CN114645017A - 一个特异表达启动子kt631p的功能及其应用 - Google Patents
一个特异表达启动子kt631p的功能及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114645017A CN114645017A CN202011491599.5A CN202011491599A CN114645017A CN 114645017 A CN114645017 A CN 114645017A CN 202011491599 A CN202011491599 A CN 202011491599A CN 114645017 A CN114645017 A CN 114645017A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- cell
- promoter
- nucleotide sequence
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 23
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 17
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 3
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 claims description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 claims 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- WRUZLCLJULHLEY-UHFFFAOYSA-N N-(p-hydroxyphenyl)glycine Chemical compound OC(=O)CNC1=CC=C(O)C=C1 WRUZLCLJULHLEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 3
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 241000209763 Avena sativa Species 0.000 description 2
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000006463 Brassica alba Nutrition 0.000 description 1
- 244000140786 Brassica hirta Species 0.000 description 1
- 235000011371 Brassica hirta Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000188595 Brassica sinapistrum Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 240000004270 Colocasia esculenta var. antiquorum Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 235000003901 Crambe Nutrition 0.000 description 1
- 241000220246 Crambe <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000009847 Cucumis melo var cantalupensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241001523681 Dendrobium Species 0.000 description 1
- 235000002723 Dioscorea alata Nutrition 0.000 description 1
- 235000007056 Dioscorea composita Nutrition 0.000 description 1
- 235000009723 Dioscorea convolvulacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000005362 Dioscorea floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 235000004868 Dioscorea macrostachya Nutrition 0.000 description 1
- 235000005361 Dioscorea nummularia Nutrition 0.000 description 1
- 235000005360 Dioscorea spiculiflora Nutrition 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000127993 Elaeis melanococca Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 description 1
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 1
- 241000245654 Gladiolus Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 241000448472 Gramma Species 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 235000006350 Ipomoea batatas var. batatas Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061661 Orchis Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000605385 Ruscus Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 244000040738 Sesamum orientale Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 101100020617 Solanum lycopersicum LAT52 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 235000009430 Thespesia populnea Nutrition 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000209138 Tripsacum Species 0.000 description 1
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 1
- 240000000359 Triticum dicoccon Species 0.000 description 1
- 235000001468 Triticum dicoccon Nutrition 0.000 description 1
- 240000000581 Triticum monococcum Species 0.000 description 1
- 235000004240 Triticum spelta Nutrition 0.000 description 1
- 240000003834 Triticum spelta Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 239000010242 baoji Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 210000000081 body of the sternum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 235000004426 flaxseed Nutrition 0.000 description 1
- 230000004883 flower formation Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000011474 orchiectomy Methods 0.000 description 1
- 230000032633 organ maturation Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001863 plant nutrition Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000016515 regulation of signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102220092319 rs876657875 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域,具体涉及一个植物花特异表达启动子KT631P的功能鉴定和应用。本发明公开了一种在植物体中调控异源核苷酸序列表达的方法和DNA构建体。该DNA构建体包含一个新的植物花特异性表达启动子的核苷酸序列,提供了使用本文所公开的花特异启动子序列在植物花器官优先表达异源核苷酸序列的方法。
Description
技术领域
本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域,具体涉及一个植物花特异表达启动子KT631P的功能鉴定和应用。
背景技术
外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达,启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子,比如CaMV 35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子(Battraw and Hall,1990; Christensen et al. 1992),然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时,往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显,或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响,这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。
此外,在研究某些代谢过程或调节途径时,常常需要将同一途径上的两个以上的基因转化到同一个株系中去,采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因,或者两个基因分别转化完成后再进行杂交,都需要等待较长的时间,为了提高效率缩短多个基因转化的时间,最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化(Lin etal. 2003; Chen et al. 2006),但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子,也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。因此,克服以上转化技术上的困难,就很有必要克隆更多的组织器官特异性或者特定条件诱导型表达的启动子,这样可以根据需要选择不同的启动子诱导目的基因在适合的时间或空间表达。
组织特异性启动子亦称器官特异性启动子,在这类启动子的驱动下,基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位,并表现发育调节等特性。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累,增加区域表达量,同时也可以避免植物营养的不必要浪费。随着植物基因工程技术的发展,这一特性必然使组织特异型启动子作为一种重要的顺式作用元件在生物反应器、选育抗虫、抗病、抗旱、抗高渗胁迫等抗逆特性的转基因植物优良品种等领域得到更加广泛的应用。
植物花器官的形成与发育一直是研究的热点问题之一。植物花的发育过程分为4个阶段:成花诱导、花分生组织形成、花器官原基产生和花器官成熟。分离这些过程中的花特异性表达基因启动子,在控制植物育种和花卉培育过程中都有重要的作用。目前世界上已经分离鉴定了一些花器官特异的启动子,例如,PAL价值的zb8启动子驱动报告基因GUS在转基因水稻的花药、花芽、花托和花丝中都表达[Zhu Q ,et al., 1995, PlantMol.Biol., 29:535-550],而另一些花特异启动子则具有花器官某特定组织的特异性,如一些水稻花药特异性启动子[Tsuchiya T等,1994,Plant Mol.Biol., 20:1189-1193] 、番茄花粉特异性启动子LAT52[Twell D等,1989,Mol GenGenet,217:240-245]和烟草花药绒毡层特异性启动子TA29[Koltunow AM等,1990,Plant cell,2:1201-1224]等。
发明内容
本发明提供了一种能在植物花器官驱动特异性转录的启动子核苷酸序列,及克隆并应用该启动子的方法。本发明还提供了用于在植物中表达核苷酸序列的方法。在一些实施方式中,方法包括(a)将核苷酸序列可操作地连接于包括SEQ ID No:1的启动子,以产生表达盒;和(b)生成包括表达盒的转基因植物,由此在植物中,更具体地说,是在植物花器官表达所述核苷酸。在一些实施方式中,所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。
本发明所提供的植物花特异性表达启动子,含有序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列,还包含与SEQ ID No:1中所列核苷酸序列至少具有95%相似性的核苷酸序列,可以驱动操作性连接的核苷酸序列在植物花器官的特异性表达。
实施方案中的启动子核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列,如其它植物(单子叶或双子叶植物等)。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性,使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此,根据它们与本文所列的完整KT631P启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段,也包括在实施方案中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离,包括(但不限于)水稻、芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、薯蓣、观赏植物和松类等。
本文中“启动子”一词指DNA调控序列,其中通常含有一个TATA盒,该序列能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列,它们通常位于TATA盒的上游或5’端,被称作上游启动子元件,这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后,分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此,本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件,如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。
本文中的“特异性表达”是指目的基因在特定的时间或特定组织器官中表达。“组织特异性启动子”又称“器官特异性启动子”,在这类启动子的调控下,基因往往只在某特定的组织或器官中表达。本文中所述植物花器官特异性表达启动子指在植物花器官特异表达的启动子。
通常,如果在某组织或器官中某特定基因的转录产物mRNA的量比在其它组织或器官中高至少5倍,优选至少高10倍,更优选至少高100倍,最优选至少高1000倍水平,则驱动其表达的启动子被认为具有组织或器官特异性。启动子的活性和强度可以根据其驱动基因的mRNA或蛋白质的含量来测定。
本发明的实施案例中也包括DNA构建体,该构建体含有操作性连接于异源核苷酸序列上的启动子,该启动子含有本发明公开的序列,并可在植物细胞中驱动上述异源核苷酸序列进行表达。本发明的实施方案还提供了表达载体,以及在基因组中稳定包含上述DNA构建体的植物或植物细胞。“操作性连接”指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的连接方式,也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个DNA片段的编码序列都保持在适当的阅读框内。“异源核苷酸序列”指天然状态下没有与本文所述启动子序列KT631P操作性连接的序列,对于植物宿主来说可以是同源的,或是异源的。
本文所公开的KT631P花器官特异启动子及其变异体和片段可用于植物基因工程,例如制备转化或转基因植物,以产生目的表型。“转化植物”或“转基因植物”指在基因组内含有异源核苷酸序列的植物。通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些异源核苷酸序列,可将该异源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。这些异源核苷酸序列可单独或与重组DNA 构建体一起存在于基因组中。这里所述的“转基因事件”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物体部分或完整植物体,只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变,包括通过转基因操作而改变的起始宿主,以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得的后代。这里所用的“转基因事件”并不包括通过传统植物种植方法或天然事件(例如随机杂交、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变了基因组(染色体或染色体外)的植物。
“转基因事件”通过以下步骤获得,使用外源DNA构建体(含有核酸表达盒,其中又含有目的基因)转化植物细胞,用基因组***了外源DNA构建体的植物细胞再培养获得大量植物体,根据***的外源基因进行筛选获得所需的阳性转基因系。转基因事件的典型表型特征是目的基因的表达。在遗传水平上,“目的基因”是植物基因组组成的一部分。“转基因事件”也指转基因植物体与其它植物体进行杂交所得的含有外源DNA的后代。
本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官(如叶、根、茎等)、种子、植物细胞,以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚,及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。
这里所用的“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子、花粉、孢子体和小孢子。可用于本文所公开方法的植物种类包括所有可进行转化的高等植物,包括单子叶植物和双子叶植物。
本文所公开的启动子序列可在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。因此,所述的异源核苷酸序列可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因(编码目的蛋白)。实施方案中的目的基因包括参与信号传导调控的基因如转录因子、激酶等,持家基因如热休克蛋白基因。更具体地说,转基因的种类包括如,所编码蛋白赋予植物耐受非生物逆境的抗性基因,所述非生物逆境包括干旱、温度、盐和毒素(杀虫剂和除草剂)等。或是所编码蛋白赋予植物耐受生物逆境的抗性基因,如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的侵害,以及由这些胁迫引起的疾病。表型的编码包括改变植物中某个基因的表达,从而改变植物对病原体或昆虫等的防御机制,或是提高植物对除草剂的抗性,根据环境改变植物的生长发育过程等。这些改变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获得。或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物,如酶、转运蛋白、辅因子等,通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。
由上可见,可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上,并在植物体中进行表达,优选在植物花器官系中表达。
根据RNA干扰技术(RNA interference, RNAi),操作性连接于本文所公开的KT631P 花器官特异性表达启动子上的异源核苷酸序列,可以是某些靶基因的反义序列。“反义核苷酸序列”指一段与靶基因核苷酸序列互补的双链RNA分子。当导入到植物细胞中后,反义DNA序列的转录能阻止靶基因DNA序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的RNA转录产物可与靶基因转录生成的内源 mRNA 互补,并可与其杂交,由此,靶基因编码的天然蛋白的合成就受到限制,从而获得相应的表型。
下面通过具体实施方式,结合附图对本发明做进一步详细描述,但不以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界;hpt表示潮霉素抗性基因;Pnos表示nos基因的启动子;Tnos表示nos基因的终止子;GUS表示gus蛋白基因;T35s表示35s基因的终止子;HindIII和 BamHI分别表示限制性内切酶HindIII和BamHI的酶切位点;花器官特异启动子即为本发明所分离鉴定的花器官特异表达启动子。
图2是KT631P转基因水稻的组织器官GUS染色。A为叶片;B为茎;C为根;D为花器官。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用引物均由上海英骏生物技术公司合成,测序由北京华大基因完成,PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司,pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司,T4 DNA连接酶购自Promega公司,方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得,基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。
1.启动子KT631P的分离和鉴定
设计克隆启动子KT631P所需引物:
引物1:5'- aagcttTTAATAGAATATTACCCCATCGTC -3'
引物2:5'- ggatccGCCCACCCCCTCCTCCTCG -3'
引物1中序列aagctt为HindIII的酶切位点,引物2中序列ggatcc为BamHI的酶切位点。
利用启动子的正反向引物(其中带下划线部分的序列为启动子序列,如Seq IDNO:1所示),以植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的水稻(中花11)基因组DNA作为模板,进行扩增,反应条件是: 95℃预变性5分钟;94℃变性30秒; 55℃退火30秒;72℃延伸1分钟;30个循环;72℃延伸10分钟。反应结束后,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收,产物连入pEASY-T1,筛选阳性克隆并进行测序验证,结果表明:所扩增序列为预期的KT631P启动子序列。
2.构建表达载体
将测序验证已经***KT631P启动子序列的质粒用HindIII和 BamHI 双酶切,连入同样用HindIII和 BamHI 双酶切的载体pHPG,挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序,测序验证正确后,提取相应阳性克隆质粒,命名为pHPG-KT631P。
菌落PCR检测所需引物:
引物3:5'- TCTCCGCTCATGACGATAAT -3'
引物4:5'- GACGTAACATGGTGAAGGGG -3'
引物3和引物4为pHPG载体上引物,位于所克隆的启动子片段两侧,扩增片段约为启动子的长度,以菌液为模板,扩增检测,PCR反应条件为:95℃预变性5分钟;94℃变性30秒;55℃退火30秒;72℃延伸1分钟;34个循环;72℃延伸10分钟。
所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图1所示,其中:LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界;hpt表示潮霉素抗性基因;Pnos表示nos基因的启动子;Tnos表示nos基因的终止子;GUS表示gus蛋白基因;T35S表示35S基因的终止子;HindIII和 BamHI分别表示内切HindIII和 BamHI的酶切位点;花特异启动子即为本发明通过PCR 克隆出的花器官特异表达启动子。
3.农杆菌共转化
利用热激法将质粒pHPG-KT631P转入农杆菌AGL0菌株,利用农杆菌介导法对水稻进行共转化,同时利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥植株。
4.功能鉴定
从转基因植株中分离各组织器官,进行GUS活性检测,将各组织器官置于含有GUS染色缓冲液的EP管中,放于37℃温箱温育过夜,然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。
4.1 转基因水稻苗的组织器官染色
将转化KT631P启动子得到的具有潮霉素抗性的水稻愈伤组织,进行GUS染色实验,结果如图2B所示,抗性愈伤中基本没有GUS基因表达。将水稻KT631P转基因水稻苗的组织器官,如叶片、茎、根和花分别进行GUS染色,结果如图2所示,GUS基因只在植株的花器官(图2D)中有很强的表达,显现出很强的蓝色,在其它各组织器官中基本没有检测到GUS基因的表达。
序列表
<110> 北京未名凯拓作物设计中心有限公司
<120> 一个特异表达启动子KT631P的功能及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)
<400> 1
ttaatagaat attaccccat cgtccatcca gttaataaat aaataaaaag aatgtatttt 60
tagcgtttcc agatgcatag tcagaaataa actatttttt ggacagagat atataaggat 120
tgtaagataa gtcctcctat gtgttgtagg tccatgtttc atatatacag cttaaatata 180
tatggttttt tttctctttt gtacgcgtag caattttagc tttgtctgaa ctgaagcaac 240
tatcaaaagg caattagtag acgactaact aactagtttc tccctgcata tgtgaacacc 300
tagctagcta cccttcgtgc ccaacagccc ataccttacc atgcatctgc atgcagcagc 360
agacagcatc atatcgatga tccatccatc tctggatcga tccagttgca aatgcgaatt 420
aggcgaagca ataatcaaag ctgagatatg atcgagccga gatagatcga gatcgatcat 480
ctgttaggta atcactggtt aggtcagtgt gtcctgaaat taatgcattg ccactgaaag 540
aaagaaaatg ctcgacgaac tgtgcatcca tcgatccatg gctgtacagt acatgcgcgc 600
gtgcgtgtgc atcatcagcg atgcatgcga acgagcatga catgatcagc cgctgagctc 660
atcatcgctc gagatcacgg cctaattagc gagttatggc gtgccacatg gcatctggca 720
cgcgaaccaa gaaaagtctc tctctcctct cctctcttct tcatcaacac acactggttg 780
accaaccagc tagctgatcg agttcgttgt ttaccatcct attaataccc cttcctctct 840
ctcttctccc ctcctgaatt tctctcttgg tagaggtaga attgatctcc tttcttgttc 900
ttcttcgagt tcttcttaat tggagttctt ggagcagcat cggtagtcgt cgtcttcgtc 960
gatccagcat ctcaaggaat tcgaggagga gggggtgggc 1000
<210> 2
<211> 915
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)
<400> 2
atgagcggga tgaattcgct gagcatggtg gaggcgaggc tgccgccggg gttcaggttc 60
cacccgcgag acgacgagct cgtgctggac tacctggaaa ggaagctcct cgacggcggc 120
gtgggcggcg ccgcggcggc ggcggcggcg gtcaccatct acggctgccc ggtgatggtc 180
gacgtcgatc tcaacaagtg cgagccatgg gaccttcctg agatcgcttg cgttggtggc 240
aaggagtggt acttctatag ccttagggat aggaagtatg caactggcca acgaacaaat 300
agagcaaccg aatcgggcta ctggaaggcc acaggaaaag atcgcccaat aagccggaaa 360
ggattgctcg tcggtatgcg aaaaaccctg gtgttctaca aaggtagagc ccctaagggg 420
aagaagaccg agtgggtcat gcatgaattc cgcaaagaag gacaagggga tccgatgaag 480
ttgcctctca aggaggactg ggtcttgtgt agagtcttct acaagagtag gacaaccatt 540
gccaagctgc caacggaggg tagctacaac aatattgaca gtgtggccac aacttcactg 600
cctcccctca ctgacaacta cattgcattt gatcagcctg gttcaatgca aaacctagag 660
ggttatgagc aagtgccctg cttctccaat aatccctctc aacagccatc gtcgtcgatg 720
aatgttccgt tgacatcggc catggttgat caagagcaaa acaatatggg tagggcgatc 780
aaggatgtgc tgagccaatt caccaagttt gaaggcaatg tgaagaggga ggcccttcaa 840
agtaattttt cccaggatgg atttgattac ttggctgaga gtggcttcac acaaatgtgg 900
aactcactca gttga 915
Claims (16)
1.一种转化的植物细胞,其特征是含有一种启动子核酸分子,所述启动子核酸分子具有选自SEQ ID NO:1,或其互补链的核酸序列。
2.权利要求1所述转化的植物细胞,其中所含的启动子核酸分子可与异源核苷酸序列操作性相连。
3.权利要求2所述转化的植物细胞,其中所含的异源核苷酸序列指天然状态下没有与所述启动子序列操作性连接的序列,对于植物宿主来说可以是同源或是异源的。
4.权利要求2所述转化的植物细胞,其中所含的异源核苷酸序列编码的基因产物可赋予植物对除草剂、盐、低温、干旱、病原体或昆虫的抗性,或是调控植物的生长发育、雄性不育。
5.权利要求2所述转化的植物细胞,其中所含的异源核苷酸序列为靶基因的部分同源序列,以RNA干扰技术的方式抑制植物内源或外源基因的表达。
6.权利要求1所述转化的植物细胞,其中所述转化的植物细胞来自单子叶植物。
7.权利要求6所述转化的植物细胞,其中所述单子叶植物细胞来自禾本科植物,优选为水稻。
8.权利要求1所述转化的植物细胞,其中所述转基因植物细胞来自双子叶植物。
9.权利要求8所述转化的植物细胞,其中所述双子叶植物细胞来自十字花科,优选为拟南芥。
10.一种在植物中表达核苷酸序列的方法,所述方法包括向植物体导入DNA构建体,所述DNA构建体含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列,其中所述启动子含有的核苷酸序列选自:
a) 含有SEQ ID NO:1所示的启动子核苷酸序列;
b)包含的序列与SEQ ID NO:1所示序列至少有95%序列相似性的启动子核苷酸序列,其中所述启动子核苷酸序列可以在植物花器官启动异源核苷酸序列的特异转录和表达。
11.一种核酸分子,包含选自SEQ ID NO:1的分离的启动子。
12.一种载体,它含有权利要求11所述的核酸分子。
13.一种细胞,它含有权利要求12所述的载体。
14.权利要求13所述细胞,其中所述细胞包括细菌细胞,哺乳动物细胞,昆虫细胞,植物细胞,或真菌细胞。
15.权利要求14所述细胞,其中所述细菌细胞来自根癌土壤杆菌或大肠杆菌。
16.权利要求13的细胞,其中所述植物细胞为水稻细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011491599.5A CN114645017A (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一个特异表达启动子kt631p的功能及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011491599.5A CN114645017A (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一个特异表达启动子kt631p的功能及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114645017A true CN114645017A (zh) | 2022-06-21 |
Family
ID=81989647
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011491599.5A Pending CN114645017A (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一个特异表达启动子kt631p的功能及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114645017A (zh) |
-
2020
- 2020-12-17 CN CN202011491599.5A patent/CN114645017A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9434955B2 (en) | Proteins relating to grain shape and leaf shape of rice, coding genes and uses thereof | |
AU665778B2 (en) | Callus-specific promoters | |
CN107299100B (zh) | 植物组成型表达启动子及其应用 | |
AU2005219533A1 (en) | Transgenic expression constructs for vegetative plant tissue specific expression of nucleic acids | |
CN111116725B (zh) | 基因Os11g0682000及其编码的蛋白在调控水稻白叶枯病抗性中的应用 | |
JP7335383B2 (ja) | 植物調節エレメント及びその使用 | |
CA2766097C (en) | Bhlh subgroup 1b transcription factors that provide heat tolerance | |
WO2013067901A1 (zh) | 一个植物花粉发育晚期特异表达启动子及其应用 | |
CN111206040B (zh) | 水稻白叶枯病抗性相关基因OsDuf6及其应用 | |
JP5186076B2 (ja) | myb遺伝子プロモーターおよびサイトカイニン生合成遺伝子を使用する植物の老化の操作 | |
WO2002078438A2 (en) | Tissue-preferred promoter from maize | |
AU6023401A (en) | Modification of gene expression in transgenic plants | |
US9873884B2 (en) | Male reproductive tissue and stage specific promoters from Eucalyptus camaldulensis sweet gene family member | |
CN114645017A (zh) | 一个特异表达启动子kt631p的功能及其应用 | |
US20040088760A1 (en) | Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use | |
CN107513532B (zh) | 一个梨组成型表达启动子PbTMT4P及其应用 | |
WO2007112326A1 (en) | Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof | |
US6664384B1 (en) | Duplicated cassava vein mosaic virus enhancers and uses thereof | |
JP2004528854A (ja) | 新規構成的植物プロモーター | |
CN102676457A (zh) | 一个花特异表达启动子kt631p的功能和应用 | |
JP4505626B2 (ja) | 花粉特異的発現活性を有するプロモーター | |
ZA200103311B (en) | Methods of suppressing flowering in transgenic plants. | |
CN114644693B (zh) | ZmWRKY44蛋白及其编码基因与调控植物抗旱的应用 | |
US7485772B2 (en) | Methods of suppressing flowering in transgenic plants | |
CN114645019A (zh) | 一种逆境诱导表达的基因启动子kt626及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220621 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |