CN114621962A - 花生AhBI-1基因VIGS沉默体系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于沉默花生AhBI‑1基因的基因特异性片段，并构建了相应VIGS病毒载体和VIGS沉默体系。本发明通过构建含有AhBI‑1基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体质粒，农杆菌介导法转化花生，诱导花生内源AhBI‑1基因发生沉默，有效降低了花生AhBI‑1基因的表达水平，致使花生产生矮化表型。发明人通过VIGS沉默技术对花生进行侵染，建立了pTRV‑VIGS沉默花生内源基因从而鉴定基因功能的体系，具有快速，高通量，易于操作的优势，为开展花生基因功能研究提供了新途径和技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种花生AhBI-1基因VIGS沉默体系。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，随着病毒的复制和转录而特异性的诱导序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修饰，从而引起植物内源基因沉默、引起表型或生理指标变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。VIGS是根据植物对RNA病毒防御机制发展起来的一种用以表征植物基因功能的基因转录技术，其内在的分子基础可能是转录后基因沉默(post-transcriptgene silence)。与传统的基因功能分析方法相比，VIGS能够在侵染植物当代对目标基因进行沉默和功能分析；无需开发稳定的转化子，并且具有沉默单个或多个基因家族成员的潜力。
花生是世界五大油料作物之一，是食用、榨油兼用的经济作物，是人们生活所需的植物脂肪和蛋白质来源，同时在世界农业生产和贸易中占有重要地位。亚洲是最重要花生种植地区，种植面积占世界总面积的63.4％，我国又是仅此于印度的花生生产国。但在目前的生产工作中，关于花生基因组学功能研究技术手段还非常有限，获取转基因材料的方法较为稀少且较难成功。农杆菌转化法是目前植物基因工程研究中最常用的方法，具有费用低、导入基因拷贝数低等优点。花生属于双子叶植物，是农杆菌的天然宿主之一，且为自花授粉的，虽然近年来花生的遗传转化取得了一定进展，但目前所构建的花生遗传转化体系存在转化周期长、转化效率低等问题，因此一种高效、快速的遗传转化方法是研究花生基因功能的重要技术突破。
已有报道和前期研究表明，花生AhBI-1基因(全长核苷酸序列见序列表SEQ.ID.NO.1)与花生发生细胞程序性死亡相关，系抑制花生细胞程序性死亡的调控基因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种花生AhBI-1基因VIGS沉默体系，为花生功能基因组学研究提供技术支撑。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
用于沉默花生AhBI-1基因的基因特异性片段，为AhBI-1vigs，它具有序列表SEQ.ID.NO.2的碱基序列。
沉默花生AhBI-1基因的VIGS病毒载体，为含有上述基因特异性片段的pTRV2载体。
上述沉默花生AhBI-1基因的VIGS病毒载体，为重组病毒载体pTRV2-AhBI-1vigs，它由上述基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中构建获得。
花生AhBI-1基因VIGS沉默体系，包括上述基因特异性片段和VIGS病毒载体。
上述花生AhBI-1基因VIGS沉默体系的构建方法，主要包括以下步骤：
(一)载体的构建
(二)农杆菌转化
(三)侵染花生材料。
步骤(一)按以下进行：
(1)从花生cDNA中扩增出AhBI-1基因全长序列，从AhBI-1基因全长序列中扩增出特异性片段AhBI-1vigs；
(2)提取pTRV2质粒，选择BamHI和EcoRI酶切位点，双酶切载体质粒，运用同源重组的方法连接目的片段及线性化的pTRV2载体；
(3)转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定阳性。
步骤(二)按以下进行：通过冻融法将构建完成的pTRV2-AhBI-1vigs重组质粒转化进农杆菌GV3101感受态细胞；而后接种到含相应抗性的LB固体培养基，挑取单克隆菌落，PCR鉴定阳性。
步骤(三)按以下进行：将pTRV2、pTRV2-AhBI-1vigs、pTRV2-AhPDSvigs重悬菌液分别和PTRV1重悬菌液等体积轻柔混合，室温孵育3-5h；花生种子刚出现第三片真叶时，实施侵染工作，注射预培养花生下表皮叶片，侵染面积至少达到叶片面积的75％以上；暗培养36-48h，之后正常光照培养，观察植株叶片表型变化，大概两周阳性对照会出现不同程度的黄叶现象，此时取新叶检测AhBI-1的表达情况，即构建得到花生AhBI-1基因沉默体系。
上述基因特异性片段、VIGS病毒载体、VIGS沉默体系在沉默花生AhBI-1基因中的应用。
在前期研究的基础上，发明人设计了用于沉默花生AhBI-1基因的基因特异性片段，并构建了相应VIGS病毒载体和VIGS沉默体系。本发明通过构建含有AhBI-1基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体质粒，农杆菌介导法转化花生，诱导花生内源AhBI-1基因发生沉默，有效降低了花生AhBI-1基因的表达水平，致使花生产生矮化表型。发明人通过VIGS沉默技术对花生进行侵染，建立了pTRV-VIGS沉默花生内源基因从而鉴定基因功能的体系，具有快速，高通量，易于操作的优势，为开展花生基因功能研究提供了新途径和技术支撑。
附图说明
图1是AhBI-1基因扩增的电泳结果图，图中：Marker为2000bp，1和2都是从花生根尖cDNA扩增出的目的片段。
图2是农杆菌介导的花粉管通道法转化花生操作示意图，图中：A注射选择花生叶片下表皮；B使用不带针管的1mL注射器进行接触注射；C已注射进入叶片的花生下表皮侵染状态。
图3是VIGS侵染两周后花生生长表型观察图，图中：CK是中花2号野生型，AhPDS阳性是花生阳性对照pTRV2-AhPDSvigs出现黄叶表型，AhBI-1是花生pTRV2-AhBI-1vigs植株。
图4是取样检测时花生的表型观察图，图中：WT为中花2号野生型，pTRV2-空载是不含目的基因只将pTRV2空载转进花生中的植株，pTRV2-AhPDSvigs是花生沉默AhPDS基因的阳性对照植株，pTRV2-AhBI-1vigs是花生中沉默AhBI-1的实验植株。
图5是AhBI-1基因表达量检测结果图，图中：CK是中花2号正常培养，pTRV2-空载是不含目的基因只将pTRV2空载转进花生中的植株，1-24是AhBI-1侵染处理的花生。(*表示在检验水平0.05表达显著，abc代表显著性分析)
具体实施方式
下述实施例中：如无特殊说明，实施方法均为常规方法；所用的材料均为自常规生化试剂商店购买得到的；实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量；其中定量试验均设置三次重复实验，结果取平均值。实验所涉及的引物如表1：
表1引物列表
实施例1阳性菌液的获得
1、花生根尖/叶片RNA的提取
RNA提取方法参照普洛麦格(上海)生物产品有限公司的普通RNA提取试剂盒说明书。操作步骤如下：
(1)准备专用枪头和离心管，研钵、研钵棒和药匙等器具，200℃高温灭菌4h。
(2)研钵使用前先使用液氮预冷，将样品约0.2g置于已预冷完全的研钵中，加入足量液氮，使用研钵棒轻轻挤压样品，待液氮还有少量剩余时，迅速研磨样品至细粉末状，重复1-2次(研磨样品时，不要让液氮挥发干净，以防止RNA降解)。
(3)研磨后的样品粉末转至预冷的离心管中，加入500μL裂解液，吹打混匀，加入500μL稀释液，吹打混匀，室温静置5min。
(4)12,000rpm离心5min，吸取上清，移至新1.5mL离心管中，加入500μL无水乙醇，吹打匀混；过柱，12,000rpm离心45sec(样品量较多时可分量多次过柱)。
(5)加入600μL洗脱液，12,000rpm，4℃离心45sec。
(6)加入50μL孵育液(无核酸酶水：40μL，DNA酶I：5μL，10×DNA酶I缓冲液：5μL)，室温孵育15min。
(7)加入600μL洗脱液，12,000rpm，4℃离心45sec。
(8)重复洗脱一次，空转2min。
(9)将离心柱重新安置于新的洗脱管中，加入40μL无核酸酶水，室温静置2min，12,000rpm，离心1min。
(10)重新将洗脱液加入离心柱中洗脱一次，测定浓度。
2、cDNA的合成
根据诺唯赞生物科技公司
III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒说明书，操作进行反转录，获得cDNA，步骤如下：
(1)将RNA模版、5×HiScriptⅢqRT SuperMix、4×gDNA Wiper和RNase-FreeddH2O溶解，放置于冰盒内备用。
按以下表2配制反应体系：
表2反应体系
用移液枪轻轻吹打混匀。42℃，2min。
(2)在第一步的反应管中直接加入5×HiScriptⅢqRT SuperMix
表3第一步反应体系
用移液枪轻轻吹打混匀，按下列条件进行反转录。
表4反转录程序
3、pTRV2-AhBI-1vigs表达载体的构建
根据基因序列信息设计特异性引物(pTRV2-AhBI-1R/F及pTRV2-AhBI-1vigs R/F)，以花生cDNA为模板，扩增目的片段(见序列表SEQ.ID.NO.2)，反应体系如下表5，PCR反应程序参照2×
Max Master Mix(Dye Plus)说明书。
表5 PCR反应体系(总体积20μL)
反应程序如下：
PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测后，通过DNA纯化回收试剂盒对目的基因片段进行纯化回收，并测定目的基因片段浓度。
提取pTRV2质粒，选择BamHI和EcoRI酶切位点，设计特异性引物并增加合适长度的同源臂序列，双酶切载体质粒；运用同源重组的方法连接目的片段及线性化的pTRV2载体。
转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定阳性。
4、重组质粒转化GV3101感受态
(一)GV3101感受态细胞的制备
(1)取-80℃保存的GV3101菌种在冰盒中融化，在含抗性(Rif：25mg/L；Str：25mg/L)的YFP平板上划线，28℃恒温培养箱中2-3d见单菌落。
(2)挑单菌落，接种于5mL YFP液体培养基中(Rif：25mg/L；Str：25mg/L)，28℃/180rpm，振荡培养过夜。
(3)按1：50接种于新的100mL抗性(Rif：25mg/L；Str：25mg/L)YEP液体培养基，培养至OD600为0.5。
(4)培养完成后的菌液冰浴30min，同时预冷制备感受态所需的试剂和材料(离心管、EP管、枪头等)。
(5)超净台中分装菌液至50mL离心管中，4℃/5000rpm，离心10min，弃上清。
(6)尽量吸除残留液体后，加入预冷的20mM CaCl2(含10％甘油)轻柔重悬，4℃/5000rpm离心10min，弃上清。
(6)加入适量20mM CaCl2(含10％甘油)重悬菌体，分装200μL每管，镊子竖直放入液氮中速冻，-80℃保存备用。
(二)转化GV3101感受态细胞
(1)在冰上解冻克隆感受态细胞(DH5αCompetent cell)。
(2)取10μL重组产物加入到呈液态状的100μL感受态细胞中，轻轻搅匀(勿振荡混匀)，冰上静置30min。
(3)42℃水浴热激60sec后，立即置于冰上冷却3-5min。
(4)加入900μL液体LB培养基(无抗生素)，37℃复苏1h(转速200rpm)。
(5)同时，将相应抗性(卡纳霉素(Kana)：100ug/ml+利福平(Rif)：25ug/ml+链霉素(Str)：25ug/ml)的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热。
(6)移液器吹打使菌体重悬，取100μL重悬菌液用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀，密封平板并做标记。
(7)37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。
(8)挑取转化板上长势一致的单菌落进行菌液PCR鉴定，保存阳性克隆菌液(50％甘油1:1保存)反应体系如下表6。
表6 PCR反应体系(总体积10μL)
将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，选择条带正确的菌液进行送测并进行序列比对，序列正确进行后续实验。
结果：成功获得含目的基因的阳性菌液。
实施例2农杆菌介导的花粉管通道法转化花生
1、注射
选取颗粒饱满的花生种子(品种：中花2号)剥壳后于湿润的珍珠岩中26±2℃黑暗条件下催芽3-4d，待种子萌发后将其种皮剥除，转移至改良Hoagland培养液中水培3-4d，培养条件为26±2℃、光照30–50μmol m-2s-1、光照周期16h/8h，刚出现第三片真叶时，实施侵染工作。
配制新鲜侵染液(pTRV1、pTRV2、pTRV2-AhBI-1vigs、pTRV2-AhPDSvigs)
(1)培养菌液(pTRV1、pTRV2、pTRV2-AhBI-1vigs、pTRV2-AhPDSvigs)：取新鲜菌液(PCR已鉴定阳性)分别在200mL LB液体培养基(含Kana：100μg/mL，Rif：25μg/mL，Str：25μg/mL)中培养(28℃，200rpm)过夜，使OD600达到0.8-1.0左右；
(2)5000rpm离心10min，收集菌体；
(3)用少量LB液体洗涤菌体，再次离心；
(4)用LB液体培养基(含10mM MES(2-吗啉乙磺酸)、10mM MgCl2(氯化镁)和100ΜmAS(乙酰丁香酮)重悬菌体，使OD600达到1.0左右。
将菌液重悬，将重悬菌液分别和PTRV1重悬菌液等体积轻柔混合，室温孵育3-5h。选择在清晨注射预培养花生下表皮叶片，侵染面积至少达到叶片面积的75％以上。暗培养36-48h，之后正常光照培养，观察植株叶片表型变化，大概两周阳性对照会出现不同程度的黄叶现象，此时取新叶检测AhBI-1的表达情况，即构建得到花生AhBI-1基因沉默体系。
2、阳性植株的验证
注射后两周左右当观察到阳性对照出现黄叶现象时，取新叶检测AhBI-1的表达情况。提取新叶的RNA，反转录为cDNA，进行荧光定量测定AhBI-1的表达量，主要使用ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)来进行qPCR(引物：qAhBI-1R/F)。具体反应体系见下表7，反应程序见下表8。
表7 qPCR反应体系(总体积20μL)
表8 qPCR反应体系(总体积20μL)
具体退火温度以及所需延伸时间参照各基因的具体信息进行调整设置。设置三次生物学重复，数据处理采用2-ΔΔCt法进行计算。
结果：成功筛选获得含目的基因的花生植株，阳性率转化率为62.5％，生长表型差异显著，可用于该基因的相关功能的后续研究。
序列表
<110> 广西大学
<120> 花生AhBI-1基因VIGS沉默体系
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggattctt ttacttcgtt cttcgattct tcccgaaccc gctggagcta cgatgctctc 60
aagaacttcc atcagatctc tcccgtagtt cagaatcatc tcaagcaggt ttattttacg 120
ctatgttgcg ctgtggttgc ttcagctgtt ggtgcttacc ttcatgtgct gtggaatatt 180
ggaggtctac tcactgcttt ggcttccatt ggaagctatg tgtggttgat gtccacacct 240
ccttttgaag agcaaaagag ggttactttg ttgatggttt cggccctgtt tcaaggtgcc 300
tacattggac ctcttattga tctggctatt caagttgaac caagccttat ctttactgcg 360
tttgtgggaa cttccttggc cttcgcatgt ttctcagcgg cagctttggt tgcaaagcgt 420
agggagtacc tctaccttgg cggcatgctt tcttctgggt tgtctcttct tatgtggctg 480
catttcgctt cctccatctt tggtggttcg atagcacttt ttaagtttga gttgtatttt 540
ggactcttgg tatttgtggg ttacgtgatc gtagataccc aagaaataat tgagagggca 600
cactttggtg atctagatta tgtgaagcat gccatgactc tgtttactga tttggctgca 660
atctttgtgc ggattcttgt tataatgttg aagaattcgg ttgagaaaaa tgagaaaaag 720
aacaagagga gagagtga 738
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggattctt ttacttcgtt cttcgattct tcccgaaccc gctggagcta cgatgctctc 60
aagaacttcc atcagatctc tcccgtagtt cagaatcatc tcaagcaggt ttattttacg 120
ctatgttgcg ctgtggttgc ttcagctgtt ggtgcttacc ttcatgtgct gtggaatatt 180
ggaggtctac tcactgcttt ggcttccatt ggaagctatg tgtggttgat gtccacacct 240
ccttttgaag agcaaaagag ggttactttg ttgatggttt cggccctgtt tcaaggtgcc 300
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcttgacc atggtagatc tatggattct tttacttcgt tcttcg 46
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggaaattc gagctggtca cctcactctc tcctcttgtt ctttttctc 49
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgagtaagg ttaccgaatt catggattct tttacttcgt tcttcg 46
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggaggcctt ctagagaatt cggcaccttg aaacagggcc 40
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggaggtcta ctcactgct 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagataaggc ttggttca 18
Claims (9)
1.一种用于沉默花生AhBI-1基因的基因特异性片段，其特征在于为AhBI-1vigs，它具有序列表SEQ.ID.NO.2的碱基序列。
2.一种沉默花生AhBI-1基因的VIGS病毒载体，其特征在于为含有权利要求1所述基因特异性片段的pTRV2载体。
3.权利要求2所述沉默花生AhBI-1基因的VIGS病毒载体，其特征在于为重组病毒载体pTRV2-AhBI-1vigs，它由权利要求1所述基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中构建获得。
4.一种花生AhBI-1基因VIGS沉默体系，其特征在于包括权利要求所述的基因特异性片段和权利要求2所述的VIGS病毒载体。
5.权利要求3所述花生AhBI-1基因VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤：
(一)载体的构建
(二)农杆菌转化
(三)侵染花生材料。
6.根据权利要求5所述的花生AhBI-1基因VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(一)按以下进行：
(1)从花生cDNA中扩增出AhBI-1基因全长序列，从AhBI-1基因全长序列中扩增出特异性片段AhBI-1vigs；
(2)提取pTRV2质粒，选择BamHI和EcoRI酶切位点，双酶切载体质粒，运用同源重组的方法连接目的片段及线性化的pTRV2载体；
(3)转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定阳性。
7.根据权利要求5所述的花生AhBI-1基因VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(二)按以下进行：通过冻融法将构建完成的pTRV2-AhBI-1vigs重组质粒转化进农杆菌GV3101感受态细胞；而后接种到含相应抗性的LB固体培养基，挑取单克隆菌落，PCR鉴定阳性。
8.根据权利要求5所述的花生AhBI-1基因VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(三)按以下进行：将pTRV2、pTRV2-AhBI-1vigs、pTRV2-AhPDSvigs重悬菌液分别和PTRV1重悬菌液等体积轻柔混合，室温孵育3-5h；花生种子刚出现第三片真叶时，实施侵染工作，注射预培养花生下表皮叶片，侵染面积至少达到叶片面积的75％以上；暗培养36-48h，之后正常光照培养，观察植株叶片表型变化，大概两周阳性对照会出现不同程度的黄叶现象，此时取新叶检测AhBI-1的表达情况，即构建得到花生AhBI-1基因沉默体系。
9.权利要求1所述的基因特异性片段、权利要求2所述的VIGS病毒载体、权利要求3所述的VIGS沉默体系在沉默花生AhBI-1基因中的应用。
Priority Applications (1)
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Family
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1419541A (zh) * | 2000-03-27 | 2003-05-21 | 应用研究***Ars股份公司 | 作为bax抑制剂的药物活性的吡咯烷衍生物 |
| DE102004024184A1 (de) * | 2004-05-13 | 2006-01-26 | Basf Plant Science Gmbh | Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen |
| WO2011084718A1 (en) * | 2009-12-17 | 2011-07-14 | The Curators Of The University Of Missouri | Plant genes associated with seed oil content and methods of their use |
| US20120072124A1 (en) * | 2005-12-15 | 2012-03-22 | Rosetta Inpharmatics, Llc | Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof |
| CN102660555A (zh) * | 2012-05-03 | 2012-09-12 | 广西大学 | 调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列与应用 |
| CN102892890A (zh) * | 2010-03-18 | 2013-01-23 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| CN102939383A (zh) * | 2009-12-30 | 2013-02-20 | 先锋国际良种公司 | 用于靶向多核苷酸修饰的方法和组合物 |
| CN103740753A (zh) * | 2013-12-28 | 2014-04-23 | 杭州师范大学 | Bi-1基因在促进长春花细胞生长中的应用及方法 |
| CN111328287A (zh) * | 2017-07-04 | 2020-06-23 | 库瑞瓦格股份公司 | 新型核酸分子 |
| CN113736819A (zh) * | 2021-09-02 | 2021-12-03 | 浙江大学 | 一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法 |
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1419541A (zh) * | 2000-03-27 | 2003-05-21 | 应用研究***Ars股份公司 | 作为bax抑制剂的药物活性的吡咯烷衍生物 |
| DE102004024184A1 (de) * | 2004-05-13 | 2006-01-26 | Basf Plant Science Gmbh | Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen |
| US20120072124A1 (en) * | 2005-12-15 | 2012-03-22 | Rosetta Inpharmatics, Llc | Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof |
| WO2011084718A1 (en) * | 2009-12-17 | 2011-07-14 | The Curators Of The University Of Missouri | Plant genes associated with seed oil content and methods of their use |
| CN102939383A (zh) * | 2009-12-30 | 2013-02-20 | 先锋国际良种公司 | 用于靶向多核苷酸修饰的方法和组合物 |
| CN102892890A (zh) * | 2010-03-18 | 2013-01-23 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| CN102660555A (zh) * | 2012-05-03 | 2012-09-12 | 广西大学 | 调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列与应用 |
| CN103740753A (zh) * | 2013-12-28 | 2014-04-23 | 杭州师范大学 | Bi-1基因在促进长春花细胞生长中的应用及方法 |
| CN111328287A (zh) * | 2017-07-04 | 2020-06-23 | 库瑞瓦格股份公司 | 新型核酸分子 |
| CN113736819A (zh) * | 2021-09-02 | 2021-12-03 | 浙江大学 | 一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JINGXIA ZHANG等: "A novel VIGS methoed by agroinoculation of cotton seeds and application for elucidating functions of GhBI-1 in salt-stress response", PLANT CELL REP * |
| NCBI: "Predicted:Arachis hypogaea bax inhibitor 1(LOC112802210），mRNA", GENBANK DATABASE, pages 025845315 * |
| ZHOU MIN: "An efficient method for the production of transgenic peanut plants by pollen tube transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens", PLANT CELL, 27 March 2023 (2023-03-27) * |
| 罗锦等: "花生AhBI-1的克隆、生物信息学分析、亚细胞定位及其在铝胁迫下的表达分析", 分子植物育种, pages 4 * |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |