CN114594260A - 光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，其步骤包括提供疑似hook样本，向疑似hook样本中按照先后顺序依次添加包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、标记生物素的乙肝表面抗体、亲和素包被的感光微粒进行混合反应，并读取反应后的发光信号值，若信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本。该方法可以在不稀释的情况下直接识别HBsAg检测中存在的hook效应，反应时间较短，可完全由全自动化完成整个过程，方便、快捷，大大提高了临床检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体的说，涉及了一种光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法。
背景技术
光激化学发光均相免疫检测技术是目前的一种新型免疫学检测技术，该技术通过抗原抗体结合后距离拉近的原理来识别结合相和未结合相，可以做到均相检测。而传统的免疫检测技术则是以非均相方式进行检测，该过程需要通过洗涤来分离结合相和未结合相。由此光激化学发光均相免疫检测技术可以省去洗涤过程。省去该过程，则可以加快检测速度，同时避免洗涤不干净带来的污染，精密度更好。但是，不洗涤同时也带来了hook效应问题，即在检测物浓度极高时，反而会出现检测结果显示为较低的值，尤其是对采用夹心法检测的项目。目前的传染病检测项目中，多是定性检测，因此即使出现hook效应，也多不影响正常的定性诊断。
然而，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)在临床上则常常有定量的需求。目前临床上乙肝治疗的最理想效果就是HBsAg浓度下降，最终变为阴性。但是利用光激化学发光检测平台进行检测时，如果出现hook效应，则会误导临床治疗。即样本本来是一个极高的浓度，比如1000000ng/mL，但是检测显示结果反而较低，常常只有50-300ng/mL，虽然治疗一段时间效果较为明显，但是光激化学发光检测平台缺检测不到样本浓度的降低，这样会误导临床治疗方案效果不明显，实则治疗有较好的效果。
目前能够识别hook效应的方法，主要是对样本进行一次光激化学发光检测平台检测后，对判定为疑似hook样本进行稀释，然后将稀释后的样本利用光激化学发光检测平台再检测一次。但是由于仪器不是都设置有稀释功能，需要手工进行稀释，增加了临床操作的繁琐，且稀释后再次检测，检测时间增加了一倍，大大降低了检测效率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，包括以下步骤：
步骤一、提供疑似hook样本；
步骤二、向疑似hook样本中按照先后顺序依次添加包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、标记生物素的乙肝表面抗体、亲和素包被的感光微粒进行混合反应，并读取反应后的发光信号值，若信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本。
如此，具体原因如下：本发明通过与现有的稀释法最终确定样本的分类进行比对，发现当样本为非hook时，其发光信号值基本上都低于2000的；而当样本为hook样本时，其发光信号值基本上都高于4000。倘若本发明只设置一个临界值来具体划分，那么在临界值附近的样本就无法进行准确归类。因此，本发明通过将信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本，使得介于2000至4000之间的样本归属具有较大的缓冲区域，分界很清楚，而介于2000至4000之间的样本可以再通过现有的稀释法进一步进行归类。即，本发明特别适合大批量样本的快速检测，有效解决了大批量样本检测时会由于稀释样本较多而无法满足正常临床发报告时间的问题。
基于上述，所述步骤二中，所述疑似hook样本、所述包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、所述标记生物素的乙肝表面抗体、所述亲和素包被的感光微粒之间的体积比为1:1:1:10。
基于上述，所述步骤二包括：向10μL所述疑似hook样本中按照先后顺序依次添加10μL所述包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、10μL所述标记生物素的乙肝表面抗体、100μL所述亲和素包被的感光微粒，之后在37℃温度下混合反应1min，并读取反应后的发光信号值，若信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本。
基于上述，所述步骤一包括：利用光激化学发光检测平台对乙型肝炎表面抗原样本进行检测，并读取反应后的发光信号值，并根据已有校准曲线获得浓度结果，将浓度在0.2ng/mL～500ng/mL的乙型肝炎表面抗原样本判定为疑似hook样本。
具体地，所述步骤一包括：将25μL乙型肝炎表面抗原样本与25μL包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、25μL标记生物素的乙肝表面抗体进行混合反应15min，然后再向其中加入175μL亲和素包被的感光微粒进行反应10min，整个反应在37°中进行，并读取反应后的发光信号值，并根据已有校准曲线获得浓度结果，将浓度在0.2ng/mL～500ng/mL的乙型肝炎表面抗原样本判定为疑似hook样本。
与现有技术相比，本发明具有突出的实质性特点和显著的进步，具体地说，本发明提供的一种光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，可以在不稀释的情况下直接识别HBsAg检测中存在的hook效应，而且只需要1min就可以完成识别过程，无需手工稀释，反应时间较短，可以完全由全自动化完成整个过程，方便、快捷，大大提高了临床检测效率。
进一步的，本发明将信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本的原因为本发明通过与现有的稀释法最终确定样本的分类进行比对，发现当样本为非hook时，其发光信号值基本上都低于2000的；而当样本为hook样本时，其发光信号值基本上都高于4000，从而可以使得hook样本和非hook样本有较好的区分度，识别度较高，解决存在的hook问题，保证临床HBsAg定量检测结果的准确性。且在浓度不改变的情况下，对临床样本用量和较为昂贵的抗体试剂体积用量均降低到只需要10微升，对临床样本的采取量没有更高要求，需要付出的检测成本也较小，从而达到以较低的成本代价来高效、快速、准确地解决HBsAg定量检测的hook问题。因此，本发明特别适合大批量样本的快速检测，有效解决了大批量样本检测时会由于稀释样本较多而无法满足正常临床发报告时间的问题。
附图说明
图1为利用常规的稀释法和本发明提供的方法对样本进行检测时反应机理中各符号指代物质。
图2为利用常规的稀释法对样本进行检测时样本的反应机理，图中A表示为非hook样本发生的反应类型，图中B为hook样本发生的反应类型。
图3为利用本发明提供的方法对样本进行检测时的反应机理，图中A表示为非hook样本发生的反应类型，图中B为hook样本发生的反应类型。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本实施例提供一种光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，包括以下步骤：
步骤一、提供疑似hook样本；
步骤二、向10μL所述疑似hook样本中按照先后顺序依次添加10μL所述包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、10μL所述标记生物素的乙肝表面抗体、100μL所述亲和素包被的感光微粒，之后在37℃温度下混合反应1min，并读取反应后的发光信号值，若信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本。而介于2000至4000之间的样本可以再通过现有的稀释法进一步进行归类。
具体地，本实施例中采用科美诊断技术股份有限公司生产的自动光激化学发光检测仪LiCA500进行试验并读取反应后的发光信号值。同时通过对比，其他厂家生产的自动光激化学发光检测仪对同一批疑似hook样本测得的发光信号值基本一致，即自动光激化学发光检测仪的生产厂家并不影响发光信号值的测定。
具体地，本实施例中，所述步骤一包括：将25μL乙型肝炎表面抗原样本与25μL包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、25μL标记生物素的乙肝表面抗体进行混合反应15min，然后再向其中加入175μL亲和素包被的感光微粒进行反应10min，整个反应在37°中进行，并读取反应后的发光信号值，并根据已有校准曲线获得浓度结果，将浓度在0.2ng/mL～500ng/mL的乙型肝炎表面抗原样本判定为疑似hook样本。
具体地，如图1和图2所示，对于利用常规的稀释法对疑似hook样本再次进行检测时，会发生以下两种情况：
当疑似hook样本实际上为非hook样本时：所有抗原均和试剂形成双抗体夹心模式；当疑似hook样本实际上为hook样本：只有部分抗原能形成三联复合物，虽然抗原量很高，但是检测信号值无法完全体现。
更具体地，如图1和图2所示，图2A中的非hook样本基本所有的抗原均和试剂反应形成三联复合物。图2B中的hook样本一部分形成双抗体夹心模式的三联复合物，但是还有一些分别和试剂A与试剂B形成各自的二联复合物，而无法形成三联复合物，这一部分中的抗原相当于检测不到，因此，最终得到的检测结果和A较为接近，无法有效进行区分。
具体地，如图1和图3所示，而利用本发明提供的方法对疑似hook样本进行检测时，会发生以下两种情况。
当疑似hook样本实际上为非hook样本：由于通用液在反应第一时间就加入，而生物素和亲和素的亲和力远大于抗原抗体结合时间，同时由于乙肝表面抗原浓度不高，因此，试剂B会先和通用液结合，这样以游离形式存在的试剂B会大量富集在包被亲和素的感光微粒上，这样可能会造成两种情况：1、游离抗体的扩散能力减弱，导致和HBsAg的碰撞更加困难；2、由于一个亲和素要结合四个生物素，可能会造成空间位阻，加上只反应了1min，所以信号值非常低，接近试剂的本底。
当疑似hook样本实际上为hook样本时：虽然生物素和亲和素亲和力远远大于抗原抗体反应，但是抗原抗体结合需要先碰撞然后再考虑亲和力大小。在hook效应存在时，乙肝表面抗原的量极高，此时抗原抗体碰撞的概率极高，会先形成：试剂A-乙肝表面抗原-试剂B的三联复合物，虽然反应时间只有1min，但由于抗原浓度高，也能形成较多的三联复合物，然后才会和通用液结合，因此最终形成的三联复合物和目前在使用的检测方案较为接近。
即图3B图中形成的三联复合物和正常检测较为接近，但是按照该模式A图中形成的三联复合物则近乎为0，由此两者之间的检测信号值会有明显差异，这样就对hook效应有一个较好的区分。
对比试验
为了验证本实施例提供的光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法的准确性，对同一批疑似hook样本同时按照传统的稀释法对判定为疑似hook样本进行稀释，然后将稀释后的样本利用光激化学发光检测平台再检测一次，同时按照本实施例提供的方法对判定为疑似hook样本进行检测，来判断疑似hook样本是否为非hook样本或hook样本。具体检测结果如表1所示。
其中，常规稀释法中，对样本随机阴性(传染病八项全阴)血清稀释10倍后进行检测。判定标准为：稀释10倍后检测浓度值为大于500ng/mL为hook样本；稀释10倍后浓度值小于原倍检测浓度为非hook样本。
而按照本实施例提供的方法，判定标准为：所测得的信号值大于4000判定为hook样本，所测得的信号值小于2000则判定该样本为非hook样本。
从表1中可以看出，本实施例提供的方法的检测准确率与常规的稀释法的准确率相同。但是，由于该方法可以在不稀释的情况下直接识别HBsAg检测中存在的hook效应，而且只需要1min就可以完成识别过程，无需手工稀释，反应时间较短，可以完全由全自动化完成整个过程，方便、快捷，大大提高了临床检测效率。
同时，本方法中hook样本和非hook样本有较好的区分度，识别度较高，解决存在的hook问题，保证临床HBsAg定量检测结果的准确性。且对临床样本用量和较为昂贵的抗体试剂体积用量，在浓度不改变的情况下，均降低到只需要10微升，对临床样本的采取量没有更高要求，需要付出的检测成本也较小。从而达到以很低的成本代价来高效、快速、准确地解决HBsAg定量检测的hook问题。
具体地，表1中原倍检测浓度是指首次利用光激化学发光检测平台对乙型肝炎表面抗原样本进行检测，读取反应后的发光信号值，并根据已有校准曲线获得的浓度值。
血清稀释10倍检测浓度是指对乙型肝炎表面抗原样本进行稀释10倍后，再次利用光激化学发光检测平台对乙型肝炎表面抗原样本进行检测，读取反应后的发光信号值，并根据已有校准曲线获得的浓度值。
本发明方法信号值是指利用本发明提供的方法对乙型肝炎表面抗原样本进行检查获取的发光信号值。
表1、本发明中的方法与常规稀释法识别hook样本检测结果对比
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (4)
1.一种光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，包括以下步骤：
步骤一、提供疑似hook样本；
步骤二、向疑似hook样本中按照先后顺序依次添加包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、标记生物素的乙肝表面抗体、亲和素包被的感光微粒进行混合反应，并读取反应后的发光信号值，若信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本。
2.根据权利要求1所述的光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，其特征在于：所述步骤二中，所述疑似hook样本、所述包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、所述标记生物素的乙肝表面抗体、所述亲和素包被的感光微粒之间的体积比为1:1:1:10。
3.根据权利要求1或2所述的光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，其特征在于：所述步骤二包括：向10µL所述疑似hook样本中按照先后顺序依次添加10µL所述包被在发光微粒表面的乙肝表面抗体、10µL所述标记生物素的乙肝表面抗体、100µL所述亲和素包被的感光微粒，之后在37℃温度下混合反应1min，并读取反应后的发光信号值，若信号值大于4000，将疑似hook样本确定为hook样本，若信号值小于2000，将疑似hook样本确定为非hook样本。
4.根据权利要求1所述的光激化学发光均相免疫检测HBsAg中识别hook效应的方法，其特征在于：所述步骤一包括：利用光激化学发光检测平台对乙型肝炎表面抗原样本进行检测，并读取反应后的发光信号值，并根据已有校准曲线获得浓度结果，将浓度在0.2ng/mL～500ng/mL的乙型肝炎表面抗原样本判定为疑似hook样本。
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| 王海刚等: "3种HBsAg检测方法的比较", 国际检验医学杂志, vol. 35, no. 12, 30 June 2014 (2014-06-30), pages 1614 - 1615 * |
| 陆燕等: "乙型肝炎病毒表面抗原定量检测及临床意义分析", 标记免疫分析与临床, vol. 21, no. 6, 25 December 2014 (2014-12-25), pages 756 - 759 * |
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