CN114632188A - 带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架及其制备方法和应用，其中方法包括以下步骤：选取生物组织中的带血管蒂的脂肪组织；将肝素生理盐水用针头注入带血管蒂的脂肪组织；用PBS缓冲液冲洗；将冲洗后的带血管蒂的脂肪组织注入灌注式生物反应器；将十二烷基硫酸钠溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织；用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织以去除十二烷基硫酸钠；用聚乙二醇辛基苯基醚溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织；用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织以去除残存溶液，获得带血管蒂脱细胞支架。本发明的技术方案克服了目前常用的脱细胞方法中没有一种适用于所有脱细胞材料的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架及其制备方法和应用。
背景技术
再生医学和组织工程是近年来整形外科领域的热点之一，它利用细胞、生长因子、天然或合成的生物材料等潜在地修复病变或受损的组织器官，实现再生和重塑，是一种有前途的治疗手段。干细胞注射是组织或器官的再生方法之一，作为一种自体治疗，它避免了排斥或免疫抑制等问题。此外，一些生物材料，如天然纤维素、壳聚糖、海藻酸钠；合成聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)，可用作组织工程的支架、递送***和生物替代品，以加速愈合或替代组织器官。然而，尽管再生医学领域取得了长足的进步，但大多数技术方法仍不能完全满足构建具有生物性、结构性和功能性的再生组织器官的要求。
脱细胞技术通过化学、物理、生物或几种方法的组合去除可能引起宿主免疫反应的细胞抗原，最终获得脱细胞支架。同时，这种脱细胞支架还保留了完整的血管网络和维持正常组织的基质成分，形成一种由胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹力蛋白组成的三维支架结构，可以模拟组织微环境的生物、化学和力学特性，有利于血管网络的重建，弥补上述的限制。
目前常用的脱细胞方法主要包括去污剂、超临界流体、酶消化、反复冻融等，然而，由于不同组织具有不同的细胞构成和体积密度，没有一种适用于所有脱细胞材料的脱细胞方法。理想的脱细胞方法是在有效去除所有细胞物质的情况下，最大限度地减少对细胞外基质的组成、生物活性、表面拓扑和机械完整性的任何不利影响。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术或相关技术中存在的技术问题之一。
为此，本发明的目的在于提供一种带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架及其制备方法和应用，其能够在有效去除所有细胞物质的情况下，最大限度地减少对细胞外基质的组成、生物活性、表面拓扑和机械完整性的任何不利影响。
为实现上述目的，本发明第一方面的技术方案提供了一种带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，包括以下步骤：选取生物组织中的带血管蒂的脂肪组织；将肝素生理盐水用针头注入带血管蒂的脂肪组织至少一次；用PBS缓冲液冲洗至少一次；将冲洗后的带血管蒂的脂肪组织直接连接到灌注式生物反应器，利用灌注式生物反应器模拟生物组织间液流动所产生的的力学环境；将十二烷基硫酸钠溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织；用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织以去除十二烷基硫酸钠；用聚乙二醇辛基苯基醚溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织块；用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织块以去除残存溶液，获得带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架。
在上述技术方案中，优选地，将肝素生理盐水用针头注入带血管蒂的脂肪组织2-3次。
在上述任一技术方案中，优选地，将0.5％的十二烷基硫酸钠溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织72h，恒定流速为61.45ul/分钟，压力为60mmHg-80mmHg。
在上述任一技术方案中，优选地，用去离子水灌注1h以去除带血管蒂的脂肪组织中的十二烷基硫酸钠。
在上述任一技术方案中，优选地，用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织24h以去除残存溶液。
在上述任一技术方案中，优选地，用1％聚乙二醇辛基苯基醚溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织2h。
在上述任一技术方案中，优选地，生物组织为500g-600g雄性SD大鼠麻醉后，取大鼠腹股沟区带血管蒂的脂肪筋膜瓣、且不含皮肤组织。
在上述任一技术方案中，优选地，血管蒂来自腹壁浅动脉。
在上述技术方案中，优选地，生物组织中的带血管蒂的脂肪组织为人体组织中的带血管蒂的脂肪组织。
本发明第二方面的技术方案提供了一种带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架，带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架采用如本发明第一方面中任一技术方案提供的制备方法制成。
本发明第三方面的技术方案提供了采用如本发明第一方面中任一技术方案提供的制备方法制备带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的应用，带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架用于肝脏组织、肺脏组织或肾脏组织的的再生或重建。
本发明的技术效果如下：
1、能够完全满足生物特性、结构特性和功能特性的再生组织器官的要求，可用作组织工程的支架、递送***和生物替代品，以加速愈合或替代组织器官；
2、该带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架在有效去除可能引起宿主免疫反应的细胞抗原的前提下，保留了完整的血管网络和维持正常组织的基质成分，形成一种由胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹力蛋白组成的三维支架结构，可以模拟组织微环境的生物、化学和力学特性，有利于血管网络的重建；
3、本发明的制备方法克服了目前常用的脱细胞方法中由于不同组织具有不同的细胞构成和体积密度，没有一种适用于所有脱细胞材料的问题；该带血管蒂脱细胞支架在有效去除所有细胞物质的情况下，最大限度地减少对细胞外基质的组成、生物活性、表面拓扑和机械完整性的任何不利影响。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1示出了本发明实施例所涉及制备方法的流程框图；
图2示出了本发明实施例所涉及脂肪组织和脱细胞支架的外观对比图；
图3示出了本发明实施例所涉及脂肪组织和脱细胞支架的染色对比图；
图4示出了本发明实施例所涉及脂肪组织和脱细胞支架的免疫组织化学染色对比图；
图5示出了本发明实施例所涉及脂肪组织和脱细胞支架的DNA含量对比图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不限于下面公开的具体实施例的限制。
下面参照图1至图5描述根据本发明一些实施例的种带血管蒂脱细胞支架及其制备方法和应用。
如图1所示，按照本发明一个实施例的带血管蒂脱细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
S1，选取生物组织中的带血管蒂的脂肪组织；
S2，将肝素生理盐水用针头注入带血管蒂的脂肪组织至少一次；
S3，用PBS缓冲液冲洗至少一次；
S4，将冲洗后的带血管蒂的脂肪组织注入灌注式生物反应器，利用灌注式生物反应器模拟生物组织间液流动所产生的的力学环境；
S5，将十二烷基硫酸钠溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织；
S6，用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织以去除十二烷基硫酸钠；
S7，用聚乙二醇辛基苯基醚溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织；
S8，用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织以去除残存溶液，获得带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架。
在上述实施例中，优选地，将肝素生理盐水用针头注入带血管蒂的脂肪组织2-3次。
在上述任一实施例中，优选地，将0.5％的十二烷基硫酸钠溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织72h，恒定流速为61.45ul/分钟，压力为60mmHg-80mmHg。
在上述任一实施例中，优选地，用去离子水灌注1h以去除带血管蒂的脂肪组织中的十二烷基硫酸钠。
在上述任一实施例中，优选地，用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织24h以去除残存溶液。
在上述任一实施例中，优选地，用1％聚乙二醇辛基苯基醚溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织2h。
在上述任一实施例中，优选地，生物组织为500g-600g雄性SD大鼠麻醉后，取大鼠腹股沟区带血管蒂的脂肪筋膜瓣、且不含皮肤组织。
在上述任一实施例中，优选地，血管蒂来自腹壁浅动脉。
在上述实施例中，优选地，生物组织中的带血管蒂的脂肪组织为人体组织中的带血管蒂的脂肪组织。
按照本发明另一个实施例的带血管蒂脱细胞支架，带血管蒂脱细胞支架采用如本发明上述任一实施例提供的制备方法制成。
按照本发明第三个实施例的采用如本发明上述任一实施例提供的制备方法制备带血管蒂脱细胞支架的应用，带血管蒂脱细胞支架用于肝脏组织、肺脏组织或肾脏组织的的再生或重建。
带血管蒂脱细胞支架的鉴定
1、大体观察
大体观察脂肪组织去细胞前后形状、质地、颜色等外观变化。
如图2所示，脂肪组织质地柔软，脱去细胞后，基质呈乳白色，外形基本不变，结构疏松。
2、组织学观察
取脂肪组织及制备的脱细胞基质支架，4％多聚甲醛固定24h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，进行HE染色、Masson染色以及Alcian blue染色，光镜下观察脂肪组织脱细胞效果与支架组织结构。
如图3所示，脂肪组织脱细胞处理前，HE染色可见蓝染的脂肪细胞核并且细胞结构完整、网状排列，还可见粉红色基质蛋白成分；Masson染色可见红染细胞核及蓝染的细胞外胶原纤维结构；脱细胞支架HE染色未见蓝染细胞核，无明显细胞结构，可见粉红色基质蛋白；脱细胞支架Masson染色可见蓝染胶原纤维，未见明显的红染细胞核，脱细胞完全。脱细胞支架Alcian blue染色可见蓝绿色糖胺聚糖保留。
3、免疫组织化学染色观察
同法制备切片，脱蜡，加入一抗以及生物素标记的二抗，DAB显色，苏木素复染，封片，光镜下观察染色结果，检测Ⅰ、Ⅳ型胶原及层粘连蛋白含量。
如图4所示，脱细胞后支架材料Ⅰ、Ⅳ型胶原(COLⅠ、COLⅣ)、层粘连蛋白(Lamin)免疫组化染色均成棕黄色阳性结果，表明脱细胞后保留了脂肪组织原本的Ⅰ、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白。
4、DNA残留检测
脱细胞支架冷冻干燥后，按DNA提取试剂盒的说明步骤提取脱细胞支架中的DNA，再用Nanodrop测量DNA浓度，最终算得DNA含量。
如图5所示，脂肪组织(Native)与脱细胞支架(Decellularized)DNA含量存在显著性的差异，且脱细胞组织DNA含量均值为22.55ng/mg小于50ng/mg这一标准，表明脱细胞效果较好。
本发明的技术效果如下：
1、能够完全满足生物特性、结构特性和功能特性的再生组织器官的要求，可用作组织工程的支架、递送***和生物替代品，以加速愈合或替代组织器官；
2、该带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架在有效去除可能引起宿主免疫反应的细胞抗原的前提下，保留了完整的血管网络和维持正常组织的基质成分，形成一种由胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹力蛋白组成的三维支架结构，可以模拟组织微环境的生物、化学和力学特性，有利于血管网络的重建，为未来组织工程再细胞化，利用该模型体外构建肝脏，肺脏，肾脏等器官打下良好的基础。
3、本发明的制备方法克服了目前常用的脱细胞方法中由于不同组织具有不同的细胞构成和体积密度，没有一种适用于所有脱细胞材料的脱细胞方法的问题；该带血管蒂脱细胞支架在有效去除所有细胞物质的情况下，最大限度地减少对细胞外基质的组成、生物活性、表面拓扑和机械完整性的任何不利影响。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
选取生物组织中的带血管蒂的脂肪组织；
将肝素生理盐水用针头注入带血管蒂的脂肪组织至少一次；
用PBS缓冲液冲洗至少一次；
将冲洗后的带血管蒂的脂肪组织连接到灌注式生物反应器，利用灌注式生物反应器模拟生物组织间液流动所产生的的力学环境；
将十二烷基硫酸钠溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织；
用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织以去除十二烷基硫酸钠；
用聚乙二醇辛基苯基醚溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织块；
用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织以去除残存溶液，获得所述带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架。
2.根据权利要求1所述的带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于：将肝素生理盐水用针头注入带血管蒂的脂肪组织2-3次。
3.根据权利要求1或2所述的带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于：将0.5％的十二烷基硫酸钠溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织72h，恒定流速为61.45ul/分钟，压力为60mmHg-80mmHg。
4.根据权利要求1或2所述的带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于：用去离子水灌注1h以去除带血管蒂的脂肪组织中的十二烷基硫酸钠；和/或用去离子水灌注带血管蒂的脂肪组织24h以去除残存溶液。
5.根据权利要求1或2所述的带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于：用1％聚乙二醇辛基苯基醚溶液通过灌注式生物反应器中的血管通路注入带血管蒂的脂肪组织2h。
6.根据权利要求1或2所述的带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于：所述生物组织为500g-600g雄性SD大鼠麻醉后，取大鼠腹股沟区带血管蒂的脂肪筋膜瓣、且不含皮肤组织。
7.根据权利要求6所述的带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于：所述血管蒂来自腹壁浅动脉。
8.根据权利要求1或2所述的带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架的制备方法，其特征在于：所述生物组织中的带血管蒂的脂肪组织为人体组织中的带血管蒂的脂肪组织。
9.一种带血管蒂脂肪组织块脱细胞支架，其特征在于，所述带血管蒂脂肪组织脱细胞支架采用如权利要求1至8中任一项所述制备方法制成。
10.一种权利要求1至8中任一项制备方法制备带血管蒂脂肪组织脱细胞支架的应用，其特征在于，所述带血管蒂脂肪组织脱细胞支架用于肝脏组织、肺脏组织或肾脏组织的的再生或重建。
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