CN114656437B - 一种具有urat1抑制活性的芫花素及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有URAT1抑制活性的芫花素及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：将干燥芫花粉碎过筛，得到的芫花粉中加入乙醇溶液，进行高温萃取，冷却降温后，收集萃取液，减压浓缩，得到的浓缩液用大孔吸附树脂分离洗脱，收集洗脱液，再次减压浓缩，干燥得到的芫花提取物粗品；溶解后，用高速逆流色谱纯化，干燥后得到芫花素。本发明采用的芫花素制备方法高效、环境友好、成本低，制备得到的芫花素纯度高，且芫花素具有较好的URAT1抑制活性，URAT1抑制率可达80.13%。

Description

一种具有URAT1抑制活性的芫花素及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然产物开发领域，具体涉及一种具有URAT1抑制活性的芫花素及其制备方法和应用。
背景技术
尿酸是嘌呤分解代谢的最终产物，在生理上通过尿液***。尿酸产生过多或肾脏***过少会导致高尿酸血症，高尿酸血症还与一系列慢性疾病相关，包括高血压、糖尿病、代谢综合征、肾脏和心血管疾病等。由于已上市的降尿酸药物如丙磺舒、苯溴马隆、雷西纳德存在一定的毒副作用，寻找新型安全的降尿酸活性物质具有重要意义。研究发现尿酸盐转运蛋白1（URAT1）是治疗高尿酸血症的一个重要靶点，其参与尿酸盐的重吸收，而高水平的尿酸盐转运蛋白1可能会引起高尿酸血症或痛风。天然产物由于其安全、低毒副作用，目前已成为开发URAT1抑制剂的重要领域。
芫花含有多种化合物，包括黄酮类、双香豆素、木脂素、挥发油、二萜酯、绿原酸和酚苷，其中黄酮类和二萜酯是主要功效成分。芫花素是芫花中的主要黄酮类化合物之一，具有多种药理活性，在芫花的质量控制和生物活性方面发挥着重要作用。芫花素的药理活性研究目前主要集中在抗癌、抗菌等方面，关于芫花素的URAT1抑制活性应用未见报道。
芫花素常见的提取方法有浸提、超声提取、微波提取、索氏提取等，然而传统的提取方法存在耗时长、溶剂消耗大、破坏活性成分等缺陷。亚临界萃取是利用亚临界流体作为萃取剂的一种新型萃取与分离技术，具有非热加工，保留提取物的活性产品不破坏、不氧化、易于和产物分离等优点。采用亚临界乙醇水溶液提取芫花素的方法未见公开报道。
发明内容
本发明提供一种具有URAT1抑制活性的芫花素及其制备方法和应用。本发明采用亚临界萃取技术从芫花中高效提取芫花素，产品纯度高，具有良好的URAT1抑制活性。
本发明的一个目的是提供了一种具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法。
本发明的另一个目的是提供了由上述制备方法制备得到的芫花素。
本发明的另一个目的是提供了芫花素的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法，包括以下步骤：
（1）将干燥芫花粉碎，过筛，得到芫花粉；
（2）向步骤（1）的芫花粉中加入乙醇溶液，进行高温萃取，冷却降温后，收集萃取液；
（3）将步骤（2）的萃取液减压浓缩，得到浓缩液；
（4）将步骤（3）的浓缩液用大孔吸附树脂分离洗脱，收集洗脱液；
（5）将步骤（4）的洗脱液再次减压浓缩，干燥得到芫花提取物粗品；
（6）将步骤（5）的芫花提取物粗品溶解后，用高速逆流色谱纯化，干燥后得到芫花素。
进一步的，所述步骤（1）中过筛的目数为50目-200目。
进一步的，所述步骤（2）中高温萃取的条件为：乙醇溶液浓度为75%-95%，萃取温度150°C -180°C，萃取压力8 MPa-12MPa，萃取时间20min-40min。
优选的，所述步骤（2）中高温萃取的条件为：乙醇溶液浓度为85%，萃取温度165°C，萃取压力10MPa，萃取时间30 min。
进一步的，所述步骤（4）中大孔吸附树脂包括AB-8、HPD-826、HPD-600、D-101大孔吸附树脂；所述洗脱的条件为：分别用水、40%-50%乙醇溶液、70%-80%乙醇溶液进行梯度洗脱。
进一步的，所述步骤（3）中和步骤（5）中减压浓缩的温度为40℃～60℃。
进一步的，所述步骤（6）中高速逆流色谱的条件为：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂，其中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为5：5：8-12：5；主机转速为800 r/min-1000r/min，流速为2 mL/min-5mL/min。
优选的，所述主机转速为1000r/min。
综上所述，一种具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法，包括以下步骤：
（1）将干燥芫花粉碎，过筛，得粒径为50目-200目的芫花粉；
（2）向步骤（1）的芫花粉中加入10-20倍体积为75%-95%的乙醇溶液，加热到150°C-180°C后，停止加热，高温下釜内压力达到8 MPa-12MPa，进行保温保压萃取20min-40min，冷却降温，过滤收集萃取液；
（3）将步骤（2）的萃取液在40°C～60°C减压浓缩至原体积的1/8~1/10，得到浓缩液；
（4）将步骤（3）的浓缩液用大孔树脂分离，依次用水、40%~50%乙醇溶液、70%~80%乙醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；
（5）将步骤（4）的洗脱液在40℃～60℃减压浓缩，干燥得到芫花提取物粗品；
（6）将步骤（5）的芫花提取物粗品溶解，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂，上相（有机层）为固定相，下相（水层）为流动相，将下相以20mL/min流速将固定相泵入主机，开启800 r/min-1000r/min正转，以2 mL/min-5mL/min流速泵入流动相，两相已达到平衡后，将样品溶液由进样阀注入逆流色谱仪，流速调至2mL/min，开启检测器和记录仪，冷冻干燥得到芫花素。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的芫花素，所述芫花素具有URAT1抑制活性，且芫花素的纯度大于97%。
进一步的，所述芫花素抑制URAT1的IC50为57.43µmol/L。
本发明还提供了所述的芫花素在用于制备尿酸盐转运蛋白1抑制剂中的应用。
进一步的，所述芫花素的使用浓度为1 µmol/L~200µmol/L。
本发明还提供了所述的芫花素在用于制备防治高尿酸血症中的药物和/或保健品中的应用。
进一步的，所述高尿酸血症是由尿酸盐转运蛋白1高表达引起的高尿酸血症。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
本发明首次采用亚临界乙醇溶液从芫花中提取芫花素，并通过大孔树脂、高速逆流色谱进行分离纯化。与现有技术相比，本发明提取效率高，环境友好无污染，制备得到的芫花素纯度均在98%以上，最高可达99.11%，其URAT1抑制率可达80.13%，具有显著的URAT1抑制活性，可作为URAT1抑制剂的新来源，其应用场景广泛。
附图说明
图1为纯化得到的芫花素HPLC图，其中横坐标为时间，纵坐标为电信号。
图2为实施例1-4中制备的芫花素对URAT1的抑制率，其中横坐标为不同实施例制备的芫花素，纵坐标为URAT1抑制率。
图3为芫花素对URAT1的抑制作用及IC50，其中横坐标为芫花素浓度，纵坐标为URAT1抑制率。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
芫花素纯度测定：采用HPLC法测定芫花素纯度，具体方法如下：
色谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相：A：1%甲酸；B：甲醇，洗脱条件：0-5min 30%B；5-25min 30%-90%B；25-30min 90%-30%B；30-32min 30%B，紫外检测器，检测波长：365nm。以芫花素标准品的质量浓度（mmol/L）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算芫花素纯度。
实施例1、从芫花中制备芫花素
将干燥芫花粉碎，过筛，收集粒径在50-200目的芫花粉。取芫花粉5g，加入10倍体积80%乙醇溶液，加热到150°C后停止加热，高温下釜内压力达到10Mpa，进行保温保压萃取30min，冷却降温，过滤收集萃取液；萃取液50℃减压浓缩至原体积的1/8，得浓缩液，将浓缩液用AB8型大孔树脂分离，分别用水、40%乙醇溶液和70%乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥得芫花提取物粗品160mg。将粗品用适量水溶解，经高速逆流色谱法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5：5：8：5）为两相溶剂，上相（有机层）为固定相，下相（水层）为流动相，将下相以20mL/min流速将固定相泵入主机，开启900r/min正转，以5mL/min流速泵入流动相，两相已达到平衡后，将样品溶液由进样阀注入逆流色谱仪，流速调至2mL/min，开启检测器和记录仪，冷冻干燥得纯品芫花素35mg。HPLC检测芫花素纯度为98.58%。
实施例2、从芫花中制备芫花素
将干燥芫花粉碎，过筛，收集粒径在50-200目的芫花粉。取芫花粉5g，加入20倍体积90%乙醇溶液，加热到180°C后停止加热，高温下釜内压力达到12Mpa，进行保温保压萃取30min，冷却降温，过滤收集萃取液；萃取液50℃减压浓缩至原体积的1/10得浓缩液，将浓缩液用D101型大孔树脂分离，分别用水、45%乙醇溶液和70%乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥得芫花提取物粗品210mg。将粗品用适量水溶解，经高速逆流色谱法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5：5：10：5）为两相溶剂，上相（有机层）为固定相，下相（水层）为流动相，将下相以20mL/min流速将固定相泵入主机，开启900r/min正转，以5mL/min流速泵入流动相，两相已达到平衡后，将样品溶液由进样阀注入逆流色谱仪，流速调至2mL/min，开启检测器和记录仪，冷冻干燥得纯品芫花素53.1mg。HPLC检测芫花素纯度为99.11%。
实施例3、从芫花中制备芫花素
将干燥芫花粉碎，过筛，收集粒径在50-200目的芫花粉。取芫花粉5g，加入15倍体积75%乙醇溶液，加热到170°C后停止加热，高温下釜内压力达到8Mpa，进行保温保压萃取40min，冷却降温，过滤收集萃取液；萃取液40℃减压浓缩至原体积的1/9得浓缩液，将浓缩液用HPD-826型大孔树脂分离，分别用水、45%乙醇溶液和75%乙醇溶液洗脱，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩回收乙醇，水溶液冷冻干燥，得芫花提取物粗品145mg。将粗品用适量水溶解，经高速逆流色谱法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5：5：9：5）为两相溶剂，上相（有机层）为固定相，下相（水层）为流动相，将下相以20mL/min流速将固定相泵入主机，开启1000r/min正转，以4mL/min流速泵入流动相，两相已达到平衡后，将样品溶液由进样阀注入逆流色谱仪，流速调至2mL/min，开启检测器和记录仪，冷冻干燥得纯品芫花素40.6g。HPLC检测芫花素纯度为98.69%。
实施例4、从芫花中制备芫花素
将干燥芫花粉碎，过筛，收集粒径在50-200目的芫花粉。取芫花粉5g，加入10倍体积95%乙醇溶液，加热到160°C后停止加热，高温下釜内压力达到12Mpa，进行保温保压萃取20min，冷却降温，过滤收集萃取液；萃取液60℃减压浓缩至原体积的1/10得浓缩液，将浓缩液用HPD-600型大孔树脂分离，分别用水、50%乙醇溶液和80%乙醇溶液洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩回收乙醇，水溶液冷冻干燥，得芫花提取物粗品175mg。将粗品用适量水溶解，经高速逆流色谱法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5：5：12：5）为两相溶剂，上相（有机层）为固定相，下相（水层）为流动相，将下相以20mL/min流速将固定相泵入主机，开启800r/min正转，以5mL/min流速泵入流动相，两相已达到平衡后，将样品溶液由进样阀注入逆流色谱仪，流速调至2mL/min，开启检测器和记录仪，冷冻干燥得纯品芫花素56.9mg， HPLC检测芫花素纯度为98.16%。芫花素HPLC图见图1。
实施例5、工艺条件对制备芫花素的影响
将干燥芫花粉碎，过筛，收集粒径在50-200目的芫花粉。取芫花粉5g，加入15倍体积85%乙醇溶液，加热到160°C后停止加热，高温下釜内压力达到10Mpa，进行保温保压萃取30min，冷却降温，过滤收集萃取液；萃取液50℃减压浓缩至原体积的1/8得浓缩液，将浓缩液用AB8型大孔树脂分离，分别用水、40%乙醇溶液和70%乙醇溶液洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥得芫花提取物粗品。将粗品用适量水溶解，经高速逆流色谱法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5：5：10：5）为两相溶剂，上相（有机层）为固定相，下相（水层）为流动相，将下相以20mL/min流速将固定相泵入主机，开启900r/min正转，以4mL/min流速泵入流动相，两相已达到平衡后，将样品溶液由进样阀注入逆流色谱仪，流速调至2mL/min，开启检测器和记录仪，冷冻干燥得纯品芫花素。计算芫花素提取率，HPLC检测芫花素纯度。
（1）提取乙醇浓度对制备芫花素的影响
在上述基本工艺的基础上，分别加入15倍体积浓度55%，65%，75%，85%，95%，99.8%的乙醇溶液，进行高温高压萃取芫花素，其它工艺条件不变，研究不同乙醇浓度对制备芫花素的影响。
表1： 不同乙醇浓度对制备芫花素的影响
乙醇浓度/% 55 65 75 85 95 99.8
提取率/% 0.35 0.48 0.67 0.74 0.73 0.42
芫花素纯度/% 82.6 85.7 97.3 98.6 98.3 93.4
结果如表1，提取的乙醇浓度为85%时，芫花素的提取率和纯度最高。
（2）提取温度压力对制备芫花素的影响
在上述基本工艺的基础上，控制温度（压力）120℃（4Mpa），135℃（6Mpa）， 150℃（8Mpa），165℃（10Mpa），180℃（12Mpa），195℃（14Mpa），进行高温高压萃取芫花素，其它工艺条件不变，研究不同温度（压力）对制备芫花素的影响。
表2： 不同温度（压力）对制备芫花素的影响
温度/℃ 120 135 150 165 180 195
提取率/% 0.47 0.52 0.64 0.76 0.74 0.41
芫花素纯度/% 86.1 90.7 96.5 99.1 98.4 90.4
结果如表2，提取温度在165℃时，芫花素的提取率和纯度最高。
（3）高速逆流色谱转速对制备芫花素的影响
在上述基本工艺的基础上，控制高速逆流色谱转速400r/min，600r/min，800r/min，1000r/min，1200r/min，1200r/min，进行高速逆流色谱纯化，其它工艺条件不变，研究不同转速对制备芫花素的影响。
表3：不同转速对制备芫花素的影响
转速/ (r/min) 400 600 800 1000 1200 1400
提取率/% 0.35 0.54 0.65 0.72 0.59 0.52
芫花素纯度/% 76.1 88.7 96.2 98.1 93.4 87.6
结果如表3，高速逆流色谱转速在1000r/min时，芫花素的提取率和纯度最高。
实施例6、芫花素对URAT1抑制活性
在本实施例中，采用以下步骤测定芫花素对URAT1吸收6-羧基荧光素（6-CFL）的抑制活性：
（1）将HEK-293T细胞加入含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待细胞融合度达到80%以上时，使用DNA转染试剂盒进行转染。用胰酶将转染pcDNA3.1-EGFP-SLC22A12质粒和未转染的HEK-293T细胞从10cm皿中消化下来，制备成5×103的细胞悬液，每孔100µL加入96孔白色荧光板中，设置实验组和对照组，每组设置6个复孔。
（2）48 h后，用HBSS缓冲液洗涤细胞三次，在含有239.5μmol/L的荧光底物及有无待测样品的HBSS缓冲液中孵育1 h。在室温下用100μL 0.1M NaOH裂解细胞30分钟，在酶标仪中震荡5 min后，在激发和发射光分别为490nm和525nm的条件下进行读数。按照如下公式计算抑制率。
抑制率=（对照组-实验组）/（对照组-空白组）×100%
（3）梯度稀释芫花素溶液，以HBSS作为空白对照，按上述方法测定样品对细胞中URAT1吸收6-CFL的抑制率，计算IC50值。
对实施例1，实施例2，实施例3，实施例4制备的芫花素的URAT1抑制活性进行测定，结果见图2。结果表明，本发明制备的芫花素对细胞中URAT1吸收6-CFL的抑制率分别为77.91%、80.13%、77.28%、75.42%，表明芫花素能够显著地抑制URAT1对6-CFL的吸收，具有显著的URAT1抑制活性。
选择实施例2制备的芫花素，研究不同浓度的芫花素对URAT1抑制活性，结果见图3。结果表明在0~200µmol/L浓度范围内，随着芫花素浓度升高对URAT1抑制活性逐渐增加。芫花素浓度为100µmol/L时，其抑制率可达66.25%，浓度继续升高，抑制率增长趋势趋于平缓，芫花素对URAT1抑制的IC50为57.43µmol/L。芫花素具有作为先导化合物或原料进一步开发具有抑制URAT1抑制活性的药品、特殊医学用途配方食品、保健食品的潜力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所表述的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将干燥芫花粉碎，过筛，得到芫花粉；
（2）向步骤（1）的芫花粉中加入乙醇溶液，进行高温萃取，冷却降温后，收集萃取液；所述高温萃取的条件为：乙醇溶液浓度为75%-95%，萃取温度150°C -180°C，萃取压力8 MPa-12MPa，萃取时间20min-40min；
（3）将步骤（2）的萃取液减压浓缩，得到浓缩液；
（4）将步骤（3）的浓缩液用大孔吸附树脂分离洗脱，收集洗脱液；
（5）将步骤（4）的洗脱液再次减压浓缩，干燥得到芫花提取物粗品；
（6）将步骤（5）的芫花提取物粗品溶解后，用高速逆流色谱纯化，干燥后得到芫花素。
2.根据权利要求1所述的具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中过筛的目数为50目-200目。
3.根据权利要求1所述的具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中大孔吸附树脂为AB-8、HPD-826、HPD-600或D-101大孔吸附树脂；所述洗脱的条件为：分别用水、40%-50%乙醇溶液、70%-80%乙醇溶液进行梯度洗脱。
4.根据权利要求1所述的具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中和步骤（5）中减压浓缩的温度为40℃～60℃。
5.根据权利要求1所述的具有URAT1抑制活性的芫花素的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中高速逆流色谱的条件为：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂，其中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为5：5：8-12：5；主机转速为800 r/min-1000r/min，流速为2mL/min-5mL/min。
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