CN114634811B - 聚醚改性有机硅共聚物在增强亲脂性aie有机荧光探针的荧光检测性能中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚醚改性有机硅共聚物在增强亲脂性AIE有机荧光探针的荧光检测性能中的应用，所述聚醚改性有机硅共聚物与所述荧光探针分子通过分子间相互作用，自组装形成以荧光探针分子在内、聚醚改性有机硅共聚物缠绕在外的纳米粒子，增强亲脂性AIE有机荧光探针的荧光检测性能；有效提升了亲脂性AIE有机荧光探针的水溶性和检测灵敏度，并赋予检测条件以较大的耐酸碱宽容度。

Description

聚醚改性有机硅共聚物在增强亲脂性AIE有机荧光探针的荧光检测性能中的应用

技术领域

本发明涉及一种有机硅共聚物的应用，特别涉及一种聚醚改性有机硅共聚物在增强亲脂性AIE有机荧光探针的荧光检测性能中的应用。

背景技术

具有聚集诱导发光效应(Aggregation-Induced Emission，以下简称AIE)的荧光分子或荧光团在生物传感与成像和刺激响应***具备广泛的应用价值，如在线监测生物进程、体内特异性荧光成像、生物小分子荧光检测与传感、生物刺激响应***、基因转染与药物传递和体内光动力治疗等。目前，用于细胞膜、内质网、线粒体、脂滴、溶酶体和细胞核的AIE有机荧光探针已见文献报道。

脂滴作为一种重要的动态细胞器，在内质网形成，主要分布在细胞质基质，也少量存在于细胞核当中，其粒径分布在40～100nm范围，研究表明多种疾病与细胞内脂滴水平的异常相关，因此，通过AIE有机荧光探针实现对细胞内脂滴的监测与定位对于研究与脂滴相关疾病和定向治疗具应用价值。脂滴主要由磷脂双分子层包裹，并含有多种中性脂质体如胆固醇酯和甘油三酯等，属于脂溶性微粒，基于“相似相亲”原理，以脂滴为靶标的AIE有机荧光探针分子需具亲脂性能，才能有效靶向、接触和结合脂滴从而实现对其检测、传感和成像等应用，靶向脂滴的AIE有机荧光探针分子多为亲脂疏水性。但是，脂滴作为一种动态细胞器主要存在于以水为主的水溶性细胞质和其它细胞器中，因此，靶向脂滴的脂溶性AIE有机荧光探针分子在实际生物应用特别是生物传感和检测时，存在因亲脂疏水带来的水溶性差、溶质分子或微粒吸附等现象，造成荧光探针分子在生物传感和检测介质中无序聚集、非均匀分散和荧光淬灭等问题，严重制约了靶向脂滴的脂溶性AIE有机荧光探针分子的实际应用。

发明内容

发明目的：本发明提供一种聚醚改性有机硅共聚物在增强亲脂性AIE有机荧光探针的荧光检测性能中的应用，改善荧光探针分子的水溶性，提高检测灵敏度和耐酸碱宽容度。

技术方案：本发明的一种聚醚改性有机硅共聚物在增强亲脂性AIE有机荧光探针的荧光检测性能中的应用。

所述聚醚改性有机硅共聚物的聚硅氧烷链段与所述荧光探针分子通过分子间作用力，自组装形成AIE有机荧光探针分子在内、聚醚改性有机硅共聚物缠绕在外的纳米粒子，显著增强AIE有机荧光探针的荧光检测性能。

所述增强AIE有机荧光探针的荧光检测性能包括水溶性、检测灵敏度和耐酸碱宽容度。

所述聚醚改性有机硅共聚物为两亲性梳状，其结构式为：

其中m为20～100，n为1～20，x为5～25，y为1～30。

优选的，所述聚醚改性有机硅共聚物中m为40～80；n为5～10；x为6～18；y为3～22。

优选的，所述AIE有机荧光探针为2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(TTI)、2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)呋喃-2-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(TOI)或2-((5-(4-(二对甲苯基氨基)苯基)呋喃-2-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(MTOI)，其结构式为：

所述应用方法为：将AIE有机荧光探针加入到水或缓冲溶液中，再加入聚醚改性有机硅共聚物于溶液当中，混合均匀形成荧光探针溶液。

所述荧光探针溶液的pH为3～10。

优选的，所述荧光探针溶液中，荧光探针的浓度为10～20μmol/L，聚醚改性有机硅共聚物浓度大于零小于7.5×10^-4mol/L。

优选的，所述荧光探针溶液中，荧光探针的浓度为10～20μmol/L，聚醚改性有机硅共聚物浓度为3.0×10^-4mol/L～7.5×10^-4mol/L。

所述聚醚改性机硅共聚物的合成路线如下：

其中m为20～100，n为1～20，x为5～25，y为1～30。

具体制备方法为：在配有温度计、搅拌器、回流冷凝管的100mL三口瓶中，将含氢硅油和烯丙基聚醚以摩尔比1:1.0～2.0加入烧瓶中，加入Speier铂催化剂，氮气保护搅拌下升温至80～100℃，反应4～8小时，得到产物。

其中含氢硅油自制，烯丙基聚醚购于钟山化工有限公司，其余试剂购于晚晴化玻仪器有限公司。

所述含氢硅油的合成路线如下：

其中m＝k/a为20～100，n＝w/a为1～20。

具体制备方法为：在配有温度计、搅拌器、回流冷凝管的100mL三口瓶中，将八甲基环四硅氧烷、202硅油(高含氢硅油)和六甲基二硅氧烷(封端剂)以摩尔比80:1:3～7加入烧瓶中，加入浓硫酸催化剂，氮气保护搅拌下升温至70～90℃，反应8～10小时，得到含氢硅油。

所述AIE有机荧光探针TTI、TOI、MTOI的合路线如下：

具体合成方法为：

(1)将a(1mmol)和b(1mmol)溶解在20mL的甲醇和甲苯的混合溶剂中(甲醇和甲苯的体积比为1:1)，并向其中加入碳酸钾(5mmol)，待搅拌均匀后除去反应体系中的空气并向其中加入1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(0.1mmol)，进一步除去空气后将反应温度升至85℃并继续反应12小时。待反应结束后除去溶剂，并用石油醚：乙酸乙酯＝100:1的混合液体对混合物进行洗脱，以获得黄色固体产物c；

(2)将c(1mmol)和1,3-茚二酮(1mmol)溶解在20mL的乙醇中，并向其中加入哌啶(0.1mmol)，待搅拌均匀后将反应温度升至85℃并继续反应12小时。待反应结束后，冷却至室温并过滤，同时用乙醇对滤饼进行多次洗涤后烘干，所得固体化合物即为TTI、TOI和MTOI。

发明机理：细胞中水的含量约为70％(wt％)，且细胞的培养基亦为水性环境，而靶向脂滴的AIE有机荧光探针分子为亲脂疏水性。因此，靶向脂滴的AIE有机荧光探针分子既无法在生物检测的水溶液环境中均匀分布并实现稳定的荧光传感和检测，也不能在生物体中实现有效的荧光成像。本发明通过加入两亲性梳状聚醚改性有机硅共聚物作为表面活性物质，通过分子间作用力自组装形成以荧光探针分子在内、聚醚改性有机硅共聚物缠绕在外的“水包油”型纳米粒子，提高了AIE有机荧光探针的水溶性。所形成的“水包油”型纳米粒子有利于AIE有机荧光探针分子的聚集和诱导发光，可显著增强其荧光强度。同时，“水包油”型纳米粒子有助于AIE有机荧光探针分子与细胞膜的结合及进一步通过胞吞等方式进入细胞，与脂滴发生聚集诱导荧光作用，实现荧光传感和检测，显著提高其荧光传感性能。

此外，通过加入上述聚醚改性有机硅共聚物作为界面调控材料，构建AIE有机荧光探针分子在内、聚醚改性有机硅共聚物在外的“水包油”型纳米粒子，将检测介质中具干扰作用的溶质分子和微粒等阻挡在上述纳米粒子之外，克服了荧光探针分子与检测介质间因非辐射弛豫或能量转移效应等造成的荧光淬灭、光漂白等荧光传感性能大幅衰减的问题，从而显著提高AIE有机荧光探针分子的荧光强度、检测灵敏度和稳定性。同时，通过自组装形成纳米粒子还可有效减弱AIE有机荧光探针分子的分子内自旋转，减弱非辐射跃迁损耗几率，对基于聚集诱导效应的AIE有机荧光探针分子荧光强度的提高十分有益，从而利于荧光检测灵敏度的提高。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)通过向亲脂性AIE有机荧光探针中加入两亲性梳状聚醚改性有机硅共聚物，从而有效提升亲脂性AIE有机荧光探针的水溶性和检测灵敏度，并赋予检测条件较大的耐酸碱宽容度；(2)聚醚改性有机硅共聚物自身具备的良好的生物相容性，有利于亲脂性AIE有机荧光探针的生物相容性。

附图说明

图1为实施例1制备的含氢硅油及聚醚改性有机硅共聚物的¹H NMR谱图；

图2为实施例1制备的含氢硅油及聚醚改性有机硅共聚物的红外谱图；

图3为实施例2制备的含氢硅油及聚醚改性有机硅共聚物的¹H NMR谱图；

图4为实施例2制备的含氢硅油及聚醚改性有机硅共聚物的红外谱图；

图5为实施例1聚醚改性有机硅共聚物对TTI、TOI、MTOI等不同AIE荧光探针的增益效果测试；

图6为不同聚醚改性有机硅共聚物对TOI荧光强度的增益效果测试；

图7为不同浓度聚醚改性有机硅共聚物对TTI荧光强度的增益效果测试；

图8为聚醚改性有机硅共聚物应用于TOI时的粒径分布测试及TEM测试；

图9为聚醚改性有机硅共聚物应用于TTI的耐酸碱宽容度测试；

图10为聚醚改性有机硅共聚物应用于TOI的细胞毒性测试。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1～2

含氢硅油的制备：在配有温度计、搅拌器、回流冷凝管(配有N₂导气管)的100mL三口瓶中，加入202硅油(H％＝1.55％)10.0g，六甲基二硅氧烷1.95g，八甲基环四硅氧烷52.0g，浓硫酸催化剂用量为物料总质量的1％，反应温度85℃，反应8h，通过调聚反应合成实施例1含氢硅油中间体；调整六甲基二硅氧烷1.95g为4.55g，其它合成条件不变，合成实施例2含氢硅油中间体。

聚醚改性有机硅共聚物的制备：在配有温度计、搅拌器、回流冷凝管(配有N₂导气管)的100mL三口瓶中，根据表1将含氢硅油和烯丙基聚醚以摩尔比1:1.0加入烧瓶中，加入Speier铂催化剂(30ppm)，开始搅拌(转速为300r/min)并升温至100℃，反应4h，得到产物。

表1聚醚改性有机硅共聚物的制备

序号	m	n	x	y
					实施例1	80	10	18	22
实施例2	40	5	6	3

实施例1-2制备的聚醚改性有机硅共聚物，由图1、3可得，含氢硅油4.70ppm处的Si-H位移及烯丙基聚醚5.06～5.80ppm处的双键位移在共聚物中均消失；由图2、4可得，在共聚物当中，含氢硅油2156.4cm^-1处的Si-H特征峰基本消失，烯丙基聚醚1646.9cm^-1处的C＝C特征峰大幅度下降，综合可得，含氢硅油与烯丙基聚醚已成功发生反应制得聚醚改性有机硅共聚物。

实施例3

AIE有机荧光探针TTI的制备：

(1)将1mmol a(4-溴-N,N-二苯基苯胺)和1mmol b((5-甲酰基噻吩-2-基)硼酸)溶解在20mL的甲醇和甲苯的混合溶剂中(甲醇和甲苯的体积比为1:1)，并向其中加入碳酸钾(5mmol)，待搅拌均匀后除去反应体系中的空气并向其中加入1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(0.1mmol)，进一步除去空气后将反应温度升至85℃并继续反应12小时。待反应结束后除去溶剂，并用石油醚：乙酸乙酯＝100:1的混合液体对混合物进行洗脱，以获得黄色固体产物c(5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛)；产物c的¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.86(s,1H),7.71(d,J＝4.0Hz,1H),7.54–7.51(m,2H),7.32–7.29(m,5H),7.15(dd,J＝8.5,0.9Hz,4H),7.11–7.06(m,4H)。

(2)将c(1mmol)和1,3-茚二酮(1mmol)溶解在20mL的乙醇中，并向其中加入哌啶(0.1mmol)，待搅拌均匀后将反应温度升至85℃并继续反应12小时。待反应结束后，冷却至室温并过滤，同时用乙醇对滤饼进行多次洗涤后烘干，所得固体化合物即为TTI；TTI为红棕色固体，¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.00–7.94(m,4H),7.80–7.75(m,2H),7.66–7.63(m,2H),7.38(d,J＝4.1Hz,1H),7.35–7.31(m,4H),7.19–7.16(m,4H),7.13(t,J＝7.4Hz,2H),7.10–7.07(m,2H)。

实施例4

AIE有机荧光探针TOI的制备：在实施例3的基础上，将b((5-甲酰基噻吩-2-基)硼酸)替换为(5-甲酰基呋喃-2-基)硼酸，其他条件不变。

产物c(5-(4-(二苯基氨基)苯基)呋喃-2-甲醛)的¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.59(s,1H),7.65(d,J＝8.8Hz,2H),7.31–7.29(m,4H),7.28(s,1H),7.13(d,J＝7.7Hz,4H),7.08(dd,J＝16.6,8.1Hz,4H),6.70(d,J＝3.7Hz,1H)。

TOI为棕绿色固体，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.95–7.92(m,2H),7.77–7.72(m,3H),7.70(d,J＝8.6Hz,2H),7.33–7.29(m,4H),7.15(dd,J＝8.5,1.0Hz,4H),7.14–7.05(m,5H),6.88(d,J＝3.8Hz,1H)。

实施例5

AIE有机荧光探针MTOI的制备：在实施例4的基础上，将a(4-溴-N,N-二苯基苯胺)替换为4-溴-N,N-二对甲苯胺，其他条件不变。

产物c(5-(4-(二对甲苯基氨基)苯基)呋喃-2-甲醛)的¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.58(s,1H),7.63–7.60(m,2H),7.29(d,J＝3.7Hz,1H),7.10(d,J＝8.1Hz,4H),7.04–7.03(m,2H),7.02(d,J＝1.8Hz,2H),7.01–6.99(m,2H),6.67(d,J＝3.7Hz,1H),2.33(s,6H)。

MTOI为棕绿色固体，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.82(s,1H),8.64(dd,J＝6.7,1.1Hz,1H),8.51(s,1H),7.87–7.85(m,1H),7.73–7.65(m,4H),7.13(d,J＝8.2Hz,4H),7.06(d,J＝8.3Hz,4H),7.01–6.98(m,2H),6.92(d,J＝4.1Hz,1H),2.35(s,6H)。

实施例6

聚醚改性有机硅共聚物对不同探针的荧光增益效果测试。

选取实施例1的聚醚改性有机硅共聚物和实施例3～5的AIE有机荧光探针TTI、TOI、MTOI配置成水溶液，其中聚醚改性有机硅共聚物浓度分别为0、1.0×10^-4、6.0×10^{- 4}mol/L，TTI、TOI、MTOI的浓度为10μmol/L，分别取3ml溶液用于荧光分析。

荧光分析方法：荧光分光光度计：岛津RF-6000(A40245601101SA)；激发波长：510nm；数据间隔：1.0nm；扫描速度：2000nm/min；带宽：5.0nm。

通过图5可知，聚醚改性有机硅共聚物对AIE有机荧光探针TTI、TOI、MTOI均具备荧光增益效果，表明其具备良好的普适性。当聚醚改性有机硅共聚物浓度为1.0×10^-4mol/L时，其对TTI、TOI、MTOI的增益效果分别为19.2％、113.8％、76.6％；当聚醚改性有机硅共聚物浓度为6.0×10^-4mol/L时，其对TTI、TOI、MTOI的增益效果分别为71.5％、425.0％、108.4％，表明其可以显著增强荧光检测的荧光强度，并显著提高检测灵敏度。

实施例7

不同聚醚改性有机硅共聚物对TOI荧光强度的增益效果测试。

选取实施例1、2的聚醚改性有机硅共聚物和实施例4的TOI，配置成水溶液，其中聚醚改性有机硅共聚物浓度分别为0、1.0×10^-4、6.0×10^-4mol/L，TOI浓度为10μmol/L，分别取3mL溶液用于荧光分析，测定不同聚醚改性有机硅共聚物对亲脂性有机荧光探针TTI的荧光增益效果。

通过图6可知，当浓度为1.0×10^-4mol/L时，实施例1、2共聚物对TOI的增益效果分别为113.8％、64.9％；当浓度为6.0×10^-4mol/L时，实施例1、2共聚物对TOI的增益效果分别为425.0％、255.0％。表明不同聚醚改性有机硅共聚物均对TOI具备荧光增益效果，在所给浓度范围，聚醚改性有机硅共聚物的增益效果随其浓度的增大而提高。

实施例8

聚醚改性有机硅共聚物最佳增益浓度的筛选。

选取实施例1的聚醚改性有机硅共聚物和实施例3的TTI，配置成水溶液，其中聚醚改性有机硅共聚物浓度分别为0、1.0×10^-4、1.5×10^-4、2.0×10^-4、2.5×10^-4、3.0×10^-4、3.5×10^-4、4.0×10^-4、4.5×10^-4、5.0×10^-4、5.5×10^-4、6.0×10^-4、6.5×10^-4、7.0×10^-4、7.5×10^-4mol/L，TTI浓度为10μmol/L，分别取3mL溶液用于荧光分析。

通过图7可知，不同浓度的聚醚改性有机硅共聚物对亲脂性探针TTI均具备荧光增益效果，其中，浓度为6.0×10^-4mol/L时增益效果达到最大，荧光强度提高了71.5％。

实施例9

聚醚改性有机硅共聚物应用于探针时的粒径分布及TEM测试。

选取实施例1的聚醚改性有机硅共聚物和实施例4的TOI，配置成水溶液，其中聚醚改性有机硅共聚物浓度分别0μmol/L、10μmol/L，TOI浓度为10μmol/L，分别取3ml溶液用于粒径分布测试和TEM测试。

粒径分布测试方法：使用动态光散射仪(DLS)进行测定，温度：25℃；角度：90°；基线数值：8.3。

TEM测试方法：加速电压：200KV；点分辨率：0.24nm；晶格分辨率：0.14nm；能谱分辨率：136ev。

通过图8可知，添加聚醚改性有机硅共聚物之后，TOI在水溶液中的平均粒径由148.40nm增至173.19nm，同时，TEM测试图像显示，添加聚醚改性有机硅共聚物后，TOI纳米颗粒的分散均匀程度和有序聚集程度得到有效提升，表明两亲性梳状聚醚改性有机硅共聚物作为表面活性物质，可以与AIE荧光探针分子自组装形成“水包油”型纳米粒子，提高其聚集诱导发光效应，同时，有助于AIE有机荧光探针分子通过胞吞等方式进入细胞，与脂滴发生聚集诱导荧光作用，实现荧光传感和检测。

实施例10

聚醚改性有机硅共聚物应用于探针时的耐酸碱宽容度测试。

不同pH磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制：称取二水合磷酸二氢钠(0.7410g)、十二水合磷酸氢二钠(7.2495g)和六水合氯化镁(0.2030g)置于100mL烧杯中，分4次往烧杯中加入二次蒸馏水(共200mL)充分溶解，静置，转移至250mL容量瓶中，并补加二次蒸馏水定容，充分振荡均匀，再用pH计检验缓冲液的pH。配制得到PBS缓冲液(0.1M,pH 7.4,c(MgCl₂)＝4.0mM)，置于4℃储存。通过加入计量的NaOH和HCl溶液(浓度为1M)，分别配备pH为3、4、5、6、7、8、9、10的PBS缓冲溶液。

取上述不同pH的PBS溶液，分别加入实施例3的TTI和实施例1的聚醚改性有机硅共聚物，其中TTI浓度为10μmol/L，聚醚改性有机硅共聚物的浓度为2.0×10^-4mol/L，制备得到不同pH下的混合溶液，分别取3ml溶液用于荧光分析。

通过图9可知，在pH为3～10的检测条件下，加入聚醚改性有机硅共聚物均可以提高TTI的荧光强度，表明其具备较大的耐酸碱宽容度。

实施例11

聚醚改性有机硅共聚物应用于探针时的细胞毒性测试。

通过MTT比色法测定细胞活性，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT(噻唑蓝)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

首先将LO2细胞(人类正常肝细胞)接种在96孔培养板中，加入含有10％胎牛血清(FBS)的培养基(100μL)，并在5％CO₂中于37℃恒温培育24小时。将LO2细胞的培养基换为只含实施例4的TOI，只含实施例1的聚醚改性有机硅共聚物和同时含有TOI和实施例1聚醚改性有机硅共聚物的三种培养基(100μL)继续培育24小时，TOI和聚醚改性有机硅共聚物的浓度均为0.15625，0.6250，2.5000，10.0000，40.0000μM。吸除培养基并用PBS(100μL)洗涤细胞，向每个孔中加入100μL含有0.05％MTT的培养基，继续培育4小时。培养结束后，除去培养基并向各孔中加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10分钟使孔内生成的甲臜溶解。最后，用酶标仪测量每个孔在490nm处的吸光度，并与对照组的吸光度(100％存活率)进行比较，得到不同条件下细胞的相对存活率。通过图10可知，聚醚改性有机硅共聚物具备良好的生物相容性，且应用于AIE有机荧光探针时可以进一步提高其生物相容性。

Claims (5)

1.一种荧光探针溶液在荧光检测性能中的应用，其特征在于，将亲脂性AIE有机荧光探针加入到水或缓冲溶液中，再加入聚醚改性有机硅共聚物，混合均匀形成荧光探针溶液；所述聚醚改性有机硅共聚物能增强亲脂性AIE有机荧光探针的荧光检测性能；所述聚醚改性有机硅共聚物的聚硅氧烷链段与所述荧光探针分子通过分子间作用力，自组装形成以荧光探针分子在内、聚醚改性有机硅共聚物缠绕在外的纳米粒子，增强AIE有机荧光探针的荧光检测性能；

所述聚醚改性有机硅共聚物的结构式为：

,

其中，m为40~80；n为5~10；x为6~18；y为3~22；

所述亲脂性AIE有机荧光探针为2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮、2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)呋喃-2-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮或2-((5-(4-(二对甲苯基氨基)苯基)呋喃-2-基)亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光检测性能包括水溶性、检测灵敏度和耐酸碱宽容度。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光探针溶液的pH为3~10。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光探针溶液中，荧光探针的浓度为10~20μmol/L，聚醚改性有机硅共聚物浓度大于零小于7.5×10^-4 mol/L。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荧光探针溶液中，荧光探针的浓度为10~20μmol/L，聚醚改性有机硅共聚物浓度为3.0×10^-4 mol/L~7.5×10^-4 mol/L。

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