CN114655993A - 一种纳米铜铁氧体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种纳米铜铁氧体、制备方法及其应用，涉及生物医学材料技术领域，该方法包括如下步骤：取油酸铜和油酸铁共同混合于1‑十八烯内，得到混合物，向所述混合物中加入油酸和油酸钠依次加热、沉淀，得到铜铁纳米颗粒；将所述铜铁纳米颗粒分散后与NOBF4的DMF溶液依次混合、除杂和离心后，取所述离心得到的沉淀物，即得到所述纳米铜铁氧体；其能够解决现目前的铁基纳米材料在生理中性和弱酸性肿瘤环境下催化芬顿反应的性能较低从而无法有效抑制癌细胞生长的技术问题。

Description

一种纳米铜铁氧体、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体而言，涉及一种纳米铜铁氧体、制备方法及其应用。
背景技术
现目前，化疗仍然是目前癌症治疗的主要手段。然而，在化疗的过程中，由于全身给药的方式往往导致药物的非特异性生物分布，药物的生物利用度低，全身毒性等问题。近年来，随着纳米科技的出现，纳米材料在医学领域的应用给肿瘤患者带来新的希望。在纳米医学的研究中，化学动力疗法(CDT)作为一种新兴高效的癌症治疗策略，其治疗机理是通过将肿瘤细胞内的过氧化氢(H2O2)转化为具有细胞毒性的羟基自由基(·OH)，加快肿瘤细胞的凋亡。此外，由于肿瘤组织中H2O2过表达的特点，而正常组织内的H2O2含量极低，因此CDT疗法具有肿瘤治疗特异性和低侵袭性的优势。
在众多CDT疗法的研究中，铁基纳米材料作为CDT剂广泛应用于肿瘤的诊断与治疗，主要是由于其生物安全性较高、具有磁共振成像的功能，有助于实现基于磁共振成像的肿瘤诊疗一体化。铁基纳米材料具有较高的比表面积，可以作为纳米药物载体，并在进入肿瘤组织后，由于肿瘤微环境的弱酸性，引起铁基纳米材料的结构坍塌，释放出抗癌药物，有利于实现肿瘤的精确治疗。此外，铁基纳米材料在肿瘤微环境中可以释放出Fe2+离子，显著提升肿瘤组织内Fe2+离子的含量。这些游离的Fe2+离子能够快速发生芬顿反应(Fe2++H2O2→Fe3++OH-+OH·)，将癌细胞内过表达的H2O2催化成高氧化性的·OH，导致脂质、蛋白质、DNA等产生氧化性损伤，实现CDT与化学药物的协同治疗。然而目前的研究发现，Fe2+离子在生理中性和弱酸性肿瘤环境下催化芬顿反应的性能较低，不足以有效抑制癌细胞的生长。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种纳米铜铁氧体，其能够解决现目前的铁基纳米材料在生理中性和弱酸性肿瘤环境下催化芬顿反应的性能较低从而无法有效抑制癌细胞生长的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种纳米铜铁氧体的制备方法，该方法制备简单且效率较高。
本发明的第三目的在于提供一种纳米铜铁氧体的制备方法所制得的纳米铜铁氧体在制备肿瘤药物治疗***中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
第一方面，本申请提供了一种纳米铜铁氧体，该纳米铜铁氧体的化学式为CuxFe3- xO4，X为铜占纳米铜铁氧体的摩尔比。该纳米铜铁氧体有助于实现化学治疗、化学动力学治疗以及光热治疗等多模式协同肿瘤治疗的目的，避免单一化疗药物治疗所产生的耐药性与副作用等问题，为肿瘤患者实现高效安全的诊疗一体化奠定物质基础。
第二方面，本申请提供了一种纳米铜铁氧体的制备方法，包括如下步骤：取油酸铜和油酸铁共同混合于1-十八烯内，得到混合物，向混合物中加入油酸和油酸钠依次加热、沉淀，得到铜铁纳米颗粒；将铜铁纳米颗粒分散后与NOBF4的DMF溶液依次混合、除杂和离心后，取离心得到的沉淀物，即得到所述纳米铜铁氧体。该方法通过高温分解法在高沸点有机溶剂中加热分解油酸铜与油酸铁的混合液，并通过改变油酸铜与油酸铁的比例制备出具有高催化性能、高光热性能、高成像性能的纳米颗粒。该纳米颗粒相比于传统的铁基纳米材料其具有更好的芬顿催化性能，其芬顿催化能力以及光热转化能力显著优于Fe3O4纳米颗粒。另外，纳米铜铁氧体具有良好的生物相容性。对正常的细胞无显著性毒性，对肿瘤细胞具有选择性杀伤的能力。体内抗肿瘤结果同样证明了这一点，LFCCD治疗后小鼠肿瘤得到显著的抑制，而小鼠的体重以及血常规与对照组相比没有明显的区别，因此，纳米铜铁氧体有助于实现化学治疗、化学动力学治疗以及光热治疗等多模式协同肿瘤治疗的目的，避免单一化疗药物治疗所产生的耐药性与副作用等问题，为肿瘤患者实现高效安全的诊疗一体化奠定物质基础。
第三方面，本申请还提供了一种纳米铜铁氧体的制备方法所制得的纳米铜铁氧体在制备肿瘤药物治疗***中的应用。将纳米铜铁氧体和化疗药物通过脂质体组装成纳米簇，制备出智能纳米治疗***。
相对于现有技术，本发明至少具有如下优点或有益效果：
本发明提供了一种纳米铜铁氧体的制备方法，该方法通过高温分解法在高沸点有机溶剂中加热分解油酸铜与油酸铁的混合液，并通过改变油酸铜与油酸铁的比例制备出具有高催化性能、高光热性能、高成像性能的纳米颗粒。该纳米颗粒相比于传统的铁基纳米材料其具有更好的芬顿催化性能，其芬顿催化能力以及光热转化能力显著优于Fe3O4纳米颗粒。另外，纳米铜铁氧体具有良好的生物相容性。对正常的细胞无显著性毒性，对肿瘤细胞具有选择性杀伤的能力。体内抗肿瘤结果同样证明了这一点，LFCCD治疗后小鼠肿瘤得到显著的抑制，而小鼠的体重以及血常规与对照组相比没有明显的区别，因此，纳米铜铁氧体有助于实现化学治疗、化学动力学治疗以及光热治疗等多模式协同肿瘤治疗的目的，避免单一化疗药物治疗所产生的耐药性与副作用等问题，为肿瘤患者实现高效安全的诊疗一体化奠定物质基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1(a)不同CuxFe3-xO4的TEM图片(X分别为0.066、0.106、0.119、0.126、0.190、0)；(b)CuxFe3-xO4在650nm激光照射下温度的变化曲线；(c)CuxFe3-xO4处理的TMB紫外-可见吸收光谱；(d)CuxFe3-xO4的弛豫率r2值；
图2(a)LFCCD的TEM图片；(b)LFCCD在弱酸性条件下处理前后粒径尺寸的变化；(c)弱酸处理后的LFCCD的TEM图片；
图3(a)不同浓度CuXFe3-xO4(x＝0.119)处理THLE-3和293T细胞24h后细胞生存率的变化；(b)不同样品以及不同浓度处理24小时后CT26细胞后的生存率；(c)不同样品以及不同浓度处理48小时后CT26细胞后的生存率；
图4(a)不同治疗组小鼠肿瘤相对体积的变化；(b)不同治疗方法治疗期间小鼠体重的变化；(c)静脉注射PBS(对照)、Cam/Dox或LFCCD 24h后小鼠常规血液分析数据；
图5(a)CuxFe3-xO4或LFCCD注射前和注射后的荷瘤小鼠横断面和冠状面T2-加权MR图像；(b)小鼠肿瘤和肾脏的MRI信号噪比变化(ΔSNR)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
第一方面，本申请提供了一种纳米铜铁氧体，其化学式为CuxFe3-xO4，其中X为铜占纳米铜铁氧体的摩尔比。
第二方面，本申请提供了一种纳米铜铁氧体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取油酸铜和油酸铁共同混合于1-十八烯内，得到混合物，向混合物中加入油酸和油酸钠依次加热、沉淀，得到铜铁纳米颗粒；将铜铁纳米颗粒分散后与NOBF4的DMF溶液依次混合、除杂和离心后，取离心得到的沉淀物，即得到纳米铜铁氧体。该方法通过高温分解法在高沸点有机溶剂中加热分解油酸铜与油酸铁的混合液，并通过改变油酸铜与油酸铁的比例制备出具有高催化性能、高光热性能、高成像性能的纳米颗粒。该纳米颗粒相比于传统的铁基纳米材料其具有更好的芬顿催化性能，其芬顿催化能力以及光热转化能力显著优于Fe3O4纳米颗粒。另外，纳米铜铁氧体具有良好的生物相容性。对正常的细胞无显著性毒性，对肿瘤细胞具有选择性杀伤的能力。体内抗肿瘤结果同样证明了这一点，LFCCD治疗后小鼠肿瘤得到显著的抑制，而小鼠的体重以及血常规与对照组相比没有明显的区别，因此，纳米铜铁氧体有助于实现化学治疗、化学动力学治疗以及光热治疗等多模式协同肿瘤治疗的目的，避免单一化疗药物治疗所产生的耐药性与副作用等问题，为肿瘤患者实现高效安全的诊疗一体化奠定物质基础。
上述油酸铜和油酸铁的制备包括如下步骤：取氯化铁、氯化铜和油酸钠混合并加入乙醇、正己烷和水的混合液加热至70℃后回流2-4小时，得到混合液，将混合液的油相和水相分离后清洗油相，即得到油酸铁和油酸铜的混合物。通过该方法所制得的油酸铁和油酸铜的纯度较高，方便后续同铁合金的制备。
上述混合物、油酸和油酸钠的加热时间为0.5-1小时，加热的温度为280-320℃。该加热温度和加热时间能够保证油酸铜和油酸铁的稳定性，且制备得到的油酸铜和油酸铁的产量更高。
上述混合物、油酸和油酸钠加热时还包括通入惰性气体步骤，惰性气体包括氮气。通过惰性气体保护以免其在加热的过程中与空气中的氧气等其他杂质气体进行反应而生成副产物。
上述铜铁纳米颗粒与NOBF4的DMF溶液的体积比为1：(1-2)，NOBF4的DMF溶液的浓度为0.01-0.05mol/L。该比例区间能够保证铜铁纳米颗粒在其中完全分散。
上述除杂包括如下步骤：将铜铁纳米颗粒与NOBF4的DMF溶液混合后摇晃至纳米颗粒从正己烷层转入DMF层后弃去正己烷层，再加入DMSA除杂，即完成混合。通过转入DMF层使纳米颗粒完全分散在DMF层，从而方便除去正己烷层，以免正己烷层参与后续的反应体系。
第三方面，本申请还提供了一种纳米铜铁氧体的制备方法所制得的纳米铜铁氧体在制备肿瘤药物治疗***中的应用。
上述肿瘤药物治疗***的制备方法包括如下步骤，将纳米铜铁氧体与氢化大豆磷脂氯仿溶液、DSPE-PEG2000氯仿溶液、胆固醇氯仿溶液和喜树碱氯仿溶液混合并蒸发氯仿，得到薄膜，向薄膜加入盐酸阿霉素水溶液和去离子水超声水化25-35min，得到药物粗品，将药物粗品离心后取沉淀，即得到肿瘤药物治疗***。这种脂质体以铜掺杂的超小四氧化三铁纳米颗粒(CuxFe3-xO4)为基础，随后将纳米颗粒以及抗癌药物(喜树碱，阿霉素)通过脂质体组装成智能纳米诊疗平台。CuxFe3-xO4赋予本纳米平台很好的光热作用，化学动力学治疗作用，磁共振成像作用。脂质体作为载体，优异的肿瘤微环境响应能力，为纳米平台的安全性提供保障。而喜树碱，阿霉素用于化学治疗。
上述氢化大豆磷脂氯仿溶液中的氢化大豆磷脂、DSPE-PEG2000氯仿溶液中DSPE-PEG2000的和胆固醇氯仿溶液中的胆固醇的摩尔比为(80-90)：(1-1.5)：(8-12)。该比例区间能够为铜铁纳米材料的安全性提供保障。
上述氢化大豆磷脂氯仿溶液、DSPE-PEG2000氯仿溶液、胆固醇氯仿溶液和盐酸阿霉素水溶液的浓度均为8-12mg/mL。该浓度区间能够为纳米铜铁氧体提供适宜的分散环境，并且使喜树碱、阿霉素等的治疗效果维持较高的水平。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
油酸铜/油酸铁混合物的合成：三口烧瓶中加入10mmol氯化铁(FeCl3)和1mmol氯化铜(CuCl2)以及油酸钠32mmol，随后加入60mL乙醇、18mL正己烷和6mL的混合溶液，然后将烧瓶加热至70℃回流3小时。待反应冷却至室温，将油相和水相分离，用去离子水洗涤油相三次后，放入烘箱过夜。
CuxFe3-xO4的合成：烘干的油酸铁和油酸铜分散在40mL 1-十八烯中，加入4mmol油酸和1.5mmol油酸钠，在氮气保护下，反应逐渐升温至300℃，并维持0.5h。冷却至室温后，加入乙醇沉淀所得到的铁铜纳米材料。用乙醇洗三遍后，分散在正己烷中进一步使用。
CuxFe3-xO4表面配体交换：5mL分散在正己烷中的纳米颗粒(5mg)与5mL NOBF4(0.01M)的DMF溶液混合，摇晃5min至纳米颗粒从正己烷层转入DMF层，弃去正己烷层后，加入DMSA0.1g。摇床震荡0.5h后，加入10mL水，离心10min。乙醇洗涤沉淀2遍后重新分散在水中，得到CuxFe3-xO4(X＝0.066)。
实施例2
油酸铜油酸铁混合物的合成：三口烧瓶中加入9mmol氯化铁(FeCl3)和2mmol氯化铜(CuCl2)以及油酸钠31mmol,随后加入60mL乙醇、18mL正己烷和6mL的混合溶液，然后将烧瓶加热至70℃回流3小时。待反应冷却至室温，将油相和水相分离，用去离子水洗涤油相三次后，放入烘箱过夜。
纳米铜铁氧体的合成：烘干的油酸铁和油酸铜分散在40mL 1-十八烯中，加入4mmol油酸和2mmol油酸钠，在氮气保护下，反应逐渐升温至300℃，并维持0.5小时。冷却至室温后，加入乙醇沉淀所得到的铜铁纳米材料。用乙醇洗三遍后，分散在正己烷中进一步使用。
纳米铜铁氧体配体交换：5mL分散在正己烷中的纳米颗粒(6mg)与5mL NOBF4(0.02M)的DMF溶液混合，摇晃6min至纳米颗粒从正己烷层转入DMF层，弃去正己烷层后，加入DMSA0.15g。摇床震荡0.5h后，加入10mL水，离心10分钟。乙醇洗涤沉淀两遍后重新分散在水中，得到CuxFe3-xO4(X＝0.106)。
实施例3
油酸铜油酸铁混合物的合成：三口烧瓶中加入8mmol氯化铁(FeCl3)和3mmol氯化铜(CuCl2)以及油酸钠30mmol,随后加入60mL乙醇、18mL正己烷和6mL的混合溶液，然后将烧瓶加热至70℃回流4小时。待反应冷却至室温，将油相和水相分离，用去离子水洗涤油相3次后，放入烘箱过夜。
CuxFe3-xO4(X＝0.119)纳米颗粒的合成：烘干的油酸铁和油酸铜分散在40mL 1-十八烯中，加入5mmol油酸和2.5mmol油酸钠，在氮气保护下，反应逐渐升温至300℃，并维持1h。冷却至室温后，加入乙醇沉淀所得到的铜铁纳米材料。用乙醇洗三遍后，分散在正己烷中进一步使用。
CuxFe3-xO4(X＝0.119)纳米颗粒配体交换：5mL分散在正己烷中的纳米颗粒(7mg)与5mL NOBF4(0.03M)的DMF溶液混合，摇晃7min至纳米颗粒从正己烷层转入DMF层，弃去正己烷层后，加入DMSA 0.2g。摇床震荡1h后，加入10mL水，离心10分钟。乙醇洗涤沉淀两遍后重新分散在水中，得到CuxFe3-xO4(X＝0.119)。
实施例4
油酸铜油酸铁混合物的合成：三口烧瓶中加入7mmol氯化铁(FeCl3)和4mmol氯化铜(CuCl2)以及油酸钠29mmol,随后加入60mL乙醇、18mL正己烷和6mL的混合溶液，然后将烧瓶加热至70℃回流4小时。待反应冷却至室温，将油相和水相分离，用去离子水洗涤油相3次后，放入烘箱过夜。
CuxFe3-xO4(X＝0.129)的合成：烘干的油酸铁和油酸铜分散在40mL 1-十八烯中，加入5mmol油酸和3mmol油酸钠，在氮气保护下，反应逐渐升温至300℃，并维持1h。冷却至室温后，加入乙醇沉淀所得到的FeCu纳米材料。用乙醇洗三遍后，分散在正己烷中进一步使用。
CuxFe3-xO4(X＝0.129)表面结合配体交换：5mL分散在正己烷中的纳米颗粒(8mg)与5mL NOBF4(0.04M)的DMF溶液混合，摇晃8min至纳米颗粒从正己烷层转入DMF层，弃去正己烷层后，加入DMSA 0.3g。摇床震荡1h后，加入10mL水，离心10min。乙醇洗涤沉淀两遍后重新分散在水中，得到CuxFe3-xO4(X＝0.129)。
实施例5
油酸铜油酸铁混合物的合成：三口烧瓶中加入6mmol氯化铁(FeCl3)和5mmol氯化铜(CuCl2)以及油酸钠28mmol,随后加入60mL乙醇、18mL正己烷和6mL的混合溶液，然后将烧瓶加热至70℃回流4小时。待反应冷却至室温，将油相和水相分离，用去离子水洗涤油相3次后，放入烘箱过夜。
CuxFe3-xO4(X＝0.190)的合成：烘干的油酸铁和油酸铜分散在40mL 1-十八烯中，加入5mmol油酸和3mmol油酸钠，在氮气保护下，反应逐渐升温至300℃，并维持30min。冷却至室温后，加入乙醇沉淀所得到的FeCu纳米材料。用乙醇洗三遍后，分散在正己烷中进一步使用。
CuxFe3-xO4(X＝0.190)表面结合配体交换：5mL分散在正己烷中的纳米颗粒(9mg)与5mL NOBF4(0.04M)的DMF溶液混合，摇晃8min至纳米颗粒从正己烷层转入DMF层，弃去正己烷层后，加入DMSA 0.3g。摇床震荡1h后，加入10mL水，离心10min。乙醇洗涤沉淀两遍后重新分散在水中，得到CuxFe3-xO4(X＝0.190)。
实施例6
氢化大豆磷脂(HSPC)，胆固醇，DSPE-PEG2000分别溶于氯仿中配置成10mg/mL的溶液。喜树碱(Cam)和盐酸阿霉素(Dox)分别用氯仿和去离子水配置成10mg/mL的溶液。
分别取HSPC氯仿溶液2.5131mL,胆固醇氯仿溶液150μL,DSPE-PEG2000氯仿溶液533.1μL,使得HSPC、胆固醇、DSPE-PEG2000的摩尔比为85:10:1。另外加入CuxFe3-xO4 5mg,Cam氯仿溶液2mL,混匀后使用旋转蒸发仪蒸发氯仿，直至在烧瓶中形成均匀的薄膜。(X＝0.119)
加入盐酸阿霉素水溶液2mL,去离子水3mL,超声水化30min。将得到的纳米药物150000×g，4℃离心2h。分离上清，将沉淀重新分散在5mL水中，4℃保存，得到肿瘤药物治疗***。
试验例1
采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定铁、铜元素含量。将纳米铜铁氧体表示为CuxFe3-xO4，那么以上五种CuxFe3-xO4的X值分别为0.066、0.106、0.119、0.129、0.190。透射电子显微镜(TEM)成像结果表明，CuxFe3-xO4纳米晶均在10～20nm范围内具有相似的尺寸范围，且随着铜掺杂比例的增加，其形貌逐渐由球形变为方形，再变为不规则。CuxFe3-xO4纳米晶体在650nm激光照射10分钟后，比纯Fe3O4具有更好的光热效应。CuxFe3-xO4纳米晶的温度可提高13-18℃，而纯Fe3O4的温度仅提高约4℃。结果表明，铜的掺杂显著提高了Fe3O4的光热性能。然后，我们通过3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)检测来评估CuxFe3-xO4纳米晶体催化芬顿型反应的能力。TMB被·OH氧化形成TMB-ox(蓝色)，最大吸光度为652nm。结果显示，CuxFe3-xO4纳米晶的Fenton催化能力明显优于传统Fe3O4。这验证了我们的想法，简单的铁基纳米材料可以通过铜的掺杂显著提高催化性能。然后，使用7.0T磁共振扫描仪评估CuxFe3- xO4的T2增强效果。通过1/T2与铁离子浓度的比值，计算CuxFe3-xO4的横向弛豫率(r2)。可以观察到，与其他组相比，CuxFe3-xO4(x＝0.119)在320.71mM-1s-1处r2值最高，表明CuxFe3-xO4(x＝0.119)具有最强的T2 MRI对比能力。
综上所示，CuxFe3-xO4(x＝0.119)可能是一种较好的造影剂同时拥有很好的催化能力以及光热性能，可用于后续的实验探索。
试验例2
从TEM图像中可以看出，LFCCD纳米粒子的形貌为球形纳米团簇，尺寸为100nm，具有优良的单分散性。此外，LFCCD的紫外-可见吸收光谱显示了Dox和Cam的典型峰，表明Dox和Cam已成功加载到磁性纳米脂质体中。为了确定LFCCD是否能够在肿瘤微环境中释放化疗药物和超小CuxFe3-xO4(x＝0.119)纳米晶体，我们模拟弱酸性肿瘤微环境(pH 4.5)对LFCCD纳米颗粒进行处理。如图所示，经过处理后，LFCCD的纳米团簇结构开始坍塌，并***成许多微小的纳米晶体，同时，LFCCD的水动力尺寸显著减小，说明LFCCD对肿瘤微环境具有较强的响应能力。
试验例3
1.1体外安全性评估
纳米脂质体的生物安全性是评价其临床应用潜力的重要考虑因素。结果发现，磁性纳米脂质体对THLE-3和293T细胞具有较低的细胞毒性，在0-160mg/mL浓度范围内，存活率超过70％，表明超小LFCCD纳米脂质体对正常细胞具有较低的毒性。
1.2体外抗肿瘤疗效评价
设置5个对照组，分别为Control(未经任何处理)、Cam/Dox(喜树碱与阿霉素的混合溶液)、LFCC(未负载阿霉素)、LFCCD、LFCCD+Laser(加上650nm激光照射处理)，评估不同组处理的CT26细胞的活力。随着浓度的增加，不同处理培养的CT26细胞存活率降低。更重要的是，与Cam/Dox和LFCC组相比，LFCCD表现出更高的细胞毒性，这是由于铁死亡与化疗的协同作用。此外，LFCCD+Laser对细胞活力的抑制作用强于LFCCD，这是由于在使用激光时，温度升高不仅会灼伤肿瘤细胞，还会促进铁死亡作用。
试验例4
1.1体内抗肿瘤疗效评价
为了进一步评估LFCCD在体内的抗肿瘤能力，通过注射CT26细胞构建了携带CT26的BALB/c小鼠，然后通过尾静脉注射Cam、Cam/Dox、LFCC、LFCCD和LFCCD+L。Cam治疗后肿瘤生长可部分抑制。然而，与游离Cam相比，LFCC对肿瘤生长的抑制能力更强，说明铁死亡能有效促进LFCC的抗癌活性。值得注意的是，通过联合注射Cam和Dox也有效抑制了肿瘤的生长，这说明了Cam和Dox联合治疗的优势。LFCCD组的抗肿瘤能力进一步证实了这一结果。更重要的是，LFCCD+L组表现出最强的抗癌活性，提示使用激光可以进一步抑制肿瘤生长。
1.2体内安全性评估
作为一种新的治疗药物，除了疗效外，其安全性、药代动力学和生物分布也需要在体内进行***评价，所开发的制剂是否具有潜在的临床应用价值。在治疗过程中，对不同组小鼠的体重进行监测，各组小鼠的体重无显著差异。
然而，在常规血液分析结果中，Cam/Dox处理小鼠后，白细胞显著增加，而红细胞显著减少。这些结果表明Cam/Dox具有严重的血液毒性。此外，LFCCD治疗后血常规指标无明显变化，说明LFCCD可降低Cam和Dox的毒性，具有良好的血液生物相容性。通过以上分析可以看出，LFCCD具有良好的组织生物安全性和血液生物相容性，在癌症治疗方面具有潜在的临床应用潜力。
试验例5
体内磁共振成像性能评价
将荷瘤的BALB/c小鼠注射CuxFe3-xO4或LFCCD，剂量为2mg/kg，使用7.0T MRI扫描仪通过T2WI观察治疗前后肿瘤区域。如图5所示横断面中，CuxFe3-xO4(x＝0.119)处理小鼠的肿瘤区域没有明显改变(白色圆圈)，但LFCCD逐渐变暗，尤其是在120分钟内。注射CuxFe3-xO4小鼠的冠状面T2-加权成像仅在注射后30分钟出现轻微的黑暗，其他时间点无明显变化。这可能是因为超小的CuxFe3-xO4纳米晶体在尾静脉注射30分钟内快速代谢。我们注意到，LFCCD处理小鼠的肿瘤组织在尾静脉注射120分钟时MR图像显示为最暗，这与横断面面结果一致。这些结果表明LFCCD比CuxFe3-xO4纳米晶在肿瘤中有更有效的积聚，从而实现了肿瘤的准确诊断。一般情况下，大于10nm的颗粒是通过肝脏代谢途径排出体外的。而小于10nm的颗粒则通过肾脏途径代谢。值得注意的是,我们发现在T2加权的横断面图像中，LFCCD处理的小鼠的肾脏(灰色圆圈)在120分钟出现明显变黑，以及冠状面中小鼠肾脏在150分钟呈现最黑的状态,这意味着大量的LFCCD通过肾脏代谢途径。这是因为LFCCD在癌细胞中被有效降解，并***成大量的超小颗粒，使超小颗粒通过肾脏途径排出体外。这一结果进一步证明了LFCCD对肿瘤微环境具有较强的响应能力，并可被生物降解。相比之下，注射CuxFe3-xO4后，轴位和冠状位T2加权图像上肾脏区域在30min时迅速变暗，然后随着时间的增加逐渐恢复，说明超小CuxFe3-xO4纳米晶容易被肾脏快速代谢。综上所述，LFCCD能够在肿瘤中有效积累，并通过肾脏途径降解代谢，表现出良好的肿瘤MRI诊断能力和生物降解能力。
综上所述，本发明实施例提供了一种纳米铜铁氧体的制备方法及其应用：
本发明实施例提供了一种纳米铜铁氧体的制备方法，该方法通过高温分解法在高沸点有机溶剂中加热分解油酸铜与油酸铁的混合液，并通过改变油酸铜与油酸铁的比例制备出具有高催化性能、高光热性能、高成像性能的纳米颗粒。该纳米颗粒相比于传统的铁基纳米材料其具有更好的芬顿催化性能，其芬顿催化能力以及光热转化能力显著优于Fe3O4纳米颗粒。另外，纳米铜铁氧体具有良好的生物相容性。对正常的细胞无显著性毒性，对肿瘤细胞具有选择性杀伤的能力。体内抗肿瘤结果同样证明了这一点，LFCCD治疗后小鼠肿瘤得到显著的抑制，而小鼠的体重以及血常规与对照组相比没有明显的区别，因此，纳米铜铁氧体有助于实现化学治疗、化学动力学治疗以及光热治疗等多模式协同肿瘤治疗的目的，避免单一化疗药物治疗所产生的耐药性与副作用等问题，为肿瘤患者实现高效安全的诊疗一体化奠定物质基础。
该铜铁合金生物相容性好、芬顿催化性能高；制备工艺简单，成本相对便宜，易生产；原料环境友好，无化学污染。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种纳米铜铁氧体，其特征在于，所述纳米铜铁氧体的化学式为CuxFe3-xO4，X为铜占所述纳米铜铁氧体的摩尔比。
2.一种如权利要求1所述的纳米铜铁氧体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取油酸铜和油酸铁共同混合于1-十八烯内，得到混合物，向所述混合物中加入油酸和油酸钠依次加热、沉淀，得到铜铁纳米颗粒；
将所述铜铁纳米颗粒分散后与NOBF4的DMF溶液依次混合、除杂和离心后，取所述离心得到的沉淀物，即得到所述纳米铜铁氧体。
3.根据权利要求2所述的纳米铜铁氧体的制备方法，其特在于，所述油酸铜和所述油酸铁的制备包括如下步骤：取氯化铁、氯化铜和油酸钠混合并加入乙醇、正己烷和水的混合液加热至70℃后回流2-4小时，得到混合液，将所述混合液的油相和水相分离后清洗所述油相，即得到所述油酸铁和所述油酸铜的混合物。
4.根据权利要求2所述的纳米铜铁氧体的制备方法，其特征在于，所述混合物、所述油酸和所述油酸钠的加热时间为0.5-1小时，所述加热的温度为280-320℃。
5.根据权利要求4所述的纳米铜铁氧体的制备方法，其特征在于，所述混合物、所述油酸和所述油酸钠加热时还包括通入惰性气体步骤，所述惰性气体包括氮气。
6.根据权利要求2所述的纳米铜铁氧体的制备方法，其特征在于，所述铜铁纳米颗粒与所述NOBF4的DMF溶液的体积比为1：(1-2)，所述NOBF4的DMF溶液的浓度为0.01-0.05mol/L。
7.根据权利要求2所述的纳米铜铁氧体的制备方法，其特征在于，所述除杂包括如下步骤：将所述铜铁纳米颗粒与所述NOBF4的DMF溶液混合后摇晃至纳米颗粒从正己烷层转入DMF层后弃去所述正己烷层，再加入DMSA除杂，即完成混合。
8.一种如权利要求1-6任意一项所述的纳米铜铁氧体的制备方法所制得的纳米铜铁氧体在制备肿瘤药物治疗***中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤，将所述纳米铜铁氧体与氢化大豆磷脂氯仿溶液、DSPE-PEG2000氯仿溶液、胆固醇氯仿溶液和喜树碱氯仿溶液混合并蒸发氯仿，得到薄膜，向所述薄膜加入盐酸阿霉素水溶液和去离子水超声水化25-35min，得到药物粗品，将所述药物粗品离心后取沉淀，即得到所述肿瘤药物治疗***。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述氢化大豆磷脂氯仿溶液中的氢化大豆磷脂、所述DSPE-PEG2000氯仿溶液中DSPE-PEG2000的和所述胆固醇氯仿溶液中的胆固醇的摩尔比为(80-90)：(1-1.5)：(8-12)，所述氢化大豆磷脂氯仿溶液、所述DSPE-PEG2000氯仿溶液、所述胆固醇氯仿溶液和所述盐酸阿霉素水溶液的浓度均为8-12mg/mL。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102815753A (zh) * 2012-08-24 2012-12-12 上海交通大学 在水相具有高分散稳定性的Fe3O4纳米颗粒及其制备方法
CN103768600A (zh) * 2014-01-25 2014-05-07 郑州大学 一种磁性热敏脂质体纳米金复合物、制备方法及应用
CN107138093A (zh) * 2016-08-22 2017-09-08 浙江大学台州研究院 磁力纳米搅拌子的制备方法
CN110755611A (zh) * 2019-10-18 2020-02-07 中国药科大学 一种纳米簇载药热敏脂质体制剂及其制法和应用
CN111671769A (zh) * 2020-05-26 2020-09-18 赣南医学院 含铜铁氧体纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102815753A (zh) * 2012-08-24 2012-12-12 上海交通大学 在水相具有高分散稳定性的Fe3O4纳米颗粒及其制备方法
CN103768600A (zh) * 2014-01-25 2014-05-07 郑州大学 一种磁性热敏脂质体纳米金复合物、制备方法及应用
CN107138093A (zh) * 2016-08-22 2017-09-08 浙江大学台州研究院 磁力纳米搅拌子的制备方法
CN110755611A (zh) * 2019-10-18 2020-02-07 中国药科大学 一种纳米簇载药热敏脂质体制剂及其制法和应用
CN111671769A (zh) * 2020-05-26 2020-09-18 赣南医学院 含铜铁氧体纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MELISSA R. DEWI等: "Synthesis and Phase Transfer of Monodisperse Iron Oxide (Fe3O4) Nanocubes", AUST. J. CHEM *
SHENGZHE ZHAO等: "Multifunctional magnetic iron oxide nanoparticles: an advanced platform for cancer theranostics", THERANOSTICS *

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