CN114621302A - 聚合性化合物、化合物、及硼烷磷酸酯低聚物的制造方法 - Google Patents

聚合性化合物、化合物、及硼烷磷酸酯低聚物的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供下述式A‑1或式A‑2所示的聚合性化合物。式A‑1或式A‑2中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R2表示氢原子、卤原子或‑ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，R3表示氢原子或羟基的保护基团，X表示式B‑1～式B‑5中的任意式所示的结构。
Figure DDA0003564624880000011

Description

聚合性化合物、化合物、及硼烷磷酸酯低聚物的制造方法
本申请是申请日为2017年11月9日，申请号为2017800701520，名称为“聚合性化合物、化合物、及硼烷磷酸酯低聚物的制造方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及聚合性化合物、化合物、及硼烷磷酸酯低聚物的制造方法。
背景技术
具有与靶核酸互补的碱基序列的反义分子可以形成与靶核酸互补的双链而抑制由靶核酸生成蛋白质。在作为靶核酸而选择了疾病相关基因的情况下，反义分子由于会直接作用于疾病相关基因，因此已作为对于基因治疗有效的药物而受到瞩目。
对于反义分子(核酸低聚物)，从有效抑制成为靶标的蛋白质的生成的观点出发，主要要求其具有细胞膜透过性、核酸酶抗性、在体内(例如，pH7.4的环境下)的化学稳定性、及仅与特定的碱基序列形成稳定的双链的性质。
作为反义分子，已知有例如：具有在核酸低聚物的磷酸二酯结构中至少有一部分替换为硫代磷酸酯键而成的结构的低聚物、具有在核酸低聚物的磷酸二酯结构中至少有一部分替换为硼烷磷酸酯结构而成的结构的低聚物(以下称为“硼烷磷酸酯低聚物”)等，迄今为止已有众多广泛的研究例，并且也已作为药物而付诸实用。
硼烷磷酸酯结构是指磷酸二酯结构中的非桥连氧原子中的一个被硼烷基(-BH3)取代而成的键。
硼烷磷酸酯低聚物具有下述优点：核酸酶抗性高，具有高RNAi(RNAinterference)活性，对RNA比对DNA具有更高的亲和性，对蛋白质的非特异性相互作用低，还能够应用于硼中子俘获疗法(BNCT)。
作为以往的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法，可列举在J.AM.Chem.Soc.1990,112,9000.、Tetrahedron Lett.1997,38,4957.、J.AM.Chem.Soc.1998,120,9417.、TetrahedronLett.1998,39,3899.、T.Angew.Chem.INt.Ed.2009,48,496-499、T.RSC Adv.2015,5,2392-2395、及Tetrahedron Lett.2012,53,4361-4364.中记载的方法。
发明内容
发明要解决的问题
就硼烷磷酸酯低聚物而言，由于磷原子是不对称中心，因此其含有性质相互不同的两种作为立体异构体(Rp体、Sp体)的单体单元。
因此，要求开发出立体选择性地合成这些异构体的方法。
在J.AM.Chem.Soc.1990,112,9000.、Tetrahedron Lett.1997,38,4957.、J.AM.Chem.Soc.1998,120,9417.、或Tetrahedron Lett.1998,39,3899.中记载的硼烷磷酸酯低聚物的合成法中，存在无法实现磷原子的立体控制这样的问题。
T.Angew.Chem.INt.Ed.2009,48,496-499、或T.RSC Adv.2015,5,2392-2395中记载的硼烷磷酸酯低聚物的合成法在能够实现对磷原子的立体控制这方面是有用的，但存在进行磷原子的硼化时，在被保护基团保护的碱基部会发生副反应这样的问题。
通过上述副反应，能够合成包含作为碱基仅具有胸腺嘧啶(T)结构或尿嘧啶(U)结构的核苷的硼烷磷酸酯低聚物，但难以合成出包含具有腺嘌呤(A)结构、胞嘧啶(C)结构、或鸟嘌呤(G)结构这样的具有氨基(-NH2)的碱基的核苷的硼烷磷酸酯低聚物。
在Tetrahedron Lett.2012,53,4361-4364.中记载的硼烷磷酸酯低聚物的合成法中，在酸性条件下，碱基部分的保护基团连同磷原子的不对称辅助基团一起被除去。
因此，能够在不引发上述硼化时的碱基部分的副反应的情况下，立体选择性地合成包含不只是具有胸腺嘧啶结构或尿嘧啶结构、还包括具有腺嘌呤结构、胞嘧啶结构、或鸟嘌呤结构这样的具有氨基的碱基的核苷的硼烷磷酸酯低聚物。
在本发明中，所述立体选择性地合成硼烷磷酸酯低聚物是指，对各个单体单元(磷酸二酯结构的非桥连氧原子中的一个被替换为硼烷基(-BH3)而成的核苷酸单元)进行控制而合成上述以磷原子为不对称中心的两种立体异构体(Rp体或Sp体)中的任意结构。
这里，在Tetrahedron Lett.2012,53,4361-4364.中记载的硼烷磷酸酯低聚物的合成法中，由于可实现在酸性条件下进行脱保护，因此上述不对称辅助基团具有叔碳原子，由不对称辅助基团引起的空间位阻大。
因此，存在聚合性化合物的反应性低、缩合反应的立体选择性也以例如1～2％的程度下降的问题。
由于上述问题点的存在，利用Tetrahedron Lett.2012,53,4361-4364.中涉及的硼烷磷酸酯低聚物的合成法，难以合成出例如10聚体以上这样的长链低聚物。
本发明人进行了深入研究，结果发现，本发明涉及的聚合性化合物的反应性高，无论核苷中的碱基是否具有氨基均能够实现低聚物(例如，硼烷磷酸酯低聚物)的立体选择性合成。
本发明涉及的单体不具有上述叔碳原子、空间位阻小，因此反应性高，能够合成出例如10聚体以上的长链低聚物，并且在酸性条件下可使碱基部分的保护基团连同磷原子的不对称辅助基团一起被除去，因此可认为，无论核苷中的碱基是否具有氨基，只要是例如DNA的合成，则能够立体选择性地合成出A、T、C、G这4种各碱基种类自由组合而成的硼烷磷酸酯低聚物。
另外，本发明涉及的化合物是硼烷磷酸酯低聚物的合成中间体，是新型的化合物。
进一步，利用本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法，能够合成出例如10聚体以上的长链低聚物，并且能够立体选择性地合成包含碱基具有氨基的核苷的聚合性化合物、与包含碱基不具有氨基的核苷的聚合性化合物自由组合而成的硼烷磷酸酯低聚物。
本发明的一个实施方式要解决的问题是提供反应性高、无论核苷中的碱基是否具有氨基均能够实现硼烷磷酸酯低聚物的立体选择性合成的聚合性化合物。
另外，本发明的另一实施方式要解决的问题在于提供新型的化合物。
此外，本发明的另外一个实施方式要解决的课题在于提供收率及立体选择性高、无论核苷中的碱基是否具有氨基均能够实现硼烷磷酸酯低聚物的立体选择性合成的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法。
解决问题的方法
解决上述问题的方法包括以下实施方式。
<1>
下述式A-1或式A-2所示的聚合性化合物。
[化学式1]
Figure BDA0003564624860000051
式A-1或式A-2中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，R3表示氢原子或羟基的保护基团，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构。
式B-1～式B-5中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RpC、RpA及RpG表示在酸性条件下被除去的保护基团，RpC2表示烷基，RpG2表示保护基团，RpG3表示在酸性条件下被除去的保护基团或氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
<2>
包含下述式T-1所示的结构单元及下述式D-1或D-2所示的结构单元的化合物。
[化学式2]
Figure BDA0003564624860000061
式T-1中，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，Z表示式B-6～式B-9中的任意式所示的结构，*及**表示与其它结构的结合部位。
式D-1或D-2中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，R3表示氢原子或羟基的保护基团，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构，TfO表示三氟甲磺酸阴离子，●表示与其它结构的结合部位。
式B-1～式B-5中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RpC、RpA及RpG表示在酸性条件下被除去的保护基团，RpC2表示烷基，RpG2表示保护基团，RpG3表示在酸性条件下被除去的保护基团或氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
式B-6～式B-9中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RC、RA及RG表示氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
<3>
<2>所述的化合物，其进一步包含下述式C-1或式C-2所示的结构单元中的任意一者或两者。
[化学式3]
Figure BDA0003564624860000071
式C-1或式C-2中，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，Z表示式B-6～式B-9中的任意式所示的结构，**及●表示与其它结构的结合部位。
式B-6～式B-9中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RC、RA及RG表示氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
<4>
硼烷磷酸酯低聚物的制造方法，其包括使<1>所述的聚合性化合物进行缩合的工序。
发明的效果
根据本发明的一个实施方式，可以提供反应性高、无论核苷中的碱基是否具有氨基均能够实现低聚物的立体选择性合成的聚合性化合物。
另外，根据本发明的另一实施方式，能够提供新型的化合物。
此外，根据本发明的另外一个实施方式，能够提供立体选择性及收率高、无论核苷中的碱基是否具有氨基均能够实现硼烷磷酸酯低聚物的立体选择性合成的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法。
附图说明
图1是示出了(A)(Rp)-TBT[(Rp)-24a]的合成反应液(粗)及(B)(Sp)-TBT[(Sp)-24a]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图2是示出了(C)(Rp)-dCBT[(Rp)-24b]的合成反应液(粗)及(D)(Sp)-dCBT[(Sp)-24b]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图3是示出了(E)(Rp)-dABT[(Rp)-24c]的合成反应液(粗)及(D)(Sp)-dABT[(Sp)-24c]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图4是示出了(G)(Rp)-dABT[(Rp)-24c]的合成反应液(粗)及(H)(Sp)-dABT[(Sp)-24c]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图5是示出了(I)(Rp)-dGBT[(Rp)-24d]的合成反应液(粗)及(J)(Sp)-dGBT[(Sp)-24d]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图6是示出了(K)all-(Rp)-d(CBABGBT)[25]的合成反应液(粗)及(L)all-(Sp)-d(CBABGBT)[26]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图7是示出了(M)all-(Rp)-d(CBABGBT)[25]的纯化物及(N)all-(Sp)-d(CBABGBT)[26]的纯化物的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图8是示出了(O)all-(Sp)-d(GBTB(ABCBTB)3T)[27]的合成反应液(粗)及(P)all-(Sp)-d(GBTB(ABCBTB)3T)[27]的纯化物的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
图9是示出了(Q)all-(Sp)-d(CBABGBTB)2(CBABGB)T[28]的合成反应液(粗)及(R)all-(Rp)-d(CBABGBTB)2(CBABGB)T[29]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
具体实施方式
以下，针对本发明进行详细说明。
需要说明的是，在本说明书中，“xx～yy”的记载表示包括xx及yy在内的数值范围。
另外，在本发明中，“质量％”与“重量％”同义，“质量份”与“重量份”同义。
另外，在本发明中，两种以上优选实施方式的组合是更优选的实施方式。
在本说明书中，关于由式表示的化合物中的基团的记载，在没有记载取代或无取代的情况下、上述基团能够进一步具有取代基的情况下，只要没有另外的特别说明，则不仅包括无取代的基团、也包括具有取代基的基团。例如，在式中有“R表示烷基”的记载时，其含义是“R表示无取代烷基或具有取代基的烷基”。
本说明书中的“工序”这一用语，不仅包括独立的工序，即使是无法与其它工序明确区分开的情况下，只要能够实现工序所预期的目的则也包括在本用语中。
以下，对本发明进行详细说明。
(聚合性化合物)
本发明涉及的聚合性化合物是下述式A-1或式A-2所示的化合物。
本发明涉及的聚合性化合物优选为硼烷磷酸酯低聚物形成用聚合性化合物。
[化学式4]
Figure BDA0003564624860000101
式A-1或式A-2中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，R3表示氢原子或羟基的保护基团，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构。
式B-1～式B-5中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RpC、R pA及RpG表示在酸性条件下被除去的保护基团，RpC2表示烷基，RpG2表示保护基团，RpG3表示在酸性条件下被除去的保护基团或氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
式A-1或式A-2中，R1表示给电子性基团，优选为烷氧基、-NRN 2、羟基、芳基、或烷基，更优选为烷氧基，进一步优选为碳原子数1～4的烷氧基，特别优选为甲氧基。
RN各自独立地表示氢原子或碳原子数1～10的烷基。
式A-1或式A-2中，n表示1～5的整数，优选为1～3的整数，更优选为1。
n为2以上的情况下，多个R1可以相同，也可以互不相同。
式A-1或式A-2中，R2表示氢原子、卤原子或-ORO。
作为R2中的卤原子，可列举氟原子、氯原子、溴原子及碘原子，优选为氟原子。
RO表示氢原子、烷基、或羟基的保护基团，作为羟基的保护基团，可以使用例如作为在RNA或其衍生物的合成中通常被使用的用于保护核糖结构的2位羟基的保护基团而现有公知的保护基团，也可参照Green等在Protective Groups in Organic Synthesis,3rdEdition,1999,John Wiley&Sons,Inc.等文献中记载的保护基团，可列举例如：乙酰基、苯氧乙酰基、新戊酰基、苄基、4-甲氧基苄基、苯甲酰基、三苯基甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、9-苯基呫吨基、三甲基甲硅烷基、氰基甲氧基甲基、2-(氰基乙氧基)乙基、氰基乙氧基甲基，优选列举4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)。
R3表示氢原子或羟基的保护基团，作为羟基的保护基团，可参照Green等在Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition,1999,John Wiley&Sons,Inc.等文献中记载的保护基团，可列举例如：乙酰基、苯氧乙酰基、新戊酰基、苄基、4-甲氧基苄基、苯甲酰基、三苯基甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、9-苯基呫吨基、三甲基甲硅烷基、氰基甲氧基甲基、2-(氰基乙氧基)乙基、氰基乙氧基甲基，优选列举4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)。
式A-1或式A-2中，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构，式B-1相当于胸腺嘧啶结构或尿嘧啶结构，式B-2相当于胞嘧啶结构，式B-3相当于腺嘌呤结构，式B-4及式B-5相当于鸟嘌呤结构。
需要说明的是，上述胸腺嘧啶结构、尿嘧啶结构、胞嘧啶结构、腺嘌呤结构及鸟嘌呤结构可包含具有取代基的各个结构。
式B-1～式B-5中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，优选为氢原子、碳原子数1～4的烷基、碳原子数2～4的烯基、或碳原子数2～4的炔基。
RpC、RpA及RpG表示在酸性条件下被除去的保护基团，可参照Green等在ProtectiveGroups in Organic Synthesis,3rd Edition,1999,John Wiley&Sons,Inc.等文献中记载的保护基团，优选为例如：叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、4,4’-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、或4-甲氧基苄氧基羰基(MCBz)，从空间位阻小、使单体的反应性提高的观点出发，更优选为4-甲氧基苄氧基羰基(MCBz)。
RpC2表示烷基，优选为碳原子数1～4的烷基，更优选为甲基。
RpG2表示保护基团，作为保护基团，可以无限制地使用例如公知的羟基的保护基团，但也可以参照Green等在Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition,1999,John Wiley&Sons,Inc.等文献中记载的保护基团，可列举例如：乙酰基、苯氧乙酰基、新戊酰基、苄基、4-甲氧基苄基、苯甲酰基、三苯基甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、9-苯基呫吨基、三甲基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基乙基、氰基甲氧基甲基、2-(氰基乙氧基)乙基、氰基乙氧基甲基，优选为三甲基甲硅烷基乙基。
另外，作为RpG2，优选为在酸性条件下可被除去的保护基团。
RpG3表示在酸性条件下被除去的保护基团或氢原子，作为保护基团，可列举与上述RPG中的在酸性条件下可被除去的保护基团同样的保护基团，优选实施方式也相同。
<聚合性化合物的制造方法>
以下，针对本发明涉及的聚合性化合物的制造方法的一例进行说明。但本发明并不限定于该例。
本发明涉及的聚合性化合物可以按照例如下述方案1进行合成。
在下述方案1中，Et3N为三乙胺。
下述方案1中，(Rp)or(Sp)-20a-d为式A-1或式A-2所示的化合物。
[化学式5]
Figure BDA0003564624860000131
上述方案1中的R1、n、R2、R3及X分别与式A-1或式A-2中的R1、n、R2、R3及X同义，优选的实施方式也相同。
上述方案1中的化合物9a-d可以以例如胸苷、尿苷、胞苷、腺苷或鸟苷为原料进行合成。
上述方案1中的化合物(4S,5R)-18可以按照例如下述方案2进行合成。
在下述方案2中，Me为甲基、MMTrCl为4-甲氧基三苯基氯甲烷、Et3N为三乙胺、SO3-Py为吡啶-三氧化硫复合物、DCA为二氯乙酸、PCl3为三氯化磷。
需要说明的是，下述方案2将L-脯氨酸作为了起始物质，但可以通过以D-脯氨酸为起始物质进行同样的合成而合成(4R,5S)-18。
[化学式6]
Figure BDA0003564624860000151
(硼烷磷酸酯低聚物的制造方法)
本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法是包括使本发明涉及的聚合性化合物进行缩合的工序(以下也称为“缩合工序”)的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法。
以下，针对本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法的一例进行说明。但本发明并不限定于该例。
<缩合工序>
本发明中的缩合工序例如遵循下述方案3。
[化学式7]
Figure BDA0003564624860000161
上述方案3中的R1、n、R2、R3及X分别与式A-1或式A-2中的R1、n、R2、R3及X同义，优选的实施方式也相同。
另外，上述方案3中，Z表示后述的式B-6～式B-9中的任意式所示的结构。
在上述方案3中，在负载于固相载体的化合物27中，进行R3的脱保护。上述R3的脱保护可在例如酸性条件下进行。
接着，通过使用聚合性化合物及活化剂重复进行缩合反应、和不对称辅助基团、碱基的保护基团及R3的脱保护，使低聚物链伸长。上述不对称辅助基团及碱基的保护基团的脱保护可在酸性条件下进行。作为R3，通过使用可在酸性条件下除去的保护基团，能够在进行上述不对称辅助基团及碱基的保护基团的脱保护的同时进行R3的脱保护。
上述方案3中，使用了聚合性化合物20a-d、和作为活化剂的化合物21(CMPT、N-(氰甲基)吡咯烷三氟甲烷磺酸盐)，但活化剂并不限定于此，可以进行变更。
通过在形成H-膦酸酯低聚物23之后进行硼化，可得到硼烷磷酸酯低聚物24a-d。
在上述方案3中，示出了基于固相法的合成方法，但也可以根据同样的方案进行基于液相法的合成。
从立体选择性及反应速度的观点出发，优选通过固相法合成。
上述方案3中的低聚物链的扩链反应的详情如下述方案4所示。
[化学式8]
Figure BDA0003564624860000171
上述方案4中，R1、n、R2、R3及X各自独立地与式A-1或式A-2中的R1、n、R2、R3及X同义，优选的实施方式也相同。
n表示0～100的整数、优选为1～100的整数、更优选为9～100的整数、进一步优选为11～100的整数。
上述方案4中，TfO(OTf)表示三氟甲磺酸阴离子，Z表示后述的式B-6～式B-9中的任意式所示的结构。
上述方案4中，作为本发明的聚合性化合物的(Rp)or(SP)-20a-d在活化剂21的存在下与H-膦酸酯取代核苷的末端的糖结构的5’位上的羟基结合而形成中间体28。其后，不对称辅助基团、碱基的保护基团及R3从中间体28发生脱保护，形成低聚物29。进一步，(Rp)or(SP)-20a-d与低聚物29的末端的糖结构的5’位上的羟基结合。通过该重复，低聚物链伸长。
在方案4中，为方便起见，将中间体28、低聚物29中包含的以磷原子为不对称点的所有空间构型记作S构型(Sp体)，但通过作为单体而分别使用式A-1所示的化合物、和式A-2所示的化合物，能够在任意的位置导入S构型(Sp体)的H-膦酸酯结构、和R构型(Rp体)的H-膦酸酯结构。
即，上述中间体28是包含下述式T-1所示的结构单元、及下述式D-1或D-2所示的结构单元的化合物。
[化学式9]
Figure BDA0003564624860000191
式T-1中，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，Z表示式B-6～式B-9中的任意式所示的结构，*及**表示与其它结构的结合部位。
式D-1或D-2中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，R3表示氢原子或羟基的保护基团，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构，TfO表示三氟甲磺酸阴离子，●表示与其它结构的结合部位。
式B-1～式B-5中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RpC、RpA及RpG表示在酸性条件下被除去的保护基团，RpC2表示烷基，RpG2表示保护基团，RpG3表示在酸性条件下被除去的保护基团或氢原子，RC2表示烷基，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
式B-6～式B-9中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RC、RA及RG表示氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
式T-1中，R2与式A-1或式A-2中的R2同义，优选的实施方式也相同。
式T-1中，*表示与其它结构的结合部位，在通过固相合成来合成的情况下，优选表示与载体的结合部位。
式T-1中，Z优选为式B-6～式B-9中的任意式所示的结构，更优选为胸腺嘧啶结构、尿嘧啶结构、胞嘧啶结构、腺嘌呤结构、或鸟嘌呤结构中的任意结构。
式D-1及式D-2中，R1、n、R2、R3及X与式A-1或式A-2中的R1、n、R2、R3及X同义，优选的实施方式也相同。
式B-1～式B-5与上述式A-1或式A-2中的式B-1～式B-5同义，优选的实施方式也相同。
根据本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法，通过对在缩合工序中使用的聚合性化合物进行选择，能够制造出硼烷磷酸酯DNA、硼烷磷酸酯RNA中的任一者。
本发明中，所述硼烷磷酸酯DNA是指，将天然型DNA的磷酸二酯结构中的非桥连氧原子中的一个置换为硼烷基(-BH3)而成的DNA。
本发明中，所述硼烷磷酸酯RNA是指，将天然型RNA的磷酸二酯结构中的非桥连氧原子中的一个置换为硼烷基(-BH3)而成的RNA。
在上述DNA及RNA的任一者中，均可以以得到与靶核酸的碱基序列互补的碱基序列的方式来选择本实施方式的聚合性化合物而实施合成。
另外，上述化合物还可以进一步包含下述式C-1或式C-2所示的结构单元中的任意一者或两者。
下述式C-1或式C-2所示的结构单元是通过上述方案4中记载的缩合循环的1个循环而各增加1个的结构单元，也可以具有多个。
上述化合物中包含的式C-1或式C-2所示的结构单元的总数优选为9～100、更优选为11～50。
[化学式10]
Figure BDA0003564624860000211
式C-1或式C-2中，R2表示氢原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，Z表示式B-6～式B-9中的任意式所示的结构，**及●表示与其它结构的结合部位。
式B-6～式B-9中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RC、RA及RG表示氢原子，RC2表示烷基，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
式C-1及式C-2中，Z及R2与式T-1中的Z及R2分别同义，优选的实施方式也相同。
存在多个式C-1或式C-2所示的结构的情况下，多个式C-1或式C-2中的Z及R2可以相同，也可以不同。
式B-6～式B-9与上述式T-1中的式B-6～式B-9同义，优选的实施方式也相同。
另外，上述化合物也可以进一步包含源自选自后述的式E-1～式E-4所示的聚合性化合物中的至少1个的结构单元。
在本发明中的缩合工序中，作为其它聚合性化合物，也可以进一步使用选自式E-1～式E-4所示的聚合性化合物中的至少1个的聚合性化合物。
即，利用本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法制造的硼烷磷酸酯低聚物也可以是硼烷磷酸酯LNA。
在本发明中，LNA是指具有由核糖环的2’位的氧原子和4’位的碳原子经由亚甲基桥连而成的结构的RNA衍生物，硼烷磷酸酯LNA是指LNA的磷酸二酯结构中的非桥连氧原子中的一个置换为硼烷基(-BH3)而成的LNA。
[化学式11]
Figure BDA0003564624860000221
式E-1～式E-4中，R1、n、R3及X与式A-1或式A-2中的R1、n、R2、R3及X同义，优选的实施方式也相同。
式E-3及式E-4中，R4表示羟基的保护基团，可以无限制地使用上述作为R3中羟基的保护基团而示例出的那些。
R5表示氢原子、具有保护基团的羟基、卤原子、或烷氧基。
在本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的合成方法中，使用式E-1或式E-2所示的聚合性化合物的情况下，可利用与使用式A-1或式A-2所示的聚合性化合物的情况相同的方法进行合成。
另外，在本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的合成方法中，使用式E-3或式E-4所示的聚合性化合物的情况下，可利用使用了公知的缩合剂的公知的DNA或RNA合成方法进行合成。
通过使用式E-3或式E-4所示的聚合性化合物，能够合成部分地包含磷酸二酯结构的硼烷磷酸酯低聚物。
<纯化工序>
本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法也可以进一步包括生成硼烷磷酸酯低聚物的工序(纯化工序)。
在纯化工序中，可利用例如反相高效液相色谱法(反相HPLC)、离子交换HPLC、柱色谱法、重结晶等公知的纯化方法来纯化硼烷磷酸酯低聚物。
本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法优选为10聚体～100聚体的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法、更优选为10聚体～50聚体的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法、进一步优选为12聚体～50聚体的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法。
根据本发明涉及的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法，可以制造出上述Sp体和Rp体自由组合而成的硼烷磷酸酯低聚物。
例如，通过以仅使硼烷磷酸酯低聚物的两末端为Rp体、使其它结构为Sp体的方式构成，能够制造出酶抗性提高了的硼烷磷酸酯低聚物。
通过将利用本发明的硼烷磷酸酯低聚物的制造方法得到的硼烷磷酸酯低聚物设计成与靶核酸的碱基序列互补的形式，可以将其用作相对于靶核酸的双链形成能力优异的反义分子。
例如，在上述靶核酸相当于疾病相关基因的部分序列的情况下，上述硼烷磷酸酯低聚物可优选用于翻译抑制能力高的反义药物等药物用途。
此外，还可考虑应用于硼中子俘获疗法(BNCT)。
实施例
以下，结合实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些实施例。
需要说明的是，在以下的记载中，在没有特别说明的情况下“％”为质量基准。
在实施例中使用的分析设备的详情如下所述。
1H-核磁共振谱(1H-NMR)：JNM-LA 400(400MHz)
31P-核磁共振谱(31P-NMR)：JNM-LA 400(161.8MHz)
需要说明的是，1H-NMR中使用了四甲基硅烷(TMS)作为内标、31P-NMR中使用了85％H3PO4作为外标。
ESI-MS：Varian 910-MS
实施例中使用的缩写的详情如下所述。
MMTr＝4-甲氧基三苯甲基
DMTr＝4,4’-二甲氧基三苯甲基
TBS＝叔丁基二甲基甲硅烷基
TMS＝三甲基甲硅烷基
TFA＝三氟乙酸
DCA＝二氯乙酸
MCbz＝4-甲氧基苄氧基羰基
Tse＝三甲基甲硅烷基乙基
CDI＝1,1’-羰基二咪唑
HMDS＝六甲基二硅氮烷
DEAD＝偶氮二甲酸二乙酯
CMPT＝N-(氰基甲基)吡咯烷三氟甲磺酸盐
DMAc＝N,N-二甲基乙酰胺
BSA＝N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺
Th(T)＝胸腺嘧啶
Cy(C)＝胞嘧啶
Ad(A)＝腺嘌呤
Gu(G)＝鸟嘌呤
(实施例及比较例)
<聚合性化合物的合成>
[(2S)-5的合成]
将L-脯氨酸(1)(11.51g,100mmol)制成MeOH(100mL)溶液，冷却至0℃。利用滴液漏斗向该溶液中缓慢加入SOCl2(14.42mL,200mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，减压蒸馏除去溶剂之后，得到了作为粗产物的(2S)-2。将(2S)-2不进行进一步的纯化而直接用于后续步骤。
利用甲苯、CHCl3对粗产物(2S)-2重复进行共沸干燥，制成CH2Cl2(250mL)溶液，加入了Et3N(55.75mL,400mmol)、MMTrCl(40.14g,130mmol)。将反应混合物在室温下搅拌17小时，加入了饱和NH4Cl水溶液-浓NH3水溶液(2:1,v/v)(150mL)。分离有机层，利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，并对收集的洗液利用CH2Cl2(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行减压下浓缩，得到了作为粗产物的(2S)-3。将(2S)-3不进行进一步的纯化而直接用于后续步骤。
利用吡啶、甲苯、CHCl3对粗产物(2S)-3重复进行共沸干燥，制成了THF(100mL)溶液。利用滴液漏斗将该溶液于0℃缓慢加入至LiAlH4(4.93g,130mmol)的THF(100mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌12小时之后，冷却至0℃，依次利用滴液漏斗缓慢加入了H2O(5mL)、15％NaOH水溶液(5mL)、H2O(15mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，加入无水MgSO4，进一步搅拌了30分钟。对悬浮液进行硅藻土过滤，并利用AcOEt(500mL)进行了洗涤。对溶液进行减压蒸馏，向残渣中加入CH2Cl2(300ml)。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CH2Cl2(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行减压下浓缩，得到了作为粗产物的(2S)-4。将(2S)-4不进行进一步的纯化而直接用于后续步骤。
将粗产物(2S)-4制成CH2Cl2(400mL)溶液，并加入了Et3N(83.18mL,600mmol。于0℃向该溶液中加入了吡啶-三氧化硫复合物(47.75g,300mmol)的DMSO(100mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时，加入了饱和NaHCO3水溶液(100mL)。分离有机层，并利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CH2Cl2(100mL)进行了萃取。对收集的有机层进行减压下浓缩，向残渣中加入Et2O(300mL)，并利用饱和NaCl水溶液(5×100mL)进行了洗涤。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。对残渣利用硅胶柱色谱法[中性硅胶,己烷-乙酸乙酯(6:1,v/v),吡啶1％]进行分离纯化，回收了包含(2S)-5的级分。减压蒸馏除去溶剂，得到了作为淡黄色泡沫状物质的(2S)-5。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.84(s,1H),7.55-7.43(m,6H),7.28-7.14(m,6H),6.82-6.78(m,2H),3.78(s,3H),3.29-3.23(m,1H),2.93-2.87(m,1H),1.64-1.55(m,2H),1.47-1.37(m,1H),1.19-1.10(m,1H),0.90-0.77(m,1H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+Na]+；394.1783.Found；394.1788
[(2R)-5的合成]
以D-脯氨酸(1)为起始物质、利用与(2S)-5同样的方法合成了(2R)-5。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.83(s,1H),7.56-7.43(m,6H),7.28-7.12(m,6H),6.84-6.78(m,2H),3.77(s,3H),3.30-3.21(m,1H),2.94-2.85(m,1H),1.65-1.55(m,2H),1.49-1.37(m,1H),1.20-1.08(m,1H),0.90-0.75(m,1H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+Na]+；394.1783.Found；394.1784.
[(αR,2S)-7的合成]
利用吡啶、甲苯、CHCl3对(2S)-5(26.00g,70mmol)重复进行共沸干燥，并制成Et2O(300mL)溶液，冷却至-78℃。利用滴液漏斗向该溶液中缓慢加入0.5M的4-甲氧基苯基溴化镁/THF溶液(420mL,210mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时，于0℃加入了饱和NH4Cl水溶液-浓NH3水溶液(2:1,v/v)(300mL)。对悬浮液进行硅藻土过滤，并利用Et2O(300mL)进行了洗涤。分离有机层，并利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用Et2O(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行减压下浓缩，得到了作为粗产物的(αR,2S)-6。将(αR,2S)-6不进行进一步的纯化而直接用于后续步骤。
向粗产物(αR,2S)-6中加入3％DCA/CH2Cl2溶液(300mL)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，加入H2O(300mL)，分离出水层，利用CH2Cl2(5×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用水(100mL)进行了萃取。向收集的水层中加入5M NaOH水溶液、直至达到pH 11。向其中加入CH2Cl2(300mL)，分离有机层，并利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CH2Cl2(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行减压下浓缩，得到了(αRS,2S)-7。
向(αRS,2S)-7(5.18g,25mmol)中加入反式肉桂酸(3.70g,25mmol)，使用EtOH进行了重结晶。向析出的结晶中加入2M KOH水溶液(100mL)、CH2Cl2(100mL)，分离了有机层。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CH2Cl2(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行减压下浓缩，得到了作为淡黄色油状物质的(αR,2S)-7。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30-7.27(m,2H),6.89-6.86(m,2H),4.68(d,J＝4.0Hz,1H),3.80(s,3H),3.42-3.37(m,1H),3.05-2.99(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.43(br,2H),1.79-1.62(m,3H),1.55-1.47(m,1H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；208.1338.Found；208.1337.
[(αS,2R)-7的合成]
以(2R)-5为起始物质，利用与(αR,2S)-7同样的方法合成了(αS,2R)-7。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30-7.27(m,2H),6.89-6.86(m,2H),4.66(d,J＝4.0Hz,1H),3.80(s,3H),3.40-3.35(m,1H),3.03-2.98(m,1H),2.94-2.88(m,1H),2.54(br,2H),1.79-1.61(m,3H),1.55-1.46(m,1H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；208.1338.Found；208.1338.
[化学式12]
Figure BDA0003564624860000291
[5’-O-(DMTr)胸苷[9a]的合成]
以胸苷(8)为起始物质，按照文献记载的方法进行了合成。1H NMR谱与文献值一致。
[化学式13]
Figure BDA0003564624860000301
[3’,5’-O-双(TBS)-2’-脱氧胞苷[14]的合成]
2’-脱氧胞苷(13)为起始物质，按照文献记载的方法进行了合成。1H NMR谱与文献值一致。
[3’,5’-O-双(TBS)-N4-MCbz-2’-脱氧胞苷[15].的合成]
利用吡啶、甲苯、CHCl3对3’,5’-O-双(TBS)-2’-脱氧胞苷(14)(4.55g,10mmol)重复进行共沸干燥，制成1,2-二氯乙烷(100mL)溶液，并加入CDI(2.60g,16mmol)，使其加热回流20小时。加入4-甲氧基苄醇(2.00mL,16mmol)，进一步加热回流了18小时。加入饱和NaHCO3水溶液(100mL)，分离了有机层。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CH2Cl2(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。对残渣利用硅胶柱色谱法[中性硅胶,己烷-乙酸乙酯(1:1,v/v)]进行分离纯化，回收了包含15的级分。减压蒸馏除去溶剂，得到了作为无色泡沫状物质的15(4.64g,7.49mmol,75％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.38(d,1H),7.46(br,1H),7.34(d,2H),7.18(d,1H),6.93(d,2H),6.25(t,1H),5.15(s,2H),4.41(q,1H),3.98-3.94(m,2H),3.82-3.76(m,4H),2.56-2.47(m,1H),2.17-2.08(m,1H),0.93-0.88(m,18H),0.12-0.05(m,12H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；620.3187.Found；620.3187.
[N4-MCbz-5’-O-DMTr-2’-脱氧胞苷[9b]的合成]
将3’,5’-O-双(TBS)-N4-MCbz-2’-脱氧胞苷(15)(4.34g,7mmol)制成THF(35mL)溶液，加入1M TBAF/THF(35mL)，在室温下进行了1小时搅拌。加入饱和NaHCO3水溶液(100mL)、AcOEt(300mL)，分离了有机层。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用AcOEt(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。向残渣中加入吡啶(70mL)、DMTrCl(2.37g,7mmol)，于室温下进行了14小时搅拌。加入MeOH(30mL)、CHCl3(300mL)、饱和NaHCO3水溶液(100mL)，分离有机层。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CHCl3(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。对残渣利用硅胶柱色谱法[中性硅胶,CH2Cl2-MeOH-吡啶(99:0.5:0.5 to 94.5:5:0.5,v/v)]进行分离纯化，回收了包含9b的级分。减压蒸馏除去溶剂，得到了作为无色泡沫状物质的9b(3.47g,5mmol,71％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.25(d,1H),7.44-7.39(m,3H),7.34-7.22(m,9H),7.02(d,1H),6.92-6.84(m,6H),6.25(t,1H),5.13(s,2H),4.47(br,1H),4.09(q,1H),3.80(s,9H),3.55-3.39(m,2H),2.71-2.62(m,1H),2.30-2.22(m,1H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；694.2765.Found；694.2763.
[化学式14]
Figure BDA0003564624860000321
[3’,5’-O-双(TBS)-2’-脱氧腺苷[11]的合成]
以2’-脱氧腺苷(10)为起始物质，按照文献记载的方法进行了合成。1H NMR谱与文献值一致。
[3’,5’-O-双(TBS)-N6-MCbz-2’-脱氧腺苷[12]的合成]
利用吡啶、甲苯、CHCl3对3’,5’-O-双(TBS)-2’-脱氧腺苷(11)(7.19g,15mmol)重复进行共沸干燥，制成1,2-二氯乙烷(150mL)溶液，加入CDI(3.89g,24mmol)，并进行了17小时加热回流。加入4-甲氧基苄醇(3.00mL,24mmol)，进一步进行了20小时加热回流。加入饱和NaHCO3水溶液(100mL)，分离了有机层。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CH2Cl2(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。对残渣利用硅胶柱色谱法[中性硅胶,己烷-乙酸乙酯(2:1,v/v)]进行分离纯化，回收了包含12的级分。减压蒸馏除去溶剂，得到了作为无色泡沫状物质的12(7.26g,11mmol,75％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.75(s,1H),8.41(s,1H),8.26(s,1H),8.38(d,2H),6.90(d,2H),6.49(t,1H),5.23(s,2H),4.63-4.59(m,1H),4.04(q,1H),3.89-3.75(m,5H),2.67-2.61(m,1H),2.48-2.42(m,1H),0.92-0.87(m,18H),0.10-0.04(m,12H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；644.3300.Found；644.3298.
[N6-MCbz-5’-O-DMTr-2’-脱氧腺苷[9c]的合成]
将3’,5’-O-双(TBS)-N6-MCbz-2’-脱氧腺苷(12)(7.26g,11mmol)制成THF(55mL)溶液，加入1M TBAF/THF(55mL)，在室温下进行了1小时搅拌。加入饱和NaHCO3水溶液(100mL)、AcOEt(300mL)，分离了有机层。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用AcOEt(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。向残渣中加入吡啶(110mL)、DMTrCl(4.48g,13.2mmol)，在室温下进行了18小时搅拌。加入MeOH(50mL)、CHCl3(300mL)、饱和NaHCO3水溶液(100mL)，分离了有机层。利用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CHCl3(100mL)进行了萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。对残渣利用硅胶柱色谱法[中性硅胶,CH2Cl2-MeOH-吡啶(98:1.5:0.5 to 96.5:3:0.5,v/v)]进行分离纯化，回收了包含9c的级分。减压蒸馏除去溶剂，得到了作为无色泡沫状物质的9c(5.08g,7mmol,64％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),8.16(br,1H),8.06(s,1H),7.40-7.36(m,2H),7.31-7.16(m,9H),6.91-6.77(m,6H),6.46(t,1H),5.23(s,2H),4.70(br,1H),4.16(q,1H),3.77(s,9H),3.41-3.39(m,2H),2.91-2.82(m,1H),2.59-2.51(m,1H),1.65(br,1H).FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；718.2877.Found；718.2880.
[化学式15]
Figure BDA0003564624860000341
[O6-Tse-5’-O-DMTr-2’-脱氧鸟苷[9d]的合成]
以2’-脱氧鸟苷(1)为起始物质，按照文献记载的方法进行了合成。1H NMR谱与文献值一致。
[化学式16]
Figure BDA0003564624860000351
[3’,5’-双-O-苯甲酰基-N2-MCbz-脱氧鸟苷[6]的合成]
将3’,5’-双-O-苯甲酰基脱氧鸟苷(4)(0.52g,1.09mmol)制成THF(13.0mL)溶液，加入DIPEA(0.95mL,5.5mmol)、TMSCl(0.15mL,1.0mmol)，在室温下进行了1小时搅拌。加入三光气(0.1g,0.35mmol)，于0℃进行了1小时搅拌。在室温下加入4-甲氧基苄醇(0.17g,1.2mmol)，加热回流过夜。利用饱和食盐水(3×10mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CH2Cl2(5mL)进行了额萃取。对收集的有机层利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。对残渣利用二氧化硅柱色谱法[中性硅胶,CH2Cl2-MeOH-吡啶(99:0.5:0.5 to 94.5:5:0.5,v/v)]进行分离纯化，回收了包含6的级分。减压蒸馏除去溶剂，得到了作为黄色泡沫状物质的6(0.09g,0.40mmol,37％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ11.31(s,1H),8.35(s,1H),8.06-8.04(d,J＝7.5Hz,2H),7.96-7.93(d,J＝7.2Hz,2H),7.72(s,1H),7.64-7.59(m,1H),7.55-7.45(m,9H),7.39-7.34(m,4H),6.94-6.92(m,2H),6.30-6.26(t,J＝7.2,6.6Hz,1H),5.80-5.78(m,1H),5.23(s,2H),4.94-4.90(m,1H),4.75-4.69(m,1H),4.69-4.67(m,1H),3.83(s,1H),3.17-3.07(m,1H),2.70-2.65(m,1H).
[化学式17]
Figure BDA0003564624860000361
[2-氯-1,3,2-氧氮磷杂环戊烷[(4S,5R)-18]的合成]
利用甲苯对(αR,2S)-7(1.07g,5.16mmol)重复进行共沸干燥，制成甲苯(3mL)溶液，加入了N-甲基吗啉(1.13mL,10.32mmol)。利用注射器将混合溶液于0℃缓慢加入三氯化磷(0.45mL,5.16mmol)的甲苯(2.5mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时后，将生成的盐在Ar气氛围中、-78℃下进行过滤分离，在Ar气氛围中进行减压浓缩，得到了2-氯-1,3,2-氧氮磷杂环戊烷(4S,5R)-18(1.28g,4.71mmol)。淡黄色油。将(4S,5R)-18不进行进一步的纯化而用于反应。
[[(4R,5S)-18]的合成]
以(αS,2R)-7为起始物质，利用与(4S,5R)-18同样的方法进行了合成。
[化学式18]
Figure BDA0003564624860000371
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Rp)-20a]的合成]
利用吡啶、甲苯、THF对5’-O-(DMTr)胸苷(9a)(0.86g,1.58mmol)重复进行共沸干燥，制成THF(8mL)，并加入了Et3N(1.52mL,11mmol)。将混合溶液冷却至-78℃，利用注射器缓慢地加入了0.5M(4S,5R)-18的THF(9.5mL,4.75mmol)溶液。将反应溶液在室温下搅拌2小时，加入了CHCl3(300mL)、饱和NaHCO3水溶液(100mL)。分离有机相，利用饱和NaHCO3水溶液(2×100mL)进行洗涤，对收集的洗液利用CHCl3(100mL)进行了萃取。对收集的有机相利用无水Na2SO4进行干燥、并进行过滤，进行了减压下浓缩。对残渣利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(7:3,v/v),Et3N 0.1％]进行分离纯化，收集包含(Rp)-20a的级分，减压蒸馏除去溶剂，得到了作为无色泡沫状物质的(Rp)-20a(0.53g,0.68mmol,43％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.60(s,1H),7.41-7.22(m,11H),6.89-6.79(m,6H),6.43(t,1H),5.68(d,1H),4.94-4.89(m,1H),4.13(q,1H),3.80-3.77(m,10H),3.60-3.53(m,1H),3.49-3.36(m,2H),3.20-3.13(m,1H),2.60-2.55(m,1H),2.40-2.33(m,1H),1.66-1.58(m,2H),1.42(s,3H),1.21-1.14(m,1H),1.00-0.91(m,1H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ155.65.FAB-HRMS:Calcd.for[M+Na]+；802.2869.Found；802.2866.
(Rp)-20b-d、(Sp)-20a-d的粗产物全部是利用与上述相同的方法得到的。这些仅显示出了硅胶柱色谱法的条件。
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Rp)-20b]的合成]
(Rp)-20b的粗产物是由9b(1.02g,1.47mmol)和(4S,5R)-18(0.80g,2.94mmol)、利用与(Rp)-20a同样的方法得到的。利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(7:3,v/v),Et3N 0.1％]进行纯化，得到了作为无色泡沫状物质的(Rp)-20b(0.65g,0.70mmol,47％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(d,1H),7.39-7.13(m,13H),6.91-6.79(m,8H),6.26(t,1H),5.68(d,1H),5.13(s,2H),4.87-4.81(m,1H),4.16(q,1H),3.83-3.76(m,14H),3.60-3.52(m,1H),3.47(d,2H),3.22-3.13(m,1H),2.82-2.75(m,1H),2.38-2.32(m,1H),1.67-1.57(m,2H),1.22-1.15(m,1H),1.01-0.94(m,1H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ156.72.FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；929.3527.Found；929.3528.
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Rp)-20c]的合成]
(Rp)-20c的粗产物是由9c(1.05g,1.47mmol)和(4S,5R)-18(0.80g,2.94mmol)、利用与(Rp)-20a同样的方法得到的。利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(8:2,v/v),Et3N 0.1％]进行纯化，得到了作为无色泡沫状物质的(Rp)-20c(0.62g,0.65mmol,44％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.67(s,1H),8.30(br,1H),8.06(s,1H),7.38-7.35(m,4H),7.29-7.14(m,9H),6.91-6.86(m,4H),6.75-6.70(m,4H),6.47(t,1H),5.77(d,1H),5.22(s,2H),5.09-5.03(m,1H),4.29(q,1H),3.88-3.84(m,1H),3.81(s,6H),3.74(s,6H),3.62-3.54(m,1H),3.41-3.33(m,2H),3.20-3.11(m,1H),2.99-2.92(m,1H),2.71-2.65(m,1H),1.68-1.59(m,2H),1.26-1.16(m,1H),1.03-0.94(m,1H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ154.97.FAB-HRMS:Calcd.for[M+Na]+；975.3458.Found；975.3459.
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Rp)-20d]的合成]
(Rp)-20d的粗产物是由9d(0.67g,1.00mmol)和(4S,5R)-18(1.07g,3.95mmol)、利用与(Rp)-20a同样的方法得到的。利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(9:1,v/v),Et3N 0.1％]进行纯化，得到了作为无色泡沫状物质的(Rp)-20d(0.34g,0.38mmol,38％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(s,1H),7.43-7.13(m,11H),6.92-6.74(m,6H),6.33(t,1H),5.75(d,1H),5.04(m,1H),4.65-4.53(m,4H),4.26(q,1H),3.92-3.74(m,10H),3.64-3.53(m,1H),3.41-3.30(m,2H),3.20-3.13(m,1H),2.57-2.55(m,1H),2.24-2.19(m,1H),1.68-1.55(m,2H),1.26-1.12(m,3H),1.03-0.96(m,1H),0.08(s,9H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ155.04.FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；905.3823.Found；905.3826.
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Sp)-20a]]
(Sp)-20a的粗产物是由9a(0.85g,1.57mmol)和(4R,5S)-18(1.28g,4.71mmol)、利用与(Rp)-20a同样的方法得到的。利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(7:3,v/v),Et3N 0.1％]进行纯化，得到了作为无色泡沫状物质的(Sp)-20a(0.82g,1.05mmol,67％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(br,1H),7.64(s,1H),7.42-7.16(m,11H),6.90-6.82(m,6H),6.41(t,1H),5.63(d,1H),4.94-4.89(m,1H),4.18(q,1H),3.86-3.76(m,10H),3.56-3.48(m,1H),3.39-3.34(m,2H),3.20-3.13(m,1H),2.50-2.43(m,1H),2.39-2.31(m,1H),1.64-1.59(m,2H),1.40(s,3H),1.25-1.19(m,1H),1.06-0.90(m,1H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ156.12.FAB-HRMS:Calcd.for[M+Na]+；802.2869.Found；802.2874.
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Sp)-20b]的合成]
(Sp)-20b的粗产物是由9b(1.01g,1.46mmol)和(4R,5S)-18(1.00g,3.67mmol)、利用与(Rp)-20a同样的方法得到的。利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(7:3,v/v),Et3N 0.1％]进行纯化，得到了作为无色泡沫状物质的(Sp)-20b(0.55g,0.59mmol,40％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.36(d,1H),7.43-7.16(m,13H),6.94-6.84(m,8H),6.24(t,1H),5.68(d,1H),5.13(s,2H),4.90-4.83(m,1H),4.18(q,1H),3.87-3.76(m,14H),3.57-3.44(m,3H),3.21-3.13(m,1H),2.69-2.63(m,1H),2.41-2.32(m,1H),1.69-1.60(m,2H),1.25-1.17(m,1H),1.04-0.95(m,1H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ155.97.FAB-HRMS:Calcd.for[M+Na]+；951.3346.Found；951.3349.
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Sp)-20c]的合成]
(Sp)-20c的粗产物是由9c(1.05g,1.46mmol)和(4R,5S)-18(1.00g,3.67mmol)、利用与(Rp)-20a同样的方法得到的。利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(8:2,v/v),Et3N 0.1％]进行纯化，得到了作为无色泡沫状物质的(Sp)-20c(0.67g,0.70mmol,48％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.67(s,1H),8.29(br,1H),8.11(s,1H),7.41-7.35(m,4H),7.30-7.12(m,9H),6.91-6.74(m,8H),6.46(t,1H),5.72(d,1H),5.22(s,2H),5.06-5.00(m,1H),4.34(q,1H),3.91-3.85(m,1H),3.80(s,6H),3.76(s,6H),3.62-3.52(m,1H),3.48-3.34(m,2H),3.22-3.13(m,1H),2.94-2.88(m,1H),2.63-2.58(m,1H),1.69-1.58(m,2H),1.26-1.19(m,1H),1.06-0.98(m,1H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ155.36.FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；953.3639.Found；953.3643.
[氧氮磷杂环戊烷单体[(Sp)-20d]的合成]
(Sp)-20d的粗产物是由9d(0.67g,1.00mmol)和(4R,5S)-18(1.07g,3.95mmol)、利用与(Rp)-20a同样的方法得到的。利用硅胶柱色谱法[NH-硅胶,甲苯-AcOEt(9:1,v/v),Et3N 0.1％]进行纯化，得到了作为无色泡沫状物质的(Sp)-20d(0.34g,0.38mmol,38％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(s,1H),7.44-7.13(m,11H),6.88-6.78(m,6H),6.30(t,1H),5.71(d,1H),5.01(m,1H),4.61-4.53(m,4H),4.30(q,1H),3.90-3.77(m,10H),3.62-3.52(m,1H),3.46-3.42(m,1H),3.33-3.30(m,1H),3.22-3.13(m,1H),2.52-2.48(m,1H),2.25-2.20(m,1H),1.66-1.59(m,2H),1.26-1.19(m,3H),1.07-0.98(m,1H),0.08(s,9H).31P NMR(161MHz,CDCl3)δ155.36.FAB-HRMS:Calcd.for[M+H]+；905.3823.Found；905.3825.
[化学式19]
Figure BDA0003564624860000411
表1中记载了在各单体的合成中使用的9a～9d(利用保护基团保护的碱基)、所使用的化合物18、各单体的收率、及所得单体中包含的Rp体和Sp体的质量比。
表1中，Th的记载表示胸腺嘧啶、CyMCbz的记载表示氨基被MCbz基保护了的胞嘧啶、AdMCbz的记载表示氨基被MCbz基保护了的腺嘌呤、GuTse的记载表示氨基被三甲基甲硅烷基保护了的鸟嘌呤。
[表1]
Figure BDA0003564624860000421
a在项目4及8中，使上述基于Et3N的处理条件为-78℃。
b使用31P NMR进行了测定。
<硼烷磷酸酯DNA的合成1>
硼烷磷酸酯DNA(PB-DNA)(24a-d,25,26)的手动固相合成使用CPG(可控孔度玻璃)作为固相载体、反应容器使用下部具有旋塞的玻璃过滤器(10mm×50mm)进行。
首先，对经由琥珀酰基连接部而负载在CPG上的5’-O-(DMTr)胸苷(27)利用1％TFA/CH2Cl2进行处理(4×5s)，除去5’-O-DMTr基之后，进行以下的(i)～(v)的步骤，合成了H-膦酸酯DNA(23)。
(i)洗涤(CH2Cl2、CH3CN)
(ii)偶联(0.2M单体20a-d和1.0M CMPT(21)在CH3CN中；5min),
(iii)洗涤(CH3CN、CH2Cl2)
(iv)1％TFA/CH2Cl2-Et3SiH(1:1,v/v)(4×1min)
(v)洗涤(CH2Cl2、CH3CN)
接着，相对于所合成的23，在室温下加入DMAc(0.8mL)、BSA(0.1mL)、BH3·SMe2(0.1mL)。15分钟后，除去反应溶液，对CPG利用DMAc、CH3CN进行了洗涤。利用浓NH3水溶液-EtOH(3:1,v/v)对CPG于25℃进行3小时、或者于55℃进行12小时处理，过滤分离CPG，对滤液进行了减压浓缩。对残渣利用RP-HPLC、ESI-MS进行了分析、鉴定。
[化学式20]
Figure BDA0003564624860000431
将所得硼烷磷酸酯DNA(PB-DNA)的序列、从固相分离的反应条件(conc.NH3-EtOH(3:1,v/v)条件下的温度及保持时间)、收率及2聚体的立体化学纯度分别记载于表2。需要说明的是，表2中，Rp或Sp的记载示出了低聚物中的硼烷磷酸酯结构的绝对空间构型是Sp或Rp中的哪一种。all-(Rp)的记载表示低聚物中的硼烷磷酸酯结构的绝对空间构型全部为Rp，all-(Sp)的记载表示低聚物中的硼烷磷酸酯结构的绝对空间构型全部为Sp。
[表2]
Figure BDA0003564624860000441
a“B”表示通过硼烷磷酸酯结构而发生了结合。
b通过反相HPLC进行了计算。HPLC图谱记载于图1～图7。
c分离收率
图1为示出了(A)(Rp)-TBT[(Rp)-24a]的合成反应液(粗)及(B)(Sp)-TBT[(Sp)-24a]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：在0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至10％进行30分钟线性梯度之后，使乙腈保持10％30分钟。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000442
3.9mm×150mm)(Waters)
图2为示出了(C)(Rp)-dCBT[(Rp)-24b]的合成反应液(粗)及(D)(Sp)-dCBT[(Sp)-24b]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：在0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至10％进行30分钟线性梯度之后，使乙腈保持10％20分钟保持。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000451
3.9mm×150mm)(Waters)
图3为示出了(E)(Rp)-dABT[(Rp)-24c]的合成反应液(粗)及(D)(Sp)-dABT[(Sp)-24c]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：在0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至30％进行60分钟线性梯度。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000452
3.9mm×150mm)(Waters)
图4为示出了(G)(Rp)-dABT[(Rp)-24c]的合成反应液(粗)及(H)(Sp)-dABT[(Sp)-24c]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至30％进行60分钟线性梯度。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000461
3.9mm×150mm)(Waters)
图5为示出了(I)(Rp)-dGBT[(Rp)-24d]的合成反应液(粗)及(J)(Sp)-dGBT[(Sp)-24d]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：在0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至30％进行60分钟线性梯度。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000462
3.9mm×150mm)(Waters)
图6为示出了(K)all-(Rp)-d(CBABGBT)[25]的合成反应液(粗)及(L)all-(Sp)-d(CBABGBT)[26]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：在0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至20％进行60分钟线性梯度。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000471
3.9mm×150mm)(Waters)
图7为示出了(K)all-(Rp)-d(CBABGBT)[25]的纯化物及(L)all-(Sp)-d(CBABGBT)[26]的纯化物的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：在0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至20％进行60分钟线性梯度。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000472
3.9mm×150mm)(Waters)
将所得硼烷磷酸酯DNA(PB-DNA)的序列、化学式[-H+]、分子量(MS)的理论值及基于ESI-MS的实测值分别记载于表3。需要说明的是，表3中，Rp或Sp的记载示出了低聚物中的硼烷磷酸酯结构的绝对空间构型是Sp或Rp中的哪一种。all-(Rp)的记载表示低聚物中的硼烷磷酸酯结构的绝对空间构型全部为Rp，all-(Sp)的记载表示低聚物中的硼烷磷酸酯结构的绝对空间构型全部为Sp。
[表3]
Figure BDA0003564624860000481
a“B”表示通过硼烷磷酸酯结构而发生了结合。
<硼烷磷酸酯DNA的合成2>
按照下述方案合成了硼烷磷酸酯DNA(PB-DNA)[27]。序列为all-(Sp)-d(GBTB(ABCBTB)3T)。使用CPG(可控孔度玻璃)作为固相载体、反应容器使用下部具有旋塞的玻璃过滤器(10mm×50mm)进行。分离效率为1.5％。
此外，详细的反应条件记载于下述表4。
[化学式21]
Figure BDA0003564624860000491
[表4]
Figure BDA0003564624860000492
上述表4中，单体单元表示化合物20a-d。
图8为示出了(O)all-(Sp)-d(GBTB(ABCBTB)3T)[27]的合成反应液(粗)及(P)all-(Sp)-d(GBTB(ABCBTB)3T)[27]的纯化物的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：在0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至40％进行60分钟线性梯度。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000501
3.9mm×150mm)(Waters)
<硼烷磷酸酯DNA的合成3(比较例)>
按照下述方案合成了硼烷磷酸酯DNA(PB-DNA)[28、29]。序列为all-(Sp)-d(CBABGBTB)2(CBABGB)T[28]或all-(Rp)-d(CBABGBTB)2(CBABGB)T[29]。使用CPG(可控孔度玻璃)作为固相载体、反应容器使用下部具有旋塞的玻璃过滤器(10mm×50mm)进行。
此外，详细的反应条件记载于下述表5。
[化学式22]
Figure BDA0003564624860000511
[表5]
Figure BDA0003564624860000521
图9为示出了(Q)all-(Sp)-d(CBABGBTB)2(CBABGB)T[28]的合成反应液(粗)及(R)all-(Rp)-d(CBABGBTB)2(CBABGB)T[29]的合成反应液(粗)的反相HPLC的结果的HPLC图谱。
反相HPLC的测定条件如下所述。
梯度循环：0.1M三乙基铵缓冲液(pH7.0)中，使乙腈在0％至40％进行60分钟线性梯度。
测定温度：30℃
流速：0.5mL/min
色谱柱：μBondasphere 5μm C18 column(
Figure BDA0003564624860000522
3.9mm×150mm)(Waters)
由图9可知，根据本比较例无法合成出硼烷磷酸酯DNA。

Claims (4)

1.下述式E-1～式E-4任一项所示的聚合性化合物：
Figure FDA0003564624850000011
式E-1～式E-4中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R3表示氢原子或羟基的保护基团，R4表示羟基的保护基团，R5表示氢原子、具有保护基团的羟基、卤原子或者烷氧基，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构；
式B-1～式B-5中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RpC、R pA及RpG表示在酸性条件下被除去的保护基团，RpC2表示烷基，RpG2表示保护基团，RpG3表示在酸性条件下被除去的保护基团或氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
2.一种化合物，包含：
下述式T-1所示的结构单元，
下述式D-1或式D-2所示的结构单元，以及
至少一种衍生自下述式E-1～式E-4所示的结构单元；
Figure FDA0003564624850000021
式T-1中，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，Z表示式B-6～式B-9中的任意式所示的结构，*及**表示与其它结构的结合部位；
式D-1或D-2中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，R3表示氢原子或羟基的保护基团，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构，TfO表示三氟甲磺酸阴离子，●表示与其它结构的结合部位，在式E-1～式E～4中，R1表示给电子性基团，n表示1～5的整数，R3表示氢原子或羟基的保护基团，R4表示羟基的保护基团，R5表示氢原子、具有保护基团的羟基、卤原子或者烷氧基，X表示式B-1～式B-5中的任意式所示的结构；
式B-1～式B-5中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RpC、R pA及RpG表示在酸性条件下被除去的保护基团，RpC2表示烷基，RpG2表示保护基团，RpG3表示在酸性条件下被除去的保护基团或氢原子，波浪线部表示与其它结构的结合部位；
式B-6～式B-9中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RC、R A及RG表示氢原子，RC2表示烷基，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
3.根据权利要求2所述的化合物，其进一步包含下述式C-1或式C-2所示的结构单元中的任意一者或两者：
Figure FDA0003564624850000031
式C-1或式C-2中，R2表示氢原子、卤原子或-ORO，RO表示氢原子、烷基或羟基的保护基团，Z表示式B-6～式B-9中的任意式所示的结构，**及●表示与其它结构的结合部位；
式B-6～式B-9中，RT表示氢原子、烷基、烯基、或炔基，RC、R A及RG表示氢原子，RC2表示烷基，波浪线部表示与其它结构的结合部位。
4.硼烷磷酸酯低聚物的制造方法，其包括使权利要求1所述的聚合性化合物进行缩合的工序。
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