CN114645074A - 一种单花蕾微量rna建库方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单花蕾微量RNA建库方法，该方法基于Tn5转座酶进行RNA/DNA杂合链片段化并同时使cDNA两端带上接头，从而能够省去常规转录组建库技术中必需的RNA打断、二链合成等繁琐的操作步骤，整个过程不需要进行mRNA的富集，直接总RNA投入建库，大大降低了起始模板投入量，通过一步酶促反应也减少多个繁琐步骤，例如RNA片段化、一链合成、二链合成、末端修复和接头连接等所带来的样品的损耗，整个流程总RNA需求量大大降低，且至少节省2个小时。

Description

一种单花蕾微量RNA建库方法
技术领域
本发明涉及测序文库构建技术领域，具体涉及一种利用单个植物花蕾的微量RNA构建转录组文库的方法。
背景技术
随着高通量测序技术的发展，许多科学研究取得突破性的进展。转录组测序是目前应用最广泛的高通量测序技术之一，其能够从全基因组整体转录水平研究基因功能，揭示特定生物学过程发生中的关键分子机制。
目前植物常规转录组测序文库制备通常需要至少100ng的RNA起始量，然而在实际的科研实验中，植物样本的获得却受到许多条件的限制，若研究的目标是特定发育阶段的单个营养或生殖器官时，这类实验的材料取材难以获取足够多的RNA来进行常规转录组建库测序，也因此限制了许多植物涉及生长发育阶段过程的关键研究。
因此，发明通过微量的RNA便能够构建转录组文库的方法，能够推动植物生长发育阶段过程的关键研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中植物转录组测序文库制备需要100ng的RNA起始量的缺陷，提供一种单花蕾微量RNA建库方法，该方法利用单个植物花蕾的低至100ng的RNA起始量便能够获得较高质量的转录组文库，与目前常用的转录组测序建库方法相比，在大大简化建库过程的同时，所需样品总量也大大减少，可以实现某些肉眼不具识别性的特定组织或器官形成过程中的表达动态变化。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种单花蕾微量RNA建库方法，其包括以下步骤：
pTXB1-Tn5纯化步骤：将pTXB1-Tn5质粒转化感受态E.coli Transetta DE3；将单菌落接种添加了抗生素的LB培养基中，培养至OD600＝0.9；加入0.25mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达至OD600＝3.0，诱导表达后的菌液离心制成菌体；加入HEGX裂解液和蛋白酶抑制剂，裂解释放蛋白质；裂解产物离心后取上清液加入PEI溶液，离心除去沉淀物，得到的上清液进行层析；接着裂解层析柱，以实现pTXB1-Tn5质粒从内含子上切割；收集含目的蛋白的液体，得到Tn5蛋白未浓缩液；然后用超滤浓缩柱透析，得到Tn5转座酶；
RNA提取步骤：取植物的单花蕾提取RNA；
RNA反转录步骤：取溶解了RNA的溶液，加入oligo-dTVN引物和dNTP混合物，制成RNA样品溶液备用；配置反转录反应体系，所述反转录反应体系包括SuperScript II逆转录酶、RNase抑制剂、Superscript II第一链缓冲液、二硫苏糖醇、甜菜碱、氯化镁、模板转换寡核苷酸；将RNA样品溶液加入反转录反应体系中，运行PCR反应，获得RNA/DNA杂合产物；
Tn5转座复合体组装和纯化步骤：取功能嵌合端寡核苷酸与接头A、取功能嵌合端寡核苷酸与接头B分别逐步退火形成双链，然后分别加入Tn5转座酶孵育，得到转座体A和转座体B，将转座体A和转座体B混合后加入RNA/DNA杂合产物，在缓冲缓中进行片段化；
单花蕾文库制备和测序步骤：将片段化的RNA进行PCR扩增，然后纯化，获得出库产物，用Qubit 2.0进行定量。
一种实施方式，所述oligo-dTVN引物的序列为
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3’。
一种实施方式，所述反转录反应体系中，模板转换寡核苷酸的序列为5’-AAGCAGTGGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’。
一种实施方式，RNA反转录步骤中，反转录PCR反应程序为：42℃，90min；50℃，2min；42℃，2min和70℃，15min。
一种实施方式，所述功能嵌合端寡核苷酸的序列为5-CTGCTCTTATACACATCT-3，所述接头A的序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，所述接头B的序列为5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3。
一种实施方式，Tn5转座复合体组装和纯化步骤中，所述缓冲剂包括10mM三羟甲基氨基甲烷、5mM MgCl2、10％N,N-二甲基甲酰胺、9％PEG8000、0.85mM ATP。
一种实施方式，所述RNA提取步骤中，采用Trizol提取液从单花蕾中提取总RNA，用氯仿进行离心分离，再用异丙醇进行离心使RNA沉淀于管壁和底部，用乙醇洗涤后风干至透明状，加入经过高温灭菌的双蒸水溶解RNA备用。
一种实施方式，将片段化的RNA进行PCR扩增的步骤为：往片段化RNA产物中添加100units的Superscript II和1x Q5 High-Fidelity Master Mix，反应程序为42℃，15min；70°，15min；接着加入5μL N5XX和5μL N7XX进行PCR扩增，反应程序为72℃，15min；98℃，30s；10个循环98℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 2min；，72℃，5min。
一种实施方式，片段化的RNA进行PCR扩增完成后，用VAHTS DNA Clean Beads按1：1的比例进行纯化。
一种实施方式，取用的单花蕾为荔枝或者倒地铃的单花蕾。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明建立的单花蕾微量RNA建库方法仅需植物的单个花蕾就可以完成建库。本方的单花蕾微量RNA建库方法基于Tn5转座酶进行RNA/DNA杂合链片段化并同时使cDNA两端带上接头，从而能够省去常规转录组建库技术中必需的RNA打断、二链合成等繁琐的操作步骤，整个过程不需要进行mRNA的富集，直接总RNA投入建库，大大降低了起始模板投入量，通过一步酶促反应也减少多个繁琐步骤，例如RNA片段化、一链合成、二链合成、末端修复和接头连接等所带来的样品的损耗，整个流程总RNA需求量大大降低，且至少节省2个小时。
本发明建立的单花蕾微量RNA建库方法实现了微量植物样品的转录组建库，与目前常用的转录组测序建库方法相比，在大大简化建库过程的同时，所需样品总量也大大减少，可以实现某些肉眼不具识别性的特定组织或器官形成过程中的表达动态变化。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是本发明Tn5蛋白纯化过程SDS-PAGE分析图；
图2为本发明的单花蕾微量RNA建库方法的流程图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。除特殊说明的之外，本实施例中所采用到的材料及设备均可从市场购得。所述实施例的实例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解对本申请的限制。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或者位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或者暗示所指的装置或者元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非是另有精确具体地规定。
在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连通”、“连接”应作广义理解，例如，可以使固定连接，也可以是通过中介媒介间相连，可以是两个元件内部的连通或者两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本实施例提供的单花蕾微量RNA建库方法，是利用植物的单花蕾提取RNA，然后采用Tn5转座酶进行RNA/DNA杂合链片段化并同时使cDNA两端带上接头，省去了常规转录组建库技术中必需的RNA打断、二链合成等繁琐的操作步骤，整个过程不需要进行mRNA的富集，直接总RNA投入建库，整个流程总RNA需求量大大降低，且至少节省2个小时。具体步骤如下：
pTXB1-Tn5纯化步骤：将pTXB1-Tn5质粒转化感受态E.coli Transetta DE3；将单菌落接种添加了抗生素的LB培养基中，培养至OD600＝0.9；加入0.25mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达至OD600＝3.0，诱导表达后的菌液离心制成菌体；加入HEGX裂解液和蛋白酶抑制剂，裂解释放蛋白质；裂解产物离心后取上清液加入PEI溶液，离心除去沉淀物，得到的上清液进行层析；接着裂解层析柱，以实现pTXB1-Tn5质粒从内含子上切割；收集含目的蛋白的液体，得到Tn5蛋白未浓缩液；然后用超滤浓缩柱透析，得到Tn5转座酶；
RNA提取步骤：取植物的单花蕾提取RNA；
RNA反转录步骤：取溶解了RNA的溶液，加入oligo-dTVN引物和dNTP混合物，制成RNA样品溶液备用；配置反转录反应体系，所述反转录反应体系包括SuperScript II逆转录酶、RNase抑制剂、Superscript II第一链缓冲液、二硫苏糖醇、甜菜碱、氯化镁、模板转换寡核苷酸；将RNA样品溶液加入反转录反应体系中，运行PCR反应，获得RNA/DNA杂合产物；
Tn5转座复合体组装和纯化步骤：取功能嵌合端寡核苷酸与接头A、取功能嵌合端寡核苷酸与接头B分别逐步退火形成双链，然后分别加入Tn5转座酶孵育，得到转座体A和转座体B，将转座体A和转座体B混合后加入RNA/DNA杂合产物，在缓冲缓中进行片段化；
单花蕾文库制备和测序步骤：将片段化的RNA进行PCR扩增，然后纯化，获得出库产物，用Qubit 2.0进行定量。
所述oligo-dTVN引物的序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3’。
所述反转录反应体系中，模板转换寡核苷酸的序列为
5’-AAGCAGTGGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’。
在RNA反转录步骤中，反转录PCR反应程序为：42℃，90min；50℃，2min；42℃，2min和70℃，15min。
所述功能嵌合端寡核苷酸的序列为5-CTGCTCTTATACACATCT-3，所述接头A的序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，所述接头B的序列为5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3。
在Tn5转座复合体组装和纯化步骤中，所述缓冲剂包括10mM三羟甲基氨基甲烷、5mM MgCl2、10％N,N-二甲基甲酰胺、9％PEG8000、0.85mM ATP。
所述RNA提取步骤中，采用Trizol提取液从单花蕾中提取总RNA，用氯仿进行离心分离，再用异丙醇进行离心使RNA沉淀于管壁和底部，用乙醇洗涤后风干至透明状，加入经过高温灭菌的双蒸水溶解RNA备用。
将片段化的RNA进行PCR扩增的具体步骤为：往片段化RNA产物中添加100units的Superscript II和1x Q5 High-Fidelity Master Mix，反应程序为42℃，15min；70°，15min；接着加入5μL N5XX和5μL N7XX进行PCR扩增，反应程序为72℃，15min；98℃，30s；10个循环98℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 2min；，72℃，5min。
在片段化的RNA进行PCR扩增完成后，用VAHTS DNA Clean Beads按1：1的比例进行纯化。
下面以荔枝或者倒地铃的单花蕾进行微量RNA建库对本发明作进一步详细介绍。
请参照图2，一种单花蕾微量RNA建库方法，其包括以下步骤：
步骤10、pTXB1-Tn5纯化步骤：
101、购买pTXB1-Tn5质粒。
102、将pTXB1-Tn5质粒转化表达菌株Transetta(DE3)感受态细胞，在氨苄(50mg/L)抗性的LB培养基上涂板过夜，挑取单克隆于10mL LB液体培养基(氨苄抗性Amp)，37℃，250rpm振荡培养过夜。
103、吸取10μL保存的Tn5菌液(DE3菌株)转接到含50mg/L氨苄抗生素的10mL LB液体中，37℃，220rpm，大概需要18h。
104、将步骤103小摇的菌液转接(最好按1:50或1:100比例转接)到200mL LB培养基中，加入氨苄抗生素(50mg/L)，继续37℃，250rpm培养，间断检测菌液OD值，使OD600＝0.9(以1:100比例转接，大概需要6h)。取出1.5ml菌液作为IPTG诱导前的全细胞对照，-20℃保存，如附图1 S1泳道。
105、然后将步骤104菌液冷却到10℃，并加入0.25mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达。在23℃、220rpm条件下继续生长4h后，OD600达到3.0，产生3-4gr的细胞。取1.5ml菌液作为IPTG诱导后的全细胞对照，-20℃保存，如附图1 S2泳道。
106、对步骤105获得的菌液收集到50mL离心管中，12000r/min，4℃，离心15min，弃上清液，然后菌液沉淀放在-80℃冷冻过夜。
107、将步骤106的菌体沉淀冰上溶解，接着加入16mL HEGX裂解液和640μL蛋白酶抑制剂中，轻柔吹打使沉淀重悬，避免产生气泡。所述HEGX裂解液包括20mM HEPES-KOH(pH7.2)，0.8M NaCl，1mM EDTA，10％甘油，0.2％Triton X-100。
108、在冰上用超声波破碎仪进行超声破碎，至菌液呈现半透明。超声波破碎仪的功率设置为20％，超声9s，停9s，可调整频率和强度，最大限度地减少气泡/泡沫的形成。吸取1mL上清液用于SDS-PAGE分析—菌体破碎效率检测，如附图1 S3泳道。
109、将步骤108的裂解产物在离心机中以12,000rpm的速度在4℃下离心30分钟。
110、取步骤109的上清液，弃沉淀，在滴加420μL 10％的中和的聚乙烯亚胺溶液。接着在4℃下以12,000rpm的速度离心10分钟，除去沉淀物。引入聚乙烯亚胺沉淀步骤可以有效降低文库中大肠杆菌的reads的污染。保留10μL上清液用于SDS-PAGE分析—细胞粗提液，如附图1 S4泳道。
111、准备层析柱，垫好棉垫，先用含有蛋白酶抑制剂的HEGX溶液洗一下柱子，然后彻底混匀柱料，往每个层析柱中加入2mL柱料，静置待柱料沉降，再加入4-5mL HEGX溶液过柱，待层析柱中液体剩一点。
112、封好层析柱底帽，然后往每个层析柱中分别加入8mL步骤110获得的上清液，盖上盖子。
113、在旋转仪上以5rpm转速旋转25min。
114、取下层析柱，静置至分层，先打开顶部盖，再打开底部帽，收集流出液4℃保存于。取出10μL流出液进行SDS-PAGE分析，如附图1 S5泳道。
115、用30mL的HEGX溶液(≥20倍柱床体积的柱缓冲液)洗涤柱子，以彻底去除游离蛋白，收集洗涤液。取出10μL的洗涤液进行SDS-PAGE分析，如附图1 S6泳道。
116、加入硫醇：盖好底部盖，在柱床底部加入5mL含100mM DTT的HEGX溶液(含蛋白酶抑制剂)。
117、柱上裂解：步骤116的层析柱在4℃下，5rpm保持关闭36-48小时，以实现Tn5从内含子上的切割。
118、从旋转仪上取下步骤117的层析柱并静置5-10min，把柱上切割后含目的蛋白的液体收集起来，得到初步的Tn5蛋白未浓缩液。保留10μL上清液用于SDS-PAGE分析，如附图1 S8泳道。
119、用2mLHEGX溶液洗脱一遍(静置10min后流出)，收集柱中残余的Tn5蛋白。取出10μL洗脱液用于SDS-PAGE分析，如附图1 S9泳道。
120、用超滤浓缩柱透析。保留10μL废弃滤液用于SDS-PAGE分析—Tn5透析效率检测，如附图1 S11泳道。
121、当透析柱内液体剩余200-300μL液体时，加入同等体积的2xTn5透析液置换至剩余200-300μL蛋白浓缩液。
122、用枪缓慢吹洗一下透析柱内部后吸出浓缩后的Tn5蛋白。取10μL用于SDS-PAGE分析，图1 S10泳道。
123、每管加入1.1V的100％甘油保存。
124、用Qubit测定Tn5蛋白的浓度。
步骤20、RNA提取步骤：
201、取荔枝/倒地铃的单花蕾，放入1.5mL离心管中，在液氮创造的低温条件下用研棒彻底磨碎，加入300μL Trizol提取液，上下颠倒震荡混匀，在室温条件静置3～5分钟。
202、往离心管中再加入100μL氯仿，大力摇动，室温条件下静置3～5分钟，在预冷至4℃的冷冻离心机中以转速12000rpm离心15分钟。
203、离心后，吸取上清液转入新的1.5mL离心管中，再加入等体积的异丙醇，上下颠倒轻柔混匀，室温条件下静置10分钟，在预冷至4℃的冷冻离心机中以转速12000rpm离心10分钟，RNA沉淀于管壁和底部。
204、弃去上清液，加入1mL 75％乙醇洗涤，在预冷至4℃的冷冻离心机中以转速7500rpm离心5分钟，倒掉75％乙醇。
205、重复上述洗涤步骤，倒掉75％乙醇。
206、空管在预冷至4℃的冷冻离心机中以转速12000rpm离心3分钟，吸掉多余酒精，于通风橱中风干酒精至透明状，加入10μL高温灭菌40分钟的ddH2O溶解RNA。
207、吸取1μL用于检测RNA的纯度和浓度，记录样品浓度和OD比值，结果见表1。
步骤30、RNA反转录步骤：
301、将2.3uL RNA加入0.2mL的薄壁PCR试管中。加入1μL 10μM的oligo-dTVN引物和1μL dNTP混合物。所述oligo-dTVN引物的序列为：
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3’)
302、迅速涡旋震荡混匀，700g室温离心10秒，立即冰浴。
303、将样品在72℃孵育3分钟，立即冰浴。
304、700g室温离心10s，收集管底液体并立即冰浴待用。
305、制备反转录反应体系：100U SuperScript II逆转录酶(200U/μL)，10U RNase抑制剂(40U/μL)，1×Superscript II第一链缓冲液，5mM DTT，1M甜菜碱，6Mm MgCl2，1μMTSO。所述TSO序列为：5’-AAGCAGTGGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’。
306、将上述反转录反应体系加入步骤304获得的样品中，用水补齐使终反应体系为10μL。轻轻上下吹吸混匀，避免产生气泡。
307、700g室温离心10s，收集管底液体，置PCR仪进行反转录PCR反应，PCR反应程序为：42℃，90min；50℃，2min和42℃，2min(10个循环)；70℃，15min。
步骤40、Tn5转座复合体组装和纯化步骤
401、分别取50uL的功能嵌合端(ME)寡核苷酸与50uL的接头Adaptor A置一无酶的200uL PCR管中，混匀后，95℃，3min；70℃，3min；44个循环[70℃——>25℃，按每个循环降低1℃最终降至25℃，每个温度运行30s]，然后放置至恢复常温，之后可直接使用，或者储存-20℃。采取上述同样的方法，将ME与接头Adaptor B逐步退火形成双链。
所述功能嵌合端寡核苷酸的序列为5-CTGCTCTTATACACATCT-3。
所述接头Adaptor A的序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’。
所述接头Adaptor B的序列为5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3。
402、将100ug用甘油保存的Tn5转座酶与上述步骤401中退火的ME-Adaptor A(20μM)或ME-Adaptor B(20μM)分别充分混合，并在30℃下孵育1小时，得到转座体A和转座体B。
403、将步骤402得到的两个转座体充分混合在一起。
404、利用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器去除上述步骤403转座体中多余的接头序列，准备片段化或储存在-20℃。
405、对于步骤30中RNA反转录获得的RNA/DNA杂合产物，加入0.006uL步骤404的Tn5转座复合体，并在含有10mM Tris-Cl(pH 7.6)、5mM MgCl2、10％N,N-二甲基甲酰胺、9％PEG8000、0.85mM ATP的缓冲液中进行片段化，55℃孵育30min。
步骤50、单花蕾文库制备和测序
501、往上述片段化产物中添加100units的Superscript II和1x Q5 High-Fidelity Master Mix在42℃下反应15min，然后在70℃下反应15min使Superscript II失活。具体反应程序为：42℃，15min；70°，15min。
502、加入indexed common primers(5μL N5XX+5μL N7XX)进行PCR扩增，反应程序为72℃ 15min，98℃ 30s，10个循环[98℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 2min]，72℃ 5min。
503、先用PCR仪进行5-8个循环的反应，后吸取10uL反应产物进行qRT-PCR，记录每个文库的CT值，后根据CT值设置循环数(一般在CT值的基础上增加1-2cycle)进行剩余反应产物的PCR扩增。
504、PCR完成后获得的文库用VAHTS DNA Clean Beads按1：1比例进行纯化。
505、获得出库产物，用Qubit 2.0进行定量，按照测序要求进行文库送测，结果见表1。
表1 单花蕾RNA和文库浓度及转录组数据相关信息表
Figure BDA0003535579940000091
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
pTXB1-Tn5纯化步骤：将pTXB1-Tn5质粒转化感受态E.coli Transetta DE3；将单菌落接种添加了抗生素的LB培养基中，培养至OD600＝0.9；加入0.25mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达至OD600＝3.0，诱导表达后的菌液离心制成菌体；加入HEGX裂解液和蛋白酶抑制剂，裂解释放蛋白质；裂解产物离心后取上清液加入PEI溶液，离心除去沉淀物，得到的上清液进行层析；接着裂解层析柱，以实现pTXB1-Tn5质粒从内含子上切割；收集含目的蛋白的液体，得到Tn5蛋白未浓缩液；然后用超滤浓缩柱透析，得到Tn5转座酶；
RNA提取步骤：取植物的单花蕾提取RNA；
RNA反转录步骤：取溶解了RNA的溶液，加入oligo-dTVN引物和dNTP混合物，制成RNA样品溶液备用；配置反转录反应体系，所述反转录反应体系包括SuperScript II逆转录酶、RNase抑制剂、Superscript II第一链缓冲液、二硫苏糖醇、甜菜碱、氯化镁、模板转换寡核苷酸；将RNA样品溶液加入反转录反应体系中，运行PCR反应，获得RNA/DNA杂合产物；
Tn5转座复合体组装和纯化步骤：取功能嵌合端寡核苷酸与接头A、取功能嵌合端寡核苷酸与接头B分别逐步退火形成双链，然后分别加入Tn5转座酶孵育，得到转座体A和转座体B，将转座体A和转座体B混合后加入RNA/DNA杂合产物，在缓冲缓中进行片段化；
单花蕾文库制备和测序步骤：将片段化的RNA进行PCR扩增，然后纯化，获得出库产物，用Qubit 2.0进行定量。
2.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于：所述oligo-dTVN引物的序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3’。
3.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于：所述反转录反应体系中，模板转换寡核苷酸的序列为5’-AAGCAGTGGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’。
4.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于：RNA反转录步骤中，反转录PCR反应程序为：42℃，90min；50℃，2min；42℃，2min和70℃，15min。
5.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于：所述功能嵌合端寡核苷酸的序列为5-CTGCTCTTATACACATCT-3，所述接头A的序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，所述接头B的序列为5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3。
6.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于：Tn5转座复合体组装和纯化步骤中，所述缓冲剂包括10mM三羟甲基氨基甲烷、5mM MgCl2、10％N,N-二甲基甲酰胺、9％PEG8000、0.85mM ATP。
7.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于：所述RNA提取步骤中，采用Trizol提取液从单花蕾中提取总RNA，用氯仿进行离心分离，再用异丙醇进行离心使RNA沉淀于管壁和底部，用乙醇洗涤后风干至透明状，加入经过高温灭菌的双蒸水溶解RNA备用。
8.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于，将片段化的RNA进行PCR扩增的步骤为：往片段化RNA产物中添加100units的Superscript II和1 x Q5High-Fidelity Master Mix，反应程序为42℃，15min；70°，15min；接着加入5μL N5XX和5μL N7XX进行PCR扩增，反应程序为72℃，15min；98℃，30s；10个循环98℃ 20s，60℃20s，72℃2min；，72℃，5min。
9.如权利要求8所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于：PCR扩增完成后，用VAHTSDNA Clean Beads按1：1的比例进行纯化。
10.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法，其特征在于，取用的单花蕾为荔枝或者倒地铃的单花蕾。
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