CN114615998A - 缀合物及其用途 - Google Patents

缀合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114615998A
CN114615998A CN202080071067.8A CN202080071067A CN114615998A CN 114615998 A CN114615998 A CN 114615998A CN 202080071067 A CN202080071067 A CN 202080071067A CN 114615998 A CN114615998 A CN 114615998A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
conjugate
peptide
suitably
bala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080071067.8A
Other languages
English (en)
Inventor
马修·伍德
米格尔·瓦雷拉
阿诗琳·霍兰德
理查德·拉兹
丹尼斯·弗林
阿诺·克莱因
迈克尔·盖特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Association Institut de Myologie
Sorbonne Universite
Oxford University Innovation Ltd
United Kingdom Research and Innovation
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Association Institut de Myologie
Sorbonne Universite
Oxford University Innovation Ltd
United Kingdom Research and Innovation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Association Institut de Myologie, Sorbonne Universite, Oxford University Innovation Ltd, United Kingdom Research and Innovation filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of CN114615998A publication Critical patent/CN114615998A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及由与治疗分子连接的细胞穿透肽载体形成的缀合物，其中所述肽载体由特定结构域定义，并且所述治疗分子是由三核苷酸重复形成的核酸。本发明进一步涉及这种缀合物在治疗方法中或作为药物的用途，特别是在三核苷酸重复病症例如强直性肌营养不良症(DM1)的治疗中的用途。

Description

缀合物及其用途
技术领域
本发明涉及肽载体与治疗分子的缀合物，其中所述肽载体由特定结构域定义，并且所述治疗分子是由三核苷酸重复形成的核酸。本发明进一步涉及这种缀合物在治疗方法中或作为药物的用途，特别是在三核苷酸重复病症例如强直性肌营养不良(DM1)的治疗中的用途。
背景技术
核酸疗法是能够改变人类医疗保健的基因组药物。研究表明，此类疗法可以在广泛的疾病领域中得到应用。特别地，应用基于反义寡核苷酸的方法来调节mRNA表达已成为精准医学前沿的理想治疗手段。
然而，这些有前景的反义疗法的治疗发展受到细胞外显率不足和分布特征差的阻碍。
因此，迫切需要改善反义寡核苷酸的递送，以便为遗传性疾病，如毁灭性三核苷酸重复病症，提供更有效的疗法。
三核苷酸重复病症是一种遗传性疾病，其特征是基因组DNA中三个核苷酸的特定序列的重复数量异常多，也称为三核苷酸重复扩增。三核苷酸重复扩增是一种特定类型的微卫星重复，通常称为微卫星扩增。典型地，在正常健康受试者中存在重复的阈值数量，如果超过此数量，则该疾病会发病。疾病和受影响基因的阈值数量不同。通常在这些疾病中，重复数量可以指示疾病的严重程度。一般地，重复数量越多表明疾病的表现越严重。重复数量也可用于预测疾病的发病年龄，重复数量越高表明发病越早。
目前，已知有14种影响人类的三核苷酸重复病症。这些病症可以通过多种方法进行分组，例如根据三核苷酸重复在基因中的位置，是否在蛋白质编码ORF中；在外显子中；或在未翻译的区域中。或者，它们可以按三联体重复(triplet repeat)的序列进行分组。在许多三核苷酸病症中，所述三联体重复是“CAG”并编码谷氨酰胺，这组病症通常被称为聚谷氨酰胺病症。然而，具有其他序列的三核苷酸重复是已知的，并且可以分组为非聚谷氨酰胺重复病症。
一种称为非聚谷氨酰胺重复病症的三核苷酸病症是1型强直性肌营养不良(DM1)。DM1是由DMPK基因的3'UTR中存在的三核苷酸重复“CTG”引起的。该基因的正常重复数量在5到34个重复之间。多于34个重复，可能会出现一些疾病症状，而多于50个重复该疾病则会发病。
DM1和其他三核苷酸重复病症通常会影响神经肌肉***，并且目前没有任何有效的治疗方法。
虽然可以结合重复区域并中断剪接或翻译的反义寡核苷酸的使用已经在理论上提出并在体外得到了证明，但由于难以将这些分子递送到受影响的细胞中，因此无法将这种反义寡核苷酸用作治疗剂。治疗多种遗传疾病就是这种情况，包括三核苷酸重复病症。
已经提出使用病毒作为递送媒介物，但是由于病毒外壳蛋白的免疫毒性和潜在的致癌作用，其使用受到限制。备选地，已经开发了多种非病毒递送载体，其中显示了肽(由于其尺寸小、靶向特异性和大生物货物的跨毛细血管递送的能力)是最有前景的。已经报道了几种肽的能力，这些肽可以单独地或携带生物货物渗透细胞。
多年来，细胞穿透性肽已与反义寡核苷酸(尤其是电荷中性的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)和肽核酸(PNA))缀合，以增强此类寡核苷酸类似物的细胞递送，通过有效地携带此类寡核苷酸类似物跨细胞膜到达其在细胞核中的前mRNA靶位。已经表明，与某些富含精氨酸的肽缀合的PMO治疗剂(称为P-PMO或肽-PMO)可以有效地渗入到相关细胞中。
特别地，已经开发了PNA/PMO内化肽(Pips)，其是富含精氨酸的CPP，其由两个被中央短疏水序列隔开的富含精氨酸的序列组成。这些“Pip”肽的设计旨在提高血清稳定性，同时保持高水平的外显子跳跃，最初是通过将其附着到PNA货物上来实现的。这些肽的其他衍生物被设计为PMO的缀合物，在小鼠全身性施用后，它们在DMD模型中被证明可导致全身骨骼肌治疗，并且重要的是还包括心脏。
尽管这些载体肽是有效的，但是其相关的毒性阻碍了它们的治疗应用。
还已经产生了具有单个富含精氨酸的结构域的替代载体肽，例如R6Gly。这些肽已被用于生产具有降低了毒性的反义寡核苷酸的肽缀合物，但是与Pip肽相比，这些缀合物表现出低功效。
此外，几乎所有载体肽的开发都是在治疗DMD的情况下进行的。已证明具有疏水核心结构域的肽在DMD的情况下特别活跃。尚未对此类载体肽在具有不同病因和不同病理的其他神经肌肉疾病中的用途进行研究。
因此，目前可用的载体肽尚未被证明适合在具有用于治疗遗传病症的核酸治疗剂的缀合物中使用，特别是不适用于由不同病理引起的疾病，例如三核苷酸重复病症。
载体肽技术领域的挑战是使功效和毒性分离。本发明的发明人现在已经鉴定、合成和测试了包含改进的载体肽的缀合物，所述载体肽具有特定结构，共价连接到用于治疗三核苷酸病症的治疗性核酸，其至少解决了该问题。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种缀合物，其包含：与治疗分子共价连接的肽载体；
其中所述肽载体的总长度为40个或更少的氨基酸，并且包含：两个或多个阳离子结构域，每个阳离子结构域包含至少4个氨基酸残基以及一个或多个疏水结构域，每个疏水结构域包含至少3个氨基酸残基，其中所述肽载体不含人工氨基酸残基；
并且其中所述治疗分子包含核酸，其中所述核酸包含多个三核苷酸重复。
根据本发明的第二方面，提供了根据第一方面的缀合物用于用作药物。
根据本发明的第三方面，提供了治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的根据第一方面的缀合物。
根据本发明的第四方面，提供了根据第一方面的缀合物用于预防或治疗三核苷酸重复病症。
根据本发明的第五方面，提供了预防或治疗受试者的三核苷酸重复病症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的根据第一方面的缀合物。
根据本发明的第六方面，提供了包含根据第一方面的缀合物的药物组合物。
在第二、第三、第四或第五方面的一个实施方案中，所述缀合物包含在药物组合物中。
现在将在以下标题部分中描述本发明的其他特征和实施方案。除非另有明确说明，否则任何特征都可以与上述方面或本文中的其他特征以任何相容的组合进行组合。个别特征不限于任何特定实施方案。本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
全文提及的“肽载体”表示适合将与其缀合的分子转运到细胞中的肽，即细胞穿透性肽。术语“细胞穿透性肽”和“肽载体”和“肽”在全文中可以互换使用。
始终以“X”表示任何形式的人工的、合成制备的氨基酸氨基己酸。
始终以“B”表示天然但非遗传编码的氨基酸β-丙氨酸。
始终以“Ac”表示相关肽的乙酰化。
始终以“Hyp”表示天然但非遗传编码的氨基酸羟脯氨酸。
始终以大写字母表示根据公认的字母氨基酸代码的相关遗传编码的氨基酸残基
本文提及的“人工”氨基酸或残基表示任何不是天然存在的氨基酸，并且包括合成氨基酸、修饰氨基酸(例如用糖修饰的氨基酸)、非天然氨基酸、人造氨基酸、间隔子和非肽键合的间隔子。为了避免疑义，在本发明的背景中，氨基己酸(X)是人工氨基酸。为了避免疑义，β-丙氨酸(B)和羟脯氨酸(Hyp)是天然存在的，因此在本发明的背景中不是人工氨基酸，而是天然氨基酸。人工氨基酸可包括例如6-氨基己酸(X)、四氢异喹啉-3-羧酸(TIC)、1-(氨基)环己烷羧酸(Cy)和3-氮杂环丁烷羧酸(Az)、11-氨基十一烷酸。
本文提及的“阳离子”表示在生理pH下具有总体正电荷的氨基酸或氨基酸的结构域。
“富含精氨酸”或“富含组氨酸”是指至少40％的阳离子结构域由所述残基形成。
本文所提及的“疏水性”表示具有排斥水的能力的或不与水混合的氨基酸或氨基酸的结构域。
具体实施方式
本发明基于以下发现：将特定的肽载体与适合预防和治疗三核苷酸重复病症的核酸结合，允许核酸有效地穿透靶细胞并结合存在于受影响受试者的基因中的靶三核苷酸重复扩增。这种活性降低了细胞中存在的重复扩增转录物和/或蛋白质的水平，从而阻断了它们与细胞剪接机制的病理相互作用，使剪接正常化并改善所述受试者的生理状况。
有利地，本文所述的肽载体似乎增加了治疗性核酸抵抗降解、穿透靶细胞和到达靶三核苷酸扩增以提供治疗的能力。此外，本发明的缀合物具有比用已知肽载体形成的缀合物低得多的毒性。因此，该缀合物提供了一种有效递送用于三核苷酸重复病症的核酸疗法同时对受试者保持无毒的手段。
发明人认为，这是第一次证明任何具有疏水核心的肽载体在治疗DMD范围之外的神经肌肉疾病方面是有效的。先前的研究集中在使用肽载体递送治疗DMD的治疗剂。DMD的病理学与三核苷酸重复病症的病理学相比是完全不同的。特别是DMD涉及活跃的肌肉退化和肌肉转换(muscle turnover)和修复，包括炎症，而三核苷酸重复病症如1型强直性营养不良(DM1)涉及没有明显退化的肌肉功能障碍。本发明的发明人认为肽载体与肌肉膜相互作用以允许有效递送治疗分子，因此，它们与之相互作用的膜类型在退行性肌肉和非退行性肌肉之间(即，在DMD与三核苷酸重复病症之间)差异很大。与DMD等退行性疾病相反，在DM1中，肌肉膜没有被破坏，因此预计缀合物渗入到肌肉组织会受到抑制并且更难以实现。然而，基于本文提供的数据，肽载体不仅首次显示可有效递送至非退行性肌肉以治疗DM1，而且出乎意料地显示对DM1比DMD更有效。
在本文提供的数据中，本发明的缀合物保持良好水平的功效并递送至受三核苷酸病症影响的关键靶组织，例如腓肠肌和股四头肌骨骼肌。此外，这些缀合物，与用于相同的缀合物中时的以前可获得的载体肽相比，表现出功效上的改善。本发明的缀合物靶向突变CUG扩增-DMPK转录物以防止核聚集点(nuclear foci)的形成，从而防止核RNA聚集点对MBNL1剪接因子的有害隔离，因此减轻导致多个基因中的剪接缺陷和肌肉功能障碍的MBNL1功能损失。
这在本文中通过在施用本发明的缀合物后由含有扩增的DMPK转录物形成的聚集点的数量减少和在施用本发明的缀合物后基因的剪接纠正来证明，所述基因在DM1中由于被三核苷酸重复扩增转录物隔离的MBNL1的可用性降低通常错接。具体地，与未处理的细胞/受试者相比，本文展示的缀合物对不包括clicn1外显子7a和mblnl1外显子5以及包括serca外显子22的健康对照显示出50-90％的剪接纠正。。这进一步通过三核苷酸病症的生理状况的改善得到证实，如本文在DM1模型中所示，其中小鼠的肌强直被恢复正常并被纠正到完全恢复的程度，即使在单次注射本文所述的缀合物之后。
令人惊讶的是，发明人发现在缀合物中使用的肽载体将治疗分子以足够的浓度有效地递送到核隔室中，并递送到DMPK转录物的核聚集体中以允许与CUG突变的有利化学计量相互作用。
同时，本发明的缀合物在体内有效发挥作用，其中在全身注射后具有减轻的临床病征，并通过测量生化标记物观察到了较低的毒性。关键地，本发明的缀合物在类似的全身注射入小鼠后，被证明与相同缀合物中的先前的载体肽相比显示出惊人的降低的毒性。如本文所证明的，与盐水相比，本发明的缀合物在治疗相关剂量不会引起毒性标志物的显著增加，并且维持细胞生存力，而使用现有肽载体的缀合物显示出显著的细胞死亡率。当将缀合物施用于小鼠时，小鼠具有快速恢复时间，这比施用以先前可用的肽形成的缀合物后快得多。
因此，本发明的缀合物提供了改进的适用性，可用作人类三核苷酸重复病症的安全有效疗法，从而为治疗这些原本无法治疗的毁灭性疾病提供了途径。
人工氨基酸
本发明涉及包含具有特定结构的载体肽的缀合物，其中不存在人工氨基酸残基。
适当地，所述肽不包含氨基己酸残基。适当地，所述肽不包含任何形式的氨基己酸残基。适当地，所述肽不包含6-氨基己酸残基。
适当地，所述肽仅包含天然氨基酸残基，并因此由天然氨基酸残基组成。
适当地，通常在细胞穿透性肽中使用的人工氨基酸如6-氨基己酸被天然氨基酸替代。适当地，通常在细胞穿透性肽中使用的人工氨基酸例如6-氨基己酸被选自β-丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸和组氨酸或羟脯氨酸的氨基酸替代。
在一个实施方案中，氨基己酸被β-丙氨酸代替。适当地，6-氨基己酸被β-丙氨酸代替。
在一个实施方案中，氨基己酸被组氨酸代替。适当地，6-氨基己酸被组氨酸代替。
在一个实施方案中，氨基己酸被羟脯氨酸代替。适当地，6-氨基己酸被羟脯氨酸代替。
适当地，通常在细胞穿透性肽中使用的人工氨基酸例如6-氨基己酸可以用β-丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸和组氨酸或羟脯氨酸的任一种的组合代替，适当地，β-丙氨酸、组氨酸和羟脯氨酸的任一种的组合。
在一个实施方案中，所述肽载体的总长度可以为40个或更少的氨基酸残基，所述肽包括：
两个或更多个阳离子结构域，每个阳离子结构域包含至少4个氨基酸残基；以及
一个或多个疏水性结构域，每个疏水性结构域至少包含3个氨基酸残基；
其中至少一个阳离子结构域包含组氨酸残基。
适当地，其中至少一个阳离子结构域富含组氨酸。
适当地，富含组氨酸的含义在本文中是相对于阳离子结构域来限定的。
阳离子结构域
本发明涉及包含具有特定结构的短肽载体的缀合物，其中存在至少两个具有一定长度的阳离子结构域。
适当地，所述肽包含至多4个阳离子结构域，至多3个阳离子结构域。
适当地，所述肽包含2个阳离子结构域。
如上所限定的，所述肽包含两个或更多个阳离子结构域，每个阳离子结构域具有至少4个氨基酸残基的长度。
适当地，每个阳离子结构域的长度为4至12个氨基酸残基，适当地，长度为4至7个氨基酸残基。
适当地，每个阳离子结构域具有4、5、6或7个氨基酸残基的长度。
适当地，每个阳离子结构域具有相似的长度，适当地，每个阳离子结构域具有相同的长度。
适当地，每个阳离子结构域包含阳离子氨基酸，并且还可以包含极性和/或非极性氨基酸。
非极性氨基酸可以选自：丙氨酸、β-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。适当地，非极性氨基酸不具有电荷。
极性氨基酸可以选自：丝氨酸、天冬酰胺、羟脯氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺。适当地，所选择的极性氨基酸不具有负电荷。
阳离子氨基酸可以选自：精氨酸、组氨酸、赖氨酸。适当地，阳离子氨基酸在生理pH下具有正电荷。
适当地，每个阳离子结构域不包含阴离子或带负电荷的氨基酸残基。
适当地，每个阳离子结构域包含精氨酸、组氨酸、β-丙氨酸、羟脯氨酸和/或丝氨酸残基。
适当地，每个阳离子结构域由精氨酸、组氨酸、β-丙氨酸、羟脯氨酸和/或丝氨酸残基组成。
适当地，每个阳离子结构域包含至少40％、至少45％、至少50％的阳离子氨基酸。
适当地，每个阳离子结构域包含大部分的阳离子氨基酸。适当地，每个阳离子结构域包含至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的阳离子氨基酸。
适当地，每个阳离子结构域的等电点(pI)为至少7.5、至少8.0、至少8.5、至少9.0、至少9.5、至少10.0、至少10.5、至少11.0、至少11.5、至少12.0。
适当地，每个阳离子结构域的等电点(pI)为至少10.0。
适当地，每个阳离子结构域的等电点(pI)为10.0至13.0。
在一个实施方案中，每个阳离子结构域的等电点(pI)为10.4至12.5。
适当地，可以通过本领域可用的任何适当的方法在生理pH下计算阳离子结构域的等电点。适当地，通过使用IPC(www.isoelectric.org)，由Lukasz Kozlowski,BiolDirect.2016；11:55.DOI:10.1186/s13062-016-0159-9开发的基于网络的算法。
适当地，每个阳离子结构域包含至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％的精氨酸和/或组氨酸残基。
适当地，阳离子结构域包含至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％的精氨酸残基。
适当地，阳离子结构域包含至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％的组氨酸残基。
适当地，阳离子结构域可包含总共1-5个组氨酸和1-5个精氨酸残基。适当地，阳离子结构域可包含1-5个精氨酸残基。适当地，阳离子结构域可包含1-5个组氨酸残基。适当地，阳离子结构域可包含总共2-5个组氨酸和3-5个精氨酸残基。适当地，阳离子结构域可包含3-5个精氨酸残基。适当地，阳离子结构域可包含2-5个组氨酸残基。
适当地，每个阳离子结构域包含一个或多个β-丙氨酸残基。适当地，每个阳离子结构域可包含总共2-5个β-丙氨酸残基，适当地，总共2个或3个β-丙氨酸残基。
适当地，阳离子结构域可包含一个或多个羟脯氨酸残基或丝氨酸残基。
适当地，阳离子结构域可包含1-2个羟脯氨酸残基。适当地，阳离子结构域可包含1-2个丝氨酸残基。
适当地，给定阳离子结构域中的所有阳离子氨基酸可以是组氨酸，或者，适当地，给定阳离子结构域中的所有阳离子氨基酸可以是精氨酸。
适当地，所述肽可包含至少一个富含组氨酸的阳离子结构域。适当地，所述肽可包含至少一个富含精氨酸的阳离子结构域。
合适地，所述肽可包含至少一个富含精氨酸的阳离子结构域和至少一个富含组氨酸的阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含两个富含精氨酸的阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含两个富含组氨酸的阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含两个富含精氨酸和组氨酸的阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含一个富含精氨酸的阳离子结构域和一个富含组氨酸的阳离子结构域。
适当地，每个阳离子结构域包含不超过3个连续的精氨酸残基，适当地不超过2个连续的精氨酸残基。
适当地，每个阳离子结构域不包含连续的组氨酸残基。
适当地，每个阳离子结构域包含精氨酸、组氨酸和/或β-丙氨酸残基。适当地，每个阳离子结构域包含大部分的精氨酸、组氨酸和/或β-丙氨酸残基。适当地，每个阳离子结构域中的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、100％的氨基酸残基是精氨酸、组氨酸和/或β-丙氨酸残基。适当地，每个阳离子结构域由精氨酸、组氨酸和/或β-丙氨酸残基组成。
在一个实施方案中，所述肽包含含有精氨酸和β-丙氨酸残基的第一阳离子结构域以及含有含有精氨酸和β-丙氨酸残基的第二阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含含有精氨酸和β-丙氨酸残基的第一阳离子结构域以及含有组氨酸、β-丙氨酸以及任选地精氨酸残基的第二阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含含有精氨酸和β-丙氨酸残基的第一阳离子结构域以及含有组氨酸和β-丙氨酸残基的第二阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含由精氨酸和β-丙氨酸残基组成的第一阳离子结构域以及由精氨酸和β-丙氨酸残基组成的第二阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含由精氨酸和β-丙氨酸残基组成的第一阳离子结构域以及由精氨酸、组氨酸和β-丙氨酸残基组成的第二阳离子结构域。
适当地，所述肽包含至少两个阳离子结构域，适当地，这些阳离子结构域形成所述肽的臂。适当地，所述阳离子结构域位于所述肽的N和C末端。适当地，因此所述阳离子结构域可以被称为阳离子臂结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含两个阳离子结构域，其中一个位于所述肽的N末端，而一个位于所述肽的C末端。适当地，在所述肽的任一端。适当地，在所述肽的N-末端和C-末端不存在其他氨基酸或结构域，除了其他基团例如末端修饰、接头和/或治疗性分子之外。为避免疑义，除本文所述和要求保护的“肽”外，还可存在这样的其他基团。适当地，因此每个阳离子结构域形成所述肽的末端。适当地，这并不妨碍如本文所述的其他的接头基团的存在。
适当地，所述肽可以包含至多4个阳离子结构域。适当地，所述肽包含两个阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含两个均富含精氨酸的阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含一个富含精氨酸的阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含两个均富含精氨酸和组氨酸两者的阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含一个富含精氨酸的阳离子结构域和一个富含组氨酸的阳离子结构域。
适当地，所述阳离子结构域包含选自以下的氨基酸单元：R、H、B、RR、HH、BB、RH、HR、RB、BR、HB、BH、RBR、RBB、BRR、BBR、BRB、RBH、RHB、HRB、BRH、HRR、RRH、HRH、HBB、BBH、RHR、BHB、HBH或其任意组合。
适当地，阳离子结构域还可包括丝氨酸、脯氨酸和/或羟脯氨酸残基。适当地，所述阳离子结构域可以进一步包含选自以下的氨基酸单元：RP、PR、RPR、RRP、PRR、PRP、Hyp；R[Hyp]R、RR[Hyp]、[Hyp]RR、[Hyp]R[Hyp]、[Hyp][Hyp]R、R[Hyp][Hyp]、SB、BS或其任意组合，或与上面所列出的氨基酸单元的任意组合。
适当地，每个阳离子结构域包含以下序列的任一个：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQ ID NO:12)、HBRRBR(SEQID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B(SEQ ID NO:17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(SEQ ID NO:18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)或其任意组合。
适当地，每个阳离子结构域由以下序列的任一个组成：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQ ID NO:12)、HBRRBR(SEQID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B、R[Hyp]H[Hyp]HB、R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)或其任意组合。
适当地，每个阳离子结构域由以下序列的一个组成：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)。
适当地，所述肽中的每个阳离子结构域可以相同或不同。适当地，所述肽中的每个阳离子结构域是不同的。
疏水性结构域
本发明涉及包含具有特定结构的短肽载体的缀合物，其中存在至少一个具有一定长度的疏水结构域。
适当地，所述肽包含至多3个疏水性结构域，至多2个疏水性结构域。
适当地，所述肽包含1个疏水性结构域。
如上所限定的，所述肽包含两个或更多个疏水性结构域，每个疏水性结构域具有至少3个氨基酸残基的长度。
适当地，每个疏水性结构域具有3-6个氨基酸的长度。适当地，每个疏水性结构域具有5个氨基酸的长度。
适当地，每个疏水性结构域可包含非极性、极性和疏水性氨基酸残基。
疏水性氨基酸残基可以选自：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和色氨酸。
非极性氨基酸残基可以选自：脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸。
极性氨基酸残基可以选自：丝氨酸、天冬酰胺、羟脯氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺。
适当地，所述疏水性结构域不包含亲水性氨基酸残基。
适当地，每个疏水性结构域包含大部分疏水性氨基酸残基。适当地，每个疏水性结构域包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、100％的疏水性氨基酸。适当地，每个疏水性结构域由疏水性氨基酸残基组成。
适当地，每个疏水性结构域的疏水性为至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.8、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3。
适当地，每个疏水性结构域的疏水性为至少0.3，至少0.35，至少0.4，至少0.45。
适当地，每个疏水性结构域的疏水性为至少1.2，至少1.25，至少1.3，至少1.35。
适当地，每个疏水性结构域的疏水性为0.4至1.4。
在一个实施方案中，每个疏水性结构域的疏水性为0.45至0.48。
在一个实施方案中，每个疏水性结构域的疏水性为1.27至1.39。
适当地，疏水性由White和Wimley测量：W.C.Wimley和S.H.White,"Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membraneinterfaces"Nature Struct Biol 3:842(1996)。
适当地，每个疏水性结构域包含至少3个、至少4个疏水性氨基酸残基。
适当地，每个疏水性结构域包含苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺残基。适当地，每个疏水性结构域由苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和/或谷氨酰胺残基组成。
在一个实施方案中，每个疏水性结构域由苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和/或谷氨酰胺残基组成。
在一个实施方案中，每个疏水性结构域由酪氨酸和/或脯氨酸残基组成。
适当地，所述肽包含一个疏水性结构域。适当地，所述或每个疏水性结构域位于所述肽的中心。适当地，因此所述疏水性结构域可以被称为核心疏水性结构域。适当地，所述或每个疏水性核心结构域在任一侧侧接臂结构域。适当地，所述臂结构域可以包含一个或多个阳离子结构域和一个或多个其他的疏水性结构域。适当地，每个臂结构域包含阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽包含两个臂结构域，其侧接于疏水性核心结构域，其中每个臂结构域包含阳离子结构域。
在一个实施方案中，所述肽由侧接有疏水性核心结构域的两个阳离子臂结构域组成。
适当地，所述或每个疏水性结构域包含以下序列的一个：YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQ ID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQ IDNO:24)、WPWW(SEQ ID NO:25)、WWPW(SEQ ID NO:26)或其任意组合。
适当地，所述或每个疏水性结构域由以下序列的一个组成：YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQ ID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQID NO:24)、WPWW(SEQ ID NO:25)、WWPW(SEQ ID NO:26)或其任意组合。
适当地，所述或每个疏水性结构域由以下序列的一个组成：FQILY(SEQ ID NO:21)、WWW、WWPWW(SEQ ID NO:24)。
适当地，所述或每个疏水性结构域由FQILY(SEQ ID NO:21)组成：
适当地，所述肽中的每个疏水性结构域可以具有相同的序列或不同的序列。
肽载体
本发明涉及包含肽载体的缀合物，其用于在医学病况的治疗中运输由三核苷酸重复形成的治疗性核酸。
所述肽的序列是连续的单个分子，因此所述肽的结构域是连续的。适当地，所述肽在N末端和C末端之间包含呈线性排列的几个结构域。适当地，所述结构域选自上述阳离子结构域和疏水性结构域。适当地，所述肽由阳离子结构域和疏水性结构域组成，其中所述结构域如上所限定。
每个结构域都具有上面相关部分所述的共有序列特征，但是每个结构域的确切序列都可以进行变异和修饰。因此，每个结构域都可能有一系列序列。每个可能的结构域序列的组合产生一系列肽结构，每个肽结构形成本发明的一部分。所述肽结构的特征描述如下。
适当地，疏水性结构域分隔任意两个阳离子结构域。适当地，每个疏水性结构域在其任一侧都侧接有阳离子结构域。
适当地，没有阳离子结构域与另一个阳离子结构域相邻。
在一个实施方案中，所述肽包含侧接有两个阳离子结构域的一个疏水性结构域，其呈如下排列：
[阳离子结构域]–[疏水性结构域]–[阳离子结构域]
因此，适当地，所述疏水性结构域可以被称为核心结构域，并且每个阳离子结构域可以被称为臂结构域。适当地，所述疏水性臂结构域在其任一侧侧接有阳离子核心结构域。
在一个实施方案中，所述肽由两个阳离子结构域和一个疏水性结构域组成。
在一个实施方案中，所述肽由侧接有两个阳离子臂结构域的一个疏水性核心结构域组成。
在一个实施方案中，所述肽由包含选自以下序列的一个疏水性核心结构域组成：YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQ ID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQ ID NO:24)、WPWW(SEQ ID No:25)和WWPW(SEQ ID NO:26)，其侧接有两个阳离子臂结构域，每一个阳离子臂结构域包含选自以下的序列：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQ ID NO:12)、HBRRBR(SEQID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B(SEQ ID NO:17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(SEQ ID NO:18)和R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)。
在一个实施方案中，所述肽由包含选自以下序列的一个疏水性核心结构域组成：FQILY(SEQ ID NO:21)、WWW和WWPWW(SEQ ID NO:24)其侧接有两个阳离子臂结构域，所述阳离子臂结构域包含选自以下的序列：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)和RBHBH(SEQ ID NO:8)。
在一个实施方案中，所述肽由包含以下序列的一个疏水性核心结构域组成：FQILY(SEQ ID NO:21)，其侧接有两个阳离子臂结构域，所述阳离子臂结构域包含选自以下的序列：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RBRRB(SEQ IDNO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)。
在任何这样的实施方案中，可以存在其他基团，例如接头、末端修饰和/或治疗性分子。
适当地，所述肽是N-末端修饰的。
适当地，所述肽是N-乙酰化的、N-甲基化的、N-三氟乙酰化的、N-三氟甲基磺酰化的或N-甲基磺酰化的。适当地，所述肽是N-乙酰化的。
任选地，所述肽的N端可以是未修饰的。
在一个实施方案中，所述肽是N-乙酰化的。
适当地，所述肽包含选自以下的C末端修饰：羧基-、硫代酸-、氨基氧基-、肼基-、硫酯-、叠氮化物、应变炔烃、应变烯烃、醛-、硫醇或卤代乙酰基。
有利地，C-末端或N-末端修饰可以提供用于将肽连接至治疗性分子的手段。
因此，C-末端或N-末端修饰可包含接头，反之亦然。适当地，C-末端或N-末端修饰可由接头组成，反之亦然。适当的接头在本文的其他地方描述。
适当地，所述肽包含包含C端羧基。
适当地，所述C-末端羧基由甘氨酸、β-丙氨酸、谷氨酸或γ-氨基丁酸残基提供。
在一个实施方案中，所述C端羧基由β-丙氨酸残基提供。
适当地，所述C末端残基为接头。适当地，所述C末端β-丙氨酸残基为接头。
适当地，因此，每个阳离子结构域可进一步包含N或C末端修饰。适当地，所述阳离子结构域在C末端包含C-末端修饰。适当地，所述阳离子结构域在N末端包含N-末端修饰。适当地，所述阳离子结构域在C末端包含接头基团，适当地，所述阳离子结构域在C末端包含C末端β-丙氨酸。适当地，所述阳离子结构域在N末端是N-乙酰化的。
本发明的肽被限定为具有40个氨基酸残基或更少的总长。因此，所述肽可以被认为是寡肽。
适当地，所述肽的总长为3-30个氨基酸残基，适当地为5-25个氨基酸残基、10-25个氨基酸残基、13-23个氨基酸残基、15-20个氨基酸残基。
适当地，所述肽的总长度为至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个氨基酸残基。
适当地，所述肽能够穿透细胞。适当地，所述肽可以被认为是细胞穿透性肽。
适当地，所述肽用于附接到治疗性分子。适当地，所述肽用于将治疗性分子转运到靶细胞中。适当地，所述肽用于将治疗性分子递送到靶细胞中。因此，所述肽被认为是肽载体。
适当地，所述肽载体能够穿透进入到细胞和组织中，适当地进入到细胞的核中。适当地，进入肌肉组织中。
适当地，所述肽载体可以选自以下序列的任一个：
Figure BDA0003587174990000181
Figure BDA0003587174990000191
Figure BDA0003587174990000201
适当地，所述肽可以选自以下额外的序列的任一个：
Figure BDA0003587174990000202
Figure BDA0003587174990000211
适当地，所述肽由以下序列之一组成：
Figure BDA0003587174990000212
在一个实施方案中，所述肽由以下序列组成：RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)。
在一个实施方案中，所述肽由以下序列组成：RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)。
在一个实施方案中，所述肽由以下序列组成：RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)。
治疗分子
将所述肽载体与治疗分子共价连接以提供本发明的缀合物，其中所述治疗分子是包含多个三核苷酸重复的核酸。
适当地，所述核酸可以选自：反义寡核苷酸(例如PNA、PMO)、mRNA、gRNA(例如在使用CRISPR/Cas9技术时)、短干扰RNA、微小RNA和antagomiRNA。
适当地，所述核酸是反义寡核苷酸。
适当地，所述反义寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。
或者，所述反义寡核苷酸可以是修饰的PMO或任何其他电荷中性的反义寡核苷酸，例如肽核酸(PNA)、化学修饰的PNA如γ-PNA(Bahal,Nat.Comm.2016)、寡核苷酸氨基磷酸酯(其中磷酸根的非桥接氧被胺或烷基胺取代)如WO2016028187A1中所述的那些，或任何其他部分或完全电荷中和的寡核苷酸。
适当地，所述核酸由多个三核苷酸重复组成。
适当地，所述核酸包含任何三核苷酸重复。适当地，所述核酸包含选自以下的三核苷酸重复：GTC、CAG、GCC、GGC、CTT和CCG重复。适当地，所述核酸由选自以下的三核苷酸重复组成：GTC、CAG、GCC、GGC、CTT和CCG重复。
适当地，所述核酸包含CAG重复。适当地，所述核酸由CAG重复组成。
在一个实施方案中，所述核酸是包含CAG重复的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸是由CAG重复组成的反义寡核苷酸。
适当地，所述核酸包含多个三核苷酸重复或由其组成。适当地，所述核酸包含至少2个三核苷酸重复或由其组成。适当地，所述核酸包含5-50个三核苷酸重复或由其组成。适当地，所述核酸包含5-40个三核苷酸重复或由其组成。适当地，所述核酸包含5-30个三核苷酸重复或由其组成。适当地，所述核酸包含5-20个三核苷酸重复或由其组成。适当地，所述核酸包含5-10个三核苷酸重复或由其组成。适当地，所述核酸包含7个三核苷酸重复或由其组成。
在一个实施方案中，所述核酸是包含7个CAG重复的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸是由7个CAG重复组成的反义寡核苷酸。适当地，在这样的实施方案中，所述核酸是由[CAG]7组成的反义寡核苷酸。
适当地，所述核酸与微卫星区域互补，适当地，与重复扩增互补，适当地，与三核苷酸重复扩增互补。
适当地，所述核酸靶向并结合至微卫星区域。适当地，所述微卫星区域包含重复扩展，适当地，它们包含三核苷酸重复扩展。
在一些实施方案中，重复扩展可以包括更高的重复扩展，例如四、五、六、七、八、九或十等重复扩展，其每个重复分别包含四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个核苷酸。
因此，在一些实施方案中，所述治疗分子是包含多个四、五、六、七、八、九、或十核苷酸重复的核酸。因此，在一些实施方案中，所述治疗分子是由多个四、五、六、七、八、九、或十核苷酸重复组成的核酸。
本文关于包含三核苷酸重复的核酸的任何陈述同样适用于包含更高核苷酸重复的核酸。
适当地，所述核酸与互补的微卫星区域结合，适当地，与互补的重复扩增区域结合，适当地，与互补的三核苷酸重复扩增区域结合。
适当地，所述微卫星区域存在于DNA或RNA中。适当地，所述微卫星区域存在于RNA中。
适当地，所述微卫星区可以存在于编码或非编码序列中。适当地，所述微卫星区域存在于非编码序列中，例如3'或5'UTR。适当地，所述微卫星区域存在于3’UTR中。
适当地，所述核酸可以由与互补三核苷酸重复扩增结合的三核苷酸重复形成。
适当地，所述核酸可以由与RNA中的互补三核苷酸重复扩增结合的三核苷酸重复形成。
适当地，所述核酸可以由与RNA的非编码序列中的互补三核苷酸重复扩增结合的三核苷酸重复形成。
适当地，所述核酸可以由与RNA的非翻译区域中的互补三核苷酸重复扩增结合的三核苷酸重复形成。
在一个实施方案中，所述核酸可以由与RNA的3’UTR中的互补三核苷酸重复扩增结合的三核苷酸重复形成。
任选地，可在附接至肽载体之前将赖氨酸残基添加至所述核酸(例如PMO或PNA)的一端或两端以改善水溶性。
三核苷酸重复病症
本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗三核苷酸重复病症。
适当地，三核苷酸重复病症是由三核苷酸重复扩增(也可以被称为三联体重复扩增)引起的遗传疾病。
适当地，所述三核苷酸重复扩增存在于基因中。适当地，所述三核苷酸重复扩增存在于选自以下的基因中：ATN1、HTT、AR、ATXN1、ATXN2、ATXN3、CACNA1A、ATXN7、TBP、FMR1、AFF2、FXN、DMPK、SCA8、JPH3和PPP2R2B。
适当地，所述三核苷酸重复扩增存在于AR、SCA8或DMPK基因中。
在一个实施方案中，所述三核苷酸重复扩增存在于DMPK基因中。
适当地，所述三核苷酸重复扩增由选自以下的重复构成：CAG、CTG、CGG、CCG、GAA、TTC和GGC。
适当地，所述三核苷酸重复扩增由CAG或CTG重复构成。
在一个实施方案中，所述三核苷酸重复扩增由CTG重复构成。
通常，三核苷酸重复病症是由在特定基因中发现的特定三核苷酸重复扩增的存在引起的。通常，基因中存在的三核苷酸重复数高于正常健康受试者中相同基因中存在的三核苷酸重复数。
适当地，所述三核苷酸重复扩增是选自以下的基因中的CAG重复：ATN1、HTT、AR、ATXN1、ATXN、ATXN3、CACNA1A、ATXN7、JPH3和TBP。
适当地，由CAG重复引起的三核苷酸重复病症被称为“聚谷氨酰胺疾病”。因此，适当地，所述三核苷酸重复病症可以是聚谷氨酰胺病症。适当地，所述聚谷氨酰胺病症可以选自：DRPLA(齿状核红核苍白球路易体萎缩症)、HD(亨廷顿氏病),HDL2(类亨廷顿病综合征2)、SBMA(脊髓延髓肌萎缩症),SCA1(脊髓小脑性共济失调1型)、SCA2(脊髓小脑性共济失调2型)、SCA3(脊髓小脑性共济失调3型或Machado-Jospeh病)、SCA6(脊髓小脑性共济失调6型),SCA7(脊髓小脑性共济失调7型)和SCA17(脊髓小脑性共济失调17型)。
适当地，所述三核苷酸重复扩增是选自以下的基因中的CGG重复：FMR1。
适当地，所述三核苷酸重复扩增是选自以下的基因中的CCG重复：AFF2。
适当地，所述三核苷酸重复扩增是选自FXN的基因中的GAA重复。
适当地，所述三核苷酸重复扩增是选自DMPK和ATXN8的基因中的CTG重复。
适当地，所述三核苷酸重复扩增是选自JPH3的基因中的GTC重复。
适当地，由除CAG重复以外的三核苷酸重复引起的三核苷酸重复病症称为“非聚谷氨酰胺疾病”。因此，适当地，所述三核苷酸重复病症可以是非聚谷氨酰胺病症。适当地，所述非聚谷氨酰胺病症可以选自：HDL2(类亨廷顿病综合征2)、FRAXA(脆性X综合征)、FXTAS(脆性X相关震颤/共济失调综合征)、FRAXE(脆性XE智力迟钝)、FRDA(Friedrich共济失调)、DM1(强直性肌营养不良1型)、SCA8(脊髓小脑性共济失调8型)和SCA12(脊髓小脑性共济失调12型)。
适当地，所述三核苷酸重复病症是由于与健康受试者相比三核苷酸重复数量增加所致。适当地，在基因中的三核苷酸重复数量与健康受试者中的相同基因相比有所增加。适当地，与正常健康受试者中的三核苷酸重复数量相比，三核苷酸重复扩增中的三核苷酸重复数量增加。
适当地，三核苷酸重复扩增中的重复数量是正常健康受试者中的重复数量的至少1.5倍。适当地，三核苷酸重复扩增中的重复数量是正常健康受试者中的重复数量的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。
适当地，三核苷酸重复病症是由于三核苷酸重复扩增中的重复数量比正常健康受试者中的重复数量增加了至少1.5倍导致的。
适当地，三核苷酸重复病症是由于三核苷酸重复扩增中的重复数量比正常健康受试者中的重复数量增加了至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍导致的。
适当地，三核苷酸重复扩增中的重复数量是正常健康受试者中的重复数量的1.5倍至15倍。
适当地，三核苷酸重复病症是由于三核苷酸重复扩增的重复数量是正常健康受试者中存在的重复数量的1.5倍至15倍导致的。
适当地，三核苷酸扩增中的重复数量大于50、大于75、大于100、大于125、大于150、大于175、大于200、大于225、大于250。
适当地，三核苷酸重复病症是由包含大于50、大于75、大于100、大于125、大于150、大于175、大于200、大于225、大于250个重复的三核苷酸重复扩增导致的。
适当地，三核苷酸扩增中的重复数量大于50。
适当地，三核苷酸重复病症是由包含大于50个重复的三核苷酸重复扩增导致的。
适当地，三核苷酸扩增中的重复数量为50至250。
适当地，三核苷酸重复病症是由包含50至250个重复的三核苷酸重复扩增导致的。
适当地，所述三核苷酸重复病症是非聚谷氨酰胺病症。
适当地，所述三核苷酸重复病症是DM1或SCA8。
在一个实施方案中，所述三核苷酸病症是DM1。
在一个实施方案中，当三核苷酸重复病症为DM1时，三核苷酸扩增中的重复数量大于50。在一个实施方案中，当三核苷酸重复病症为DM1时，三核苷酸扩增中的CTG重复数大于50。在一个实施方案中，当三核苷酸重复病症为DM1时，DMPK基因的三核苷酸扩增中的CTG重复数大于50。
在一个实施方案中，当三核苷酸重复病症为SCA8时，三核苷酸扩增中的重复数量为110至250。在一个实施方案中，当三核苷酸重复病症为SCA8时，三核苷酸扩增中的CTG重复数量为110至250。在一个实施方案中，当三核苷酸重复病症为SCA8时，ATXN8基因的三核苷酸扩增中的CTG重复数为110至250。
在一些实施方案中，本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗核苷酸重复病症。
适当地，核苷酸重复病症是由核苷酸重复扩增(也可以被称为重复扩增或微卫星重复扩增)引起的遗传疾病。
适当地，所述核苷酸重复病症可能是由四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个核苷酸的重复扩增导致的。
适当地，所述核苷酸重复扩增可以是如上文所讨论的更高重复扩增，如四、五、六、七、八、九、或十核苷酸重复扩增。
因此，适当地，本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗四、五、六、七、八、九、或十核苷酸重复病症。
适当地，所述核苷酸重复扩增是四核苷酸重复，合适地，所述四核苷酸重复是CCTG重复。
因此，适当地，本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗DM2(强直性肌营养不良症2型)。
适当地，所述核苷酸重复扩增是五核苷酸重复，合适地，所述五核苷酸重复是ATTCT重复。
因此，适当地，本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗SCA10(脊髓小脑性共济失调10型)。
因此，适当地，本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗SCA31(脊髓小脑性共济失调31型)。
适当地，所述核苷酸重复扩增是六核苷酸重复，合适地，所述六核苷酸重复是GGCCTG重复或GGGGCC重复。
因此，适当地，本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗SCA36(脊髓小脑性共济失调36型)。
因此，适当地，本发明的缀合物用于用作药物，优选用于预防或治疗C9ORF72-ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症)。
本文中与三核苷酸重复病症的治疗有关的任何陈述同样适用于更高核苷酸重复病症的治疗，例如四、五、六、七、八、九或十核苷酸重复病症。
共价连接
本发明缀合物中存在的肽载体与治疗分子共价连接。
适当地，所述肽载体在C末端或N末端与治疗分子共价连接。适当地，所述肽载体在C末端与治疗分子共价连接。
适当地，如果需要，所述肽载体通过接头与治疗分子共价连接。所述接头可以充当间隔子以将所述肽序列与所述治疗性分子分开。
所述接头可以选自任何合适的序列。
适当地，所述接头存在于肽和治疗性分子之间。适当地，所述接头是肽和治疗性分子的间隔基团。因此，所述接头可以包含人工氨基酸。
在一个实施方案中，所述缀合物包含通过接头与治疗分子共价连接的肽载体。
在一个实施方案中，所述缀合物包含以下结构：
[肽]–[接头]-[治疗性分子]
在一个实施方案中，所述缀合物由以下结构组成：
[肽]–[接头]-[治疗性分子]
适当地，本文列出的任何肽均可用于根据本发明的缀合物。在一个实施方案中，所述缀合物包含选自以下序列之一的肽载体：RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)和RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)。
适当地，在任何情况下，所述肽载体可进一步包含如上所述的N-末端修饰。
适当的接头包括，例如，C末端半胱氨酸残基，其可形成二硫化物、硫醚或硫醇-马来酰亚胺连接；C-末端醛，以形成肟，与肽上的碱性氨基酸或肽上的羧酸部分发生点击反应或形成吗啉代连接，所述肽共价连接至氨基以形成羧酰胺连接。
适当地，所述接头的长度为1-5个氨基酸。适当地，所述接头可以包括本领域已知的任何接头。
适当地，所述接头选自以下序列的任一个：G、BC、XC、C、GGC、BBC、BXC、XBC、X、XX、B、BB、BX、XB、琥珀酸、GABA和E。适当地，其中X是6-氨基己酸。
适当地，所述接头可以是聚合物，例如PEG。
适当地，所述接头选自：β-丙氨酸(B)、琥珀酸(Succ)、GABA(Ab)和谷氨酸(E)。
在一个实施方案中，所述接头是β-丙氨酸(B)。
在一个实施方案中，所述肽载体通过甲酰胺键与治疗分子缀合。
所述缀合物的接头可以形成所述肽所连接的治疗性分子的一部分。或者，所述治疗分子的连接可以直接连接到肽载体的C-末端或N-末端。适当地，在这样的实施方案中，不需要接头。
或者，所述肽载体可以与治疗分子化学缀合。化学连接可以通过例如二硫化物、烯基、炔基、芳基、醚、硫醚、***、酰胺、羧酰胺、尿素、硫脲、氨基脲、卡巴肼、肼、肟、磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、亚氨基磷酸酯或硫醇-马来酰亚胺连接。
任选地，可以在治疗性分子的N-末端添加半胱氨酸以允许与肽载体形成二硫键，或者可以对N-末端进行溴乙酰化以将硫醚缀合至肽载体。
在一个实施方案中，所述缀合物包含选自以下序列之一的肽载体：RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)和RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)，其通过接头与包含CAG重复的反义寡核苷酸共价连接，其中所述接头选自：β-丙氨酸(B)、GABA(Ab)和谷氨酸(E)。
在一个实施方案中，所述缀合物包含选自以下序列之一的肽载体：RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)和RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)，其通过接头与由CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接，其中所述接头选自：β-丙氨酸(B)、GABA(Ab)和谷氨酸(E)。
在一个实施方案中，所述缀合物包含选自以下序列之一的肽载体：RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)和RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)，其通过接头与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接，其中所述接头选自：β-丙氨酸(B)、GABA(Ab)和谷氨酸(E)。
在一个实施方案中，所述缀合物包含肽载体RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)，其通过β-丙氨酸(B)与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接。(DPEP1.9)
在一个实施方案中，所述缀合物包含肽载体RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)，其通过谷氨酸(E)与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接。(DPEP1.9b)在一个实施方案中，这种缀合物增加了进入膈肌组织的渗透。适当地，增加进入膈膜的渗透可用于治疗影响呼吸***的肌肉病症，例如强直性营养不良。
在一个实施方案中，所述缀合物包含肽载体RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)，其通过β-丙氨酸(B)与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接。(DPEP3.1)在一个实施方案中，这种缀合物增加了进入肌肉组织的渗透。适当地，增加进入肌肉的渗透可用于治疗肌肉病症。
在一个实施方案中，所述缀合物包含肽载体RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)，其通过谷氨酸(E)与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接。(DPEP3.1b)在一个实施方案中，这种缀合物增加了进入肌肉组织的渗透。适当地，增加进入肌肉的渗透可用于治疗肌肉病症。
在一个实施方案中，所述缀合物包含肽载体RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)，其通过GABA(Ab)与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接。(DPEP3.1a)
在一个实施方案中，所述缀合物包含肽载体RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)，其通过β-丙氨酸(B)与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接。(DPEP3.8)在一个实施方案中，这种缀合物增加了进入肌肉组织的渗透。适当地，增加进入肌肉的渗透可用于治疗肌肉病症。
在一个实施方案中，所述缀合物包含肽载体RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)，其通过谷氨酸(E)与由七个CAG重复组成的反义寡核苷酸共价连接。(DPEP.3.8b)在一个实施方案中，这种缀合物增加了进入隔膜组织的渗透。适当地，增加进入膈膜的渗透可用于治疗影响呼吸***的肌肉病症，例如强直性营养不良。
任何上述缀合物可以在N-末端被乙酰化。
药物组合物和施用
本发明的缀合物可以配制成如上所述的药物组合物。
根据本发明的第六方面，所述药物组合物包含本发明的缀合物。
适当地，所述药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的组分，例如一种或多种稀释剂、佐剂或载体。
适当的药学上可接受的稀释剂、佐剂和载体是本领域众所周知的。
如本文所用，短语“药学上可接受的”是指那些配体、材料、配方和/或剂型，其在合理的医疗判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，符合合理的收益/风险比。
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、配方或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料，其涉及将所述缀合物从身体的一个器官或部位携带或运输到身体的另一个器官或部位。在与所述组合物的其他组分(例如肽和治疗性分子)相容的意义上来说，每种肽必须是“可接受的”，并且对个体无害。
可以重构和施用的冻干组合物也在本发明组合物的范围内。
药学上可接受的载体可以是例如赋形剂、媒介物、稀释剂及其组合。例如，当将所述组合物口服施用时，它们可以被配制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂或糖浆剂；或者用于肠胃外施用时，它们可以被配制成注射剂、滴注制剂或栓剂。这些组合物可以通过常规方法制备，并且如果需要，可以将活性化合物(即缀合物)与任何常规添加剂混合，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、包衣剂或其组合。
应当理解，本公开的药物组合物可以进一步包括其他已知的治疗剂、药物，将化合物修饰成前药等，用于在医学用途下减轻、调节、预防和治疗本文所述的疾病、病症和病况。
适当地，所述药物组合物用作药物。适当地，以与本文所述缀合物相同的方式用作药物。本文所述的与使用缀合物的医学治疗有关的所有特征均适用于所述药物组合物。
因此，在本发明的另一方面，提供了用作药物的根据第六方面的药物组合物。在另一方面，提供了一种预防或治疗受试者的疾病状况的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据第六方面的药物组合物。
适当地，其中所述药物组合物用于预防或治疗三核苷酸病症，并且适当地，其中预防或治疗方法是针对受试者的三核苷酸病症。
预防或治疗
本发明的缀合物可用作预防或治疗疾病，优选三核苷酸重复病症的药物。
所述药物可以是如上限定的药物组合物的形式。
还提供了对需要治疗疾病状况的受试者进行预防或治疗的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述缀合物的步骤。
适当地，所述缀合物用于预防或治疗三核苷酸重复病症。
包含三核苷酸重复扩增的合适基因和由此导致的三核苷酸重复病症的细节在上文中详述。
或者，所述缀合物可用于预防或治疗其他核苷酸重复病症。上文详述了此类更高重复扩增和由此产生的核苷酸重复病症的合适细节。
由三核苷酸重复形成的核酸如何作用以治疗三核苷酸重复病症的具体机制将根据所讨论的三核苷酸重复病症而不同。适当地，所述核酸与基因或转录物中的三核苷酸重复扩增结合。适当地，所述核酸降低了包含三核苷酸重复扩增的转录物的水平。适当地，所述核酸可预防三核苷酸重复扩增的病理效应，从而预防三核苷酸重复病症。这同样适用于其他核苷酸重复病症。
因此，适当地，所述缀合物改善受试者的生理状况。
例如，所述缀合物的治疗性核酸可以是可操作的以纠正由三核苷酸重复病症引起的剪接缺陷。适当地，所述缀合物的治疗性核酸可以是可操作的以使患有三核苷酸重复病症的受试者中的剪接正常化。
适当地，所述缀合物的治疗性核酸是可操作的以结合DMPK基因的转录物。适当地，所述缀合物的治疗性核酸是可操作的以结合存在于DMPK基因转录物中的重复扩增。适当地，所述缀合物的治疗性核酸是可操作的以结合存在于DMPK基因转录物中的CUG重复扩增。
因此，适当地，所述缀合物降低了DMPK转录物的水平。因此，适当地，所述缀合物降低了具有重复扩增的DMPK转录物的水平。因此，适当地，所述缀合物降低了具有CUG重复扩增DMPK转录物的水平。
因此，适当地，所述缀合物减少了核聚集点的数量。适当地，所述缀合物可防止核聚集点与细胞的剪接机制相互作用。适当地，所述缀合物可防止核聚集点与MBNL1相互作用。适当地，所述缀合物可防止核聚集点隔离MBNL1。
适当地，这些效果用于预防或治疗DM1。
适当地，与健康受试者相比，所述缀合物可将患有DM1的受试者的肌强直降低10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的肌强直降低至少50％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的肌强直降低50％-100％。
适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的成肌细胞中的核聚集点减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的成肌细胞中的核聚集点减少至少50％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的成肌细胞中的核聚集点减少50％-90％。
适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的心脏传导纠正了10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的心脏传导改善了至少10％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的心脏传导改善了10％-50％。
适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的运动功能改善了10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的运动功能改善了至少10％。％.适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的运动功能改善了10％-50％。
适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的肌肉力量相对于体重改善了10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的肌肉力量相对于体重改善了至少10％。适当地，所述缀合物将患有DM1的受试者的肌肉力量相对于体重改善了10％-50％。
适当地，所述待治疗的受试者可以是任何动物或人类。适当地，所述受试者可以是非人类哺乳动物。适当地，所述受试者可以是男性或女性。
适当地，所述待治疗的受试者可以是任何年龄。适当地，所述待治疗的受试者的年龄为0-40岁，适当地为0-30岁，适当地为0-25岁，适当地为0-20岁。
适当地，所述缀合物用于全身性施用于受试者，例如，通过髓内、鞘内、心室内、玻璃体内、肠内、肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、肿瘤内、皮下口服或经鼻途径。
在一个实施方案中，所述缀合物用于静脉内施用于受试者。
在一个实施方案中，所述缀合物用于通过注射静脉内施用于受试者。
适当地，所述缀合物以“治疗有效量”施用于受试者，对于此这是指该量足以显示出对个体的益处。实际施用的量以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。对剂量的决定由全科医生和其他医生负责。该技术和方案的示例可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,20th Edition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins中找到。
示例性剂量可以在0.01mg/kg和50mg/kg之间、0.05mg/kg和40mg/kg之间、0.1mg/kg和30mg/kg之间、0.5mg/kg和18mg/kg之间、1mg/kg和16mg/kg之间、2mg/kg和15mg/kg之间、5mg/kg和10mg/kg之间、10mg/kg和20mg/kg之间、12mg/kg和18mg/kg之间、13mg/kg和17mg/kg之间。
有利地，本发明的缀合物的剂量比由单独施用治疗性核酸起效所需的剂量低一个级别或数量级。
适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比，一种或多种毒性标志物显著降低。
适当的毒性标志物可以是肾毒性标志物。
适当的毒性标志物包括血清KIM-1、NGAL、BUN、肌酐、碱性磷酸酶、丙氨酸转移酶和天冬氨酸转氨酶水平。
合适的其他毒性标志物包括尿钠、钾、氯化物、尿素、肌酐、钙、磷、葡萄糖、尿酸、镁和蛋白质水平。
适当地，当与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比时，在施用本发明的缀合物之后，KIM-1、NGAL和BUN中至少一种的水平适当地降低了。
适当地，当与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比时，在施用本发明的缀合物之后，KIM-1、NGAL和BUN的每一种的水平适当地降低了。
适当地，当与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比时，所述或每个标记物的水平显著降低。
适当地，当与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比时，在施用本发明的缀合物之后所述或每个标记物的水平降低了至多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。
有利地，与现有的肽及缀合物相比，所述缀合物的毒性显著降低。特别地，KIM-1和NGAL-1是毒性的标志物，与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比，它们显著降低了至多120倍。
适当地，所述缀合物的长期毒性可以忽略不计。适当地，所述缀合物没有长期毒性作用。
适当地，除了对目标三核苷酸重复扩增的预期影响之外，缀合物对受试者的基因表达没有显著影响。适当地，所述缀合物对受试者的基因表达没有负面影响。
适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比，细胞活力显著改善。
适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比，成肌细胞和肝细胞活力显著改善。适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比，成肌细胞和肝细胞活力增加高达5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。
适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比，细胞存活显著改善。
适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的肽载体的缀合物相比，恢复时间减少至多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。
适当地，在施用本发明的缀合物之后，恢复时间小于60分钟、小于50分钟、小于40分钟、小于30分钟、小于20分钟、小于10分钟或小于5分钟。适当地，在施用本发明的缀合物之后，没有恢复时间。
核酸和宿主
本发明的肽载体可以通过任何标准的蛋白质合成方法(例如化学合成、半化学合成)或通过使用表达***来制备。
因此，本发明还涉及包含编码所述缀合物的DNA或由其组成的核苷酸序列、表达***(例如包含所述序列以及表达和控制表达所需序列的载体)以及由所述表达***转化的宿主细胞和宿主生物。
因此，还提供了编码根据本发明的缀合物的核酸。
适当地，所述核酸可以分离或纯化的形式提供。
还提供了包含编码根据本发明的缀合物的核酸的表达载体。
适当地，所属载体是质粒。
适当地，所述载体包含调节序列(例如启动子)，其可操作地连接至编码根据本发明的缀合物的核酸。适当地，所述表达载体当转染到合适的细胞(例如哺乳动物、细菌或真菌细胞)中时能够表达所述缀合物。
还提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。
可以根据可将本发明的核酸***其中的宿主细胞来选择表达载体。宿主细胞的这种转化涉及常规技术，例如Sambrook等人[Sambrook,J.,Russell,D.(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,USA]中教导的技术。选择合适的载体在本领域技术人员的能力范围内。合适的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和病毒。
产生的缀合物可以通过任何适当的方法从宿主细胞中分离和纯化，所述方法例如沉淀或色谱分离，所述色谱例如亲和色谱。
适当的载体、宿主和重组技术是本领域众所周知的。
在本说明书中，术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，其中所选择的核苷酸序列和调节性核苷酸序列以使核苷酸编码序列的表达处于调节序列的控制之下的方式共价连接，这样，所述调节序列能够影响形成部分或全部所选核苷酸序列的核苷酸编码序列的转录。然后在适当情况下，可以将所得的转录物翻译成所需的缀合物。
附图说明
现在将参考以下附图和实施例描述发明，其中：
图1示出了具有2600个CTG重复的DM1患者成肌细胞中致病性核聚集点数量的减少和MBNL重新分布。结果显示不同剂量的DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物转染后48小时不会降低成肌细胞或肝细胞的细胞活力(以10uM显示)。
图2A、B、C、D和E以及图3A、B、C和D示出，与使用现有肽载体Pip6a和Pip9b2形成的缀合物相比，在各种浓度下，不同的DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物在DM1患者成肌细胞中纠正Mbnl依赖性转录物的剪接缺陷，所述成肌细胞源自在DMPK基因中具有2600重复的DM1患者。
图4示出，以30mg/kg(静脉注射，尾静脉)全身递送不同的DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物可纠正HSA-LR小鼠腓肠肌(gast.)和股四头肌(quad.)中Mbnl依赖性转录物的剪接缺陷。clcn1外显子7a、serca外显子22和mbnl1外显子5(最广泛使用的DM1生物标志物)剪接的RT-PCR分析显示对于基于DPEP1和3的缀合物，剪接正常化为野生型水平。与未处理的HSA-LR小鼠相比，通过ANOVA和Tukey事后检验分析每个肽-PMO的6只HSA-LR小鼠的数据。数据是平均值±SEM(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.不显著)。
图5示出了用各种剂量的不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物转染具有2600个CTG重复的DM1患者成肌细胞48小时后的成肌细胞细胞生存力百分比。与以现有肽载体Pip6a和Pip9b2形成的缀合物相比，DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物浓度可以从治疗水平增加数倍，而不会导致成肌细胞中的细胞死亡。
图6示出了用不同的DPEP1/3-[CAG]7缀合物和比较缀合物转染具有2600个CTG重复的DM1患者成肌细胞48小时后的肝细胞细胞生存力百分比。与以现有肽载体Pip6a和Pip9b2形成的缀合物相比，DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物浓度可以从治疗水平增加数倍，而不会导致肝细胞中的细胞死亡。
图7和图9示出了，单剂量的不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物(30mg/kg，n＝6，静脉注射，尾静脉)后2周，对HSA-LR小鼠的腓肠肌的肌电图肌强直测量。将数据通过ANOVA和Tukey事后检验进行分析，并与未处理的HAS-LR小鼠和具有DPEP5.7的比较缀合物进行比较。数据是平均值±SEM(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.不显著)。图10示出了个体测试的详细数据。
图8示出了，单剂量的不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物(30mg/kg，n＝6，静脉注射，尾静脉)后2周，HSA-LR小鼠中图8和10中数据的相应肌强直等级测量。将数据通过非配对学生t检验进行分析，并与未处理的HSA-LR小鼠和具有DPEP5.7的比较缀合物进行比较。数据是平均值±SEM。
图10A、B和C示出了在来自C57BL6雌性小鼠(8-10周龄，每组n＝5)的血清中评估的ALP、ALT和AST水平，所述小鼠被施以不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物的静脉推注(尾静脉)注射，在注射后7天收集血清，与盐水相比。与现有的Pip系列肽载体诱导的倍数增加相比，ALP、ALT、AST水平与盐水对照注射液相似。
图11A示出了，向C57BL6雌性小鼠注射不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物后第2天和第7天在尿中评估的、在血清中评估的KIM-1水平，这是用稀释至适合标准曲线内的样品通过ELISA(R&D cat#MKM100)测量的。将值归一化至尿肌酐水平(Harwell)以计算尿蛋白浓度。与现有的Pip系列肽载体诱导的倍数增加相比，KIM-1水平与盐水对照注射液相似。
图11B和C示出了，与注射盐水相比，向C57BL6雌性小鼠(Harwell)注射不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物后第7天的血清中评估的BUN和肌酐水平。与现有的Pip系列肽载体诱导的倍数增加相比，BUN和肌酐水平与盐水对照注射相似。
图12和13示出了，与注射盐水相比，在以30mg/kg或以6剂5mg/kg向C57BL6雌性小鼠通过注射来施用DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物后第2、7和14天的尿中评估的KIM-1/肌酐比率。与现有的Pip系列肽载体诱导的倍数增加相比，肌酐和KIM-1水平与盐水对照注射相似。
图14A、B、C和D示出了，在将不同的DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物以5、7.5和30mg/kg通过注射施用于C57BL6雌性小鼠(8-12周龄，每组n＝5)后，与注射盐水相比，尿中的尿钠、钾、氯、尿素、肌酐、钙、磷、葡萄糖、尿酸、镁和蛋白质水平。误差条表示SEM。
图15示出了DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物处理后的HSA-LR小鼠体重。与注射盐水的5只HSA-LR小鼠相比，注射30mg/kg单剂量的5只HSA-LR小鼠的长期体重没有显示任何显著下降。
图16显示了在HSA-LR小鼠(静脉注射)中施用30mg/kg缀合物或3x200mg/kg裸PMO后两周通过ELISA测量的不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物的生物分布递送分析。对DPEP1.9和DPEP3.8缀合物生物分布的评估揭示了向DM1中严重受影响组织的最佳递送。使用用地高辛和生物素标记的探针通过定制的ELISA测定法检测PMO。治疗两周后，肌肉组织中PMO的浓度仍然>1nM，而裸PMO注射后检测到的pM较低(尽管裸PMO与DPEP-PMO缀合物处理的摩尔浓度差异>20倍)(n＝4)。数据表示为平均值+/-SEM。统计：带有Tukey事后检验的单因素ANOVA。
图17显示了注射5mg/kg单剂量后在血清中测量的不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物的药代动力学特性。使用定制的ELISA来量化血清中的浓度，在以5mg/kg静脉注射5分钟后达到500-800nM，1小时后降至100nM，3小时后降至10nM。处理后6小时浓度约为1nM，其中大部分化合物已被清除或递送至感兴趣的组织。
图18A、B、C和D更详细地示出不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物的全身递送纠正了HSA-LR小鼠腓肠肌中Mbnl依赖性转录物的剪接缺陷。Clcn1外显子7a、Serca外显子22、Mbnl1外显子5和Ldb3外显子11的剪接的RT-PCR分析显示使用30和40mg/kg的基于DPEP1.9和DPEP3.8的缀合物，剪接正常化至野生型水平。剪接纠正在治疗后至少持续3个月，并且单次低剂量(5和7.5mg/kg)后也是显著的(方框表示数据分布到四分位数，突出显示平均值，误差条表示上四分位数和下四分位数之外的变异性，每组n＝5)。
图19A、B和C示出了，在30或40mg/kg单剂量基于DPEP1.9和DPEP3.8的缀合物后，HSA-LR小鼠的肌强直等级被纠正为野生型水平(从4到0)。这种纠正在治疗后至少持续3个月(A)。当剂量分布在四次注射(4X7.5mg/kg)时，肌强直降低到50％(B)，而将剂量降低到4X5mg/kg会在最后一次注射两周后降低20-25％(C)(误差条表示SEM)；(n＝6，静脉注射，尾静脉)。
图20显示了在HSA-LR小鼠(8-12周龄，每组n＝5)中静脉注射施用不同DPEP1/3-[CAG]7PMO缀合物后2天和1周的血清和尿中的毒理学筛查，结果显示，能够使HSA-LR小鼠的表型正常化的剂量没有显著变化。与盐水处理的HSA-LR小鼠相比，仅在以30mg/kg或40mg/kg的DPEP1.9、DPEP3.8、DPEP3.1和DPEP3.1b处理后，和仅在处理后2d，KIM1水平发生显著变化，误差条表示SEM。
图21显示了HSA-LR小鼠在首次注射多种施用方案后数周内的DM1表型(肌强直)纠正，所述施用方案包括：4剂量5mg/kg的DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物、4剂量7.5mg/kg的DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物、单一7.5mg/kg剂量DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物、单一30mg/kg剂量DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物或单一40mg/kg剂量DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物。使用与任何毒性无关的低剂量DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物(5-7.5mg/kg)治疗后，可以减少肌强直。
图22显示了HSA-LR小鼠在首次注射多种施用方案后数周内的DM1表型(肌强直)纠正，所述施用方案包括：4剂量5mg/kg的DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物、4剂量7.5mg/kg的DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物、单一7.5mg/kg剂量DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物或单一40mg/kg剂量DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物。使用与任何毒性无关的低剂量DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物(5-7.5mg/kg)治疗后，可以减少肌强直。
图23显示了向HSA-LR小鼠静脉注射施用下列物质2周后各种组织中的PMO浓度(pM)：裸PMO(3剂量200mg/kg)、30mg/kg的DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物、30mg/kg的DPEP3.8b-[CAG]7PMO缀合物、7.5mg/kg的DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物和40mg/kg的DPEP3.8-[CAG]7PMO缀合物。两种肽(DPEP3.8和DPEP3.8b)都能成功地将PMO递送至肌肉，在骨骼肌中达到>6nM的浓度。
图24显示了向HSA-LR小鼠IV施用下列物质2周后各种组织中的PMO浓度(pM)：裸PMO(3剂量200mg/kg)、30mg/kg的DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物、30mg/kg的DPEP1.9b-[CAG]7PMO缀合物、7.5mg/kg的DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物和40mg/kg的DPEP1.9-[CAG]7PMO缀合物。两种肽(DPEP1.9和DPEP1.9b)都能成功地将PMO递送至肌肉。DPEP1.9b-[CAG]7PMO特别好地到达膈肌(以30mg/kg单次静脉注射两周后>15nM)。
图25显示了向HSA-LR小鼠静脉注射施用下列物质2周后各种组织中的PMO浓度(pM)：裸PMO(3剂量200mg/kg)、30mg/kg的DPEP3.1-[CAG]7PMO缀合物、30mg/kg的DPEP3.1a-[CAG]7PMO缀合物和30mg/kg的DPEP3.1b-[CAG]7PMO缀合物。所述三种肽(DPEP3.1、DPEP3.1a和DPEP3.1b)能够将PMO递送至骨骼肌和心肌(>1nM)。
图26、27和28显示了，与注射生理盐水相比、与注射裸[CAG]7PMO相比，以及与注射Pip肽-[CAG]7PMO缀合物相比，在HSA-LR小鼠中全身静脉注射施用不同剂量的本发明的不同肽-[CAG]7PMO缀合物后在不同时间在尿中测量的KIM-1相对于肌酐水平的毒理学筛选。本发明的DPEP肽-[CAG]7PMO缀合物与尤其是Pip6a-[CAG]7PMO缀合物相比即使在较高剂量下也保持低毒性。使用能够将DM1表型逆转至健康水平的剂量方案，DPEP缀合物不会影响毒性生物标志物。
在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包括”和“包含”及其变体表示“包括但不限于”，并且它们并不旨在(并且不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本说明书的整个描述和权利要求书中，单数形式包括复数形式，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的地方，本发明应被理解为既包含复数也包含单数，除非上下文有其他要求。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。本说明书中公开的所有特征(包括任何随附的权利要求书、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以任意组合进行组合，除了这些特征和/或步骤中的至少一些是互斥的组合之外。
本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或者扩展到如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的一个或任何新颖的组合。读者应注意与本申请相关的与本说明书同时提交或在本说明书之前提交的所有论文和文献，这些论文和文献与本说明书一起公开供公众查阅，并且所有这些论文和文献的内容通过引用并入本文。
实施例
1.材料和方法
P-PMO的合成与制备
9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护的L-氨基酸、苯并***-1-基-氧基-三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)以及Fmoc-β-Ala-OH预装王氏树脂(0.19or 0.46mmol g-1)从Merck(Hohenbrunn，德国)获得。1-羟基-7-氮杂苯并***(HOAt)从Sigma-Aldrich获得。HPLC级乙腈、甲醇和合成级N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)购自Fisher Scientific(Loughborough，英国)。肽合成级N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和***是从VWR(Leicestershire，英国)获得的。哌啶和三氟乙酸(TFA)从Alfa Aesar(Heysham，英国)获得。PMO购自Gene Tools Inc.(Philomath，美国)。除非另有说明，所有其他试剂均获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，美国)。使用Voyager DE ProBioSpectrometry工作站进行MALDI-TOF质谱分析。将在水中的50％乙腈中的10mg mL-1的α-氰基-4-羟基肉桂酸或芥子酸储液用作基质。误差条为±0.1％。
用于筛选的P-PMO肽的合成
a)制备肽变体文库
通过应用标准Fmoc化学方法并遵循制造商的建议，使用Fmoc-β-Ala-OH预装的王氏树脂(0.19或0.46mmol g-1，Merck Millipore)，使用Intavis平行肽合成仪以10μmol规模制备肽，或使用CEM Liberty BlueTM肽合成仪(Buckingham，英国)以100μmol规模制备肽。在使用Intavis平行肽合成仪进行合成的情况下，将双偶联步骤与PyBOP/NMM偶联混合物一起使用，然后在每个步骤之后进行乙酸酐封端。对于使用CEM Liberty Blue肽合成仪进行的合成，所有氨基酸均采用单一标准偶联，精氨酸除外，它是通过双偶联进行的。所述偶联在60瓦微波功率下于75℃进行5分钟，精氨酸残基除外，其每个被偶联两次。每个去保护基反应在75℃进行两次，一次30秒，然后在35瓦微波功率下进行3分钟。一旦合成完成，将树脂用DMF(3 x 50mL)洗涤，并将固相结合肽的N末端在室温下在DIPEA存在下用乙酸酐乙酰化。N-末端乙酰化后，将肽树脂用DMF(3 x 20mL)和DCM(3 x 20mL)洗涤。通过在室温下用分离混合物处理3小时，将所述肽与固体支持物分离，所述分离混合物由以下组成：三氟乙酸(TFA)：H2O：三异丙基硅烷(TIPS)(95％:2.5％:2.5％:3-10mL)。肽释放后，将多余的TFA通过用氮气吹扫除去。粗制的肽通过加入冷***(15-40mL，取决于合成规模)沉淀，并以3200rpm离心5分钟。将粗制的肽沉淀物用冷***(3×15mL)洗涤三次，并使用Varian 940-LC HPLC***通过RP-HPLC纯化，所述Varian 940-LC HPLC***配备445-LC放大模块和440-LC级分收集器。通过半制备型HPLC在RP-C18色谱柱(10 x 250mm，Phenomenex Jupiter)上纯化肽，使用线性梯度的在0.1％TFA/H2O中的CH3CN，流速为15mL min-1。在220nm和260nm处进行检测。合并含有所需肽的级分并冻干，得到呈白色固体的肽(产率参见表1)。
Figure BDA0003587174990000451
Figure BDA0003587174990000461
表1：用于在实施例中测试的合成的肽，其具有N-末端乙酰化(Ac)、N-末端琥珀酸接头(Succ)、C-末端β-丙氨酸接头(B)、γ-氨基丁酸接头(Ab)和谷氨酸接头(E)。S*是葡糖基化丝氨酸残基。用DPEP5.7、Pip6a和Pip9b2形成的缀合物是可比较的。
b)合成肽-PMO缀合物文库
使用了用于三联体重复序列的21聚体PMO反义序列CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG(SEQID NO.95)，也称为[CAG]7。靶向CUG/CTG扩增的重复序列的PMO序列(5′-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3′(SEQ ID NO：95))购自Gene Tools LLC。这是本文其他地方提到的[CAG]7PMO。所述肽通过其C末端羧基与PMO的3'末端缀合。在存在2.5当量DIPEA和使用溶解在DMSO中的PMO的2.5倍过量肽的情况下，分别使用NMP中的2.5和2当量PyBOP和HOAt实现了这一点。通常，向溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP，80μL)中的肽(2500nmol)的溶液中加入PyBOP(19.2μL的0.3M的NMP溶液)、HOAt(16.7μL的0.3M的NMP溶液)、DIPEA(1.0mL)以及PMO(180μL的10mM的DMSO溶液)。将混合物在40℃下放置2.5小时，并通过添加0.1％TFA的H2O溶液(300μL)淬灭反应。使用改装的Gilson HPLC***通过离子交换色谱法纯化所述溶液。将所述PMO-肽结合物在离子交换柱上进行纯化(Resource S 4mL，GE Healthcare)，使用线性梯度的含有20％CH3CN的磷酸钠缓冲液(25mM，pH 7.0)。使用氯化钠溶液(1M)从柱中洗脱所述缀合物，流速为4mL min-1或6mL min-1。立即将包含所需化合物的级分合并脱盐。通过使用
Figure BDA0003587174990000462
ultra-15 3K离心过滤装置过滤离子交换后收集的级分，可以从所述肽-PMO缀合物中去除多余的盐。将缀合物冻干并通过MALDI-TOF分析。使用前，将所述缀合物溶解在无菌水中，并通过0.22μm的醋酸纤维素膜过滤。肽-PMO的浓度是通过缀合物在0.1N HCl溶液中在265nm处的摩尔吸收来确定的。(产率参见表2)。
肽 产率
D-Pep 1.1 36％
D-Pep 1.7 41％
D-pep 1.8 38％
D-Pep 1.9 40％
D-Pep 1.9b 34％
D-Pep 1.9W3 43％
D-Pep 1.9W4P 23％
D-Pep 3.1 31％
D-Pep 3.1a 17％
D-Pep 3.1b 25％
D-Pep 3.1d 37％
D-Pep 3.8 36％
D-Pep 3.8b 35％
D-Pep 5.70 31％
表2.用于细胞培养分析和体内实验的P-PMO缀合物的产率(所述产率基于冻干的纯化的P-PMO的干重。通过正相HPLC在220nm和260nm处测定，P-PMO的纯度大于95％。
动物模型和ASO注射。根据英国和法国的法律(伦理委员会许可#1760-2015091512001083v6)，分别在牛津大学或“Centre d’études fonctionnelles”(索邦大学医学院)进行了实验。HSA-LR或C57BL/6小鼠的静脉注射通过经由尾静脉的单次或多次施用进行。将5，7.5、12.5、30或40mg/kg的剂量的肽-PMO-CAG7和12.5或200mg/kg的PMO在0.9％盐水中稀释，并以5-6μL/g体重的体积给药。间隔2周进行多次注射。评估肌强直并在最后一次注射后2周收获组织。对于长期实验，注射后3个月收集组织。对于毒理学测量，1周后收获组织。通过ELISA(R&D cat#MKM100)测试尿，其中样品被稀释以符合标准曲线。将值归一化至尿肌酐水平(Harwell)以计算尿蛋白浓度
原位肌强直/肌肉松弛测量。原位研究了腓肠肌的等长收缩特性。用***/木聚糖溶液(分别为80mg/kg和15mg/kg)麻醉小鼠。膝盖和脚用夹子和针固定。腓肠肌的远端肌腱连接到伺服电机***的杠杆臂(305B，双模式杠杆)。使用PowerLab***(4SP，ADInstruments)和软件(图表4，ADInstruments)记录和分析数据。使用0.1ms持续时间的超大(10-V)方波脉冲通过双极银电极刺激坐骨神经(近端压碎)。在响应电刺激(频率为25至150赫兹，刺激序列为500毫秒)的等长收缩期间测量绝对最大等长强直力(P0)。肌强直测量为测量P0后肌肉松弛的延迟。
细胞培养和肽-PMO处理。将健康个体或具有2600个CTG重复的DM1患者的永生化成肌细胞培养在由M199:DMEM混合物(1:4的比例，Life technologies)组成的生长培养基中，所述培养基补充有20％FBS(Life technologies)、50μg/ml庆大霉素(LifeTechnologies)、25μg/ml胎球蛋白、0.5ng/ml bFGF、5ng/ml EGF和0.2μg/ml***(Sigma-Aldrich)。对于成肌细胞，通过将汇合的细胞培养物切换为补充有5μg/ml胰岛素(Sigma-Aldrich)的DMEM培养基来诱导成肌分化。为了处理，将WT或DM1细胞分化4天。然后，用新鲜的分化培养基更换培养基，所述新鲜培养基含有浓度为1、2、5、10、20或40μM的肽-PMO缀合物。处理后48小时收获细胞用于分析。使用基于荧光的测定法(Promega)，在人类肝细胞中以40uM浓度或在成肌细胞中以1、2、5、10、20或40μM浓度的肽-PMO转染2天后，对细胞生存力进行定量。
RNA分离、RT-PCR和qPCR分析。对于小鼠组织：在RNA提取之前，使用Fastprep***和Lysing Matrix D管(MP biomedicals)在TriReagent(Sigma-Aldrich)中破坏肌肉。对于人类细胞：在RNA提取之前，将细胞在蛋白酶K缓冲液(500mM NaCl、10mM Tris-HCl、pH 7.2、1.5mM MgCl2、10mM EDTA，2％SDS和0.5mg/ml蛋白酶K)中于55℃裂解45分钟。根据制造商的方案，使用TriReagent分离了总RNA。根据制造商的说明，使用M-MLV第一链合成***(LifeTechnologies)将一微克RNA反转录，总共20μL。随后根据标准方案(ReddyMix,ThermoScientific)将一微升cDNA制备物用于半定量PCR分析中。引物在下表3中示出：
表3
Figure BDA0003587174990000491
Figure BDA0003587174990000501
在每个基因的线性扩增范围内，PCR扩增进行了25-35个循环。将PCR产物在1.5-2％的琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭染色，并用ImageJ软件定量。将外显子包涵的比率定量为包涵相对于同工型信号总强度的百分比。为了量化mRNA表达，根据制造商的说明进行实时PCR。PCR循环为15分钟的变性步骤，然后是50个循环，其中在94℃变性15秒、在58℃退火20秒以及在72℃延伸20秒。
荧光原位杂交/免疫荧光。如前所述，使用Cy3标记的2'OMe(CAG)7探针(Eurogentec)进行荧光原位杂交(FISH)实验。对于联合FISH-免疫荧光实验，在FISH最后一次洗涤后进行免疫荧光染色，用兔多克隆抗MBNL1抗体，然后是二级Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔(1:500，Life Technologies)抗体。
基于ELISA的组织中寡核苷酸浓度的测量。开发了定制的基于杂交的ELISA，以使用用地高辛和生物素双标记的具有硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯探针(序列(5'->3')[DIG]C*T*G*C*T*G*C*TGCTGCT*G*C*T*G*C*T*G[BIO](SEQ ID NO:96))来确定PMO寡核苷酸的浓度。该测定在小鼠血清和组织裂解物中具有5–250pM(R2>0.99)的线性检测范围。所述探针用于检测来自经处理的HSA-LR小鼠的八种不同组织(脑、肾、肝、肺、心、膈肌、腓肠肌和股四头肌)中的肽-PMO或裸PMO浓度。
2.结果
在这项工作中，我们使用了一种具有特定结构的富含精氨酸的细胞穿透肽并表明了，与未缀合的PMO和其他肽载体缀合物策略相比，这种与[CAG]7吗啉代磷酸二酰胺低聚物(PMO)缀合的肽在全身施用后显著增强了ASO递送进入DM1模型HSA-LR小鼠的横纹肌中。因此，本文要求保护的靶向病理性扩增的由肽-[CAG]7PMO形成的缀合物的低剂量治疗足以逆转DM1小鼠(HSA-LR)中的剪接缺陷和肌强直，并使整体疾病转录组正常化。此外，经治疗的DM1患者衍生的肌肉细胞(成肌细胞)显示，如本文要求保护的肽-[CAG]7PMO缀合物特异性靶向突变CUGexp-DMPK转录物，从而消除了核RNA聚集点对MBNL1剪接因子的有害隔离以及因此导致的MBNL1功能丧失，其造成了拼接缺陷和肌肉功能障碍。我们的结果表明，如本文要求保护的肽-[CAG]7PMO缀合物在分子和功能水平上诱导DM1相关表型的高效和持久纠正，并强力支持将这些肽缀合物用于DM1的全身纠正治疗。
我们已经产生了包含不含人工氨基酸(例如X残基)的肽载体的缀合物的数据，与以前的细胞穿透肽相比，它们具有更宽的治疗窗口和更安全的毒理学特征，因此构成了在DM1患者中测试的更有希望的候选者。当与CAG7重复反义寡核苷酸PMO缀合时，这些新一代所谓的“DPEP1和DPEP3”肽在体外在减少致病聚集点的数量(图1)和纠正剪接缺陷方面显示出高效(图2、3、4和19)。所测试的浓度均未导致人类肝细胞(1-40μM)中的细胞生存力降低,这与由已知的“Pip”载体肽形成的类似比较缀合物相反；Pip6a-PMO和Pip9b2-PMO在40μM时诱导显著的细胞死亡率(>50％)(图7)。许多所测试的浓度未导致人类成肌细胞中的细胞生存力降低,并且与由在较低剂量下诱导细胞死亡的已知的“Pip”载体肽Pip6a-PMO和Pip9b2-PMO形成的类似比较缀合物相比表现更好(图5和6)。
随后，我们测试了这些新肽是否也能有效纠正HSA-LR小鼠的肌强直和剪接变化。为此，我们测试了DPEP 1和3系列的主要肽载体DPEP1.9和DPEP3.8，并与现有的肽载体DPEP5.70进行了比较。我们能够证明，在以30mg/kg的由DPEP3.8和DPEP1.9形成的缀合物进行处理两周后，剪接缺陷(图4)和肌强直(图8、9和10)被纠正为野生型水平。
通过ELISA评估裸PMO的生物分布与用载体肽DPEP1.9和DPEP3.8形成的缀合物的生物分布，以量化肽-[CAG]7 PMO缀合物的递送。在DM1中受严重影响的组织(例如心脏和大脑)中检测PMO对于药物递送开发很重要。将30mg/kg的肽-[CAG]7 PMO缀合物单次静脉内注射或将200mg/kg的裸PMO 3次注射施用于HAS-LR小鼠(总计600mg/kg)。在施用后2周分析腓肠肌、股四头肌、膈肌、心脏和大脑的PMO检测。未缀合的裸[CAG]7 PMO在所有测试的组织中具有低至不可检测的水平，然而，与肽载体DPEP1.9和DPEP3.8缀合的[CAG]7 PMO尽管以较低剂量注射却仍以较高的水平检测到(>20倍摩尔浓度)。一般地，以30mg/kg注射后2周，在股四头肌、腓肠肌和膈肌中检测到的肽-[CAG]7 PMO缀合物为1nM-4nM而在心脏中为1nM(图17)。
表4
Figure BDA0003587174990000531
我们还研究了在施用低剂量肽-[CAG]7 PMO缀合物(5mg/kg)后在血清中测量的本发明的肽-[CAG]7 PMO缀合物的药代动力学特性。我们量化了血清中的浓度，在静脉注射5分钟后达到500-800nM，1小时后降至100nM，并且3小时后降至10nM。处理后6小时浓度约为1nM，其中大部分化合物已被清除或递送至感兴趣的组织(图18)。
在野生型小鼠中对由DPEP3.8和DPEP1.9载体肽形成的缀合物的初步毒理学评估表明，ALP、ALT、AST、KIM-1、肌酐、BUN和NGAL水平与生理盐水对照注射相似，与由目前来自Pip系列的可用的肽载体通常引起的成倍的增加相反。借助这些初步数据，我们证明了在体内由DPEP肽与[CAG]7 PMO形成的缀合物与Pip6a一样具有活性，而且具有更宽的治疗窗(图11、12和21)。
此外，与注射盐水的5只HSA-LR小鼠相比，注射单剂量的30mg/kg的由DPEP3.8-[CAG]7形成的缀合物的5只HSA-LR小鼠的体重没有显示任何显著趋势(图16)。
此外，HSA-LR小鼠在注射基于DPEP的[CAG]7 PMO缀合物后的恢复时间比注射由现有的肽载体(如Pip6a)形成的缀合物后的恢复时间短(表5)。
表5
Figure BDA0003587174990000541
更详细地评估本发明缀合物的功效，我们还发现，在施用DPEP肽-[CAG]7PMO缀合物后至少3个月，剪接缺陷和肌强直被纠正为野生型水平(分别为图19和20)。我们还测量了施用7.5mg/kg剂量后，错误拼接和肌强直减少了50％。
值得注意的是，用现有的肽载体(如Pip6a-[CAG]7 PMO)形成的缀合物不能在>20mg/kg下测试而不引起小鼠的高死亡率，这与本发明的缀合物相反，本发明的缀合物的浓度可以增加5倍以上而不会导致任何死亡。此外，在毒性筛选中，我们仅在治疗后2天在超过30mg/kg的剂量中检测到与盐水水平相比的Kim1水平变化(图21)。
功效和毒理学数据表明，所要求保护的与DPEP1和DPEP3系列载体肽形成的缀合物在受DM1影响的个体中特别有效地阻断扩增的CTG重复对MBNL1的螯合，并诱导低毒性。这些缀合物能够在分子水平上通过剪接的正常化和在肌肉水平上通过将肌强直纠正至野生型水平来完全纠正DM1表型。这些新的缀合物还比现有的肽载体形成的缀合物具有更宽的治疗窗口，因此它们更接近于在临床上实现。
综上所述，我们展示了强有力的证据支持(1)肽-[CAG]7 PMO阻断MBNL1与核突变体CUGexp-RNA的病理相互作用并挽救对RNA剪接的下游影响；(2)肽缀合的反义寡核苷酸方法允许将治疗递送至难以接近的组织，如隔肌中的心脏；(3)[CAG]7 PMO直接靶向疾病突变的强力效果结合肽载体技术在体内提供高效治疗的能力，共同将骨骼肌DM1小鼠(HSA-LR)中的DM1表型强烈逆转至野生型水平，即使在停止治疗几个月后。这些证据有力地表明肽-[CAG]7缀合物可能在DM1中具有很强的疾病改善作用。
事实上，我们的实验表明，我们在HSA-LR小鼠中观察到的效果不仅阻止了DM1病理学的恶化，而且实际上导致了疾病表型的逆转。扩增的CUG转录物已在幼崽中表达，并且HSA-LR小鼠在1月龄时出现明显的肌强直。我们用于产生支持本申请的结果的动物在至少2个月甚至7个月大时被处理，远远超出了DM1的分子和功能表型发展的时间点。
3.结论
*包含DPEP载体肽和[CAG]7 PMO(10μM)的缀合物能够减少DM1患者成肌细胞和对照中>50％的核病灶数量(在不降低细胞生存力的剂量下)。与用在20μM或更高浓度下诱导显著细胞死亡率(>50％)的其他载体肽形成的比较缀合物相反，所测试的浓度均未导致细胞生存力降低(1-40μM)。
*包含DPEP载体肽和[CAG]7 PMO的缀合物显示出积极的药代动力学，并且生物分布评估揭示了向DM1中严重受影响的组织的最佳递送。
*包含DPEP载体肽和[CAG]7 PMO的缀合物在HSA-LR小鼠中在剂量(30mg/kg，静脉注射)下在Clcn1外显子7a、Serca外显子22、Mbnl1外显子5和Ldb3外显子11中诱导50％-90％的剪接纠正，其毒性低于12.5mg/kg的与其他载体肽形成的比较缀合物。RT-PCR分析还显示了使用30和40mg/kg的包含DPEP1.9和DPEP3.8的缀合物使剪接正常化为野生型水平。剪接纠正在治疗后至少持续3个月，在单次低剂量(5和7.5mg/kg)后也很显著。
*根据肌强直定性观察和肌电图肌强直测量，在以40mg/kg或30mg/kg(IV)单次注射后，包含DPEP载体肽和[CAG]7 PMO的缀合物将肌强直降低至野生型水平。在以7.5mg/kg的包含DPEP3.8或DPEP1.9的缀合物进行4次注射后，也出现了肌强直的中度矫正。
*以30mg/kg(静脉)注射的包含DPEP载体肽和[CAG]7 PMO的缀合物在野生型小鼠中诱导的嗜睡时间比以12.5mg/kg单次注射与其他载体肽形成的比较缀合物相比更短(>1小时)。肾功能和血液分析的尿生化测试显示，与生理盐水相比，在野生型小鼠中没有变化，在HSA-LR中Kim1水平和尿蛋白在＝>30mg/kg后发生轻微变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 牛津大学科技创新有限公司
<120> 缀合物及其用途
<130> P266149GB
<160> 121
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 1
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<400> 2
Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<400> 3
Arg Xaa Arg Arg
1
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 4
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 5
Arg Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 6
Arg Xaa Arg Arg Xaa
1 5
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<400> 7
Xaa Arg Xaa Arg
1
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<400> 8
Arg Xaa His Xaa His
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<400> 9
His Xaa His Xaa Arg
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 10
Arg Xaa Arg His Xaa His Arg
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 11
Arg Xaa Arg Xaa Xaa His Arg
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 12
Arg Xaa Arg Arg Xaa His
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 13
His Xaa Arg Arg Xaa Arg
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<400> 14
His Xaa His Xaa His
1 5
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<400> 15
Xaa His Xaa His
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 16
Xaa Arg Xaa Ser Xaa
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<400> 17
Xaa Arg Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X 是 bAla
<400> 18
Arg Xaa His Xaa His Xaa
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 羟脯氨酸
<400> 19
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 20
Tyr Gln Phe Leu Ile
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 21
Phe Gln Ile Leu Tyr
1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 22
Ile Leu Phe Gln Tyr
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 23
Phe Gln Ile Tyr
1
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 24
Trp Trp Pro Trp Trp
1 5
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 25
Trp Pro Trp Trp
1
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 26
Trp Trp Pro Trp
1
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 27
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 28
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Arg
1 5 10 15
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 29
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Arg Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 30
Arg Xaa Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg
1 5 10 15
Arg
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 31
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 32
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Ile Leu Phe Gln Tyr Arg Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 33
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 34
Arg Xaa Arg Arg Xaa Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 35
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 36
Arg Xaa Arg Arg Xaa Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 37
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 38
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr His Xaa His Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 39
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr His Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
His
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 40
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 41
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Ile Leu Phe Gln Tyr Arg Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 42
Arg Xaa Arg His Xaa His Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 43
Arg Xaa Arg Xaa Xaa His Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 44
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 45
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr His Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 46
Arg Xaa Arg Arg Xaa His Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 47
His Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 48
Arg Xaa Arg Arg Xaa Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 49
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 50
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Tyr Gln Phe Leu Ile His Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 51
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Ile Leu Phe Gln Tyr His Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 52
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr His Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 53
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> x 羟脯氨酸
<400> 54
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 羟脯氨酸
<400> 55
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 56
Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 57
Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<400> 58
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Trp Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 59
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Pro Trp Trp Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 60
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<400> 60
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Pro Trp Trp Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<400> 61
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Pro Trp Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 62
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Trp Trp Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 63
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Trp Pro Trp Trp Arg Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 64
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Pro Trp Trp Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 65
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Trp Pro Trp Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 66
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 66
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 67
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 68
Xaa Arg Xaa Arg Xaa Trp Trp Pro Trp Trp Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 69
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 70
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 71
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa His
1 5 10 15
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 羟脯氨酸
<400> 72
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 73
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 羟脯氨酸
<400> 74
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 75
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<400> 75
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10
<210> 76
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<400> 76
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Pro Arg Xaa His Xaa His
1 5 10
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<400> 77
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Pro Trp Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 78
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Pro Trp Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 79
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Pro Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 80
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Pro Trp Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 81
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Trp Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 82
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Trp Pro Trp Trp Arg Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 83
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Pro Trp Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 84
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Trp Trp Pro Trp Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 85
Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 86
Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> X 是 bAla
<400> 87
Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 88
Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa His Xaa His
1 5 10 15
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> X 是 bAla
<400> 89
Arg Xaa Arg Arg Xaa His Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa His Xaa
1 5 10 15
His
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X 是 羟脯氨酸
<400> 90
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 91
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X 是 羟脯氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X 是 羟脯氨酸
<400> 92
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<400> 93
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Trp Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<400> 94
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Trp Trp Pro Trp Trp Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10 15
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21聚体PMO反义序列
<400> 95
cagcagcagc agcagcagca g 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 硫代磷酸酯探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 用地高辛标记
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 用生物素标记
<400> 96
ctgctgctgc tgctgctgct g 21
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D-PEP 5.70
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 糖基化丝氨酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X 是 bAla
<400> 97
Arg Xaa Arg Xaa Arg Ser Arg Xaa Arg Xaa Arg
1 5 10
<210> 98
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pip6a
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 氨基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X 是 氨基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X 是 氨基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X 是 氨基己酸
<400> 98
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg Xaa
1 5 10 15
Arg Xaa Arg Xaa Arg
20
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pip9b2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X 是 氨基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X 是 bAla
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X 是 氨基己酸
<400> 99
Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Phe Gln Ile Leu Tyr Arg Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Arg
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Mbnl1.F
<400> 100
gctgcccaat accaggtcaa c 21
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Mbnl1.R
<400> 101
tggtgggaga aatgctgtat gc 22
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Clcn1.F
<400> 102
ttcacatcgc cagcatctgt gc 22
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Clcn1.R
<400> 103
cacggaacac aaaggcactg aatgt 25
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Serca.F
<400> 104
gctcatggtc ctcaagatct cac 23
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Serca.R
<400> 105
gggtcagtgc ctcagctttg 20
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ldb3.F
<400> 106
ggaagatgag gctgatgagt gg 22
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ldb3.R
<400> 107
tgctgacagt ggtagtgctc tttc 24
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 BIN.F
<400> 108
agaacctcaa tgatgtgctg g 21
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 BIN.R
<400> 109
tcgtgttgac tctgatctcg g 21
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 DMD.F
<400> 110
ttagaggagg tgatggagca 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 DMD.R
<400> 111
gatactaagg actccatcgc 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 INSR.F
<400> 112
ccaaagacag actctcagat 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 INSR.R
<400> 113
aacatcgcca agggacctgc 20
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 LDB3.F
<400> 114
gcaagaccct gatgaagaag ctc 23
<210> 115
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 LDB3.R
<400> 115
gacagaaggc cggatgctg 19
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 SERCA.F
<400> 116
atcttcaagc tccgggccct 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 SERCA.R
<400> 117
cagctctgcc tgaagatgtg 20
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 SOS1.F
<400> 118
cagtaccaca gatgtttgca gtg 23
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 SOS1.R
<400> 119
tctggtcgtc ttcgtggagg aa 22
<210> 120
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 TNNT2.F
<400> 120
atagaagagg tggtggaaga gtac 24
<210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 TNNT2.R
<400> 121
gtctcagcct ctgcttcagc atcc 24

Claims (25)

1.一种缀合物，其包含：与治疗分子共价连接的肽载体；
其中所述肽载体的总长度为40个或更少的氨基酸，并且包含：两个或多个阳离子结构域，每个阳离子结构域包含至少4个氨基酸残基，以及一个或多个疏水性结构域，每个疏水性结构域包含至少3个氨基酸残基，其中所述肽载体不含人工氨基酸残基；
并且其中所述治疗分子包含核酸，其中所述核酸包含多个三核苷酸重复。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述核酸包含多个选自GTC、CAG、GCC、GGC、CTT和CCG重复的三核苷酸重复。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述核酸包含多个CAG重复。
4.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述核酸包含5-20个三核苷酸重复，优选5-10个三核苷酸重复，优选7个三核苷酸重复。
5.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述核酸与三核苷酸重复扩增结合。
6.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述肽载体由天然氨基酸残基组成。
7.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域的长度为4至12个氨基酸残基，优选为4至7个氨基酸残基。
8.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域包含至少40％、至少45％、至少50％的阳离子氨基酸。
9.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域包含精氨酸、组氨酸、β-丙氨酸、羟脯氨酸和/或丝氨酸残基，优选地其中每个阳离子结构域由精氨酸、组氨酸、β-丙氨酸、羟脯氨酸和/或丝氨酸残基组成。
10.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述肽载体包含两个阳离子结构域。
11.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中每个阳离子结构域包含以下序列之一：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ ID NO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ ID NO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQID NO:12)、HBRRBR(SEQ ID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B(SEQ ID NO:17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(SEQ ID NO:18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)或其任意组合；优选地，其中每个阳离子结构域由以下序列之一组成：RBRRBRR(SEQ ID NO:1)、RBRBR(SEQ ID NO:2)、RBRR(SEQ ID NO:3)、RBRRBR(SEQ IDNO:4)、RRBRBR(SEQ ID NO:5)、RBRRB(SEQ ID NO:6)、BRBR(SEQ ID NO:7)、RBHBH(SEQ IDNO:8)、HBHBR(SEQ ID NO:9)、RBRHBHR(SEQ ID NO:10)、RBRBBHR(SEQ ID NO:11)、RBRRBH(SEQ ID NO:12)、HBRRBR(SEQ ID NO:13)、HBHBH(SEQ ID NO:14)、BHBH(SEQ ID NO:15)、BRBSB(SEQ ID NO:16)、BRB[Hyp]B(SEQ ID NO:17)、R[Hyp]H[Hyp]HB(SEQ ID NO:18)、R[Hyp]RR[Hyp]R(SEQ ID NO:19)或其任意组合。
12.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中每个疏水性结构域的长度为3-6个氨基酸，优选地每个疏水性结构域的长度为5个氨基酸。
13.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中每个疏水性结构域包含大部分疏水性氨基酸残基，优选地每个疏水性结构域包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、100％的疏水性氨基酸。
14.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中每个疏水性结构域包含苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺残基；优选地其中每个疏水性结构域由苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和/或谷氨酰胺残基组成。
15.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述肽载体包含一个疏水性结构域。
16.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述或每个疏水性结构域包含以下序列之一：YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQ ID NO:24)、WPWW(SEQ ID NO:25)、WWPW(SEQ ID NO:26)或其任意组合；优选地，其中所述或每个疏水性结构域由以下序列之一组成：YQFLI(SEQ ID NO:20)、FQILY(SEQ ID NO:21)、ILFQY(SEQ ID NO:22)、FQIY(SEQ ID NO:23)、WWW、WWPWW(SEQID NO:24)、WPWW(SEQ ID NO:25)、WWPW(SEQ ID NO:26)或其任意组合。
17.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述肽载体由两个阳离子结构域和一个疏水性结构域组成，优选地，其中所述肽由两侧为两个阳离子臂结构域的一个疏水性核心结构域组成。
18.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述肽载体由以下序列之一组成：RBRRBRFQILYBRBR(SEQ ID NO:35)、RBRRBRRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:37)和RBRRBRFQILYRBHBH(SEQ ID NO:44)。
19.根据任一前述权利要求所述的缀合物，其中所述肽载体通过接头与所述治疗分子共价连接。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述接头选自G、BC、XC、C、GGC、BBC、BXC、XBC、X、XX、B、BB、BX、XB、E、GABA和琥珀酸。
21.根据权利要求1-20的任一项所述的缀合物，其用作药物。
22.根据权利要求1-20的任一项所述的缀合物，其用于预防或治疗三核苷酸重复病症。
23.根据权利要求22所述的缀合物，其中所述三核苷酸重复病症选自聚谷氨酰胺疾病或非聚谷氨酰胺疾病。
24.根据权利要求22或23所述的缀合物，其中所述三核苷酸重复病症选自：DRPLA(齿状核红核苍白球路易体萎缩症)、HD(亨廷顿氏病)、HDL2(类亨廷顿病综合征2)、SBMA(脊髓延髓肌萎缩症)、SCA1(脊髓小脑性共济失调1型)、SCA2(脊髓小脑性共济失调2型)、SCA3(脊髓小脑性共济失调3型或Machado-Jospeh病)、SCA6(脊髓小脑性共济失调6型)、SCA7(脊髓小脑性共济失调7型)、SCA17(脊髓小脑性共济失调17型)、HDL2(类亨廷顿病综合征2)、FRAXA(脆性X综合征)、FXTAS(脆性X相关震颤/共济失调综合征)、FRAXE(脆性XE智力迟钝)、FRDA(Friedrich共济失调)、DM1(强直性肌营养不良1型)、SCA8(脊髓小脑性共济失调8型)和SCA12(脊髓小脑性共济失调12型)。
25.根据权利要求22-24的任一项所述的缀合物，其中所述三核苷酸重复病症是强直性肌营养不良1型(DM1)。
CN202080071067.8A 2019-08-09 2020-08-07 缀合物及其用途 Pending CN114615998A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1911403.2 2019-08-09
GBGB1911403.2A GB201911403D0 (en) 2019-08-09 2019-08-09 Conjugate and uses thereof
PCT/GB2020/051891 WO2021028666A1 (en) 2019-08-09 2020-08-07 Conjugate and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114615998A true CN114615998A (zh) 2022-06-10

Family

ID=67990936

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080071067.8A Pending CN114615998A (zh) 2019-08-09 2020-08-07 缀合物及其用途

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220275372A1 (zh)
EP (1) EP4010030A1 (zh)
JP (1) JP2022543320A (zh)
KR (1) KR20220079524A (zh)
CN (1) CN114615998A (zh)
AU (1) AU2020327659A1 (zh)
BR (1) BR112022002309A2 (zh)
CA (1) CA3149700A1 (zh)
GB (1) GB201911403D0 (zh)
IL (1) IL290424A (zh)
MX (1) MX2022001712A (zh)
WO (1) WO2021028666A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3212994A1 (en) * 2021-03-12 2022-09-15 Pepgen Inc. Methods of treating myotonic dystrophy type 1 using peptide-oligonucleotide conjugates

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100016215A1 (en) * 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
US20110105403A1 (en) * 2008-06-04 2011-05-05 Medical Research Council Peptides
US20110269665A1 (en) * 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CN103998458A (zh) * 2011-08-30 2014-08-20 医学研究理事会 具有中央疏水域的细胞穿透肽
CN104837997A (zh) * 2012-09-25 2015-08-12 建新公司 用于肌强直性营养不良治疗的肽连接吗啉代反义寡核苷酸

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2708237C2 (ru) 2014-08-22 2019-12-05 Общество с ограниченной ответственностью "НооГен" Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100016215A1 (en) * 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
US20110105403A1 (en) * 2008-06-04 2011-05-05 Medical Research Council Peptides
US20110269665A1 (en) * 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CN103998458A (zh) * 2011-08-30 2014-08-20 医学研究理事会 具有中央疏水域的细胞穿透肽
US20140342992A1 (en) * 2011-08-30 2014-11-20 Medical Research Council Cell-Penetrating Peptides Having a Central Hydrophobic Domain
CN104837997A (zh) * 2012-09-25 2015-08-12 建新公司 用于肌强直性营养不良治疗的肽连接吗啉代反义寡核苷酸
US20150238627A1 (en) * 2012-09-25 2015-08-27 Genzyme Corporation Peptide-linked morpholino antisense oligonucleotides for treatment of myotonic dystrophy

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022001712A (es) 2022-05-13
WO2021028666A1 (en) 2021-02-18
US20220275372A1 (en) 2022-09-01
EP4010030A1 (en) 2022-06-15
JP2022543320A (ja) 2022-10-11
IL290424A (en) 2022-04-01
KR20220079524A (ko) 2022-06-13
BR112022002309A2 (pt) 2022-04-26
CA3149700A1 (en) 2021-02-18
AU2020327659A1 (en) 2022-02-24
GB201911403D0 (en) 2019-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2846218C (en) Cell-penetrating peptides having a central hydrophobic domain
US8575305B2 (en) Cell penetrating peptides
US20230158166A1 (en) Biologically active compounds
US20210299263A1 (en) Cell-penetrating peptides
US20220125934A1 (en) Linkers
CN114615998A (zh) 缀合物及其用途
US20220041662A1 (en) Cell penetrating peptides
WO2023194729A1 (en) Lysine rich cell-penetrating peptides
US20210299264A1 (en) Cell-penetrating peptides
US20240189434A1 (en) Methods of treating myotonic dystrophy type 1 using peptide-oligonucleotide conjugates
WO2024094980A1 (en) Shortened cell-penetrating peptides
EP4304657A2 (en) Methods of treating myotonic dystrophy type 1 using peptide-oligonucleotide conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40075520

Country of ref document: HK