CN114617062B

CN114617062B - 鳄嘴花组培快繁方法

Info

Publication number: CN114617062B
Application number: CN202210113530.1A
Authority: CN
Inventors: 王文莉; 王鹏; 陈丹凌; 沈向
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2022-01-30
Filing date: 2022-01-30
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-01-30
Also published as: ZA202202662B; CN114617062A

Abstract

本发明公开了鳄嘴花组培快繁方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括以下步骤：(1)外植体选择和消毒：以新生嫩枝作为外植体进行消毒处理；(2)腋芽生长诱导：将消毒后的嫩枝切成茎段接入诱导培养基，诱导腋芽生长；(3)丛生芽诱导和继代培养：将由腋芽生长得到的侧枝切成小段接入分化培养基，诱导长出丛生芽，再将所得丛生芽接入分化培养基中继代培养；(4)生根培养：将继代培养所得的丛生芽切下接入生根培养基中培养得到生根苗；(5)炼苗移栽：将所得生根苗炼苗3d后移栽至沙床培养。本发明建立了快速稳定有效的鳄嘴花快繁技术体系，能有效的运用于生产中，为今后鳄嘴花的开发利用规模化生产提供科学依据和技术保障。

Description

鳄嘴花组培快繁方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及鳄嘴花组培快繁方法。

背景技术

鳄嘴花[Clinacanthus nutans(Burm.f.)Lindau]是爵床科(Acanthaceae)鳄嘴花属直立高大草本植物，又名忧遁草、接骨草，在我国华南热带和东南亚国家分布。鳄嘴花含有较高类黄酮物质，含白桦脂醇、五环三萜化合物羽扇豆醇、异牡荆苷等。全株可入药，有调经、消肿、祛瘀、消炎、止痛、接骨之效，有治疗跌打、贫血，黄疽、风湿以及降血脂等功效，有研究表明鳄嘴花对抗癌有很好功效。另外在我国海南、云南等地区，鳄嘴花嫩茎叶被作为一种叶菜普遍食用，是一种药食同源的植物。

随着对鳄嘴花药用价值和食用价值认识的不断加深，商业开发的不断拓展，其作为一种传统药用植物和食材，野生资源已经远远不能满足当前需求，急需要人工繁殖以满足相应市场需求。目前鳄嘴花的繁殖主要靠扦插繁殖，但扦插繁殖系数低，扦插材料与开发使用部分相冲突，加之不耐低温等生长条件限制，很难满足大规模种植需要。植物组织培养和快繁可以在短时间内提供大量性状、生长一致的优良种苗，为鳄嘴花的规模化生产提供了便利途径。近年来，Bihua Chen(2015)、王强(2018)等，以鳄嘴花茎段为外植体，建立了鳄嘴花离体快繁体系。但在壮苗环节需要添加有机物，且重复试验中，因种苗来源不同，在丛生芽发生阶段，不能很好的产生丛生芽，基部产生愈伤、丛芽(或侧芽)生长不均匀现象普遍。因此，建立一种新的鳄嘴花组培快繁体系非常有必要。

发明内容

本发明的目的是提供鳄嘴花组培快繁方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明建立的组培快繁方法能够使得鳄嘴花移栽成活率达100％，可在短期内提供大量优质种苗，为今后鳄嘴花的开发利用规模化生产提供科学依据和技术保障。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供鳄嘴花组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体选择和消毒：以新生嫩枝作为外植体，清洗干净后进行消毒处理；

(2)腋芽生长诱导：将消毒后的嫩枝切成茎段接入诱导培养基，诱导腋芽生长；所述诱导培养基包括：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L；

(3)丛生芽诱导和继代培养：将由腋芽生长得到的侧枝切成小段接入分化培养基，诱导长出丛生芽，再将所得丛生芽接入分化培养基中继代培养；所述分化培养基包括：MS+CPPU0.1mg/L+KT0.2mg/L+NAA 0.05mg/L；

(4)生根培养：将继代培养所得的丛生芽切下接入生根培养基中培养得到生根苗；所述生根培养基包括：1/2MS+IBA 0.2mg/L+2％蔗糖或MS+6-BA0.1mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+3％蔗糖；

(5)炼苗移栽：将所得生根苗炼苗3d后移栽至沙床培养。

进一步地，步骤(1)中，在清洗干净操作之前，将所述嫩枝剪成7-8cm茎段。

进一步地，步骤(1)所述清洗干净具体为先在自来水下冲洗，然后再用洗衣粉浸泡3-5分钟，再流水冲洗40min。

进一步地，步骤(1)所述消毒处理为将清洗干净的外植体先用无菌水冲洗2遍，吸干水分，用体积分数为75％酒精消毒35-40s，再用无菌水冲洗2遍，吸干水分，用质量百分比为2％的次氯酸钠溶液消毒20-25min，最后用无菌水冲洗3遍，吸干水分。

进一步地，步骤(2)所述茎段为1.5-2cm长的带腋芽的小段。

进一步地，步骤(3)中，将得到的侧枝接入培养基之前，先将所述侧枝切成高0.6-1.5cm，至少含一个茎节的茎段或顶梢。

进一步地，步骤(4)中，在接入生根培养基之前，先将继代培养的丛生芽分割成高度为1-1.5cm的茎段或顶梢。

进一步地，所述茎段接入的生根培养基包括：MS+6-BA0.1mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+3％蔗糖，所述顶梢接入的生根培养基包括：1/2MS+IBA 0.2mg/L+2％蔗糖。

进一步地，步骤(5)所述培养条件为保持50％遮阴，湿度85％，温度20-30℃。

进一步地，步骤(1)-步骤(4)中组培条件为温度26±1℃，光照时间13.5h/d，光照强度2500lx。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以鳄嘴花新生嫩枝为外植体，在不同组合培养基中添加不同种类和浓度的激素，进行组培快繁试验，通过探究不同植物生长调节剂对鳄嘴花茎段腋芽诱导、丛生芽分化、增殖及生根培养的影响，研究和优化鳄嘴花组织培养快速繁殖方法。结果表明，MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L培养基最有利于茎段腋芽的诱导和生长，诱导率为90％；培养基MS+CPPU0.1mg/L+KT 0.2mg/L+NAA0.05mg/L为鳄嘴花腋芽诱导分化丛生芽最佳培养基，分化率100％，繁殖系数为5.02；芽苗选择顶梢和茎段最佳培养基有所不同，顶梢生根培养基选用1/2MS+IBA 0.2mg/L+2％蔗糖最佳，生根率达100％，茎段最佳生根培养基为MS+6-BA0.1mg/L+KT 0.05mg/L+NAA 0.05mg/L+3％蔗糖，生根率达100％，且根系发达，芽苗生长健壮；以洁净河沙为基质炼苗移栽，鳄嘴花成活率100％。由此可见，本发明建立了快速稳定有效的鳄嘴花快繁技术体系，能有效的运用于生产中，解决了繁殖效率低的问题，可在短期内提供大量优质种苗，为今后鳄嘴花的开发利用规模化生产提供科学依据和技术保障。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明鳄嘴花茎段组培快繁生长状况，其中图A-C分别为鳄嘴花茎段在培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L中培养10d，20d，30d的诱导情况；图D-F分别为鳄嘴花在培养基MS+CPPU 0.1mg/L+KT 0.2mg/L+NAA 0.05mg/L中培养10d，20d，30d诱导情况；图G为鳄嘴花在培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L中培养30d诱导情况；图H为鳄嘴花顶梢在培养基为1/2MS+IBA0.2+2％蔗糖中培养25d生根诱导及生长情况；图I为鳄嘴花茎段在培养基为MS+6-BA0.1mg/L+KT 0.05mg/L+NAA0.05mg/L+3％蔗糖中培养25d生根诱导及生长情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

1.1试验材料

试验材料取自从海南省五指山采集的优良野生植株，采集植株高度72cm，连根一同挖起，在根颈上部15cm处平剪后盆栽养护，待新枝萌发长至15-20cm时选取健壮无病虫害上部枝条，去除叶片和嫩梢，剪成小段(7-8cm)。先在自来水下冲洗，然后再用洗衣粉浸泡3-5分钟，再流水冲洗40min。将冲洗干净的鳄嘴花茎段在超净工作台上，用无菌水冲洗2遍，无菌滤纸吸干表面水分，用75％酒精消毒35-40s，无菌水冲洗2遍，无菌滤纸吸干水分，用2％次氯酸钠溶液消毒20-25min，无菌水冲洗3遍，无菌滤纸吸干水分，备用。

1.2培养条件

试验所用培养基为MS和B5培养基，pH5.8，在121℃下高压灭菌15min；培养温度26±1℃，光照时间13.5h/d，光照强度2500lx。

1.3试验方法

1.3.1鳄嘴花茎段腋芽诱导

把消毒好的鳄嘴花新生嫩枝切成1.5-2cm小段，每段带一对腋芽，分别接种于不同组合生长调节剂的4种培养基上(表1)，每瓶接种一枝，每组合接种20个茎段，30d后观察诱导结果(见图1A-C)。

1.3.2丛生芽诱导和继代培养

以鳄嘴花腋芽诱导长出的侧枝(约3.5-4.5cm)为材料，切成长0.6-1.5cm，至少含一个茎节的茎段或顶梢，分别接种于不同生长调节剂组合的培养基中(表2)，每组接种40个，每瓶10个，共4瓶，重复3次。30d后统计各组丛生芽诱导和生长情况(见图1D-G)。30d后进行继代培养，将诱导出的丛芽分割，每丛2-3个芽，接种于继代培养基上，每瓶10丛，继续培养，培养周期30d。

1.3.3生根培养

将继代培养30d的丛生芽分割，将高度1cm-1.5cm的芽苗(顶梢和茎段)接种于不同基本培养基和不同组合生长调节剂的培养基上(表3)，每瓶10个，每组接种40株，重复3次。25d后统计生根情况和生长情况(见图1H、I)。

1.3.4炼苗移栽

将生根培养基中培养25d的生根瓶苗，在温室中半遮阴自然光下，拧松瓶盖，炼苗3d。炼苗后将苗用镊子取出，清洗干净培养基。清洗干净后，将其移栽于已经消毒的沙床。保持50％遮阴，湿度85％，温度20-30℃。10d后，早晚撤去遮阴网，每隔7d用花宝2号肥料1500倍液喷雾施肥。

2结果与分析

2.1鳄嘴花试验材料消毒

鳄嘴花新生嫩枝用2％次氯酸钠溶液消毒20-25min，30d后污染率23％，相比于0.1％升汞溶液消毒15min污染率6％，污染率偏高，但通过两种消毒方式均能够获得良好的鳄嘴花无菌材料，建立无菌繁殖体系。考虑升汞的毒性和危害性，本试验采用2％次氯酸钠溶液消毒20-25min。

2.2鳄嘴花茎段腋芽诱导

以鳄嘴花幼嫩茎段为外植体，在添加不同浓度生长调节剂的MS培养基中，15d后有一侧腋芽长出。由表1看出，3号培养基，即MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L最有利于茎段腋芽的诱导和伸长，生长健壮，诱导率为90％。

表1不同组合培养基对鳄嘴花幼嫩茎段腋芽诱导的影响

2.3丛生芽诱导和继代培养

由表2可以看出，在基础培养基选择上，B5培养基和MS培养基均能诱导侧芽或丛生芽，从整体长势和丛生芽发生程度来看，MS培养基优于B5培养基。在生长调节剂上，使用6-BA+NAA组合和6-BA+KT+NAA组合能很好的诱导出侧芽，但很难产生丛生芽，首先是随着侧芽生长，仅1-2根侧芽迅速伸长，呈现出抑制基部侧芽的发生和生长现象；其次，随着6-BA浓度增加(2.0mg/L以上)，基部愈伤组织也随之变大，超过30d，愈伤组织褐化、松软。而含CPPU的培养基在促进鳄嘴花丛生芽发生上起到显著作用，10d可观察到基部侧芽长出，并在新长出的侧芽基部出现丛生芽点；20d时在新侧芽下方出现密集丛芽，但不同组合在丛生芽的生长上表现不同。综合来看，MS+CPPU0.1mg/L+KT0.2mg/L+NAA 0.05mg/L能很好的诱导丛生芽，诱导率100％，兼顾了丛生芽的发生和丛生芽的伸长，且不会或很少产生愈伤，可作为丛芽诱导和继代最佳组合配方。通过继代培养，每月增殖比率平均为5.02。

表2不同组合培养基对鳄嘴花丛生芽诱导的影响

2.4生根培养

将继代培养的丛生芽分割，将高度1-1.5cm的茎段和顶芽接种在不同组合的生根培养基上，5d后可观察到在鳄嘴花下部茎段上长出白色幼根。20d后生根率100％，平均根长超过3.5cm，最长6cm。从表3可以看出，鳄嘴花生根相对较快，综合分析认为，顶梢最佳生根培养基1/2MS+IBA 0.2mg/L+2％蔗糖，茎段最佳生根培养基MS+6-BA0.1mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+3％蔗糖。添加NAA和IBA混合液的1/2MS培养基与N6+IBA培养基在生长过程中中上部叶片黄化，效果较差。

表3不同组合培养基对鳄嘴花生根诱导的影响

2.5炼苗移栽

将炼苗3d的生根苗取出，清洗干净，修剪掉老根和过长根。在1000倍百菌清或多菌灵溶液中浸泡10min后栽种于消毒过的炼苗沙床。沙床用普通河沙即可，须过筛掉较大颗粒。20天后检查，生根苗成活率100％。成活后逐渐减少空气湿度直至与外界持平，增加光照至自然光照强度。40d后茎叶生长迅速，平均高度>8cm，植株健壮，此时便可进行移栽。鳄嘴花在保证一定温度和湿度的前提下，炼苗成活率高。河沙作为炼苗移栽基质，价格低廉，可循环利用，降低了生产成本；同时在移栽时对鳄嘴花根系损伤小，有利于定植移栽。

3讨论

鳄嘴花直立性强，侧枝少，具有明显的顶端优势。在丛生芽诱导阶段，在侧芽长出后很难在基部诱导新的侧芽。植物组织培养中，细胞***素能有效打破顶端优势，在诱导侧芽和丛生芽方面应用广泛；结合细胞***素/生长素不同比例，能很好的达到芽产生数量和生长长高速度间的均衡。在生长调节剂选择方面，以往研究中鳄嘴花丛生芽诱导主要采用6-BA、NAA组合(Bihua Chen(2015)、王强(2018))，低浓度的6-BA可以诱导出1-2个侧芽；随着6-BA浓度增加，在诱导多个侧芽甚至丛芽团的同时，基部产生愈伤并快速生长膨大，同时随着周期延长，丛芽中1-2条新芽快速生长，同时抑制其他侧芽，使它们生长缓慢甚至停止生长，不能形成有效丛生芽，达不到增殖继代和快繁目的。

CPPU(氯吡苯脲)是一种具有细胞***素活性的苯脲类植物生长调节剂，能促进细胞***、分化和扩大，促进器官形成、叶绿素合成，打破顶端优势，促进侧芽生长，提高光合效率，防止植株衰老。CPPU生物活性比6-BA高10-100倍，诱导细胞***和促进器官发生的活性远远高于一般嘌呤类细胞***素的活性。在农业生产中常用于单性结实和块根块茎和果实增产。本发明表明，CPPU在诱导鳄嘴花丛生芽上起到关键作用，能很好的打破顶端优势，产生侧芽。CPPU使用浓度在0.05mg/L-0.1mg/L，能有效诱导鳄嘴花丛生芽，结合低浓度NAA，有效解决了鳄嘴花丛生芽诱导过程中愈伤和培养周期内生长不均匀问题。随着CPPU浓度增加，鳄嘴花茎段产生更多丛生芽，但生长缓慢；而随着NAA浓度增加，丛生芽减少，出现上述1-2枝快速生长，同时抑制其他侧芽生长的现象。

鳄嘴花生根相对容易，以往研究中，鳄嘴花生根只采用含有生长素的培养基。实际实验发现，在仅有生长素的培养基中，带顶芽茎段与无顶芽茎段表现并不一致，有顶芽茎段能快速生根生长，而无顶芽茎段侧芽萌发缓慢，只有在侧芽长出后快速生长，周期明显长于带顶芽茎段。本发明利用低浓度6-BA、KT结合IBA，则能快速诱导出无顶芽茎段产生侧芽，生根长高。相较于仅仅使用生长素培养基，含有低浓度***素的培养基能明显缩短生长周期，且生根长势良好。

本发明从外植体到获得生根苗需要85d，由于生根过程中最快15天即可生根，因此最快可缩短至75天。而本发明在获得丛生芽后，可以不断转接和重复，生根与增殖同时进行(在取得丛生芽后，可以用来生根，也可以用来继续转接增殖)，每个周期仅30d，大大缩短周期的同时，增殖倍数显著提高，这在生产中可以满足短期内提供大量种苗要求，具有很重要的意义。同时，本发明同时利用了没有顶芽的茎段进行生根，充分利用了材料，提高了利用率。

在实际生产中，周期的缩短，意味着生产成本的降低，生产效率的提高，这对鳄嘴花组培生产有着重要意义。

4结论

本研究表明，在鳄嘴花组织培养中，CPPU在鳄嘴花茎段诱导丛生芽上起着关键作用，MS培养基结合0.1mg/L CPPU、0.2mg/L KT和0.05mg/LNAA是鳄嘴花茎段诱导丛芽最佳组合；带顶芽茎段最佳生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+2％蔗糖，无顶芽茎段最佳生根培养基MS+6-BA0.1mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+3％蔗糖。本研究有效建立了新的鳄嘴花组培快繁体系，尤其是丛生芽成功诱导和继代，从外植体到获得生根瓶苗，最快85d，每月通过增殖继代培养，增殖倍数5倍以上，对鳄嘴花规模化生产提供了有效技术支持，更是对长江以北规模化生产和保存种苗具有重要实际意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体选择和消毒：以新生嫩枝作为外植体，清洗干净后进行消毒处理；

（2）腋芽生长诱导：将消毒后的嫩枝切成茎段接入诱导培养基，诱导腋芽生长；所述诱导培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L；

（3）丛生芽诱导和继代培养：将由腋芽生长得到的侧枝切成小段接入分化培养基，诱导长出丛生芽，再将所得丛生芽接入分化培养基中继代培养；所述分化培养基为：MS+CPPU0.1mg/L+KT0.2mg/L+NAA 0.05mg/L；

（4）生根培养：在接入生根培养基之前，先将继代培养的丛生芽分割成高度为1-1.5cm的茎段或顶梢；茎段接入的生根培养基为：MS+6-BA0.1mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L＋3％蔗糖，顶梢接入的生根培养基为：1/2MS+IBA 0.2 mg/L＋2％蔗糖；

（5）炼苗移栽：将所得生根苗炼苗3d后移栽至沙床培养。

2.根据权利要求1所述的鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）中，在清洗干净操作之前，将所述嫩枝剪成7-8cm茎段。

3.根据权利要求1所述的鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）所述清洗干净具体为先在自来水下冲洗，然后再用洗衣粉浸泡3-5分钟，再流水冲洗40min。

4.根据权利要求1所述的鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）所述消毒处理为将清洗干净的外植体先用无菌水冲洗2遍，吸干水分，用体积分数为75%酒精消毒35-40s，再用无菌水冲洗2遍，吸干水分，用质量百分比为2%的次氯酸钠溶液消毒20-25min，最后用无菌水冲洗3遍，吸干水分。

5.根据权利要求1所述的鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)所述茎段为1.5-2cm长的带腋芽的小段。

6.根据权利要求1所述的鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，步骤（3）中，将得到的侧枝接入培养基之前，先将所述侧枝切成高0.6-1.5cm，至少含一个茎节的茎段或顶梢。

7.根据权利要求1所述的鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，步骤（5）中培养条件为保持50%遮阴，湿度85%，温度20-30℃。

8.根据权利要求1所述的鳄嘴花组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）-步骤（4）中组培条件为温度

，光照时间13.5h/d，光照强度2500lx。