“内部”改造方法存在着诸多缺点，例如，只有可遗传编码的分子被展示在细胞表面；永久性或不可逆编辑细胞基因组会带来未知风险。为此，学者们报道开发了多种从“外部”修饰细胞表面的途径，包括寡糖代谢工程、疏水***、直接化学修饰、脂质体融合、酶促重塑等。这些方法的优势在于其能够将许多种非遗传编码分子展示于细胞表面，极大地丰富了细胞表面组分多样性，还适用于不同来源、类型的细胞(如干细胞和原代细胞)。当然，这些方法也不是万能的，同样存在着其利与弊。例如，通过结合细胞代谢通路和生物正交反应来开发的寡糖代谢工程已经成为一个非常强大的标记细胞糖组分的重要方法，但是该方法可能会改变细胞发挥正常功能所需的生化途径，而且并非所有细胞系都具有此代谢机制。再如，虽然直接化学修饰法是一种更为简便高效的细胞标记方法，但是由于其缺乏位点选择性，有可能会干扰细胞正常的生物活性。因此，精准调控细胞表面特定组分而不干扰其他组分的正常功能仍然充满挑战。综上所述，在现有技术基础之上开发一种新颖的、非基因工程的、具有自主知识产权的活细胞表面化学修饰方法，将在基础生物医学研究和临床应用治疗方面均具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种在生物兼容条件下，可以高效、便捷地对细胞表面进行多种功能化修饰的新方法，以此为制备多肽、纳米抗体-细胞偶联物，开发活细胞介导的药物递送***以及调控细胞间特异的相互作用等研究提供一种全新的技术方案。
第一方面，本发明提供了一种共价修饰细胞表面的化学方法，即通过高碘酸钠氧化的方法在细胞表面引入活性醛基作为缩合反应位点，利用其与1,2-氨基硫醇发生特异反应生成噻唑烷的反应机理，以噻唑烷基作为连接子(linker)成功将含有此化学官能团(即1,2-氨基硫醇)的不同功能分子连接到细胞表面，从而为赋予细胞新的性质或功能提供了新方法。其中，本发明提供的噻唑烷形成化学介导的细胞表面多功能化修饰的流程示意图如图1所示。
进一步地，所述含有化学官能团的不同功能分子为含有1,2-氨基硫醇结构的多肽、蛋白质或纳米抗体等。含有1,2-氨基硫醇结构的功能分子，也可以是小分子化合物、纳米颗粒或聚合物等。
进一步地，所述多肽为N端含有半胱氨酸的荧光肽、GE11、SpyTag或SnoopTag等，所述蛋白质为融合有SpyCatcher的GFP、mCherry或Arginase等，所述纳米抗体为融合有SpyCatcher的anti-EGFRAffibody。
进一步地，所述细胞不只限于本发明所用到的Hela、THP-1、A549或MCF-7细胞，还应包括T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞以及间充质干细胞和多潜能干细胞(iPS)等。
第二方面，本发明提供了可逆化学修饰细胞表面的方法，即利用噻唑烷形成反应的可逆性特点，添加金属离子处理细胞，以此切断细胞表面上形成的噻唑烷基，从而将被修饰的功能分子从细胞表面去除。
进一步地，所述金属离子为Pd2+或Cu2+。
本发明基于醛基与1,2-氨基硫醇发生缩合反应生成噻唑烷的反应机理，通过利用高碘酸钠氧化唾液酸的邻二醇基生成醛基，将其引入细胞表面并作为与1,2-氨基硫醇发生反应的特异位点，从而在生物兼容的条件下成功将携带该化学官能团(即1,2-氨基硫醇)的不同功能分子偶联到细胞表面，为制备酶-细胞偶联物和调控细胞间特异相互作用研究提供了新方法。
本发明提供的新型细胞表面化学修饰方法具有如下有益效果：
不同于以往报道的方法，本发明提供了一种新颖的细胞表面化学修饰方法，即首次利用了噻唑烷形成化学作为修饰细胞表面的化学手段，在生物兼容条件下以噻唑烷基作为linker将含有1,2-氨基硫醇官能团的不同功能分子锚定到细胞表面，从而为赋予细胞新的性质或功能，调控细胞的生物学行为提供了全新技术手段。而且，基于噻唑烷形成反应的可逆性特点，本发明也提供了金属离子介导的可逆化学修饰细胞表面的新方案，从而为可逆调控细胞的功能属性提供了新选择。此外，不同于传统基因工程方法，该细胞表面化学修饰方法不涉及复杂的基因工程操作，也避免了基因编辑带来的不可控风险问题。因此，该方法将在肿瘤免疫治疗，干细胞靶向治疗以及活细胞药物递送等研究领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明提供的噻唑烷形成化学介导的细胞表面多功能化修饰的流程示意图；
图2为本发明实施例1中所用荧光肽的化学结构示意图和标记前后Hela细胞的荧光显微镜分析图；
图3为本发明实施例1中所用Cys-SpyTag结构示意图和表面标记有GFP的Hela、MCF-7和A549细胞的荧光显微镜分析图；
图4为本发明实施例2中荧光标记的Hela细胞在Cu2+处理前后的荧光显微镜分析图；
图5为本发明实施例2中荧光标记的Hela细胞被不同浓度的Pd2+/Cu2+处理前后的荧光强度柱状分析图；
图6为本发明实施例3中精氨酸酶-细胞偶联物的活性测定结果和Western blot分析图。
图7为本发明实施例4中诱导调控THP-1和A549细胞间特异相互作用的荧光显微镜分析图；
图8为本发明实施例5中诱导THP-1细胞发生团簇现象的荧光显微镜分析图。
具体实施方式
为了更好的阐明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例和说明书附图对本发明进行详细阐述。此处所描绘的具体实施例仅仅用于理解本发明，并不用于限定本发明的实施。
实施例1利用所述方法对细胞进行荧光标记
(1)将1x104个Hela细胞传到24孔板的培养皿上，利用含有10％PBS和1％P/S的DMEM培养基培养24h。去除培养基加入PBS清洗2-3次，将细胞分为两组，其中一组作为实验组加入终浓度为10mM的高碘酸钠溶液，而另一组作为对照组只加入等体积的PBS溶液，在4℃反应10min，利用PBS清洗3-5次去除高碘酸钠。然后，将5μM荧光肽Cys-Lys(5-FAM)溶液(如图2(A)所示)分别加入上述细胞，在4℃下反应10min，利用PBS清洗细胞去掉未反应的荧光肽。待DAPI染细胞核后，利用荧光显微镜分析细胞表面荧光强度变化。标记Cys-Lys(5-FAM)前后以及染DAPI前后的Hela细胞荧光显微镜分析图如图2(B)所示。
(2)为了从多角度论证上述细胞表面标记方法的应用潜力，我们还选用了具有连接活性的SpyTag作为功能分子进行验证，其目的是在细胞表面装载SpyTag以后，利用SpyTag与SpyCatcher之间发生自组装的特性，将含有SpyCatcher的不同融合蛋白高效连接到细胞表面，从而避免了制备N端为半胱氨酸的重组蛋白质的繁琐操作。基于该设计原理，选用Hela、MCF-7和A549细胞，参照上述步骤(1)氧化处理细胞并设置相同的空白对照，添加20μM Cys-SpyTag(如图3(A)所示)溶液至细胞，在4℃下反应30min，利用PBS清洗3-5次洗脱未反应的Cys-SpyTag，然后加入10μM SpyCatcher-GFP蛋白，待在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的SpyCatcher-GFP。从图3(B)、图3(C)和图3(D)可以看出，只有经过高碘酸钠氧化处理的Hela、MCF-7和A549细胞表面才能具有明显的绿色荧光圈，而未被氧化处理的细胞表面则无明显荧光信号。因此，上述实验结果证明了噻唑烷形成化学是可以在生理条件下用来标记活细胞表面的，具有将其他更多类型的功能分子连接到细胞表面的应用潜力。
实施例2金属离子介导的可逆性化学修饰细胞表面
选用Hela细胞为研究模型，按照实施例1中的步骤(1)制备表面含有荧光标记的细胞。然后，将该荧光标记的细胞为两组，其中一组添加Cu2+溶液进行处理，而另一组作为对照。待DAPI染细胞核后，利用荧光显微镜分析细胞表面荧光变化。如图4所示，与对照组细胞相比，经Cu2+处理的实验组细胞，其表面的荧光强度显著降低，初步说明了该细胞表面荧光信号的减弱是由于噻唑烷基的断裂造成的。为了进一步验证，按照实施例1中的步骤(1)重新制备荧光标记的细胞，然后分别添加浓度为的0.2、0.5、1、2.5、5、10μM Cu2+和0.5、1、2.5、5、10、20μM Pd2+溶液分别进行处理，在37℃反应1h，利用流式细胞仪检测细胞的荧光强度变化。从图5可以看出，随着金属离子浓度上升，Hela细胞表面的绿色荧光强度会逐渐降低。该结果进一步显示了Pd2+/Cu2+介导的噻唑烷开环反应在可逆性化学修饰细胞表面方面的应用潜力。
实施例3制备酶-细胞偶联物(Enzyme-Cell Conjugate,ECC)
以精氨酸酶(Arginase)为模式分子，参照实施例1中的步骤(1)培养Hela细胞，然后将其分为三组，即Control组(不作Arginase处理)，对照组(只作Arginase处理，而无高碘酸钠处理)和实验组(同时作Arginase和高碘酸钠处理)。对于对照组和实验组而言，该两组细胞均首先加入20μM Cys-SpyTag溶液进行标记，在4℃反应30min，PBS清洗3-5次，然后加入20μM的SpyCatcher-Arginase溶液，在37℃反应1h，PBS清洗3-5次去除未反应的SpyCatcher-Arginase，最后收集细胞并利用茚三酮法测定酶活性。如图6所示，与Control组相比，对照组细胞也显示出了一定的酶活性，这可能是由于SpyCatcher-Arginase与细胞发生了一定的非特异性相互作用，从而造成少量的SpyCatcher-Arginase残留于细胞表面，然而，其酶活力却显著低于实验组细胞。而且，Western blot分析结果也表明在相同内参存在下，与其Control和对照两组细胞相比，只有实验组细胞表面上携带了更高含量的精氨酸酶。该结果说明了通过联合应用噻唑烷形成化学和SpyCatcher/SpyTag化学是能够将SpyCatcher-Arginase以较为稳定的共价键形式连接到细胞表面，从而赋予细胞相应的酶催化活性。该方法将在制备酶-细胞偶联物以及创制活细胞介导的药物载体研究中具有广泛的应用前景。
实施例4诱导调控细胞间特异相互作用
为了展现本发明提供的细胞表面化学标记方法在调控细胞间相互作用的应用潜力，我们以悬浮生长的THP-1细胞和贴壁生长的A549细胞(表面过表达EGFR)为研究模型，并同时选用了具有靶向EGFR功能分子的多肽(GE11)和纳米抗体(anti-EGFR affibody)进行验证。参照以下步骤修饰THP-1细胞表面：将THP-1细胞传到方瓶里，利用含有10％PBS和1％P/S的1640培养基培养24h。取1x106个THP-1细胞于EP管中，4℃，5000g下离心5min，用200μL的PBS溶液重悬细胞。将上述细胞分为两组，实验组加入终浓度为10mM的NaIO4溶液，而对照组则不作氧化处理，在4℃下反应10min，接着4℃，5000g下离心5min，收集细胞。
(1)对于GE11标记，加入20μM Cys-GE11，4℃下反应30min，用PBS清洗去除未反应的Cys-GE11，接着4℃，5000g下离心5min，收集THP-1细胞；分别利用DAPI和绿色染料Fluorescein染A549细胞核和GE11标记的TPH-1细胞。而后，将二者共培养1h，PBS清洗3-5次，利用荧光显微镜观察实验结果。
(2)对于anti-EGFR Affibody标记，加入20μM Cys-SpyTag溶液，4℃下反应30min，用PBS清洗去除未反应的Cys-SpyTag，接着4℃，5000g下离心5min，加入20μM anti-EGFRAffibody，在37℃反应1h，用PBS清洗去除未反应的anti-EGFR Affibody，4℃，5000g下离心5min，收集THP-1细胞；然后，按照上述同样操作，分别利用DAPI和绿色染料Fluorescein染A549细胞核和anti-EGFR Affibody标记的THP-1细胞，将二者共培养1h，PBS清洗3-5次，利用荧光显微镜观察实验结果。
(3)为了实现可逆调控细胞间相互作用，添加5μM Cu2+至上述发生相互作用的实验组细胞，利用荧光显微镜观察实验结果。
从图7可以看出，与未修饰的细胞相比，修饰有GE11和anti-EGFR Affibody的THP-1细胞均能与A549细胞发生较明显的相互作用，而且经Cu2+处理后，这种诱导的相互作用会随之消失，因此，这部分结果说明了该方法在赋予细胞特异靶向识别功能和调控细胞间特异相互作用等方面研究具有广泛的应用潜力。
实施例5诱导细胞团簇形成
参照实施例4中的步骤培养并氧化THP-1细胞，从而在其表面引入活性醛基。将细胞分为两组进行标记，其中一组加入20μM Cys-SpyTag，而另一组加入20μM Cys-SnoopTag，4℃下反应30min，用PBS清洗去除未反应的Cys-SnoopTag和Cys-SpyTag，接着4℃，5000g下离心5min，收集细胞。然后，将上述细胞混合后再分两组进行处理，其中一组加入40μMSpyCatcher-SnoopCatcher融合蛋白，而另一组作为空白对照，在37℃条件下50rpm反应1h，最后利用扫描共聚焦显微镜观察结果。如图8所示，与空白对照相比，只有添加SpyCatcher-SnoopCatcher的细胞才会形成较为明显的细胞团簇。这是由于作为linker的SpyCatcher-SnoopCatcher能够分别与细胞表面上的SpyTag和SnoopTag之间发生自主装并形成稳定的异肽键，从而将多个细胞连接在一起并形成了细胞团簇(cell cluster)。该结果进一步说明了本发明提供的细胞表面化学修饰方法在调控细胞间相互作用方面的应用潜力。
集以上内容中针对噻唑烷形成反应化学介导的细胞表面多功能化修饰新方法及其应用做出了一般性说明，并且将具体构建过程和实施应用方案做出了详述，值得注意的是，在所述实施方案的基础上做出修改和完善亦可达到本发明所述效果，所以在不偏离本发明专利主张的基础上做出的修改和完善的均属本发明专利要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种噻唑烷形成化学介导的活细胞表面多功能化修饰方法，其特征在于，利用高碘酸钠氧化唾液酸的邻二醇基生成活性醛基的机理，在含有唾液酸的活细胞体系中添加终浓度为10mM的高碘酸钠溶液进行反应，在4℃反应10min，利用PBS清洗3-5次去除高碘酸钠，从而在含有唾液酸的活细胞表面引入活性醛基，之后利用活性醛基与1,2-氨基硫醇能够发生特异缩合反应生成噻唑烷的机理，在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子进行反应，从而将携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子以稳定共价键的形式偶联至细胞表面，从而赋予了细胞新的性质或功能；
当所述活细胞为Hela细胞时，所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的荧光肽，反应的条件为：在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的荧光肽，在4℃下反应10min，利用PBS清洗细胞去掉未反应的功能分子；或所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag与融合有SpyCatcher的GFP或融合有SpyCatcher的Arginase的组合，反应的条件为：先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag，在4℃下反应30min，利用PBS清洗洗脱未反应的N端含有半胱氨酸的SpyTag，然后加入融合有SpyCatcher的GFP或融合有SpyCatcher的Arginase，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的GFP或融合有SpyCatcher的Arginase；
当所述活细胞为MCF-7或A549细胞时，所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag与融合有SpyCatcher的GFP的组合；反应条件为：先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag，在4℃下反应30min，利用PBS清洗洗脱未反应的N端含有半胱氨酸的SpyTag，然后加入融合有SpyCatcher的GFP，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的GFP；
当所述活细胞为THP-1细胞时，所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的GE11，反应条件为：在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的GE11，在4℃下反应30min，用PBS清洗去除未反应的携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的GE11；或所述1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag与融合有SpyCatcher的anti-EGFRAffibody的组合，反应条件为先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag，在4℃下反应30min，利用PBS清洗洗脱未反应的N端含有半胱氨酸的SpyTag，然后加入融合有SpyCatcher的anti-EGFRAffibody，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的GFPanti-EGFRAffibody；或所述携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子为携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag和N端含有半胱氨酸的SnoopTag与融合有SpyCatcher的SnoopCatcher的组合，反应条件为：先在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中分别添加携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag和N端含有半胱氨酸的SnoopTag，分别在4℃下反应30min，利用PBS分别清洗去除未反应的携带1,2-氨基硫醇的N端含有半胱氨酸的SpyTag和N端含有半胱氨酸的SnoopTag，然后将上述细胞混合，加入融合有SpyCatcher的SnoopCatcher，在37℃反应1h后，用PBS清洗去除未反应的融合有SpyCatcher的SnoopCatcher。
2.根据权利要求1所述的一种噻唑烷形成化学介导的活细胞表面多功能化修饰方法，其特征在于，在高碘酸钠溶液氧化后的活细胞体系中添加携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子进行反应，从而将携带1,2-氨基硫醇官能团的功能分子以稳定共价键的形式偶联至细胞表面，其反应是可逆的，通过添加金属离子Pd2+或Cu2+，可以诱导噻唑烷的开环反应发生，从而将连接在细胞表面的功能分子去除或者原位释放，以此在活细胞界面上实现可控、可逆的化学修饰。
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