CN114641319A - 皮肤填充剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及凝胶形式的皮肤填充剂组合物，其包括包含水和/或多元醇的载液；交联透明质酸；以及平均直径在10‑200μm范围内的交联透明质酸球形微粒。当注入皮肤组织时，该填充剂提供增容效应和生物刺激效应。

Description

皮肤填充剂组合物
技术领域
本发明涉及皮肤填充剂组合物、制备该组合物的方法、用于治疗皱纹的皮肤填充剂组合物以及用于药物治疗的皮肤填充剂组合物。
背景技术
皱纹和其他皮肤线条的治疗通常通过在皮肤组织中注射皮肤填充剂组合物来实现。这类组合物既可以作为简单填充皱纹的增容剂，也可以作为注射后主动诱导胶原形成的生物刺激剂。增容剂的效果立竿见影，但不会持续很长时间(通常不到一年)。另一方面，生物刺激的效果仅在数月后才会显现，并且持续时间比增容剂的效果更长。
不幸的是，注射皮肤填充剂可能会引起并发症。最常见的副作用是局部注射相关的副作用，表现为水肿、疼痛、红斑、瘙痒和瘀斑。这些不良副作用是轻度的，通常持续不到一周，但仍令人不适。也可能发生更严重的并发症，但很罕见。例如，血管闭塞可能在数小时或数天内发生，导致局部组织坏死或血管栓塞。从长远来看，色素沉着异常和疤痕可能表现为反复注射皮肤填充剂的不良副作用。
由于许多生物刺激剂的潜在机制是组织被注射的生物刺激剂激活或甚至发炎，因此使用生物刺激剂的愿望阻碍了减少并发症(如疼痛、刺激和炎症)发生的持续努力。因此，需要一种生物刺激不会与刺激(irritation)和炎症同时发生的皮肤填充剂。此外，许多生物刺激剂的生物可降解性差，这使得它们在注射部位出现非预期副作用时很难去除。
此外，已证明难以在一种皮肤填充剂组合物中结合增容剂和生物刺激剂。这种组合的优点是，它的效果在时间上更稳定，因为当增容效应结束时，生物刺激效应就会起作用。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种皮肤填充剂组合物，其在皮肤中注射时引起较少的疼痛、刺激和炎症。尤其是，与已知的皮肤填充剂相比，该组合物具有改进的生物降解性。本发明的另一个目的是在一种皮肤填充剂组合物中结合增容剂和生物刺激剂。
现在已经发现，通过应用特定的皮肤填充剂组合物可以达到其中一个或多个目的。
因此，本发明涉及凝胶形式的皮肤填充剂组合物，包括
-包含水和/或多元醇的载液；
-交联透明质酸的凝胶成分；
-平均直径在10-200μm范围内的交联透明质酸球形微粒。
附图说明
图1显示了用于根据本发明的皮肤填充剂组合物中的微粒的显微照片。
图2显示了注射不同的基于透明质酸的制剂后，在几个时间间隔获得的苏木精和伊红染色组织。
图3显示了注射不同基于透明质酸的制剂12个月后组织中测得的胶原密度。
图4显示了注射后12个月期间本发明皮肤填充剂组合物的生物刺激进展。
图5显示了图4中提到的生物刺激研究中涉及的组织的显微照片。
具体实施方式
如本文所用，术语“皮肤填充剂”泛指设计用于增加软组织缺损区域体积的材料或组合物。因此，作为等效术语，也可以使用术语“软组织填充剂”。在本发明的含义范围内，术语“软组织”通常涉及连接、支撑或环绕身体其他结构和器官的组织。在本发明中，软组织包括例如肌肉、肌腱、声带、衬里组织、纤维组织、脂肪、血管、神经和滑膜组织。此外，术语“皮肤填充剂”不应被解释为对注射部位和类型施加任何限制。它通常包括真皮下多个层次的用途。
本发明的皮肤填充剂为凝胶形式，即为凝胶。本文中使用的术语“凝胶”通常指在哺乳动物体温(通常为37℃)下流动性介于液体和固体之间的材料。
本发明的皮肤填充剂可包含其他成分，尤其是活性药物成分。例如，它可能包含局部麻醉剂，例如利多卡因(lidocaine)或维生素(例如维生素B、C或E)。
载液是存在活性化合物(例如治疗皱纹的活性化合物)的介质。载液包括水和/或多元醇。多元醇是指含有超过一个羟基的醇，如二醇或三醇。
载液原则上设计为生理上可接受的载液。当存在大量水(例如，占所载液重量的超过50％)时，载液通常在生理pH值或其附近进行缓冲，例如使用生理盐水溶液，如磷酸盐缓冲液(PBS)。其他合适的缓冲液，例如林格氏液(通常包括氯化钠、氯化钾、氯化钙和碳酸氢钠)或台氏液(通常包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸二氢钠和碳酸氢钠)。
本发明的此类水性凝胶的pH值通常在6.4至7.8范围内，尤其是在6.8至7.4范围内。可通过施加具有适当pH值的上述缓冲液，或通过使用适当量的酸和/或碱将pH值设置为所需值来达到该pH值。
基于皮肤填充剂本身的总重量，本发明的皮肤填充剂中的载液含量通常至少为50wt.％。所述含量还可为至少60wt.％、至少70wt.％、至少90wt.％、至少95wt.％、至少97.5wt.％、至少98wt.％、至少98.5wt.％或至少99wt.％。所述含量也可以是99wt.％或更少、98wt.％或更少、95wt.％或更少、90wt.％或更少、85wt.％或更少或75wt.％或更少。优选地，所述含量在90-98wt.％范围内。
本发明皮肤填充剂中的多元醇可选自由乙二醇、甘油、1,3丙二醇、1,4丁二醇、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇组成的组。
本发明的皮肤填充剂的凝胶性质主要来源于交联透明质酸的凝胶，该凝胶是填充剂的成分。透明质酸的交联到这样的程度足以使其具有凝胶的性质。技术人员知道如何在不进行创造性努力和不进行过度实验的情况下获得这种凝胶。
在交联透明质酸的凝胶中，透明质酸的重均分子量(Mw)通常至少为50kDa。通常，其在100-10000kDa的范围内。优选地，其在200-5000kDa范围内或在500-3000kDa范围内。
在本发明的皮肤填充剂组合物中，基于皮肤填充剂本身的总重量，构成交联透明质酸凝胶的交联透明质酸的含量通常在交联透明质酸的0.1-10wt.％范围内，特别是在0.5-5.0wt.％范围内，更特别是在1.0-3.5wt.％范围内。
(凝胶成分的)交联透明质酸中的交联通常是化学交联。这些是由透明质酸和化学交联剂反应形成的。例如，此类交联剂是二缩水甘油醚(例如1,2-乙二醇二缩水甘油醚或1,4-丁二醇二缩水甘油醚)或二环氧烷烃(例如1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷或1,2,7,8-二环氧辛烷)，优选地，交联剂是二乙烯基砜或1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
由这些交联剂造成的交联通常被称为源于相应的交联剂。因此，在本发明的皮肤填充剂中，透明质酸的化学交联通常源于选自由二缩水甘油醚和二环氧烷烃组成的组的交联剂，优选选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚或二乙烯基砜。
本发明的皮肤填充剂组合物中的球形微粒不同于已知皮肤填充剂组合物中使用的微粒，因为它们具有不同的形状。如图1所示，此类皮肤填充剂应用中的已知透明质酸微粒是非球形的，而本发明中应用的是球形的。此外，本发明的微粒也相当柔软，当压在上面时可以容易地和可逆地变形。它们分别在吸收或释放水分时，容易膨胀或收缩。这些差异是微粒制造过程不同的结果。在本领域中，这涉及透明质酸交联以形成凝胶，之后通过例如在研钵中研磨将凝胶粉碎成微粒(例如在WO2018/159983A1)。由此获得的微粒具有不规则形状，例如，它们具有锋利的边缘和高纵横比。
本发明的微粒以根本不同的方式制备。将透明质酸溶解在水介质中。由该溶液制备水/乙酸乙酯乳剂，得到包含溶解透明质酸的水滴。由于微溶于乙酸乙酯，水被乙酸乙酯从液滴中抽出，留下透明质酸小球。随后，生成的小球中的透明质酸交联。进一步处理后得到交联透明质酸的球形微粒；在处理过程中暴露于过量水使其显著膨胀。因此，这些微粒高度规则且非常柔软。
在某些情况下，微粒可能会稍微偏离完美的球形。例如，最短直径与最长直径之比为至少0.75、至少0.80、至少0.85、至少0.90、至少0.95、至少0.97、至少0.98、至少0.99或至少0.995。
在动物研究中(参见示例6)，发现在长达一年的时间内，与仅包含交联透明质酸和线性透明质酸凝胶(且无微粒)的组合物相比，组合物中球形微粒的存在导致胶原形成增加。这有力地表明球形微粒具有生物刺激效应。还观察到，注射含有球形微粒的组合物与注射缺乏球形微粒的组合物产生相同水平的炎症。这是令人惊讶的，因为已知含有不规则微粒的组合物在注射后长达两周内会引起高度炎症。因此，在皮肤填充剂组合物中应用球形微粒可提供增加的生物刺激，而不会与增加的炎症同时发生。
在上述制备方法中，初始透明质酸的重均分子量越高，获得特定所需尺寸的微粒就越困难。例如，当透明质酸的重均分子量远高于500kDa时，难以制备尺寸在15–70μm范围内的微粒，这表现为例如低微粒产率和低工艺效率。如下所述，最初不认为这是降低透明质酸的重均分子量的一种选择，因为已知这会导致非预期的炎症副作用。
已知透明质酸对巨噬细胞表达有不同的影响。巨噬细胞可以发生表型变化，这取决于巨噬细胞接触的透明质酸的重均分子量(Mw)。众所周知，当巨噬细胞与重均分子量(Mw)较低的透明质酸(例如低至500kDa、100kDa或10kDa的透明质酸)接触时，会表现出促炎症反应。另一方面，已知具有较高重均分子量(Mw)(通常高于500kDa)的巨噬细胞在与透明质酸接触时可产生明显的抗炎反应。
然而，在本发明的背景下，这似乎是一种偏见。这是因为令人惊讶的是，其中微粒包含低至10kDa的重均分子量(Mw)的透明质酸的本发明组合物不会导致显著的促炎症反应。
还发现，重均分子量(Mw)的降低并未抵消本发明的任何其他有益效果，尤其是其作为生物刺激剂的有效性。
总之，透明质酸的重均分子量(Mw)的降低为更可行的微粒制备开辟了道路，而且不会影响组合物的有效性，也不会引起其他非预期的效应，例如炎症反应。
因此，在交联透明质酸的球形微粒中，透明质酸的重均分子量(Mw)通常至少为1.0kDa。通常，其在1-5,000kDa范围内。它也可能在1.2-3000kDa的范围内、在5-2000kDa的范围内、在2.4-500kDa的范围内、在5-100kDa的范围内或在10-1000kDa的范围内。优选地，其在5-500kDa范围内，更优选在10-100kDa范围内。
球形微粒原则上含有水。微粒中的含水量通常在50-99wt.％范围内，通常在75-95wt.％范围内。例如，其可以是99wt.％或更少、98wt.％或更少、97wt.％或更少、95wt.％或更少、90wt.％或更少、85wt.％或更少、80wt.％或更少、或75wt.％或更少。它也可以是60wt.％或更多、75wt.％或更多、80wt.％或更多、85wt.％或更多、90wt.％或更多、93wt.％或更多或95wt.％或更多。
球形微粒的透明质酸中的交联通常是化学交联，并且例如源于选择自由二缩水甘油醚、二环氧烷烃和二乙烯基砜组成的组的交联剂，特别是选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚或二乙烯基砜。
本发明皮肤填充剂中的球形微粒的平均直径通常为300μm或更小、150μm或更小、50μm或更小或40μm或更小。其通常为10μm或更大、15μm或更大、20μm或更大、25μm或更大、30μm或更大、40μm或更大或50μm或更大。通常，其在15-100μm范围内，特别是在15-70μm范围内，更特别地在20-55μm范围内，甚至更特别地在30-50μm范围内。
本发明的皮肤填充剂中球形微粒的含量通常在0.4-10vol.％范围内，特别是在0.5-8vol.％范围内，更特别地在1-6vol.％范围内。
本发明的皮肤填充剂可以经过灭菌过程，以提供作为无菌皮肤填充剂的皮肤填充剂。例如，通过高温(如通过蒸汽灭菌)或高能辐射(如γ辐照)对其进行灭菌。
本发明的皮肤填充剂的粘度可以通过改变皮肤填充剂的某些特性来调节，例如凝胶成分中使用的透明质酸的交联程度、微粒的数量和尺寸，以及不同成分的相对丰度，尤其是1)交联透明质酸凝胶；2)微粒；和3)对粘度有影响的最终添加剂，如线性透明质酸(见下文)。根据皮肤填充剂的具体应用，可以设置更高或更低的粘度。
本发明凝胶的动态粘度通常在10-1100Pa.s的范围内。它也可以在20-800Pa.s的范围内或在30-700Pa.s的范围内。本领域技术人员将能够通过常规实验找到达到特定粘度所需的条件，并且无需进行创造性的努力。
本发明凝胶的动态模量(储能模量)通常在1-3000Pa范围内，特别是在5-2500Pa范围内，更特别是在15-2000Pa范围内，甚至更特别是在20-1500Pa范围内。
本发明的皮肤填充剂组合物可包含线性透明质酸。该添加剂的主要用途是，它可用于调节粘度，从而优化填充剂的可注射性。
当存在线性透明质酸时，其通常具有至少为250kDa的重均分子量(Mw)。通常，其在300-10,000kDa范围内。优选地在500-5000kDa范围内或在800-4000kDa范围内。
当线性透明质酸存在于本发明的皮肤填充剂中时，基于皮肤填充剂本身的总重量，其通常存在于0.05-5.0wt.％的范围内，尤其是在0.1-2.0wt.％的范围内。
线性透明质酸(当存在时)和交联透明质酸通常基于其干物质含量，以质量比1.0:0.25至1.0:15.0的范围存在，尤其是在1.0:1.0至1.0:10.0的范围内。
本发明的皮肤填充剂的一个优势是，填充剂提供了增容效应和生物刺激效应。应用填充剂后，增容效应比生物刺激在更短的时间内表现出来。这使得填充皱纹的外观比仅有增容效应或仅有生物刺激效应时更稳定。
注射本发明的皮肤填充剂的患者比注射常规皮肤填充剂时经历更少的副作用，尤其是更少的疼痛和/或炎症，这也是一个优势。更有优势的是，这种副作用的减少不会以牺牲生物刺激的有效性为代价。换句话说，本发明的皮肤填充剂组合物提供了增加的生物刺激，并且不会与增加的炎症和/或持续的炎症同时发生。
本发明的皮肤填充剂组合物仅包含透明质酸及其衍生物作为治疗皱纹的活性物质，即有助于皮肤中产生持续增容效应和生物刺激效应的物质。例如，与注入的载液一样，局部麻醉剂或某些维生素等其他活性物质的存在被认为不具有持续的增容效应。这使得本发明的组合物完全可生物降解。此外，如示例所示，这与高安全性以及非预期副作用的发生机会和严重程度的降低相结合。
本发明还涉及一种制备凝胶形式的皮肤填充剂组合物的方法，包括：
-制备交联透明质酸凝胶；
-制备交联透明质酸的球形微粒，其中当球形微粒存在于凝胶中时，其平均直径在10-200μm范围内；
-将交联透明质酸和球形微粒与包含水和/或多元醇的载液混合以形成凝胶。
在本发明的方法中，通常单独制备交联透明质酸的凝胶成分和球形微粒，然后将其与载液混合以形成本发明的凝胶。因此，在本发明的方法中组合了至少三种成分(例如，可选地也组合线性透明质酸)。
组合这些成分有多种模式。这三种聚合物在结合时可能没有水，但在结合四种成分时，其中一种或多种聚合物也可能含有水。
例如，交联透明质酸可包含在载液中以形成凝胶，而线性透明质酸和微粒可作为干燥固体添加到该凝胶中。线性透明质酸通常作为干燥固体使用，因为它通常作为干粉购买，可用于本发明的方法。微粒通常在水性环境中制备，这使得在本发明的方法中以湿形式应用微粒变得方便。然而，在与其他成分混合前，也可对其进行干燥。
交联透明质酸通常通过使用化学交联剂(例如二乙烯基砜或1,4-丁二醇二缩水甘油醚)处理线性透明质酸来制备。类似地，透明质酸的球形微粒通常也通过交联线性透明质酸来制备。制备球形微粒的过程以如下方式进行：当微粒存在于该过程的最终产物(即皮肤填充剂)中时，其平均直径在10-200μm范围内。当其在水性环境中制备后直接测量时，其平均直径可能不同于最终产品中微粒的平均直径，尤其是当其制备的水性环境不同于最终产品中的载液时(后者可能例如包括缓冲液，而前者可能缺少此类缓冲液)。
球形微粒的制备方式通常使其在最终产品中的平均直径在15-70μm范围内，特别是在20-55μm范围内，更特别是在30-50μm范围内。这意味着在微粒制备过程中，已经解释了当微粒用于制备本发明组合物时，尤其是当它们与交联透明质酸和载液混合时，随后发生的微粒尺寸变化。这种变化通常发生在微粒所含水量发生变化时，例如，由于存在的成分的不同浓度，包括盐浓度和pH值。本领域技术人员知道最初应存在何种颗粒尺寸，以便在最终的皮肤填充剂组合物中达到所需的颗粒尺寸。
微粒的制备可包括使用筛。然后在多个筛上对球形微粒进行筛分，以得到具有适当平均直径的颗粒。当进行筛分步骤时，球形微粒通常处于湿润状态，即它们包含水。
本发明的方法通常包括灭菌步骤，产生本发明的皮肤填充剂作为无菌皮肤填充剂。例如，根据本发明方法形成的皮肤填充剂可暴露于高温下，例如暴露于80-140℃范围内的温度，尤其是暴露于100-135℃范围内的温度。然后选择暴露的温度和时间，以便在不过度降解皮肤填充剂的同时，将任何微生物破坏到所需的程度。例如，暴露皮肤填充剂15-20分钟(例如，在115-125℃的温度范围内)，或暴露2-10分钟(例如，在130-140℃的温度范围内)。
灭菌也可以通过将凝胶暴露于高能辐射，尤其是电离辐射，例如γ射线、电子射线、X射线和电磁光谱中较高的紫外线部分来实现。凝胶可能暴露的剂量为例如15、25或50kGy。
本发明还涉及可通过上述方法获得的皮肤填充剂。
本发明的皮肤填充剂通常应用于美容领域，尤其是用于皮肤皱纹和线条的美容治疗。然而，它也可能在医学领域得到应用。因此，本发明还涉及上述皮肤填充剂，用于药物治疗、用作药物和/或用于医学。
本发明还涉及上述的皮肤填充剂，用于治疗萎缩性痤疮疤痕、脂肪代谢障碍、压力性尿失禁、膀胱输尿管反流、声带闭合不全和/或声带内移。
本发明还涉及一种用于填充组织或增加组织体积以用于美容或治疗目的的方法，包括向人或动物施用有效量的上述的皮肤填充剂组合物。软组织可以是皮肤、肌肉、肌腱、声带、纤维组织、脂肪、血管、神经和滑膜组织。给药通常通过注射器通过针头将皮肤填充剂注射到组织中来进行。
本发明还涉及上述皮肤填充剂用于治疗需要其的个体的组织的用途。
本发明还涉及上述的皮肤填充剂在制备用于治疗有需要的个体的痤疮疤痕、脂肪代谢障碍、压力性尿失禁、膀胱输尿管反流、声带闭合不全和/或声带内移的药物中的用途。
示例
示例1透明质酸凝胶的制备
在13.5g 0.25M氢氧化钠(NaOH)中制备含1.5g 2600kDa透明质酸(HA)的透明质酸凝胶。在所有HA溶解后，向溶液中添加165mg 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，并用抹刀混合5分钟。将溶液置于密封的塑--料杯中，并转移至50℃烘箱中2小时。然后将凝胶置于过量的PBS中并使其水合，直到其达到1.5wt.％的HA百分比。
示例2交联微粒的制备
将50mg 10kDa透明质酸与7.5mg二乙烯基砜一起溶解在2mL 0.005NaOH中，并在室温下放置2小时。然后，用顶置式搅拌器以2000rpm的转速搅拌800mL烧杯中的400mL乙酸乙酯，并通过30G针头在2分钟内添加透明质酸溶液。将溶液搅拌1小时。然后将溶液在室温下放置24小时。纯化后(在真空中去除乙酸乙酯)，过滤并洗涤颗粒。洗涤过程中，颗粒显著膨胀，产生柔软的透明质酸微粒。
示例3组合所有三个成分
用抹刀将示例1中制备的22g水合凝胶与50mg 1600kDa透明质酸粉末混合5分钟。然后，加入示例2中制备的90mg微粒，并将所得混合物搅拌5分钟。
示例4微粒尺寸分析
使用徕卡立式DM2500光学显微镜分析示例2中制备的微粒。使用200x放大倍率的明视野对微粒进行检查。使用Image J分析形态和尺寸。获得30–50μm的平均球形微粒尺寸。图1显示了所得微粒的显微照片。
示例5凝胶流变分析
使用Discovery混合流变仪(TA Instruments)分析示例3中制造的产品。在25℃下，采用1200μm的间隙高度，测量储能模量和损耗模量。板直径为25mm，施加1％的应变。从0.1Hz到5.0Hz进行频率扫描。在5.0Hz下，凝胶的储能模量为372Pa，损耗模量为52Pa。
示例6生物反应-动物研究
6.1.设置
进行动物研究以测试本发明的皮肤填充剂组合物的安全性和有效性。体内研究于2019年6月2日至2020年6月2日在中国杭州的杭州汇博科技有限公司(Hangzhou HuiboScience and Technology Co.,Ltd)进行。在新西兰白兔中测试该组合物，并在三个不同的时间点(3、6和12个月)监测研究进展。测试了三种不同的凝胶制剂(A、B和C)：
A)含有线性透明质酸的交联透明质酸凝胶；
B)含有线性透明质酸的透明质酸微粒；和
C)含有线性透明质酸和透明质酸微粒的交联透明质酸凝胶(即本发明组合物)。
根据上述示例1-3中所述的程序制备这三种制剂(制剂B根据示例3的程序制备，但程序中不含交联透明质酸)。
测试这些制剂的主要目的是研究微粒对皮肤填充剂组合物的生物刺激效应的影响。同时，监测如炎症、排斥反应和包裹等任何副作用。
本研究共使用了21只新西兰白兔。兔子分配如下。每个时间点总共有一只兔子用于制剂A；每个时间点有三只兔子用于制剂B和制剂C。在每只动物的前肢和后肢之间，在距离脊柱约5cm处，每只兔子的背部浸润0.1至0.2mL的体积。
用于验证透明质酸凝胶安全性和有效性的两种染色方法分别是苏木精和伊红(H&E)以及天狼猩红(PSR)。H&E染色提供了凝胶浸润后非常详细的组织结构的状态，而且PSR染色突出显示了每个特定感兴趣区域胶原纤维的存在。
使用Image J软件处理所有图像。在相同的比例和10x的放大倍数分析所有图像。通过颜色反卷积处理图像，在向下滚动选项中使用H&E染色。感兴趣区域(ROI)和阈值参数是固定的，并用于所有图片中。然后在Excel中处理收集的数量数据，并按照图中所示绘制。
在下文中，术语“透明质酸”有时缩写为“HA”；术语“微粒”有时缩写为MP。
6.2.结果
首先，对获得的数据进行分析，以确定皮肤填充剂组合物的体积效应。这是注射交联透明质酸引起的体积增加。通常认为，直接注射后的体积效应最高。此后，交联透明质酸降解，表现为体积减小。还对炎症、排斥反应、包裹(encapsulation)等副作用的发生情况进行数据分析。
注射制剂A或制剂C，并随时间对皮肤进行监测。在注射后的特定时间间隔(3、6和12个月)对兔子的组织进行分析。
在注射后的前几周内，观察到的任何刺激/炎症平均分配在使用每种制剂处理的组织中。
图2显示了注射制剂A或制剂C后3个月、6个月和12个月获得的H&E染色皮肤层组织(比例尺均为0–2.5mm，有五段0.5mm)。凝胶被识别为较暗的区域，其轮廓用黑线表示。三个月后，大部分凝胶仍然存在。注射部位和周围区域均未发生皮肤排斥反应。皮肤层已经完全覆盖了凝胶的表面区域，不仅从周界开始，而且在其内部/穿过它。六个月后的照片显示凝胶的外观更模糊。一年后，注射部位没有凝胶残留，表明凝胶完全降解。该降解曲线与常规增容组合物的降解曲线一致。在任何时候都没有观察到通过纤维化组织包裹凝胶，表明没有引发免疫反应。总之，这些试验表明，本发明的组合物是一种有效的增容剂，并且本文中微粒的存在不会在注射时和注射后产生非预期的副作用。考虑到颗粒中透明质酸的重均分子量(Mw)，这更令人惊讶。Mw只有10kDa，由于它会在体内引发促炎反应，因此通常认为该值不适用。似乎是该低值可能是生物刺激的有效性以及本发明的皮肤填充剂组合物的低炎症反应的关键。
其次，对获得的数据进行关于皮肤填充剂组合物的生物刺激有效性的分析。这是注射组合物刺激胶原形成的程度。为此，通过测量注射部位的胶原密度(基于组织的PSR偏振图像)，量化每个组织样本中的胶原纤维数量。
图3显示了注射制剂A、制剂B或制剂C后12个月时组织中测得的胶原密度。制剂A提供了对应于无生物刺激的参考值(下条带)，从图3可以看出，制剂B和C确实启动了胶原的形成(分别为中条带和上条带)。这可以通过对组织本身的目视检查得到证实，因为与注射制剂A的组织相比，注射制剂B或C的组织具有更致密的外观，含有更少的空隙。
此外，(本发明的)制剂C在生物刺激方面的表现似乎优于制剂B。这表明微粒和交联透明质酸凝胶具有协同效应。凝胶可能会抑制微粒的生物降解，从而延长微粒的活性。
第三，对获得的数据进行关于注射后12个月内本发明的皮肤填充剂组合物(制剂C)的生物刺激进展的分析。众所周知，生物刺激产生可测量的效应需要一段时间，例如一个月或多个月。
图4显示了制剂C的此类时间曲线，因为三个月后的效果为中等，在此后的九个月内几乎增加了三倍。
图5显示了与图4中的条带相对应的组织显微照片，随着时间的推移，显示出更多的均匀性和更少的空隙(比例尺均为0–250μm，有五段50μm)。这也证明了本发明的皮肤填充剂组合物的生物刺激效应。
6.3.结论
以上数据得出以下结论。
1.本发明的组合物具有初始增容效应，其在12个月的时间内被生物刺激效应所取代。这两种效应的结合是，随着时间的推移，填充被认为是恒定的。
2.微粒具有生物刺激效应，并与交联透明质酸凝胶协同作用。
3.本发明的组合物具有1)和2)的性质，在注射时和注射后不会产生非预期的副作用。这与包含不规则形状透明质酸颗粒的已知组合物形成对比。设想是，本发明填充剂中球形微粒的光滑度是没有副作用的原因。

Claims (17)

1.凝胶形式的皮肤填充剂组合物，包括
-包含水和/或多元醇的载液；
-交联透明质酸凝胶；
-平均直径在10-200μm范围内的交联透明质酸球形微粒。
2.根据权利要求1所述的皮肤填充剂组合物，其中，基于所述皮肤填充剂本身的重量，所述载液的含量至少为90wt.％，优选地至少为95wt.％。
3.根据权利要求1或2所述的皮肤填充剂组合物，其中，基于所述皮肤填充剂的总重量，构成交联透明质酸凝胶的交联透明质酸的含量在0.1-10wt.％范围内，特别是在0.5-5.0wt.％范围内，更特别是在1.0-3.5wt.％范围内。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的皮肤填充剂组合物，其中，在交联透明质酸凝胶中，透明质酸的重均分子量(Mw)在200-5000kDa范围内，特别是在500-3000kDa范围内。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的皮肤填充剂组合物，其中，在交联透明质酸的球形微粒中，透明质酸的重均分子量(Mw)在5-500kDa范围内，特别是在10-100kDa范围内。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的皮肤填充剂组合物，其中所述凝胶和/或微粒中的透明质酸包含源于选自由二缩水甘油醚、二环氧烷烃和二乙烯基砜组成的组的交联剂的交联，特别是选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚或二乙烯基砜。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的皮肤填充剂组合物，其中所述球形微粒的平均直径在15-70μm范围内，特别是在20-55μm范围内，更特别是在30-50μm范围内。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的皮肤填充剂组合物，其中本发明皮肤填充剂中球形微粒的含量在0.4-10vol.％范围内，特别是在0.5-8vol.％范围内，更特别是在1-6vol.％范围内。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的皮肤填充剂组合物，进一步包含线性透明质酸。
10.根据权利要求9所述的皮肤填充剂组合物，其中所述线性透明质酸的重均分子量(Mw)在500-5000kDa范围内，特别是在800-4000kDa范围内。
11.制备凝胶形式的皮肤填充剂组合物的方法，包括
-制备交联透明质酸凝胶；
-制备交联透明质酸的球形微粒，其中当微粒存在于凝胶中时，微粒平均直径在10-200μm范围内；
-将交联透明质酸和球形微粒与包含水和/或多元醇的载液混合以形成凝胶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述交联源于选自由二缩水甘油醚、二环氧烷烃和二乙烯基砜组成的组的交联剂，特别是1,4-丁二醇二缩水甘油醚或二乙烯基砜。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述球形微粒在多个筛上筛分，以获得具有适当平均直径的颗粒。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的皮肤填充剂组合物，其用于药物治疗、整容治疗或美容治疗。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的皮肤填充剂组合物，其用于治疗萎缩性痤疮疤痕、脂肪代谢障碍、压力性尿失禁、膀胱输尿管反流、声带闭合不全和/或声带内移。
16.用于填充组织或增加组织体积以达到美容或治疗目的的方法，包括向人体施用有效量的根据权利要求1-10中任一项所述的皮肤填充剂组合物。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的皮肤填充剂组合物在治疗个体的组织的用途。
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