CN114642628B - M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114642628B CN114642628B CN202111061709.9A CN202111061709A CN114642628B CN 114642628 B CN114642628 B CN 114642628B CN 202111061709 A CN202111061709 A CN 202111061709A CN 114642628 B CN114642628 B CN 114642628B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lysate
- type
- type macrophage
- centrifuging
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 87
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 239000006166 lysate Substances 0.000 title claims abstract description 64
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 9
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 6
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical group CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 4
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 26
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 9
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 9
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 9
- -1 and the like) Proteins 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 3
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 2
- LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-difluorophenoxy)pyridin-3-amine Chemical compound NC1=CC=CN=C1OC1=CC=C(F)C=C1F LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L sodium persulfate Substances [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用，M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法为：1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成溶液；2)将EDC和交联剂溶液混合，振荡，离心，静置；放在冰浴中，加入NHS，振荡，离心；3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再振荡，离心，倒入模具中，在‑16～‑23℃放置，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；本发明的水凝胶富含多种杀伤分子、促炎因子，本发明的方法简单，M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶能缓慢释放多种杀伤分子，细胞因子促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，具有抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于材料技术领域，具体设计一种具有微米多孔结构的M1巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
水凝胶是一种三维聚合物具有亲水网络，广泛用于蛋白质、肽、药物和核酸的包裹和控制释放。同时水凝胶具有良好的仿生性，它的含水量高使其表面张力降低，可以减少细胞和蛋白在其表面的粘附，其次水凝胶柔软且具有孔隙，可以降低它与周围组织的力学摩擦，如果将其应用于人体内，可以减少或避免发生炎症反应，因而在生物医药领域中具有广泛的应用。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，可以分泌多种细胞因子，在肿瘤发生的初期，能够识别并清除肿瘤细胞，但随着肿瘤的发生发展，又对肿瘤的生长、侵袭、转移起着关键作用。M1型巨噬细胞高表达白介素-12(IL-12)、一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等杀伤分子、多种促炎细胞因子(IL-1、IL-6、IL-13和TNF-α等)及趋化因子(CCL2、CCL3、CXCL-10等)[van Dalen FJ,van StevendaalMHME,Fennemann FL,Verdoes M,Ilina O.Molecular repolarisation of tumour-associated macrophages.Molecules.(2018)24:E9.10.3390/molecules24010009]。M1型巨噬细胞通过释放促炎因子、免疫激活因子、趋化因子引起急性促炎反应、免疫活化反应以及细胞吞噬功能，发挥抗肿瘤的作用。但直接注射M1型巨噬细胞会产生急性炎症[YeungWHO,Lo CM,Ling CC,et al.Alternatively activated(M2)macrophages promote tumorgrowth and invasiveness in hepatocellular carcinoma.J Hepatol.2015；62:607-16.]，因此亟需一种副作用小的M1型巨噬细胞裂解液的制剂。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
本发明的第二个目的是提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％～20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和交联剂溶液混合，在室温下振荡10～20s，离心5～10s，静置10-30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s，倒入模具中，在-16～-23℃放置24小时～48小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5-25:100-500:3-20；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1～5：1～3；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为80～120ng/mL；放置24～48小时，诱导分化得到M1型巨噬细胞，用pH＝7.2±0.5PBS清洗2～3次，用pH＝7.2±0.5PBS将M1型巨噬细胞吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心3～5分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融3～5次，在400rpm转速下离心10～15分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
所述交联剂溶液的溶剂为pH＝7.2±0.5的磷酸缓冲液，交联剂溶液的质量浓度为2％。
交联剂为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠、数均分子量100000～200000透明质酸或数均分子量100000的聚丙烯酸。
上述制备方法制备的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
上述M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
本发明的优点：
本发明的一种具有微米多孔结构的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶所用主要原料是M1型巨噬细胞，富含多种杀伤分子、促炎因子(IL-12、ROS、TNF-α、IFN-γ等)。
本发明的方法简单易操作，低温环境易于M1型巨噬细胞中活性组分的保存。M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶能缓慢释放多种杀伤分子，细胞因子促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，具有抗肿瘤作用。
本发明以含羧基的水溶性高分子(如天然多糖透明质酸、海藻酸钠等或合成聚合物聚丙烯酸等)为交联剂，通过M1巨噬细胞裂解液中氨基与交联剂羧基之间的酰胺反应，在低温下制备具有微米多孔结构的M1巨噬细胞裂解液基水凝胶。
附图说明
图1为实施例5制备的水凝胶的照片。
图2为M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的共聚焦显微镜照片，其中(A)为实施例4制备；(B)为实施例5制备。
图3为M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的扫描电镜照片，其中(A)为实施例4制备；(B)为实施例5制备。
图4中的(A)为实施例4、实施例5制备的水凝胶的模量表征。(B)实施例4、实施例5制备的水凝胶的降解。
图5实施例5制备的水凝胶和对照组凝胶的溶胀率(A)；实施例5制备的水凝胶和对照组凝胶的孔隙率(B)。
图6实施例5制备的水凝胶生物活性分子释放曲线，(A)IFN-γ、(B)TNF-α、(C)IL-12。
图7为空白对照组、实施例5制备的水凝胶与对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠基多孔凝胶)通过流式细胞术检测对M2型巨噬细胞表型的改变。
图8空白对照组、实施例5制备的水凝胶与对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠基多孔凝胶)通过酶联免疫吸附法和聚合酶链式反应检测对M2型巨噬细胞表型的改变，(A)聚合酶链式反应检测TNF-α(B)酶联免疫吸附法检测IFN-γ(C)酶联免疫吸附法检测IL-12。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述各实施例中涉及的LPS为脂多糖(市售)；
M0型巨噬细胞(市售)，M0型巨噬细胞是小鼠来源的巨噬细胞系。
EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
实施例1
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液(RPMI-1640培养液)中，使终浓度为100ng/mL；放置36小时，诱导分化为M1型巨噬细胞，用pH＝7.2PBS清洗3次，用pH＝7.2PBS将M1型巨噬细胞(从培养细胞的容器壁上)吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心4分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮快速冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融4次，在400rpm转速下离心13分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
实施例2
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为80ng/mL；放置24小时，诱导分化为M1型巨噬细胞，用pH＝7.7PBS清洗2次，用pH＝7.7PBS将M1型巨噬细胞(从培养细胞的容器壁上)吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心3分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮快速冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融3次，在400rpm转速下离心10分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
实施例3
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为120ng/mL；放置48小时，诱导分化为M1型巨噬细胞，用pH＝6.7PBS清洗3次，用pH＝6.7PBS将M1型巨噬细胞(从培养细胞的容器壁上)吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心5分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮快速冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融5次，在400rpm转速下离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
实施例4
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将实施例1制备的M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为15％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和质量浓度为2％的交联剂溶液(溶剂：pH＝7.2的磷酸缓冲液)混合，在室温下振荡15s，离心8s，静置20分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡15s，离心8s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡15s，离心8s，倒入模具中，在-20℃放置36小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为15:240:9；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为3:2；
交联剂为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠。
共聚焦显微镜与扫描电镜显示凝胶内部为无规微孔，孔径大小为40～50微米(如图2A，3A所示)。
实施例5
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将实施例2制备的M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和质量浓度为2％的交联剂溶液(溶剂：pH＝7.7磷酸缓冲液)混合，在室温下振荡10s，离心5s，静置10分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10s，离心5s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10s，离心5s，倒入模具中，在-16℃放置48小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5:100:3；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1:1；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
交联剂为数均分子量100000～200000透明质酸。
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶，如图1所示。
本实施例得到的产物共聚焦显微镜与扫描电镜显示凝胶内部为无规微孔，孔径大小为100～120微米(如图2B，3B所示)。
实施例6
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将实施例3制备的M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和质量浓度为2％的交联剂溶液(溶剂：pH＝6.7磷酸缓冲液)混合，在室温下振荡20s，离心10s，静置30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡20s，离心10s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡20s，离心10s，倒入模具中，在-23℃放置24小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为25:500:20；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为5:3；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
交联剂为数均分子量100000的聚丙烯酸。
本实施例得到的产物共聚焦显微镜与扫描电镜显示凝胶内部为无规微孔，孔径大小为微米级。
实施例7
对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶)，用下述方法制备：
取18微升甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠溶液[浓度为25％(w/v)]加入离心管中，加入28微升PBS(pH＝7.2PBS)充分震荡混匀，再加入2微升过硫酸钠(APS)充分震荡混匀，再加入2微升N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)充分震荡混匀，混匀后迅速倒入模具中。在-16℃冰箱中放置24小时，得到甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶。
实验例1
实施例4、5制备的水凝胶的性能测试
将实施例4、实施例5制备的水凝胶通过杨氏模量仪测不同频率下水凝胶的模量变化，结果如图4A所示，实施例4、实施例5的水凝胶有较好力学性能。
实验例2
实施例4、5制备的水凝胶降解率实验
将实施例4、实施例5的水凝胶放入冷冻干燥机内进行冻干，24h后取出，取出后称其重量，并做好记录，记为M1，然后放入装满去离子水的2mlEP管中浸泡，再将所有放入37℃恒温、100转每分钟的摇床中，模拟人体的内部环境。在1、3、5、7、9、12、15天取出凝胶，将凝胶先放入-40℃冰箱中进行冷冻，24h后再将其放入冷冻干燥机中进行冻干，24h后取出，进行称重，称重后分别进行记录，记为M2，由公式可得M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的降解率。降解率＝【(M1-M2)/M1】*100％见图4B。
实验证明，实施例6制备的水凝胶力学性能、降解率与实施例5制备的水凝胶相似。
实验例3
水凝胶溶胀率与孔隙率
将实施例5的水凝胶和实施例7的对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶)冷冻干燥后称重为W1，再用去离子水浸泡过夜后称重为W2，然后用滤纸将浸泡凝胶中的水吸干再称重为W3。
按照公式：溶胀率＝W2/W1，孔隙率＝W2/W3×100％，分别计算凝胶的溶胀率及孔隙率，结果如图5所示。
实验例4
实施例5制备的水凝胶的生长因子的释放检测
检测步骤如下：实施例5制备的水凝胶置于磷酸缓冲液(pH＝7.2)中，37℃下在不同时间点收集释放液同时补充新鲜磷酸缓冲液，利用酶联免疫吸附法测定释放液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)的含量。如图6所示，在前两天凝胶快速释放TNF-α、IFN-γ及IL-12，然后缓慢释放直到第6天。
实验例5
实施例5制备的水凝胶对M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化的应用
M2型巨噬细胞在M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶下的极化
在无菌操作台中将M2型巨噬细胞以1×105个/孔铺于24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。然后在24孔板中分别加入实施例5制备的水凝胶与实施例7的对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶)平放于24孔板中。置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。
空白对照组不加入凝胶，只有培养基与M2型巨噬细胞。
实施例5制备的水凝胶组、实施例7的对照组和空白对照组12个平行，在第2天后进行流式细胞术，计算M2型巨噬细胞减少数目。如图7所示，加M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶使M2型巨噬细胞减少到18.45％，实施例7的对照组50.93％，空白对照组64.94％，实施例5制备的水凝胶组极大的减少了M2型巨噬细胞的数目。
在无菌操作台中将M2型巨噬细胞以1×105个/孔铺于24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。然后在24孔板中加入实施例5制备的凝胶与实施例7的对照组的凝胶平放于24孔板中。置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。空白对照组不含凝胶材料只有培养基与M2型巨噬细胞，实施例5制备的水凝胶组、实施例7的对照组和空白对照组12个平行，在2天后进行聚合酶链式反应测TNF-α含量(图8A)。酶联吸附反应检测IFN-γ(图8B)和IL-12(图8C)释放量。通过图8所示M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶使M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞。
实验证明，实施例4、6制备的水凝胶的溶胀率、孔隙率、生长因子的释放和对M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化与实施例5制备的水凝胶相似。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％～20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和交联剂溶液混合，在室温下振荡10～20s，离心5～10s，静置10-30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s，倒入模具中，在-16～-23℃放置24小时～48小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5-25:100-500:3-20；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1～5：1～3；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写；
所述M1型巨噬细胞裂解液冻干粉用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为80～120ng/mL；放置24～48小时，诱导分化得到M1型巨噬细胞，用pH＝7.2±0.5PBS清洗2～3次，用pH＝7.2±0.5PBS将M1型巨噬细胞吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心3～5分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融3～5次，在400rpm转速下离心10～15分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存；
所述交联剂为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠、数均分子量100000～200000透明质酸或数均分子量100000的聚丙烯酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述交联剂溶液的溶剂为pH＝7.2±0.5的磷酸缓冲液，交联剂溶液的质量浓度为2％。
3.权利要求1或2的制备方法制备的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
4.权利要求3的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111061709.9A CN114642628B (zh) | 2021-09-10 | 2021-09-10 | M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111061709.9A CN114642628B (zh) | 2021-09-10 | 2021-09-10 | M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114642628A CN114642628A (zh) | 2022-06-21 |
| CN114642628B true CN114642628B (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=81991730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111061709.9A Active CN114642628B (zh) | 2021-09-10 | 2021-09-10 | M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114642628B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115261307B (zh) * | 2022-07-28 | 2023-08-08 | 中山大学 | 一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN115572739A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-01-06 | 天津科技大学 | 一种发酵菌体为原料制备水凝胶的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013109959A1 (en) * | 2012-01-18 | 2013-07-25 | University Of Kansas | Hyaluronic acid particles and their use in biomedical applications |
| JP2017136014A (ja) * | 2016-02-03 | 2017-08-10 | 富士ソフト株式会社 | Ｍ２様マクロファージ組成物の製造方法、およびｍ２様マクロファージ組成物原料 |
| EP3216861A1 (en) * | 2016-03-11 | 2017-09-13 | Fropharm GmbH | Immunoregulatory cells and methods for their production |
| EP3372675A1 (en) * | 2017-03-09 | 2018-09-12 | Université de Liège | Methods for in vitro differentiation of monocytes to regulatory macrophages |
| CN111110653A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-08 | 东华大学 | 一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备 |
| CN111269443A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-06-12 | 中国科学院大学温州研究院(温州生物材料与工程研究所) | 基于动态化学键交联的纳米凝胶及其制备方法与应用 |
| CN111437435A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-07-24 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种水凝胶细胞支架及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170157296A1 (en) * | 2014-07-21 | 2017-06-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Macrophage or monocyte enhanced wound healing |
-
2021
- 2021-09-10 CN CN202111061709.9A patent/CN114642628B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013109959A1 (en) * | 2012-01-18 | 2013-07-25 | University Of Kansas | Hyaluronic acid particles and their use in biomedical applications |
| JP2017136014A (ja) * | 2016-02-03 | 2017-08-10 | 富士ソフト株式会社 | Ｍ２様マクロファージ組成物の製造方法、およびｍ２様マクロファージ組成物原料 |
| EP3216861A1 (en) * | 2016-03-11 | 2017-09-13 | Fropharm GmbH | Immunoregulatory cells and methods for their production |
| EP3372675A1 (en) * | 2017-03-09 | 2018-09-12 | Université de Liège | Methods for in vitro differentiation of monocytes to regulatory macrophages |
| CN111110653A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-08 | 东华大学 | 一种巨噬细胞介导的载药透明质酸纳米水凝胶及其制备 |
| CN111269443A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-06-12 | 中国科学院大学温州研究院(温州生物材料与工程研究所) | 基于动态化学键交联的纳米凝胶及其制备方法与应用 |
| CN111437435A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-07-24 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种水凝胶细胞支架及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| The Anti-Tumor Effects of M1 Macrophage-Loaded Poly (ethylene glycol) and Gelatin-Based Hydrogels on Hepatocellular Carcinoma;Alberto Daniel Guerra 等;Theranostics;第7卷(第15期);第3732-3744页 * |
| 不同氨基聚糖对巨噬细胞极化的影响;尹玉 等;中国医科大学学报;49(10);第942-943页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114642628A (zh) | 2022-06-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114642628B (zh) | M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用 | |
| Lai et al. | Gelatin methacrylate/carboxybetaine methacrylate hydrogels with tunable crosslinking for controlled drug release | |
| Liu et al. | A study on a chitosan-gelatin-hyaluronic acid scaffold as artificial skin in vitro and its tissue engineering applications | |
| Chiu et al. | Generation of porous poly (ethylene glycol) hydrogels by salt leaching | |
| Mao et al. | Study of novel chitosan‐gelatin artificial skin in vitro | |
| Sezer et al. | Preparation of fucoidan-chitosan hydrogel and its application as burn healing accelerator on rabbits | |
| Hsieh et al. | Preparation of γ-PGA/chitosan composite tissue engineering matrices | |
| Zhang et al. | Physically crosslinked poly (vinyl alcohol)–carrageenan composite hydrogels: Pore structure stability and cell adhesive ability | |
| Cho et al. | Fabrication and characterization of porous alginate/polyvinyl alcohol hybrid scaffolds for 3D cell culture | |
| Çetin et al. | Novel scaffolds based on poly (2-hydroxyethyl methacrylate) superporous hydrogels for bone tissue engineering | |
| Wu et al. | Development of a biocompatible and biodegradable hybrid hydrogel platform for sustained release of ionic drugs | |
| Tang et al. | Stable antibacterial polysaccharide-based hydrogels as tissue adhesives for wound healing | |
| He et al. | Shape memory composite hydrogel based on sodium alginate dual crosslinked network with carboxymethyl cellulose | |
| Shi et al. | Cell-compatible hydrogels based on a multifunctional crosslinker with tunable stiffness for tissue engineering | |
| CN108409988B (zh) | 一种海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶的制备方法 | |
| Cho et al. | Time-dependent alginate/polyvinyl alcohol hydrogels as injectable cell carriers | |
| Chang et al. | Hydrophilic gelatin and hyaluronic acid-treated PLGA scaffolds for cartilage tissue engineering | |
| Iswariya et al. | Design and development of a piscine collagen blended pullulan hydrogel for skin tissue engineering | |
| Foglia et al. | A new method for the preparation of biocompatible silica coated-collagen hydrogels | |
| Chen et al. | Fabrication and evaluation of homogeneous alginate/polyacrylamide–chitosan–gelatin composite hydrogel scaffolds based on the interpenetrating networks for tissue engineering | |
| Fan et al. | Dynamic crosslinked and injectable biohydrogels as extracellular matrix mimics for the delivery of antibiotics and 3D cell culture | |
| Yang et al. | PTMAc-PEG-PTMAc hydrogel modified by RGDC and hyaluronic acid promotes neural stem cells' survival and differentiation in vitro | |
| Gan et al. | GelMA/κ-carrageenan double-network hydrogels with superior mechanics and biocompatibility | |
| Sazhnev et al. | Preparation of chitosan cryostructurates with controlled porous morphology and their use as 3D-scaffolds for the cultivation of animal cells | |
| Gümüşderelioğlu et al. | Superporous polyacrylate/chitosan IPN hydrogels for protein delivery |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |