CN114632558B - 一种微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微流控芯片，包括：底层芯片、顶层芯片以及连接组件；所述底层芯片包括：设于所述底层芯片正中处的中心孔、若干第一逶迤通道、若干第一反应微室、若干第一连接通道以及若干第二连接通道；所述顶层芯片包括：若干第三连接通道、若干第二逶迤通道以及若干第二反应微室；本发明还涉及一种如上所述微流控芯片的制备方法以及如上所述微流控芯片在检测新型冠状病毒或/和流感病毒核酸中的应用。本发明的微流控芯片实现了SARS‑CoV‑2、甲流病毒(Flu A)H1N1、Flu A H3N2和流感病毒(Flu B)的高特异性和高灵敏度检测，为疫情防控提供全新的技术平台。

Description

一种微流控芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因诊断技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及其制备方法与应用。
背景技术
新冠病毒(SARS-COV-2)引发的新冠肺炎(COVID-19)正在全球肆虐。由于极强的传染性，SARS-COV-2已在人与人之间广泛传播。如果对有症状的患者进行快速检测，SARS-CoV-2的传播可以得到控制。然而，新冠病毒感染患者的症状与其他常见疾病相似。流感病毒A(FluA)和流感病毒B(FluB)在传播特征和临床症状方面与SARS-CoV-2相似。SARS-CoV-2和FluB患者共感染的病例已见报道。FluA是最常见的共感染病毒之一，从而导致RT-PCR检测SARS-CoV-2时出现假阴性结果。合并感染SARS-CoV-2和FluA的患者的临床症状与单独感染SARS-CoV-2的患者相似，而且FluA与SARS-COV-2共感染可导致更严重的临床症状。因此，建立快速、方便和准确的分析方法实现SARS-COV-2、FluA和FluB的同时检测对促进早期干预和降低病毒传播具有重要意义。
RT-PCR是SARS-COV-2分子诊断的金标准。然而，RT-PCR对检测场所和人员要求很高，不适合医院门急诊及基层医疗机构广泛开展。与RT-PCR比较，逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)不需精良的仪器设备，因此更适合呼吸道病毒核酸即时检测(POCT)。RT-LAMP快速，高灵敏检测SARS-CoV-2已见报道。然而，RT-LAMP分析过程中的非特异性扩增可能导致假阳性结果，这限制了此技术的应用。为了进一步提高SARS-CoV-2检测的特异性，进一步确定扩增产物的特性，以及这些产物是否来自病毒序列，研究人员正在不断探索新的检测技术。CRISPR(clusters of regularly interspaced short palindromic repeats，即成簇的规律间隔的短回文重复序列)技术是一种编辑基因的技术，具有简单、廉价和高效等优势，目前已经成为全球最为流行的基因编辑技术，被称为编辑基因的“魔剪”。近来研究人员已经开始使用CRISPR来进行核酸的体外检测，因此其就有望被开发成为一种强大精确的分子诊断工具；在CRISPR-Cas效应子家族中，Cas12是一种RNA导向的DNase，该***能在识别靶点后诱导任意单链DNA(ssDNA)的***，从而导致ssDNA报道子的降解，并在***位点释放荧光信号，即可通过一种便携式的方法进行检测。Cas12这一特点可有效弥补LAMP反应的非特异性扩增的缺陷。为了提高SARS-CoV-2检测的准确性，几个研究组开发了用于SARS-CoV-2检测的一步、闭管CRISPR-Cas12等温扩增反应。然而，单管法不能同时检测SARS-CoV-2的N基因和ORF1ab基因，也不能同步检测或区分多个呼吸道病毒。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种微流控芯片及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种微流控芯片，包括：底层芯片、顶层芯片以及连接组件；
其中，所述底层芯片包括：设于所述底层芯片正中处的中心孔、若干第一逶迤通道、若干第一反应微室、若干第一连接通道以及若干第二连接通道；所述顶层芯片包括：若干第三连接通道、若干第二逶迤通道以及若干第二反应微室；所述中心孔于圆周上设有若干出液口，每个所述中心孔的出液口各自与一个所述第一逶迤通道的进液口连通，每个所述第一逶迤通道的出液口各自与一个所述第一反应微室的进液口连通，每个所述第一反应微室的出液口各自与一个所述第一连接通道的进液口连通，每个所述第一连接通道的出液口各自与一个所述第二连接通道的进液口连通，每个所述第二连接通道的出液口各自与一个所述第三连接通道的进液口连通，每个所述第三连接通道的出液口各自与一个所述第二逶迤通道的进液口连通，每个所述第二逶迤通道的出液口各自与一个所述第二反应微室的进液口连通，每个所述第二反应微室远离所述第二逶迤通道的一端设有试剂进口；
其中，所述连接组件包括：若干贯穿所述顶层芯片并与所述底层芯片连接的螺丝、设于所述第一连接通道与所述第二连接通道连通处的若干控制阀以及设于所述第二连接通道与所述第三连接通道连通处的若干密封圈；所述螺丝与所述顶层芯片可拆卸连接，所述螺丝与所述底层芯片可拆卸连接，且所述螺丝与所述控制阀相邻；所述控制阀设于所述顶层芯片与所述底层芯片之间；所述密封圈设于所述顶层芯片与所述底层芯片之间。
优选地，所述第一逶迤通道的长度为35.0mm-40.0mm，宽度为0.1mm-0.4mm，深度为0.1mm-0.4mm，体积为1.0μL-2.0μL。
优选地，所述第一反应微室的长度为3.0mm-9.0mm，宽度为1.0mm-4.0mm，深度为0.1mm-1.0mm，体积为3.0μL-9.0μL。
优选地，所述第一连接通道、所述第二连接通道、所述第三连接通道以及所述第二逶迤通道的总长度为20.0mm-30.0mm，宽度均为0.1mm-0.4mm，深度均为0.1mm-0.4mm，总体积为0.5μL-1.5μL。
优选地，所述第二反应微室的长度为3.0mm-9.0mm，宽度为1.0mm-4.0mm，深度为1.5mm-2.0mm，体积为20.0μL-25.0μL。
优选地，若干所述第一反应微室包括：至少一个包被有SARS-CoV-2N基因LAMP反应引物的第一反应微室、至少一个包被有SARS-CoV-2ORF1ab基因LAMP反应引物的第一反应微室、至少一个包被有FluA H1N1基因LAMP反应引物的第一反应微室、至少一个包被有FluAH3N2基因LAMP反应引物的第一反应微室、至少一个包被有FluB基因LAMP反应引物的第一反应微室以及至少一个不包被任何LAMP反应引物的第一反应微室。
优选地，所述顶层芯片还包括：若干气孔，每个所述气孔开设于所述第三连接通道与所述第二逶迤通道的连通处。
本发明的第二方面是提供一种如上所述微流控芯片的制备方法，步骤包括：
以激光雕刻的方式，于板体表面雕刻出各通道以及各反应微室后，对所述板体进行冲洗；待去除沉积的碎片后，于底层芯片的各反应微室中包被各自的LAMP反应引物或不包被任何LAMP反应引物；以透明的微流控胶带密封所述底层芯片的上表面以及顶层芯片的上下表面，并以连接组件密封连接所述底层芯片与所述顶层芯片，即得所述微流控芯片。
本发明的第三方面是提供一种如上所述微流控芯片在检测新型冠状病毒或/和流感病毒核酸中的应用，步骤包括：
S1、拧松所述螺丝后，依次将含样本的LAMP反应体系以及矿物油加入所述中心孔中，使所述含样本的LAMP反应体系填充所述第一反应微室，并使所述矿物油充满所述第一逶迤通道；将CRISPR/Cas12a反应体系通过所述试剂进口加入所述第二反应微室中；
S2、拧紧所述螺丝，并以透明的微流控胶带密封所述中心孔、所述试剂进口以及所述气孔，将所述微流控芯片置于恒温加热器上，于65℃恒温40分钟后，拧松所述螺丝，并移除所述透明的微流控胶带，向所述中心孔中加入矿物油，以将LAMP反应产物转移至所述第二反应微室中；
S3、拧紧所述螺丝，并以透明的微流控胶带密封所述中心孔以及所述试剂进口，将所述微流控芯片置于恒温加热器上，于37℃恒温15分钟后，以470nm的蓝光照射所述微流控芯片，透过蓝光滤光片即可记录所产生的荧光，裸眼即可观察结果；
其中，当所述螺丝被拧紧时，所述控制阀在所述顶层芯片与所述底层芯片的挤压下发生形变，进而封堵所述第二连接通道与所述第三连接通道的连通口；当所述螺丝被拧松时，所述控制阀的形状复原，从而所述第二连接通道与所述第三连接通道的连通恢复。
优选地，所述LAMP反应体系包括：
优选地，SARS-CoV-2N基因的LAMP反应引物包括：
Primer name Sequence(5’to 3’)
F3-N GCTGCAATCGTGCTACAACT
B3-N TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA
FIP-N TGCGACTACGTCATGAGGAACGTTGCCAAAAGGCCTCTACGC
BIP-N GGCAGCAGTAGCGGAACTTCTGAGCAGCAGCAAAGCAAGAG
LF-N TTGACTGCCGCCTCTGC
LB-N CTGCTAGAATGGCTGGCAAT
优选地，SARS-CoV-2ORF1ab基因的LAMP反应引物包括：
Primer name Sequence(5’to 3’)
F3-ORF1ab GAGCTACTGTAGTAATTGGAAC
B3-ORF1ab CTCAATACTTGAGCACACTCAT
FIP-ORF1ab AAGGTGAGGGTATTCTACATCACTAAGCAAATTCTTTGGTGGTTG
BIP-ORF1ab CCTAACATGCTTACAATTATGGCCTAGTGACAAGCTACAACACG
LB-ORF1ab CACTTGTTCTTGCTCGCAAAC
优选地，FluA H1N1基因的LAMP反应引物包括：
Primer name Sequence(5’to 3’)
F3-H1N1 AGACGCTTTGTCCAAAATGC
B3-H1N1 CAAGTGGCACACACTAGGC
FIP-H1N1 CCTTGGCCCCAAGGAACGTTGGGGACCCGAACTACATG
BIP-H1N1 TTCAACTGGCGCACTTGCCAGTGTGGTCACTGTTACCATCC
LB-H1N1 TGCATGGGCCTCATATACAACA
优选地，FluA H3N2基因的LAMP反应引物包括：
Primer name Sequence(5’to 3’)
F3-H3N2 GGGGCATGTCCCAGATAT
B3-H3N2 CGATTGCTGCTTGAGTGC
FIP-H3N2 CGCCAAATATGCGTCTAGTTTGTACTCTGACATTGGCAACAG
BIP-H3N2 TTCATAGATAATGGTTGGGAGGGAACTGATGCTTGTCCTCTTC
LF-H3N2 CTCTCTGGGACATTTCGCATTC
优选地，FluB基因的LAMP反应引物包括：
Primer name Sequence(5’to 3’)
F3-Flu B TGACAATAAAAAGGGATATGCG
B3-Flu B CGAAGAGTGAGTTGAGGATC
FIP-Flu B CTTGTATCCATAGGGGTGTTTGAGTAATGTATTGTGCTTGAGAGTGT
BIP-Flu B ATATGACCAGAGTGCAAGGCTATGGCCATCTACTTGATCC
LB-Flu B TGTTGCTAAACTTGTTGCCACT
优选地，所述CRISPR/Cas12a反应体系包括：
优选地，CRISPR/Cas12a反应体系中的crRNA包括：
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的微流控芯片实现了SARS-CoV-2、甲流病毒(Flu A)H1N1、Flu AH3N2和流感病毒(Flu B)的高特异性和高灵敏度检测，为疫情防控提供全新的技术平台。
附图说明
图1为本发明中微流控芯片的结构示意图；
图2-3为本发明中阀门的工作示意图；
图4为本发明中微流控芯片的实物图；
图5为本发明中应用实施例的检测结果图；
其中，附图标记包括：中心孔1；第一逶迤通道2；第一反应微室3；包被有SARS-CoV-2N基因LAMP反应引物的第一反应微室31；包被有SARS-CoV-2ORF1ab基因LAMP反应引物的第一反应微室32；包被有FluA H1N1基因LAMP反应引物的第一反应微室33；包被有FluA H3N2基因LAMP反应引物的第一反应微室34；包被有FluB基因LAMP反应引物的第一反应微室35；不包被任何LAMP反应引物的第一反应微室36；第一连接通道41；第二连接通道42；第三连接通道43；第二逶迤通道5；第二反应微室6；与包被有SARS-CoV-2N基因LAMP反应引物的第一反应微室31相连通的第二反应微室1*；与包被有SARS-CoV-2ORF1ab基因LAMP反应引物的第一反应微室32相连通的第二反应微室2*；与包被有FluA H1N1基因LAMP反应引物的第一反应微室33相连通的第二反应微室3*；与包被有FluA H3N2基因LAMP反应引物的第一反应微室34相连通的第二反应微室4*；与包被有FluB基因LAMP反应引物的第一反应微室35相连通的第二反应微室5*；与不包被任何LAMP反应引物的第一反应微室36相连通的第二反应微室N*；试剂进口7；螺丝8；控制阀9；密封圈10；气孔11。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种微流控芯片，包括：底层芯片、顶层芯片以及连接组件；
其中，所述底层芯片包括：设于所述底层芯片正中处的中心孔1、6条第一逶迤通道2、6个第一反应微室3、6条第一连接通道41以及6条第二连接通道42；所述顶层芯片包括：6条第三连接通道43、6条第二逶迤通道5、6个第二反应微室6以及6个气孔11；所述中心孔1于圆周上设有6个出液口，每个所述中心孔1的出液口各自与一个所述第一逶迤通道2的进液口连通，每个所述第一逶迤通道2的出液口各自与一个所述第一反应微室3的进液口连通，每个所述第一反应微室3的出液口各自与一个所述第一连接通道41的进液口连通，每个所述第一连接通道41的出液口各自与一个所述第二连接通道42的进液口连通，每个所述第二连接通道42的出液口各自与一个所述第三连接通道43的进液口连通，每个所述第三连接通道43的出液口各自与一个所述第二逶迤通道5的进液口连通，每个所述第二逶迤通道5的出液口各自与一个所述第二反应微室6的进液口连通；每个所述第三连接通道43与所述第二逶迤通道5的连通处开设有所述气孔11，每个所述第二反应微室6远离所述第二逶迤通道5的一端设有试剂进口7；
其中，所述第一逶迤通道2的长度为37.5mm，宽度为0.2mm，深度为0.2mm，体积为1.5μL；所述第一反应微室3的长度为6.0mm，宽度为2.0mm，深度为0.5mm，体积为6.0μL；所述第一连接通道41、所述第二连接通道42、所述第三连接通道43以及所述第二逶迤通道5的总长度为25.0mm，宽度均为0.2mm，深度均为0.2mm，总体积为1.0μL；所述第二反应微室6的长度为6.0mm，宽度为2.0mm，深度为1.8mm，体积为21.6μL；
其中，6个所述第一反应微室3包括：1个包被有SARS-CoV-2N基因LAMP反应引物的第一反应微室31、1个包被有SARS-CoV-2ORF1ab基因LAMP反应引物的第一反应微室32、1个包被有FluA H1N1基因LAMP反应引物的第一反应微室33、1个包被有FluA H3N2基因LAMP反应引物的第一反应微室34、1个包被有FluB基因LAMP反应引物的第一反应微室35以及1个不包被任何LAMP反应引物的第一反应微室36；
其中，所述连接组件包括：6颗贯穿所述顶层芯片并与所述底层芯片连接的螺丝8、设于所述第一连接通道41与所述第二连接通道42连通处的6个控制阀9以及设于所述第二连接通道42与所述第三连接通道43连通处的6个密封圈10；所述螺丝8与所述顶层芯片可拆卸连接，所述螺丝8与所述底层芯片可拆卸连接，且所述螺丝8与所述控制阀9相邻；所述控制阀9设于所述顶层芯片与所述底层芯片之间；所述密封圈10设于所述顶层芯片与所述底层芯片之间。
实施例2
本实施例提供一种如实施例1所述微流控芯片的制备方法，步骤包括：
以激光雕刻的方式，于PMMA板体表面雕刻出各通道以及各反应微室后，对所述板体进行冲洗；待去除沉积的碎片后，于底层芯片的各反应微室中包被各自的LAMP反应引物或不包被任何LAMP反应引物；以透明的微流控胶带密封所述底层芯片的上表面以及顶层芯片的上下表面，并以连接组件密封连接所述底层芯片与所述顶层芯片，即得如图4所示的微流控芯片，其直径为5cm，高度为12mm。
实施例3
本实施例提供一种如实施例1所述微流控芯片检测新型冠状病毒或/和流感病毒核酸的方法，步骤包括：
S1、拧松所述螺丝8后，依次将含样本的LAMP反应体系以及矿物油加入所述中心孔1中，使所述含样本的LAMP反应体系填充所述第一反应微室3，并使所述矿物油充满所述第一逶迤通道2；将CRISPR/Cas12a反应体系通过所述试剂进口7加入所述第二反应微室6中；
其中，所述LAMP反应体系包括(各基因的LAMP反应引物如前所述)：
其中，所述CRISPR/Cas12a反应体系包括(各基因相对应的crRNA如前所述)：
S2、拧紧所述螺丝8，并以透明的微流控胶带密封所述中心孔1、所述试剂进口7以及所述气孔11，将所述微流控芯片置于恒温加热器上，于65℃恒温40分钟后，拧松所述螺丝8，并移除所述透明的微流控胶带，向所述中心孔1中加入矿物油，以将LAMP反应产物转移至所述第二反应微室中；
S3、拧紧所述螺丝8，并以透明的微流控胶带密封所述中心孔1以及所述试剂进口7，将所述微流控芯片置于恒温加热器上，于37℃恒温15分钟后，以470nm的蓝光照射所述微流控芯片，透过蓝光滤光片即可记录所产生的荧光，裸眼即可观察结果；
其中，如图3所示，当所述螺丝8被拧紧时，所述控制阀9在所述顶层芯片与所述底层芯片的挤压下发生形变，进而封堵所述第二连接通道42与所述第三连接通道43的连通口；如图2所示，当所述螺丝8被拧松时，所述控制阀9的形状复原，从而所述第二连接通道42与所述第三连接通道43的连通恢复。
应用实施例
采集患者的咽拭子，并于生物安全柜中提取RNA，采用如实施例3所述的方法进行新型冠状病毒或/和流感病毒核酸的结果；患者1的检测结果如图5A所示，为FluA H1N1阳性；患者2的检测结果如图5B所示，为FluA H3N2阳性；患者3的检测结果如图5C所示，为FluB阳性；上海市计量测试技研究院提供的SARS-CoV-2RNA标准物质(1.0×103copies/μL)的检测结果如图5D所示。
综上所述，本发明的微流控芯片实现了SARS-CoV-2、甲流病毒(Flu A)H1N1、Flu AH3N2和流感病毒(Flu B)的高特异性和高灵敏度检测，为疫情防控提供全新的技术平台。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> 一种微流控芯片及其制备方法与应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgcaatcg tgctacaact 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgctctcaa gctggttcaa 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcgactacg tcatgaggaa cgttgccaaa aggcctctac gc 42
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcagcagta gcggaacttc tgagcagcag caaagcaaga g 41
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgactgccg cctctgc 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgctagaat ggctggcaat 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagctactgt agtaattgga ac 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcaatactt gagcacactc at 22
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaggtgaggg tattctacat cactaagcaa attctttggt ggttg 45
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctaacatgc ttacaattat ggcctagtga caagctacaa cacg 44
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacttgttct tgctcgcaaa c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agacgctttg tccaaaatgc 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagtggcac acactaggc 19
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccttggcccc aaggaacgtt ggggacccga actacatg 38
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttcaactggc gcacttgcca gtgtggtcac tgttaccatc c 41
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgcatgggcc tcatatacaa ca 22
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggggcatgtc ccagatat 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgattgctgc ttgagtgc 18
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgccaaatat gcgtctagtt tgtactctga cattggcaac ag 42
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttcatagata atggttggga gggaactgat gcttgtcctc ttc 43
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctctctggga catttcgcat tc 22
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggtggatgg ttggtacgg 19
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgacaataaa aagggatatg cg 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgaagagtga gttgaggatc 20
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttgtatcca taggggtgtt tgagtaatgt attgtgcttg agagtgt 47
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atatgaccag agtgcaaggc tatggccatc tacttgatcc 40
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgttgctaaa cttgttgcca ct 22
<210> 28
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaauuucuac uguuguagau uugaacuguu gcgacuacgu gaug 44
<210> 29
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gaauuucuac uguuguagau cgagcaagaa caagucaggc caua 44
<210> 30
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaauuucuac uguuguagau agcuucuugu auacuuuaac ugcu 44
<210> 31
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaauuucuac uguuguagau auagaaaaug guuggcaggg aaug 44
<210> 32
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaauuucuac uguuguagau aggaauguuc cauuuaccaa cacu 44

Claims (6)

1.一种微流控芯片在检测新型冠状病毒或/和流感病毒核酸中的应用，其特征在于，所述微流控芯片包括：底层芯片、顶层芯片以及连接组件；
其中，所述底层芯片包括：设于所述底层芯片正中处的中心孔(1)、若干第一逶迤通道(2)、若干第一反应微室(3)、若干第一连接通道(41)以及若干第二连接通道(42)；所述顶层芯片包括：若干第三连接通道(43)、若干第二逶迤通道(5)以及若干第二反应微室(6)；所述中心孔(1)于圆周上设有若干出液口，每个所述中心孔(1)的出液口各自与一个所述第一逶迤通道(2)的进液口连通，每个所述第一逶迤通道(2)的出液口各自与一个所述第一反应微室(3)的进液口连通，每个所述第一反应微室(3)的出液口各自与一个所述第一连接通道(41)的进液口连通，每个所述第一连接通道(41)的出液口各自与一个所述第二连接通道(42)的进液口连通，每个所述第二连接通道(42)的出液口各自与一个所述第三连接通道(43)的进液口连通，每个所述第三连接通道(43)的出液口各自与一个所述第二逶迤通道(5)的进液口连通，每个所述第二逶迤通道(5)的出液口各自与一个所述第二反应微室(6)的进液口连通，每个所述第二反应微室(6)远离所述第二逶迤通道(5)的一端设有试剂进口(7)；
其中，所述连接组件包括：若干贯穿所述顶层芯片并与所述底层芯片连接的螺丝(8)、设于所述第一连接通道(41)与所述第二连接通道(42)连通处的若干控制阀(9)以及设于所述第二连接通道(42)与所述第三连接通道(43)连通处的若干密封圈(10)；所述螺丝(8)与所述顶层芯片可拆卸连接，所述螺丝(8)与所述底层芯片可拆卸连接，且所述螺丝(8)与所述控制阀(9)相邻；所述控制阀(9)设于所述顶层芯片与所述底层芯片之间；所述密封圈(10)设于所述顶层芯片与所述底层芯片之间；
所述微流控芯片检测新型冠状病毒或/和流感病毒核酸的步骤包括：
S1、拧松所述螺丝(8)后，依次将含样本的LAMP反应体系以及矿物油加入所述中心孔(1)中，使所述含样本的LAMP反应体系填充所述第一反应微室(3)，并使所述矿物油充满所述第一逶迤通道(2)；将CRISPR/Cas12a反应体系通过所述试剂进口(7)加入所述第二反应微室(6)中；
S2、拧紧所述螺丝(8)，并以透明的微流控胶带密封所述中心孔(1)、所述试剂进口(7)以及气孔(11)，将所述微流控芯片置于恒温加热器上，于65℃恒温40分钟后，拧松所述螺丝(8)，并移除所述透明的微流控胶带，向所述中心孔(1)中加入矿物油，以将LAMP反应产物转移至所述第二反应微室中；
S3、拧紧所述螺丝(8)，并以透明的微流控胶带密封所述中心孔(1)以及所述试剂进口(7)，将所述微流控芯片置于恒温加热器上，于37℃恒温15分钟后，以470nm的蓝光照射所述微流控芯片，透过蓝光滤光片即可记录所产生的荧光，裸眼即可观察结果；
其中，当所述螺丝(8)被拧紧时，所述控制阀(9)在所述顶层芯片与所述底层芯片的挤压下发生形变，进而封堵所述第二连接通道(42)与所述第三连接通道(43)的连通口；当所述螺丝(8)被拧松时，所述控制阀(9)的形状复原，从而所述第二连接通道(42)与所述第三连接通道(43)的连通恢复；
其中，所述LAMP反应体系包括：
其中，所述CRISPR/Cas12a反应体系包括：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一逶迤通道(2)的长度为35.0mm-40.0mm，宽度为0.1mm-0.4mm，深度为0.1mm-0.4mm，体积为1.0μL-2.0μL；
所述第一反应微室(3)的长度为3.0mm-9.0mm，宽度为1.0mm-4.0mm，深度为0.1mm-1.0mm，体积为3.0μL-9.0μL；
所述第一连接通道(41)、所述第二连接通道(42)、所述第三连接通道(43)以及所述第二逶迤通道(5)的总长度为20.0mm-30.0mm，宽度均为0.1mm-0.4mm，深度均为0.1mm-0.4mm，总体积为0.5μL-1.5μL；
所述第二反应微室(6)的长度为3.0mm-9.0mm，宽度为1.0mm-4.0mm，深度为1.5mm-2.0mm，体积为20.0μL-25.0μL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，若干所述第一反应微室(3)包括：至少一个包被有SARS-CoV-2N基因LAMP反应引物的第一反应微室(31)、至少一个包被有SARS-CoV-2ORF1ab基因LAMP反应引物的第一反应微室(32)、至少一个包被有FluA H1N1基因LAMP反应引物的第一反应微室(33)、至少一个包被有FluA H3N2基因LAMP反应引物的第一反应微室(34)、至少一个包被有FluB基因LAMP反应引物的第一反应微室(35)以及至少一个不包被任何LAMP反应引物的第一反应微室(36)。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述顶层芯片还包括：若干气孔(11)，每个所述气孔(11)开设于所述第三连接通道(43)与所述第二逶迤通道(5)的连通处。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SARS-CoV-2N基因的F3引物如SEQ ID NO：1所示，B3引物如SEQ ID NO：2所示，FIP引物如SEQ ID NO：3所示，BIP引物如SEQ ID NO：4所示，LF引物如SEQ ID NO：5所示，LB引物如SEQ ID NO：6所示；
SARS-CoV-2ORF1ab基因的F3引物如SEQ ID NO：7所示，B3引物如SEQ ID NO：8所示，FIP引物如SEQ ID NO：9所示，BIP引物如SEQ ID NO：10所示，LB引物如SEQ ID NO：11所示；
FluA H1N1基因的F3引物如SEQ ID NO：12所示，B3引物如SEQ ID NO：13所示，FIP引物如SEQ ID NO：14所示，BIP引物如SEQ ID NO：15所示，LB引物如SEQ ID NO：16所示；
FluA H3N2基因的F3引物如SEQ ID NO：17所示，B3引物如SEQ ID NO：18所示，FIP引物如SEQ ID NO：19所示，BIP引物如SEQ ID NO：20所示，LF引物如SEQ ID NO：21所示，LB引物如SEQ ID NO：22所示；
FluB基因的F3引物如SEQ ID NO：23所示，B3引物如SEQ ID NO：24所示，FIP引物如SEQID NO：25所示，BIP引物如SEQ ID NO：26所示，LB引物如SEQ ID NO：27所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SARS-CoV-2N基因的crRNA如SEQ ID NO：28所示；SARS-CoV-2ORF1ab基因的crRNA如SEQ ID NO：29所示；FluA H1N1基因的crRNA如SEQID NO：30所示；FluA H3N2基因的crRNA如SEQ ID NO：31所示；FluB基因的crRNA如SEQ IDNO：32所示。
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