CN114585391A - 西妥昔单抗-ir700偶联物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供酞菁染料IR700及EGFR‑结合抗体(诸如西妥昔单抗(cetuximab)抗体)的偶联物及其医药组合物。在一些方面中，这些组合物含有EGFR‑结合抗体，诸如西妥昔单抗抗体，其是通过在该西妥昔单抗抗体的重链和/或轻链内的特定位置偶联至IR700染料而修饰。在一些方面中，此偶联物能够在照射该偶联物之后杀死所靶向细胞。本发明还提供相关制造方法和使用方法，和包括用于***和特定癌症适应症的用途。
Description
相关申请案的交叉引用
本申请要求2019年8月7日提交的标题为“西妥昔单抗-IR700偶联物组合物”的美国临时申请案第62/883,825号的优先权，其内容以全文引用的方式并入。
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技术领域
本发明涉及酞菁染料IR700和EGFR-结合抗体(诸如西妥昔单抗抗体)的偶联物及其医药组合物。在一些方面中，组合物含有EGFR-结合抗体，诸如西妥昔单抗抗体，其通过在西妥昔单抗抗体的重链和/或轻链内的特定位置偶联至IR700染料而修饰。在一些方面中，此偶联物能够在照射偶联物之后杀死所靶向细胞。本发明还提供相关制造方法和使用方法，及包括用于***和特定癌症适应症的用途。
背景技术
各种疗法可用于治疗疾病，诸如癌症。举例而言，光免疫疗法(PIT)为一种使用偶联至抗体或其他靶向分子的光敏剂以靶向细胞表面目标分子(例如细胞表面受体)的方法，以便允许靶向杀死特定细胞。在一些情况下，PIT可选择性地靶向诸如肿瘤细胞的疾病细胞，且由此选择性地杀死此类细胞而不损伤健康细胞。需要经改良的策略以改良用于PIT中的酞菁染料偶联物。提供满足此类需求的组合物和方法。
发明内容
本文提供偶联物，诸如抗体-酞菁染料偶联物，例如西妥昔单抗-IR700偶联物。在一些所提供实施方式中，偶联物包括至少两个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少两个赖氨酸(K)位置，且其中该至少两个赖氨酸位置独立地选自下组：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)。
在一些实施方式中，偶联物包括至少三个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少三个赖氨酸位置。在一些实施方式中，至少三个赖氨酸位置是独立地选自下组：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207及重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。在一些实施方式中，偶联至IR700的赖氨酸位置中的至少一个是选自下组：轻链中的K145或重链中的K215、K416或K449。在一些实施方式中，至少一个IR700分子偶联至轻链中的赖氨酸，且至少一个IR700分子偶联至重链中的赖氨酸。
在一些实施方式中，偶联物能够通过波长在690nm±50nm之间的光照射而活化且由此在偶联物结合至细胞表面上的表位时展现细胞杀伤活性。
本文还提供组合物。在一些所提供的实施方式中，组合物含有本文所描述的偶联物中的任一种和医药学上可接受的赋形剂。
本文还提供组合物，其包括偶联物的群体，其中该群体中的偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的这些偶联物包含至少两个IR700分子偶联至该西妥昔单抗中的至少两个赖氨酸(K)位置，且其中该两个赖氨酸位置独立地选自下组：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)。
在一些实施方式中，至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的偶联物包含至少三个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少三个赖氨酸位置。在一些实施方式中，至少三个赖氨酸位置是独立地选自下组：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207及重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。
在一些实施方式中，至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的偶联物包含至少一个IR700分子偶联至轻链中的K145或重链中的K215、K416或K449。在一些实施方式中，至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的偶联物包含IR700分子偶联至轻链中的K145和IR700分子偶联至重链中的K215、K416或K449中的至少一个。
在一些实施方式中，IR700分子与西妥昔单抗的比率在约2∶1至约4∶1之间。在一些实施方式中，IR700分子与西妥昔单抗的比率为约2.5∶1、2.6∶1、2.7∶1、2.8∶1、2.9∶1、3.0∶1、3.1∶1、3.2∶1、3.3∶1或3.4∶1。在一些实施方式中，IR700分子与西妥昔单抗的比率在约2.7∶1至约3.2∶1之间。
在一些实施方式中，组合物中不超过或不超过约15％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联。在一些实施方式中，组合物中小于或小于约10％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联。
在一些实施方式中，游离染料在组合物中的百分比小于或小于约3％、小于或小于约2％、小于或小于约1％或小于或小于约0.5％。
本文还提供组合物，其包括西妥昔单抗-IR700偶联物的群体，其中该组合物中多种偶联物各包含IR700偶联至西妥昔单抗于西妥昔单抗的轻链或重链中选自下组的赖氨酸(K)：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)，且该组合物包含以下特征：(a)该组合物中的IR700分子与该群体中的西妥昔单抗分子的比率在约2∶1与约3∶5之间，(b)小于或小于约10％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联，和(c)该组合物中的游离染料在该组合物中的所有染料分子中的百分比小于或小于约3％。
在一些实施方式中，多种偶联物包含西妥昔单抗在轻链的K145与IR700偶联。在一些实施方式中，多种偶联物包含西妥昔单抗在重链的K215、K416或K449与IR700偶联。在一些实施方式中，多种偶联物包含西妥昔单抗与至少三个IR700分子偶联。
在一些实施方式中，多种偶联物包含组合物中的至少或至少约51％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％或至少或至少约80％的偶联物。
在一些实施方式中，游离染料在组合物中的百分比小于或小于约2％、小于或小于约1％或小于或小于约0.5％。
在一些实施方式中，西妥昔单抗包含SEQ ID NO：1中所述的重链序列、SEQ ID NO：2中所述的轻链序列或其组合。
在一些实施方式中，在暗处或少光条件下储存6个月之后，游离染料在组合物中的百分比实质上未改变。在一些实施方式中，组合物包含至少或至少约95％、96％、97％或98％单体形式的偶联物。在一些实施方式中，组合物包含小于或小于约5％、4％或3％高分子量物质。
还提供关于本文所提供的偶联物或组合物中的任一种的方法。在一些实施方式中，所提供的方法包括杀死肿瘤或癌细胞的方法。在一些所提供的实施方式中，方法涉及在或接近肿瘤或癌细胞的部位给予包含本文中所描述的偶联物或组合物中的任一种的医药组合物；和在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近肿瘤或癌细胞的区结构域，由此杀死肿瘤或癌细胞。
还提供治疗个体中的疾病或病症的方法。在一些实施方式中，方法涉及在或接近肿瘤或癌细胞的部位给予包含本文中所描述的偶联物或组合物中的任一种的医药组合物；和在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近个体的病灶或肿瘤的区结构域，由此治疗该疾病或病症。
在一些实施方式中，照射步骤是在690±50nm的波长或在或约690±20nm的波长进行。在一些实施方式中，照射步骤是在约690nm的波长进行。
在一些实施方式中，疾病或病症为肿瘤或癌症。在一些实施方式中，肿瘤或癌细胞或疾病或病症为肿瘤，该肿瘤为膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、***癌、子***、食道癌或头颈癌。在一些实施方式中，肿瘤或癌细胞或疾病或病症为位于头颈部、***、肝脏、结肠、卵巢、***、胰腺、大脑、子宫颈、骨、皮肤、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺的癌症。在一些实施方式中，癌症为头颈癌。
还提供制造偶联物(诸如本文所描述的西妥昔单抗-IR700偶联物)的方法。在一些实施方式中，提供制造稳定偶联物的方法。在一些实施方式中，方法涉及a)使西妥昔单抗与IR700在产生西妥昔单抗-IR700偶联物的条件下接触，其中该偶联物包含至少两个偶联至IR700的赖氨酸(K)位置，该至少两个赖氨酸(K)位置独立地选自下组：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)；b)使该偶联物在偶联期间和/或之后经受一个步骤，该步骤实质上减少与该西妥昔单抗非特异性结合的IR700；c)在医药学上可接受的缓冲液中配制该偶联物，其中在步骤a)至c)中的每一个中，该染料和偶联物曝露的唯一光具有在约400nm至约650nm的范围内的波长或具有小于或小于约500勒克斯(lux)的强度。
在一些实施方式中，步骤b)包含在完成IR700与西妥昔单抗之间的偶联反应之后，使偶联物经甘氨酸淬灭反应。在一些实施方式中，淬灭反应进行过夜或大于或大于约6小时的持续时间。
还提供稳定偶联物。在一些实施方式中，稳定偶联物是通过本文所描述的制造偶联物的方法中的任一种制造。
本文还提供包含多种偶联物的组合物，其中这些偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中该组合物经胰蛋白酶消化产生包含以下肽的群体：a)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)；b)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)；c)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)；和d)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)。
在一些实施方式中，肽的群体进一步包含：e)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)；和f)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)。
在一些实施方式中，肽的群体进一步包含：g)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)；h)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)；i)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)；和j)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)。
在一些实施方式中，肽的群体进一步包含以下中的一个或多个：k)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)；1)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)；m)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)；和n)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)。
还提供包括多种偶联物的组合物，其中这些偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中该组合物经胰蛋白酶消化产生包含以下肽的群体：a)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)；b)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)；c)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)；d)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)；e)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)；f)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)；g)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)；h)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)；i)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)；j)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)；k)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)；1)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)；m)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)；和n)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)。
在一些实施方式中，肽通过正离子模式质谱法来检测。在一些实施方式中，当针对由正离子模式质谱法检测的肽产生提取离子层析图(EIC)时：对应于a)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于a)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的3％或约3％与5％或约5％之间；对应于b)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于b)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的3％或约3％与5％或约5％之间；对应于c)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于c)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的8％或约8％与11％或约11％之间；对应于d)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于d)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与2.5％或约2.5％之间；对应于e)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于e)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的8％或约8％与12％或约12％之间；对应于f)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于f)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.2％或约0.2％与2.5％或约2.5％之间；对应于g)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于g)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的4.5％或约4.5％与7％或约7％之间；对应于h)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于h)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的9.5％或约9.5％与13％或约13％之间；对应于i)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于i)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的6％或约6％与10％或约10％之间；对应于j)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于j)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的2％或约2％与5％或约5％之间；对应于k)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于k)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的7％或约7％与11％或约11％之间；对应于1)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于1)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间；对应于m)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于m)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的1.5％或约1.5％与5％或约5％之间；和对应于n)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于n)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间。
在一些实施方式中，对应于a)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于a)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.8±1％；对应于b)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于b)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.5±1％；对应于c)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于c)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约10.0±1％；对应于d)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于d)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约1.7±1％；对应于e)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于e)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约10.2±1％；对应于f)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于f)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约1.3±1％；对应于g)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于g)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约5.9±1％；对应于h)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于h)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约11.2±1％；对应于i)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于i)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约7.6±1％；对应于j)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于j)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.4±1％；对应于k)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于k)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约9.3±1％；对应于1)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于1)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约2.1±1％；对应于m)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于m)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.5±1％；和对应于n)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于n)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约2.0±1％。
在一些所提供的实施方式中，a)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-38；b)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸72-81；c)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸213-216；d)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸225-250；e)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸291-294；f)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸325-336；g)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸329-340；h)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸412-418；i)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸442-449；j)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸104-108；k)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸143-149；l)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸184-190；m)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸189-207；和n)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸191-211。
本文还提供包括多种偶联物的组合物，其中这些偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，且其中该组合物经胰蛋白酶消化产生肽，这些肽产生包含对应于以下的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8％。
在一些实施方式中，组合物的胰蛋白酶消化进一步产生包含对应于以下中的一个或多个的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约5％；和/或包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约3.5％。在一些实施方式中，组合物的胰蛋白酶消化进一步产生包含对应于以下中的一个或多个的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；和/或包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％。
本文还提供包括多种偶联物的组合物，其中这些偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，且其中该组合物经胰蛋白酶消化产生肽，这些肽产生包含对应于以下的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；和/或包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约4.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约7％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约1％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；和包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约1％。
在一些实施方式中，对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.8±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.0±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.7±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.2±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.3±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约5.9±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约11.2±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约7.6±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.4±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约9.3±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2.1±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；和对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2±1％。
在一些实施方式中，包含IR700分子偶联至赖氨酸的肽包含一或多个选自以下中的氨基酸序列：对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-38、氨基酸72-81、氨基酸213-216、氨基酸225-250、氨基酸291-294、氨基酸325-336、氨基酸329-340、氨基酸412-418和氨基酸442-449的氨基酸序列；对应于SEQ ID NO：2的氨基酸104-108、氨基酸143-149、氨基酸184-190、氨基酸189-207和氨基酸191-211的氨基酸序列。
本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体的偶联物，其中至少一个IR700分子连接至西妥昔单抗抗体的轻链中的赖氨酸(K)。在一个方面中，至少一个IR700分子可在选自下组的位置处连接至赖氨酸：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207。在所提供的实施方式中的任一种中，至少一个IR700分子可连接至轻链中的K145。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条轻链中的两个或更多个赖氨酸位置处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条轻链中的K145处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的轻链中的K145处和西妥昔单抗抗体的轻链或重链中的至少一个其他赖氨酸位置处连接至IR700。
本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体的偶联物，其中至少一个IR700分子连接至西妥昔单抗抗体的重链中的赖氨酸(K)。在一个方面中，至少一个IR700分子可在选自下组的位置处连接至赖氨酸：重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。在所提供的实施方式中的任一种中，至少一个IR700分子可在选自下组的位置处连接至赖氨酸：重链中的K215、K292、K336、K416和K449。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条重链中的两个或更多个赖氨酸位置处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条重链中的三个或更多个赖氨酸位置处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416和/或K449处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的重链中的K215、K292、K336、K416和/或K449处和西妥昔单抗抗体的轻链或重链中的至少一个其他赖氨酸位置处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条轻链中的K145处连接至IR700。
本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体的偶联物，其中至少一个IR700分子连接至西妥昔单抗抗体的轻链中的赖氨酸(K)，且至少一个IR700分子连接至西妥昔单抗抗体的重链中的赖氨酸(K)。在一个方面中，轻链中的赖氨酸可选自下组：K107、K145、K188、K190和K207。在所提供的实施方式中的任一种中，重链中的赖氨酸可选自下组：K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条轻链中的K145处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416和/或K449处连接至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗抗体可在西妥昔单抗抗体的一条或两条轻链中的K145处和在西妥昔单抗抗体的一条或两条重链中的K215、K292、K416和K449处连接至IR700。
在所提供的实施方式中的任一种中，偶联物的IR700分子与西妥昔单抗抗体的比率可为1∶1、2∶1、3∶1或4∶1。在所提供的实施方式中的任一种中，偶联物能够通过波长在约600nm与约850nm(例如，690nm±50nm)之间的辐射而经活化且由此获得细胞杀伤活性。
在一些实施方式中，本文提供一种组合物，其包含前述实施方式中的任一种的偶联物和医药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子具有至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的轻链中的赖氨酸(K)。在一个方面中，至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条轻链中的K107、K145、K188、K190和/或K207。在所提供的实施方式中的任一种中，群体中偶联至IR700的主要轻链赖氨酸位置可为K145。在所提供的实施方式中的任一种中，当西妥昔单抗抗体分子通过改性质谱法分析时，在轻链K145处含有IR700偶联的肽可比含有偶联至其他轻链赖氨酸位置的IR700的肽更丰富。
在一些实施方式中，本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子具有至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的重链中的赖氨酸(K)。在一个方面中，至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和/或K449。在所提供的实施方式中的任一种中，群体中偶联至IR700的主要重链赖氨酸位置可为K215、K292、K336、K416和K449中的一个或多个。在所提供的实施方式中的任一种中，当西妥昔单抗抗体分子通过质谱法分析时，含有在重链K215、K292、K336、K416或K449处偶联的IR700的肽可比含有偶联至其他重链赖氨酸位置的IR700的肽更丰富。在所提供的实施方式中的任一种中，至少70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条重链中的两个或更多个赖氨酸。
在所提供的实施方式中的任一种中，不超过约20％的西妥昔单抗抗体分子可未与IR700偶联。在所提供的实施方式中的任一种中，小于10％的西妥昔单抗抗体分子可未与IR700偶联，且/或游离染料在组合物中的百分比可小于3％。在所提供的实施方式中的任一种中，组合物中的IR700分子与群体中的西妥昔单抗抗体分子的比率可为约2∶1、约2.5∶1或约3∶1。
在一些实施方式中，本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子具有至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的轻链或重链中的赖氨酸(K)。在一个方面中，至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个IR700分子连接至一条或两条轻链中的K107、K145、K188、K190和/或K207或连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和/或K449。在一个方面中，至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个IR700分子连接至一条或两条轻链中的K145或连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416或K449。
在一些实施方式中，本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子具有至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的轻链中的赖氨酸(K)和至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的重链中的赖氨酸。在一个方面中，至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个酞菁IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条轻链中的K107、K145、K188、K190和/或K207和至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和/或K449。在一个方面中，至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个酞菁IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条轻链中的K145和至少一个IR700分子连接至各西妥昔单抗抗体分子的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416或K449。
本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中不超过约20％的西妥昔单抗抗体分子在西妥昔单抗抗体分子的轻链或重链中的赖氨酸(K)处未与IR700偶联。在一个方面中，小于15％的西妥昔单抗抗体分子可未与IR700偶联。在一个方面中，小于10％的西妥昔单抗抗体分子可未与IR700偶联。在所提供的实施方式中的任一种中，组合物中的游离染料在组合物中的所有染料分子中的百分比可小于3％、约2％、约1％或约0.5％。在所提供的实施方式中的任一种中，组合物中的IR700分子与群体中的西妥昔单抗抗体分子的比率可为约2∶1、约2.5∶1或约3∶1。
本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中一或多个西妥昔单抗抗体分子在一或多个西妥昔单抗抗体分子的轻链或重链中的赖氨酸(K)处与IR700偶联，组合物中的IR700分子与群体中的西妥昔单抗抗体分子的比率为约2∶1、约2.5∶1或约3∶1，小于10％的西妥昔单抗抗体分子未与IR700偶联，且组合物中的游离染料在组合物中的所有染料分子中的百分比小于约0.5％。
本文提供一种包含SEQ ID NO：1的组合物，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145偶联至IR700。本文提供一种包含SEQ ID NO：2的组合物，其中SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449偶联至IR700。
本文提供一种包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的组合物，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145偶联至IR700且SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449偶联至IR700。在一个方面中，组合物可在相同分子中包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145可偶联至IR700且SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449可偶联至IR700。在所提供的实施方式中的任一种中，组合物可在不同的分子中包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145可偶联至IR700且SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449可偶联至IR700。
本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中小于15％的西妥昔单抗抗体分子未与IR700偶联，组合物包含小于3％游离IR700，且游离染料在组合物中的百分比在储存约6个月之后实质上未改变。
本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子与IR700偶联的群体的组合物，其中组合物包含小于或小于约0.6％、小于或小于约0.5％、小于或小于约0.4％，或小于或小于约0.3％游离染料。在一个方面中，组合物可包含至少或至少约95％、96％、97％或98％单体。在一个方面中，组合物可包含小于或小于约5％、4％或3％高分子量物质。在所提供的实施方式中的任一种中，组合物可包含小于或小于约30％、20％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或5％未偶联抗体。
在所提供的实施方式中的任一种中，在暗处或少光条件下储存组合物6个月之后，游离染料的百分比实质上未改变。在所提供的实施方式中的任一种中，至少70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗抗体分子可具有至少一个IR700分子偶联至各西妥昔单抗抗体分子的轻链中的赖氨酸(K)。在所提供的实施方式中的任一种中，群体中偶联至IR700的主要轻链赖氨酸位置可为K145。在所提供的实施方式中的任一种中，至少70％、80％、90％或大于90％的群体可具有至少一个IR700分子偶联至各西妥昔单抗抗体分子的重链中的赖氨酸(K)。在所提供的实施方式中的任一种中，群体中偶联至IR700的主要重链赖氨酸位置可为K215、K292、K336、K416和K449中的一个或多个。
本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中约9％与约10％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700偶联的肽。本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中约9％与约11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700偶联的肽。本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中约9％与约11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700偶联的肽。本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中约10％与约12％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700偶联的肽。本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中约7％与9％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700偶联的肽。本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中约5％与7％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸336(K336)处含IR700有偶联的肽。本文提供一种包含西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中约9％与11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700偶联的肽；约9％与11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700偶联的肽；约9％与11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700偶联的肽；约10％与12％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700偶联的肽；约7％与9％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700偶联的肽；且/或约5％与7％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽为在重链赖氨酸336(K336)处含有IR700的肽。在所提供的实施方式中的任一种中，约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在轻链赖氨酸107(K107)处含有IR700偶联的肽；约1％与3％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在轻链赖氨酸188(K188)处含有IR700偶联的肽；约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在轻链赖氨酸190(K190)处含有IR700偶联的肽；约1％与3％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在轻链赖氨酸207(K207)处含有IR700偶联的肽；约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在重链赖氨酸5(K5)处含有IR700偶联的肽；约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在重链赖氨酸75(K75)处含有IR700偶联的肽；约1％与2％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在重链赖氨酸248(K248)处含有IR700偶联的肽；和/或约1％与2％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗抗体分子的总肽可为在重链赖氨酸328(K328)处含有IR700偶联的肽。
本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中：在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸215(K215)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸292(K292)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸292(K292)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中在重链中的赖氨酸336(K336)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链中的赖氨酸336(K336)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中在重链中的赖氨酸416(K416)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中在轻链中的赖氨酸145(K145)、重链中的赖氨酸215(K215)、重链中的赖氨酸292(K292)和重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约1∶1∶1∶1。
本文提供一种包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体的组合物，其中在轻链中的赖氨酸145(K145)、重链中的赖氨酸215(K215)、重链中的赖氨酸292(K292)、重链中的赖氨酸336(K336)、重链中的赖氨酸416(K416)和重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率为约1∶1∶1∶1∶1∶1。
在所提供的实施方式中的任一种中，偶联至赖氨酸的IR700在西妥昔单抗抗体分子的群体中的比率可由质谱法量测。
本文提供一种杀死肿瘤或癌细胞的方法，其包含在或接近该肿瘤或癌细胞的部位给予包含前述实施方式中的任一种的偶联物或组合物的医药组合物；和在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近该肿瘤细胞的区结构域，由此杀死该肿瘤或癌细胞。本文提供一种治疗个体中的疾病或病症(例如肿瘤或癌症)的方法，其包含向对象给予包含前述实施方式中的任一种的偶联物或组合物的医药组合物；和在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近对象中的病灶(例如，由肿瘤或癌症所致的病灶)的区结构域，由此治疗该疾病或病症。在所提供的实施方式中的任一种中，方法可进一步包含在给予步骤之前提供医药组合物。在所提供的实施方式中的任一种中，照射步骤可在690±50nm的波长或在或约690±20nm的波长进行。在所提供的实施方式中的任一种中，照射步骤可在约690nm的波长进行。在所提供的实施方式中的任一种中，肿瘤可为膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、***癌、子***、食道癌或头颈癌。在所提供的实施方式中的任一种中，癌症可位于头颈部、***、肝脏、结肠、卵巢、***、胰腺、大脑、子宫颈、骨、皮肤、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺。在所提供的实施方式中的任一种中，癌症可为位于头颈部的癌症。
本文提供一种制造稳定偶联物的方法，其包含a)使西妥昔单抗抗体与IR700在产生偶联物的条件下接触，该偶联物包含连接至一或多个选自下组的西妥昔单抗抗体的赖氨酸的IR700：K145(轻链)、K215(重链)、K292(重链)、K336(重链)、K416(重链)和K449(重链)；b)使该偶联物在偶联期间和/或之后经受一个步骤，该步骤实质上减少与该西妥昔单抗抗体非特异性结合的IR700；c)在医药学上可接受的缓冲液中配制该偶联物，其中在步骤a)至c)中的每一个中，该染料和偶联物曝露的唯一光具有在约400nm至约650nm的范围内的波长或具有小于500勒克斯的强度。在一个方面中，步骤b)可包含使偶联物经受淬灭反应。在所提供的实施方式中的任一种中，步骤b)可包含在完成IR700与西妥昔单抗抗体之间的偶联反应之后，使偶联物经甘氨酸淬灭反应。在所提供的实施方式中的任一种中，淬灭反应可进行过夜或大于约6小时的持续时间。
在一些实施方式中，本文提供由前述实施方式中的任一种制造的稳定偶联物。在所提供的实施方式中的任一种中，偶联物可包含偶联至IR700的西妥昔单抗抗体分子的群体，其中在轻链中的赖氨酸145(K145)、重链中的赖氨酸215(K215)、重链中的赖氨酸292(K292)和重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至西妥昔单抗抗体分子的赖氨酸的IR700在群体中的比率可为约1∶1∶1∶1。
附图简要说明
图1显示光免疫疗法(PIT)分析的结果，其相对于参考标准比较三个批次西妥昔单抗-IR700偶联物的BxPC3细胞-杀死活性。
图2显示三个批次西妥昔单抗-IR700偶联物的尺寸排阻HPLC(SEC-HPLC)的结果，其显示所有三个批次展现至少97％单体，小于3％高分子量物质(high molecular weightspecies；HMW)和小于或等于0.3％游离IR700染料(例如，未偶联染料)。
实施方式
本文提供酞菁染料IR700和西妥昔单抗抗体的偶联物(西妥昔单抗-IR700)和包括含有此偶联物的医药组合物的组合物。
在一些实施方式中，本文所公开的偶联物和偶联物的制剂提供组合物(包括医药组合物)的增加的均一性、稳定性、活性和/或改良的相同性。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物含有通过在特定氨基酸位置或特定氨基酸残基处(包括在特定赖氨酸(K)位置或残基处)与IR700染料偶联而修饰的西妥昔单抗抗体。还提供西妥昔单抗-IR700偶联物和含有此偶联物的组合物，当用诸如胰蛋白酶之内切蛋白酶消化时，其产生包含某些肽的群体和修饰(诸如IR700在特定赖氨酸位置或残基处的偶联)的组合物。还提供西妥昔单抗-IR700偶联物和含有此偶联物的组合物，当用诸如胰蛋白酶之内切蛋白酶消化且通过诸如液相层析/质谱法(LC/MS)的质谱法来分析或评定时，其展现特定质谱。还提供与所提供的偶联物或组合物中的任一种相关的方法和用途，诸如治疗方法或治疗用途。还提供产生所提供的西妥昔单抗-IR700偶联物和/或包含西妥昔单抗-IR700偶联物的组合物中的任一种的方法。
本申请案中所提及的所有公开案，包括专利文件、科学论文和数据库，出于所有目的均以全文引用的方式并入本文中，其引用的程度如同各个别公开案以引用的方式个别地并入一般。若本文所述的定义与以引用方式并入本文中的专利、申请案、公开申请案和其他公开案中所述的定义相反或另外不相同，则以本文所述的定义为准，而非以以引用的方式并入本文中的定义为准。
本文所使用的章节标题仅出于组织目的且不应解释为限制所描述的主题。
I.IR700酞菁染料及其偶联物
本文所提供的偶联物包括酞菁染料分子，诸如经由接头基团偶联至表皮生长因子受体(EGFR)-结合抗体(诸如西妥昔单抗)的IR700。在一个方面中，偶联物具有式I：
A-[(L)n-D]p
(I)
其中：
A为西妥昔单抗或针对EGFR的抗体；
L为各p的独立选择的接头；
n为1或2；
D为各p的独立选择的亲水性酞菁染料；和
p独立地为1、2、3、4、5，通常为1至3。
在一些实施方式中，含有反应性基团的酞菁染料为IR700 NHS酯，诸如IRDye700DX NHS酯(LiCor 929-70010，929-70011)。在一些实施方式中，染料为具有下式的化合物：
化学式：C74H96N12Na4O27S6Si3
精确质量：1952.37
分子量：1954.22
IRDye 700DX NHS酯
出于本文的目的，当染料例如经由反应性基团诸如偶联至抗体时，术语“IR700”(还称为IRDye 700或IR700染料)包括上式。在一些实施方式中，IR700染料为通常在680nm与800nm之间的近红外(NIR)光谱中具有吸收和发射波长的荧光染料。
本文所描述的酞菁染料可用市售起始材料制得。通过两个或更多个不同的二亚氨基异吲哚啉的缩合来合成核心结构。使用不同二腈或二亚氨基异吲哚啉的合成策略可引起各种程度的酞菁取代和/或区位异构体分布。用于产生染料的例示性合成流程描述于美国专利第7,005,518号中。用于制备和表征染料(诸如IR700)偶联物的例示性合成流程描述于WO 2017/031363中。
在一些实施方式中，IR700酞菁染料经由染料分子的反应性基团偶联至抗体。在一些实施方式中，反应性基团为NHS酯。
在一些实施方式中，本文所描述的组合物中所含有的西妥昔单抗-IR700偶联物含有每一抗体分子的特定数目的染料残基，还即1或约1至3或约3个染料分子。在一些实施方式中，每一抗体的染料分子数目可为2或约2至5或约5，诸如2或约2至4或约4，例如约3或3。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物，每一抗体轻链的染料分子数目可为1或约1，或1或约1至2或约2。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物，每一抗体重链的染料分子数目可为1或约1，2或约2，或3或约3，或4或约4，或1或约1至2或约2，或2或约2至3或约3，或2或约2至4或约4。
II.表皮生长因子受体(EGFR)-结合抗体、西妥昔单抗及其偶联物
本文提供抗体偶联物，其具有一或多个在抗体中的特定氨基酸位置或残基处(尤其与抗体的赖氨酸位置或残基)偶联的酞菁染料分子(诸如IR700)。在一些实施方式中，一或多个染料分子偶联至抗体的轻链和/或重链的恒定区。此偶联物保留抗体与其目标抗原偶联的能力，且此外偶联物提供抗体-染料偶联物的目标细胞杀伤活性，例如在抗体-染料偶联物与表达目标抗原的细胞表面偶联和用光照明或照射之后。
在本文所提供的偶联物和组合物中，染料分子的位置(例如，IR700偶联的抗体的一或多个链或结构域的赖氨酸(K)位置或残基)为相同且可重复的，在一些情况下是指或表示重链和轻链上与IR700偶联的位置的选择以及位置之间的偶联比例在不同批次的偶联抗体中实质上恒定。偶联位置的相同性和可重复性提供药物组合物的活性和纯度的均一性、可预测性和恒定性。
在一些实施方式中，所提供的偶联物或组合物中的抗体为靶向或偶联(例如，特异性偶联)表皮生长因子受体(EGFR；ErbB-1；HER1；EGF受体)的抗体，使得抗体可在细胞表面上结合EGFR。在一个实施方式中，抗体为西妥昔单抗。西妥昔单抗为与EGFR的胞外结构域特异性结合的重组人类/小鼠嵌合单克隆抗体。西妥昔单抗由鼠类抗EGFR抗体的Fv区与人类IgG1重链和κ轻链恒定区构成。在一些方面中，抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO：1中所述的序列。在一些方面中，抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO：2中所述的序列。在一些实施方式中，抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ ID NO：1和2中所述的序列。在一些实施方式中，所提供的偶联物包含西妥昔单抗抗体，诸如包含重链和轻链的西妥昔单抗，该重链和轻链分别包含SEQ ID NO：1和2中所述的序列。在一些实施方式中，抗体衍生自西妥昔单抗或为西妥昔单抗的变体或衍生物，诸如抗原结合片段或其经修饰版本，或西妥昔单抗的生物类似物、可互换或生物改良药。此类抗体还包括西妥昔单抗的复制生物制剂和生物仿制物。
如本文所使用的“抗体”为至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性识别和结合抗原的表位，诸如肿瘤特异性蛋白。一般而言，抗体由重链和轻链构成，其中的每一个具有称为可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的可变区。共同地，VH区和VL区负责结合由抗体识别的抗原。
如本文所使用的“抗体”包括完整免疫球蛋白和展现抗原结合的抗体片段，诸如Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白为其中免疫球蛋白的轻链可变区(VL)和免疫球蛋白的重链可变区(VH)由接头结合的融合蛋白质，而在dsFv中，各链已突变以引入二硫键来稳定各链的结合。术语还包括经基因工程改造的形式，诸如嵌合抗体，例如人源化鼠类抗体；和异偶联抗体，诸如双特异性抗体。还参见《皮尔斯目录和手册》(Pierce Catalog and Handbook)，1994-1995(PierceChemical Co.，Rockford，Ill.)；Kuby，J.Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。存在两种轻链类型：lambda(λ)和kappa(k)。存在五种主要重链类别或同种型，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG抗体是由两条重链和两条轻链构成的四聚体蛋白质。IgG重链由自N端至C端按VH-CH1-CH2-CH3次序连接的四个免疫球蛋白结构域构成，分别指重链可变结构域、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2和重链恒定结构域3(还称为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分别指IgG类的重链可变结构域、恒定γ1结构域、恒定γ2结构域和恒定γ3结构域)。IgG轻链由自N端至C端按VL-CL次序连接的两个免疫球蛋白结构域构成，分别指轻链可变结构域和轻链恒定结构域。
各重链和轻链含有恒定区和可变区，还称为“结构域”。组合地，重链和轻链可变区通常特异性偶联抗原。轻链和重链可变区可含有间杂有三个还称为“互补决定区”或“CDR”的高变区的“构架”区。已定义构架区和CDR的范围(参见Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and HumanServices，1991，其特此以引用的方式并入)。Kabat数据库现仍在线。不同轻链或重链的构架区的序列在诸如人类的物种内相对保守。抗体的构架区，还即组成轻链和重链的组合构架区，用以在三维空间中定位且对准CDR。
CDR通常负责结合至抗原的表位。自N端开始依序编号的各链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，且通常还通过其中定位有特定CDR的链鉴别。因此，VH CDR3位于发现其的抗体的重链可变结构域中，而VL CDR1为来自发现其的抗体的轻链可变结构域的CDR1。具有不同特异性(诸如不同抗原的不同组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管CDR在抗体与抗体之间不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
“VH”或“VH”的参考是指免疫球蛋白重链的可变区(还即，重链可变区)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。“VL”或“VL”的参考是指免疫球蛋白轻链的可变区(还即，轻链可变区)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
“CH”或“CH”的参考是指免疫球蛋白重链的恒定区。“CL”或“CL”的参考是指免疫球蛋白轻链的恒定区。恒定区如此命名，因为其氨基酸序列在同一同种型或重链类的抗体之间相对相似或相同。举例而言，IgG抗体的恒定区可高度同源，甚至跨物种。例示性IgG同种型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4且可进一步划分成诸如IgG2a和IgG2b的亚类。举例而言，人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区在氨基酸序列中显示超过90％的同源性，其中差异并非随机分布的。在铰链区和N端CH2结构域中发现许多差异，而在其他结构域中发现较少氨基酸差异。
“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。其他抗体片段或由抗体片段形成的多特异性抗体包括多价scFv、双特异性scFv或scFv-CH3二聚体。抗体片段可通过各种技术制得，包括(但不限于)完整抗体的蛋白分解消化以及通过重组宿主细胞产生。
“单克隆抗体”为通过B淋巴细胞的单一克隆或通过其中已转染单一抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过自骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合物制造杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一个物种(诸如人类)的构架残基，和来自另一物种(诸如特异性结合间皮素的鼠类抗体)的通常赋予抗原结合的CDR。
“人源化”免疫球蛋白为包括人类构架区和一或多个来自非人类(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白称为“供体”且提供构架的人类免疫球蛋白称为“受体”。在一些实施方式中，CDR来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不必存在，但若其存在，则其可与人类免疫球蛋白恒定区实质上相同，诸如至少约85-90％，诸如约95％或更高相同。因此，除可能CDR外，人源化免疫球蛋白的部分与天然人类免疫球蛋白序列的对应部分实质上相同。“人源化抗体”为包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合至相同抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体构架可具有有限数目的通过取自供体构架的氨基酸的取代。人源化或其他单克隆抗体可具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能实质上无影响的额外保守性氨基酸取代。人源化免疫球蛋白可借助于基因工程改造构建(参见例如美国专利第5,585,089号)。
“人类”抗体(还称为“完全人类”抗体)为包括人类构架区和来自人类免疫球蛋白的CDR的抗体。在一些实施方式中，构架和CDR来自同一起源人类重链和/或轻链氨基酸序列。然而，来自一种人类抗体的构架可经工程改造以包括来自不同人类抗体的CDR。人类免疫球蛋白的部分可与天然人类免疫球蛋白序列的对应部分实质上相同。
本文提供偶联至诸如IR700的酞菁染料的抗体，具体地，结合EGFR的抗体。在一些实施方式中，偶联物的抗体为西妥昔单抗。在一些实施方式中，西妥昔单抗偶联至IR700染料。在一些实施方式中，偶联至IR700的西妥昔单抗具有包含SEQ ID NO：1的重链。在一些实施方式中，偶联至IR700的西妥昔单抗具有包含SEQ ID NO：2的轻链。在一些实施方式中，西妥昔单抗具有分别包含SEQ ID NO：1和2的重链和轻链。
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
如本文所使用，两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同的氨基酸百分比。“序列相似性”指示相同的或表示保守性氨基酸取代的氨基酸百分比。
在一些实施方式中，本文所公开的西妥昔单抗在CDR区中与示于SEQ ID NO：1中的重链序列中的CDR区中的一个或多个具有至少60％，更优选地至少70％或80％，仍更优选至少90％且最优选至少95％的序列相同性。在一些实施方式中，本文所公开的西妥昔单抗在CDR区中与示于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的CDR区中的一个或多个具有至少60％，更优选地至少70％或80％，仍更优选至少90％且最优选至少95％的序列相同性。在一些实施方式中，本文所公开的西妥昔单抗在CDR区中与示于SEQ ID NO：1中的重链序列和示于SEQ IDNO：2中的轻链序列中的CDR区中的一个或多个具有至少60％，更优选地至少70％或80％，仍更优选至少90％且最优选至少95％的序列相同性。
在一些实施方式中，本文所公开的西妥昔单抗在CDR区中与示于SEQ ID NO：1中的重链序列中的CDR区中的一个或多个具有至少80％，更优选90％且最优选95％的序列相似性。在一些实施方式中，本文所公开的西妥昔单抗在CDR区中与示于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的CDR区中的一个或多个具有至少80％，更优选90％且最优选95％的序列相似性。在一些实施方式中，本文所公开的西妥昔单抗在CDR区中与示于SEQ ID NO：1中的重链序列和示于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的CDR区中的一个或多个具有至少80％，更优选90％且最优选95％的序列相似性。
在一些实施方式中，抗体为西妥昔单抗(例如，包含示于SEQ ID NO：1中的重链序列和/或示于SEQ ID NO：2中的轻链序列)的变体或衍生物。举例而言，抗体具有西妥昔单抗的可变区(VH和VL)，且CH和CL区为不同的，诸如来自不同IgG同种型的CH和CL或与西妥昔单抗的CH和CL区具有一或多个氨基酸差异。在一些实施方式中，西妥昔单抗的变体或衍生物为具有与西妥昔单抗相同的CDR且具有与西妥昔单抗的CH区至少90％、92％、95％、98％或99％相同的CH区的变体或衍生物。在一些实施方式中，西妥昔单抗的变体或衍生物为具有与西妥昔单抗相同的CDR且具有与西妥昔单抗的CL区至少90％、92％、95％、98％或99％相同的CL区的变体或衍生物。在一些实施方式中，西妥昔单抗的变体或衍生物为具有与西妥昔单抗相同的CDR且具有与CH至少90％、92％、95％、98％或99％相同的CH区和与西妥昔单抗的CL区至少90％、92％、95％、98％或99％相同的CL区的变体或衍生物。在一些实施方式中，与西妥昔单抗的CH和CL区至少90％、92％、95％、98％或99％相同性包括CH和/或CL区中的一或多个赖氨酸残基或经暴露赖氨酸残基的位置。
在一些实施方式中，西妥昔单抗的变体或衍生物为具有与西妥昔单抗相同的CDR且具有与西妥昔单抗(例如，包含示于SEQ ID NO：1中的重链序列和/或示于SEQ ID NO：2中的轻链序列)的CH区相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个氨基酸取代的CH区的变体或衍生物。在一些实施方式中，西妥昔单抗的变体或衍生物为具有与西妥昔单抗相同的CDR且具有与西妥昔单抗的CL区相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个氨基酸取代的CL区的变体或衍生物。在一些实施方式中，西妥昔单抗的变体或衍生物为具有与西妥昔单抗相同的CDR且具有与西妥昔单抗的CH区相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代的CH区和与西妥昔单抗的CL区相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的CL区的变体或衍生物。在所提供的实施方式中的任一种中，一或多个氨基酸取代可在除CH和/或CL区中的赖氨酸残基外的位置处。在所提供的实施方式中的任一种中，一或多个氨基酸取代可在除CH和/或CL区中的经暴露赖氨酸残基外的位置处。在一些实施方式中，一或多个氨基酸取代可包括公开于US6,737,056、US 7,183,387、US 7,632,497、US 7,741,072、US 7,960,512、US 8,217,147、US8,388,955、US 8,445,645、US 8,652,466、US 8,697,071、US 8,735,547、US 8,753,628和US 8,937,158中的那些，其全部以引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，抗体为具有变体Fc区的西妥昔单抗的变体或衍生物。在一些实施方式中，与西妥昔单抗(例如，包含示于SEQ ID NO：1中的重链序列和/或示于SEQ IDNO：2中的轻链序列)的Fc区相比，变体Fc区包含变化，例如，氨基酸残基取代。在一些实施方式中，变化包括公开于US 6,737,056、US 7,183,387、US 7,632,497、US 7,741,072、US 7,960,512、US 8,217,147、US 8,388,955、US 8,445,645、US 8,652,466、US 8,697,071、US8,735,547、US 8,753,628和US 8,937,158中的那些，其全部出于所有目的以引用的方式并入本文中。
在本文实施方式中，诸如IR700的酞菁染料经由抗体上的个别反应性位点偶联至抗体。在一些实施方式中，反应性位点为抗体轻链上的一或多个赖氨酸残基。在一些实施方式中，反应性位点为抗体重链上的一或多个赖氨酸残基。在一些实施方式中，反应性位点为抗体轻链上的一或多个赖氨酸残基且为抗体重链上的一或多个赖氨酸残基。
在一些实施方式中，至少一个IR700染料偶联至抗体轻链中的至少一个赖氨酸。在一些实施方式中，至少一个IR700染料偶联至抗体轻链中的至少一个赖氨酸和恒定区中的赖氨酸处的偶联位置残基。在一些实施方式中，仅一个IR700染料偶联至抗体轻链中的赖氨酸和恒定区中的赖氨酸处的偶联位置残基。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物在西妥昔单抗的轻链中在偶联至IR700染料分子的位置145(K145)处具有至少一个赖氨酸(例如，参见示于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的位置编号)。
在一些实施方式中，至少一个IR700染料偶联至抗体重链中的赖氨酸。在一些实施方式中，至少一个IR700染料偶联至抗体重链中的赖氨酸和恒定区中的赖氨酸处的偶联位置残基。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物在西妥昔单抗的重链内的一或多个特定位置处经修饰。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物在西妥昔单抗的重链中在偶联至IR700染料分子的K215、K292、K336、K416和K449中的一或多个位置处具有至少一个赖氨酸(例如，参见示于SEQ ID NO：1中的重链序列中的位置编号)。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物在西妥昔单抗的重链内的两个或更多个特定位置处经修饰且在重链中在偶联至IR700染料分子的K215、K292、K336、K416和K449的位置处具有至少一个赖氨酸。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物在西妥昔单抗的重链内的两个或更多个特定位置处经修饰且在重链中在偶联至IR700染料分子的K215、K292、K336、K416和K449的位置处具有至少两个赖氨酸。在一些实施方式中，西妥昔单抗-IR700偶联物在西妥昔单抗的重链内的三个或更多个特定位置处经修饰且具有偶联至IR700染料分子的位置K215、K292、K336、K416和K449中的1、2或3个。
III.偶联物的组合物
提供含有所提供偶联物(例如西妥昔单抗-IR700偶联物)中的一个或多个的组合物(诸如医药组合物)。在一些实施方式中，组合物包含偶联物群体或多种偶联物，诸如西妥昔单抗-IR700偶联物群体或多种西妥昔单抗-IR700偶联物。还提供含有西妥昔单抗-IR700偶联物的组合物，当用诸如胰蛋白酶的内切蛋白酶消化时，其产生某些肽和修饰(诸如IR700偶联在特定赖氨酸位置或残基)的群体，和/或当通过诸如液相层析/质谱(LC/MS)的质谱法来分析或评估时，其展现特定质谱(例如指示某些肽和修饰的存在)。还提供诸如分析组合物的组合物，其含有由内切蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化包含西妥昔单抗-IR700偶联物的组合物产生的肽和经修饰肽(例如含有与IR700偶联的氨基酸残基的肽)。在一些方面中，可通过诸如LC/MS的质谱法来分析或评估此分析组合物。
在一些实施方式中，群体中抗体的每一抗体的染料分子平均数目可为2或约2至5或约5，诸如2或约2至4或约4，例如约3或3或约2.5或2.5。在一些实施方式中，群体中每一抗体轻链的染料分子平均数目为或约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或约1，或0.2或约0.2至1.0或约1.0，0.2或约0.2至0.6或约0.6，或0.4或约0.4至0.5或约0.5，或0.5或约0.5至1.0或约1.0。在一些实施方式中，群体中每一抗体重链的染料分子平均数目为或约1、约2或约3或约4，或1或约1至2或约2，或2或约2至3或约3，或2或约2至4或约4，或约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5。
在一些本文所提供的实施方式中，经IR700修饰或与其偶联的赖氨酸(K)残基或位置参见西妥昔单抗中的氨基酸位置编号。在一些本文所提供的实施方式中，经IR700修饰或与其偶联的重链赖氨酸(K)残基或位置参见述于SEQ ID NO：1中的重链序列中的氨基酸位置编号。举例而言，重链的K215、K292、K336、K416或K449可指述于SEQ ID NO：1中的重链序列的位置215、292、336、416或449的赖氨酸。在一些本文所提供的实施方式中，经IR700修饰或与其偶联的轻链赖氨酸(K)残基或位置参见述于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的氨基酸位置编号。举例而言，轻链的K145可指述于SEQ ID NO：2中的轻链序列的位置145的赖氨酸。
在一些实施方式中，群体包含西妥昔单抗-IR700偶联物，由此相当大百分比的偶联物具有至少一个偶联至IR700染料的轻链赖氨酸残基。在一些实施方式中，群体中至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或多于50％的抗体具有至少一个偶联至IR700染料的轻链赖氨酸(K)残基。
在一些实施方式中，群体包含西妥昔单抗-IR700偶联物，由此相当大百分比的偶联物具有至少偶联至IR700染料的轻链位置K145。在一些实施方式中，群体中至少或至少约10％的所有西妥昔单抗在轻链的位置K145处偶联至IR700。在一些实施方式中，群体中至少或至少约10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％或多于50％的所有偶联抗体在轻链的位置K145处具有IR700(例如，参见示于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的位置编号)。
在一些实施方式中，群体包含西妥昔单抗，由此相当大百分比的IR700偶联西妥昔单抗在重链中具有至少位置K215、K292、K336、K416或K449偶联至IR700染料分子(例如，参见示于SEQ ID NO：1中的重链序列中的位置编号)。在一些实施方式中，群体中至少或至少约10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％或多于50％的所有西妥昔单抗在重链中的位置K215、K292、K336、K416或K449中的至少一个处偶联至IR700。在一些实施方式中，群体中至少55％、60％、65％或70％的所有西妥昔单抗偶联物在重链中的位置K215、K292、K336、K416或K449中的一个或多个处具有IR700。在一些实施方式中，群体中至少或至少约10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％或多于50％的所有西妥昔单抗具有至少两个IR700染料分子偶联至重链，其中偶联位置中的一或两者为K215、K292、K336、K416或K449。
在一些实施方式中，组合物包含可通过诸如胰蛋白酶的内切蛋白酶消化的西妥昔单抗-IR700偶联物的群体，其中经消化的组合物可随后通过液相层析/质谱法(LC/MS)来分析。在一些实施方式中，本文所提供的组合物经胰蛋白酶消化产生多个肽，包括具有如表1中所述的氨基酸(AA)、未偶联肽和IR700偶联肽的单同位素质量([MH]+)的肽：
在一些实施方式中，本文提供包含西妥昔单抗-IR700偶联物群体或多种西妥昔单抗-IR700偶联物的组合物，其中组合物经胰蛋白酶消化产生包含肽的混合物的肽，其中一些偶联至一或多个IR700分子且其他肽不偶联至IR700分子(未偶联或未经修饰肽)。在一些实施方式中，所提供组合物的胰蛋白酶消化含有西妥昔单抗的重链的肽，这些肽含有偶联至位置5(K5)、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和/或K449(例如，参见示于SEQ IDNO：1中的重链序列中的位置编号)处的赖氨酸中的一个或多个的IR700分子。在一些实施方式中，所提供组合物的胰蛋白酶消化含有西妥昔单抗的轻链的肽，这些肽含有偶联至位置107(K107)、K145、K188、K190和/或K207(例如，参见示于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的位置编号)处的赖氨酸中的一个或多个的IR700分子。
在一些实施方式中，通过质谱法(例如，以正离子模式)来检测偶联至IR700分子的肽。在一些实施方式中，所提供组合物的胰蛋白酶消化产生通过质谱法检测的经修饰和未经修饰肽。
遵循液相层析/质谱法(LC/MS)程序，提取离子层析图(EIC)可通过绘制在所选质荷比(m/z)值或随滞留时间记录的系列质谱中的系列所选m/z值下观察到的信号强度来创建。对于所选值，通过积分确定的EIC的曲线下面积可用于计算所选组分的含量。为确定所选肽(具有所选质荷比(m/z)值)的偶联百分比，对应于所选肽的曲线下面积除以偶联肽序列和对应于与偶联肽相同残基的未偶联肽(未经修饰)的曲线下面积的总和，乘以100[偶联百分比＝偶联肽的面积/(偶联肽面积+未经修饰肽的面积)×100]。所选肽可为单电荷肽或多电荷肽，诸如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个电荷(z)的肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K5处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的2％或约2％与5％或约5％之间或约3％与5％或约5％之间，诸如约3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或约5％。在一些实施方式中，位置K5处的偶联肽百分比为约3.8±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K5处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-38。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K5处偶联至IR700的肽为约m/z 1243.09的[MH4]4+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K75处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的2％或约2％与5％或约5％之间或3％或约3％与5％或约5％之间，诸如约3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或约5％。在一些实施方式中，位置K75处的偶联肽百分比为约3.5±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K75处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸72-81。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K75处偶联至IR700的肽为约m/z984.91的[MH2]2+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K215处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的8％或约8％与11％或约11％之间或9％或约9％与11％或约11％之间，诸如约9％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10.0％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％或约11％。在一些实施方式中，位置K215处的偶联肽百分比为约10.0±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K215处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸213-216。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K215处偶联至IR700的肽为约m/z 643.76的[MH2]2+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K248处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的0.5％或约0.5％与2.5％或约2.5％之间，诸如约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或约2.5％。在一些实施方式中，位置K248处的偶联肽百分比为约1.7±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K248处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸225-250。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K248处偶联至IR700的肽为约m/z 1205.22的[MH3]3+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K292处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的8％或约8％与12％或约12％之间，诸如约8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10.0％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％、11.0％、11.1％、11.2％、11.3％、11.4％、11.5％、11.6％、11.7％、11.8％、11.9％或约12％。在一些实施方式中，位置K292处的偶联肽百分比为约10.2±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K292处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQID NO：1的氨基酸291-294。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K292处偶联至IR700的肽为约m/z 424.16的[MH3]3+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K328处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的0.2％或约0.2％与2.5％或约2.5％之间，诸如约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或约2.5％。在一些实施方式中，位置K328处的偶联肽百分比为约1.3±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K328处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸325-336。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K328处偶联至IR700的肽为约m/z 1018.47的[MH2]2+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K336处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的4.5％或约4.5％与7％或约7％之间，诸如约4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％或约7.0％。在一些实施方式中，位置K336处的偶联肽百分比为约5.9±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K336处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸329-340。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K336处偶联至IR700的肽为约m/z 1018.98的[MH2]2+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K416处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的9.5％或约9.5％与13％或约13％之间，诸如约9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10.0％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％、11.0％、11.1％、11.2％、11.3％、11.4％、11.5％、11.6％、11.7％、11.8％、11.9％、12.0％、12.1％、12.2％、12.3％、12.4％、12.5％、12.6％、12.7％、12.8％、12.9％或约13.0％。在一些实施方式中，位置K416处的偶联肽百分比为约11.2±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K416处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸412-418。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K416处偶联至IR700的肽为约m/z529.89的[MH3]3+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗重链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K449处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的6％或约6％与10％或约10％之间，诸如约6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％或约10.0％。在一些实施方式中，位置K449处的偶联肽百分比为约7.6±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K449处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：1的氨基酸442-449。在一些实施方式中，在西妥昔单抗重链的位置K449处偶联至IR700的肽为约m/z779.33的[MH2]2+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗轻链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K107处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的2％或约2％与5％或约5％之间，诸如约2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或约5.0％。在一些实施方式中，位置K107处的偶联肽百分比为约3.4±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K107处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：2的氨基酸104-108。在一些实施方式中，在西妥昔单抗轻链的位置K107处偶联至IR700的肽为约m/z714.34的[MH2]2+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗轻链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K145处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的7％或约7％与11％或约11％之间，诸如约7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10.0％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％或约11.0％。在一些实施方式中，位置K145处的偶联肽百分比为约9.3±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K145处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ IDNO：2的氨基酸143-149。在一些实施方式中，在西妥昔单抗轻链的位置K145处偶联至IR700的肽为约m/z 829.36的[MH2]2+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗轻链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K188处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间，诸如约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％或约4.0％。在一些实施方式中，位置K188处的偶联肽百分比为约2.1±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K188处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：2的氨基酸184-190。在一些实施方式中，在西妥昔单抗轻链的位置K188处偶联至IR700的肽为约m/z 415.67的[MH4]4+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗轻链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K190处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的1.5％或约1.5％与5％或约5％之间，诸如约1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或约5.0％。在一些实施方式中，位置K190处的偶联肽百分比为约3.5±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K190处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：2的氨基酸189-207。在一些实施方式中，在西妥昔单抗轻链的位置K190处偶联至IR700的肽为约m/z 970.76的[MH3]3+肽。
在一些实施方式中，对应于西妥昔单抗轻链的肽(包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207))的提取离子层析图(EIC)峰的积分面积(偶联肽百分比)是在对应未经修饰肽的EIC峰和对应于位置K207处修饰的肽的EIC峰的积分面积总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间，诸如约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％或约4.0％。在一些实施方式中，位置K207处的偶联肽百分比为约2.0±1％。在一些实施方式中，用于计算偶联肽百分比的在位置K207处偶联至IR700的肽和未经修饰肽对应于SEQ ID NO：2的氨基酸191-211。在一些实施方式中，在西妥昔单抗轻链的位置K207处偶联至IR700的肽为约m/z 1050.48的[MH3]3+肽。
在一些实施方式中，所提供组合物的胰蛋白酶消化产生如通过质谱法(例如，以正离子模式)检测的多个IR700偶联肽的计算分数模式(偶联肽％)，进而产生组合物的肽质量指纹。
在一些实施方式中，经胰蛋白酶消化、LC/MS分析的组合物含有肽的群体，其中组合物中第一组检测的经IR700修饰的肽的丰度(或其检测的频率)大于其他经修饰肽的丰度或检测频率，且第一组包括以下中的一个或多个：西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)；西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)；西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)；和西妥昔单抗轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)。在一些此类实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的至少约7.5％，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约至少8％、8.5％或至少9％。在一些实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是在对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约7.5％与20％之间，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约7.5％、8％、8.5％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10.0％、10.1％、10.2％、10.3％、10.4％、10.5％、10.6％、10.7％、10.8％、10.9％、11.0％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、18％、19％或至少20％。
在一些实施方式中，组合物中第二组检测的经IR700修饰的肽的丰度(或其检测的频率)大于其他经修饰肽的丰度或检测频率(但丰度或检测频率低于第一组)，且该第二组包括以下中的一个或多个：西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ IDNO：1的位置336的赖氨酸(K336)；和西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)。在一些此类实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的至少约4％，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约至少4％、4.5％或至少5％，但丰度或频率小于第一组经修饰肽。在一些实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是在对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约4％与9％之间，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约4％、4.5％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.5％或9％。
在一些实施方式中，组合物中第三组检测的经IR700修饰的肽的丰度(或其检测的频率)大于其他经修饰肽的丰度或检测频率(但丰度或检测频率低于第一组和第二组)，且该第三组包括以下中的一个或多个：西妥昔单抗轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)；西妥昔单抗轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)；西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)；和西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)。在一些此类实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的至少约2％，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约至少2.5％、2.7％或至少3％，但丰度或频率低于第一组和第二组经修饰肽。在一些实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是在对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约2.5％与5.5％之间，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约2.5％、2.7％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％或5.5％。
在一些实施方式中，组合物中第四组检测的经IR700修饰的肽的丰度(或其检测的频率)大于其他经修饰肽的丰度或检测频率(但丰度或检测频率低于第一组、第二组和第三组)，且该第四组包括以下中的一个或多个：西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)；西妥昔单抗重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)；西妥昔单抗轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)；和西妥昔单抗轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)。在一些此类实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的至少约0.5％，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约至少1％、1.1％或至少1.2％，但丰度或频率低于第一组、第二组和第三组经修饰肽。在一些实施方式中，IR700偶联的EIC峰的面积百分比是在对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约0.5％与3％之间，诸如对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的约0.5％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3％。
在一些实施方式中，本文所提供的经胰蛋白酶消化、LC/MS分析的组合物含有以下：具有偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的IR700的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰肽的EIC峰总面积的至少约2.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约2.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约9％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约0.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比为约对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约8.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约0.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约4.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约9％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约7％；包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约2.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约8.5％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约1％；包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约2.5％；和包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应经修饰和未经修饰多肽的EIC峰总面积的至少约1％。
在一些实施方式中，对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.8±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.0±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.7±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.2±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.3±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约5.9±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约11.2±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约7.6±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.4±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约9.3±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2.1±1％；对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；和对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2±1％。
在一些实施方式中，使用具有对应于以下的氨基序列的肽计算面积百分比：对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-38、氨基酸72-81、氨基酸213-216、氨基酸225-250、氨基酸291-294、氨基酸325-336、氨基酸329-340、氨基酸412-418和氨基酸442-449的氨基酸序列；和对应于SEQ ID NO：2的氨基酸104-108、氨基酸143-149、氨基酸184-190、氨基酸189-207和氨基酸191-211的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文提供包含偶联至IR700分子的西妥昔单抗分子的群体的组合物，其中当通过质谱法分析组合物时：在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸336(K336)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，本文提供包含西妥昔单抗分子的群体的组合物，其中当通过质谱法分析组合物时：在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸336(K336)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，本文提供包含西妥昔单抗分子的群体的组合物，其中当通过质谱法分析组合物时：在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸336(K336)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，本文提供包含西妥昔单抗分子的群体的组合物，其中当通过质谱法分析组合物时：在重链赖氨酸336(K336)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链赖氨酸336(K336)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，本文提供包含西妥昔单抗分子的群体的组合物，其中当通过质谱法分析组合物时，在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽与在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，本文提供包含西妥昔单抗分子的群体的组合物，其中当通过质谱法分析组合物时，在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽、在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽、在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽和在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约1∶1∶1∶1。
在一些实施方式中，本文提供包含SEQ ID NO：1的组合物，其中赖氨酸145偶联至IR700染料。在一些方面中，组合物进一步包含SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292和赖氨酸416和任选地SEQ ID NO：2的赖氨酸449各自偶联至IR700染料。
在一些实施方式中，本文提供包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗的偶联物，其中至少一个IR700染料偶联至抗体轻链中的赖氨酸。在一些方面中，IR700染料偶联在西妥昔单抗的轻链的位置145处的赖氨酸。
在一些实施方式中，本文提供包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗的偶联物，其中至少一个IR700染料偶联至抗体重链中的赖氨酸。在一些方面中，IR700染料分子在选自K215、K292、K416和K449组成的群的重链中的赖氨酸残基处偶联。
在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗可包含在重链中的2个或更多个赖氨酸残基处偶联的IR700染料。在一些方面中，西妥昔单抗包含在重链中的3个赖氨酸残基处偶联的IR700染料。
在所提供的实施方式中的任一种中，西妥昔单抗可具有在赖氨酸残基145处偶联至西妥昔单抗的轻链的IR700染料。
在所提供的实施方式中的任一种中，可通过具有约600nm与850nm之间的波长的照射活化偶联物且由此获得细胞杀伤活性。在一些方面中，波长为690nm±50nm。
在一些实施方式中，本文提供包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗的群体的组合物，其中至少70％、80％、90％或大于90％的群体具有至少一个IR700染料偶联至西妥昔单抗轻链上的赖氨酸。在一些方面中，轻链中偶联的主要赖氨酸残基为K145。
在一些实施方式中，本文提供包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗的群体的组合物，其中至少70％、80％、90％或大于90％的群体具有至少一个IR700染料偶联至西妥昔单抗重链上的赖氨酸。在一些方面中，重链中偶联的主要赖氨酸残基为K215、K292、K416和K449中的一个或多个。
在所提供的实施方式中的任一种中，至少70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子的群体可具有偶联至西妥昔单抗重链上的两个或更多个赖氨酸的IR700染料。
在一些实施方式中，本文提供包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗的群体的组合物，其中不超过约20％的群体为未偶联抗体。在一些方面中，小于10％的群体为未偶联抗体。在一些方面中，小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的群体为未偶联抗体。
在所提供的实施方式中的任一种中，群体中染料与西妥昔单抗的比率可为约2∶1、约2.5∶1或约3∶1。
在一些实施方式中，本文提供包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗的组合物，其中组合物包含小于或小于约0.6％、0.5％、0.4％或0.3％的游离染料(例如，未偶联IR700染料)。在一些方面中，组合物包含至少或至少约95％、96％、97％或98％的单体。在一些方面中，组合物包含小于或小于约5％、4％或3％的高分子量物质。在一些方面中，组合物包含小于或小于约30％、20％、25％、20％、15％或10％的未偶联抗体。在一些方面中，组合物在暗处或少光条件下储存6个月之后，游离染料(例如，未偶联IR700染料)的百分比实质上未改变。
在所提供的实施方式中的任一种中，至少70％、80％、90％或大于90％的群体可具有至少一个IR700染料偶联至抗体轻链上的赖氨酸。在一些方面中，轻链中偶联的主要赖氨酸残基为K145。
在所提供的实施方式中的任一种中，至少70％、80％、90％或大于90％的群体可具有至少一个IR700染料偶联至抗体重链上的赖氨酸。在一些方面中，重链中偶联的主要赖氨酸残基为K215、K292、K416和K449中的一个或多个。
IV.制造西妥昔单抗-IR700偶联物的方法
本文还提供制备、制造或产生本文所提供的偶联物和/或组合物的方法，这些偶联物和组合物包括在轻链和/或重链上的一或多个特定赖氨酸残基或位置处具有IR700染料的西妥昔单抗-IR700偶联物和西妥昔单抗-IR700偶联物的群体。在一些实施方式中，方法包括提供使得达成特定染料与抗体的比率的条件。在一些实施方式中，方法包括提供以下条件：使得在消化和分析包含偶联物的组合物之后，达成肽和经修饰肽的特定类型和/或相对比例和/或质谱(例如，如通过LC/MS评定)。在一些实施方式中，方法包括提供以下条件：使得与除赖氨酸位置之外的位置处的西妥昔单抗结合的染料的量实质上减少，使得组合物中相当大部分的IR700染料分子在西妥昔单抗内的赖氨酸处共价偶联。
在一些实施方式中，提供西妥昔单抗-IR700偶联物和包含稳定且一致的西妥昔单抗-IR700偶联物的群体的组合物。关于偶联物，术语“一致”是指偶联物或偶联物的群体的组合物，其中在偶联过程之后，偶联物的DAR(染料与抗体的比率)和组合物中游离染料的量随时间推移保持实质上相同。在一些过程中，IR700染料可变成在除赖氨酸处之外的位置处(诸如经由硫醇酯和酪氨酸酯)与抗体结合。这些非赖氨酸偶联位置是不稳定的，使得随时间推移，IR700染料分离且释放至组合物中，使得组合物随时间推移不一致。
本文提供制造一致的西妥昔单抗-IR700偶联物和一致的西妥昔单抗-IR700偶联物群体的方法。在本文所描述的制造步骤中的一些或全部中，反应组分和反应步骤在避光条件下进行，使得染料和/或偶联物不曝露于任何环境光或不曝露于强度大于700勒克斯、大于600勒克斯、大于500勒克斯、大于400勒克斯、大于300勒克斯、大于200勒克斯或大于100勒克斯的光。在制造的一些实施方式中，染料和偶联物不曝露于强度大于700勒克斯的光超过10分钟或超过5分钟。在制造的一些实施方式中，染料和偶联物不曝露于强度大于200勒克斯的光超过10分钟或超过5分钟。参见例如如WO2017/031363公开的PCT/US2016/047636。
在一些实施方式中，制造偶联物的方法包括制备或生产偶联物的步骤。在一些实施方式中，此类方法包括提供酞菁染料。在一些实施方式中，以诸如水溶液的水性形式提供酞菁染料。在一些实施方式中，将染料以诸如冻干粉的冻干形式提供且重建或溶解于溶剂中以形成水溶液。举例而言，在一些实施方式中，将含有反应性基团的酞菁染料(例如，IR700 NHS酯)溶解于溶剂中。在一些实施方式中，方法包括将酞菁染料溶解于溶剂中的步骤，诸如在染料与抗体偶联之前。在一些实施方式中，溶剂为有机溶剂，诸如二甲亚砜(DMSO)或DMF。在一些实施例中，溶剂为基于水的溶剂。在一些实施方式中，将染料溶解于溶剂中的浓度介于0.1mg/mL或约0.1mg/mL至100mg/ml或约100mg/ml、1mg/mL或约1mg/mL至50mg/mL或约50mg/mL、1mg/mL或约1mg/mL至15mg/mL或约15mg/mL的范围内，或溶解于溶剂中的浓度为或约10mg/mL。在一些实施方式中，在制备用于本方法的染料的步骤期间，保护诸如IR700 NHS酯的酞菁染料免于曝露于白光。
在一些实施方式中，制备或生产偶联物的步骤包括提供诸如西妥昔单抗的抗体，用于与诸如IR700的酞菁染料偶联。在一些实施方式中，在与酞菁染料偶联之前制备抗体。在一些实施方式中，制备抗体包括在偶联反应之前将抗体浓缩或稀释至特定量或浓度。在一些实施方式中，制备抗体包括将抗体交换至缓冲液(诸如与偶联反应相容或适合于偶联反应的缓冲液)中。在一些实施方式中，制备抗体包括将pH调节至适用于偶联反应的pH。举例而言，抗体在介于或介于约6与10之间，诸如介于或介于约8与9之间，诸如约8.5，诸如8.46的pH下制备。
在一些实施方式中，诸如使用超滤/透滤作用，诸如使用切向流过滤(TFF)，将抗体缓冲交换至缓冲液中。在一些实施方式中，TFF包含再生膜，诸如再生纤维素膜。在一些实施方式中，抗体经交换至其中的缓冲液为磷酸钠缓冲液，诸如100mM磷酸钠，诸如pH为8.5或pH8.65。在一些实施方式中，进行切向流过滤直至滤液达至所需pH。在一些实施方式中，所需pH在6与10之间或在约6与10之间，诸如在8与9之间或在约8与9之间，诸如约8.5，诸如8.46。
在一些实施方式中，以在0.01g或约0.01g与100g或约100g之间、在1g或约1g与50g或约50g之间、在1g或约1g与25g或约25g之间、在5g或约5g与15g或约15g之间或12g或约12g的量提供抗体。在一些实施方式中，抗体制剂的体积是在0.01L或约0.01L与100L或约100L之间、在1L或约1L与50L或约50L之间、在约1L与15L或约15L之间或为6L或约6L。在一些实施方式中，抗体的浓度小于或小于约0.01mg/mL，或在0.1mg/mL或约0.1mg/mL与100.0mg/mL或约100.0mg/mL之间、在0.1mg/mL或约0.1mg/mL与50mg/mL或约50mg/mL之间、在0.1mg/mL或约0.1mg/mL与10mg/mL或约10mg/mL之间，或在1mg/mL或约1mg/mL与5mg/mL或约5mg/mL之间，或为5mg/mL或约5mg/mL或为4.5mg/mL或约4.5mg/mL，或为2mg/mL或约2mg/mL、为10mg/mL或约10mg/mL。在一些实施方式中，将抗体稀释以使浓度在0.1mg/mL或约0.1mg/mL与100.0mg/mL或约100.0mg/mL之间、在0.1mg/mL或约0.1mg/mL与50mg/mL或约50mg/mL之间、在0.1mg/mL或约0.1mg/mL与10mg/mL或约10mg/mL之间、在1mg/mL或约1mg/mL与5mg/mL或约5mg/mL之间或在1.8mg/mL或约1.8mg/mL与2.4mg/mL或约2.4mg/mL之间，或稀释至为或约2mg/mL、约5mg/mL或约10mg/mL的浓度。
在一些实施方式中，抗体经由诸如0.2μm过滤器或0.22m过滤器的无菌过滤器过滤。在一些实施方式中，诸如在低于30℃，诸如通常低于26℃、20℃、15℃、10℃，诸如通常在2℃或约2℃与8℃或约8℃之间的温度下储存制备的抗体。在一些实施方式中，测定抗体的重量。
在一些实施方式中，制造偶联物的方法包括使抗体与诸如IR700的酞菁染料接触的步骤。在一些实施方式中，将酞菁染料和抗体在诸如反应容器的容器中混合在一起。在一些实施方式中，在诸如反应容器的容器(container/vessel)中进行接触步骤。在一些实施方式中，容器为试管、瓶或酸瓶(carboy)。在一些实施方式中，容器具有约或至少1L、2L、5L、10L、15L、20L、30L、40L、50L或100L的最大体积。在一些实施方式中，容器为40L酸瓶。在一些实施方式中，容器具有约或至少100μL、500μL、1mL、1.5mL、5mL、15mL、50mL、250mL或500mL的最大体积。在一些实施方式中，容器(container/vessel)为半透明或不透明的，为绿色或琥珀色的，和/或以诸如铝的不透明箔封盖(诸如包覆)。
在一些实施方式中，基于容器(container/vessel)中存在的抗体重量计算用于接触抗体的染料的量。举例而言，在一些实施方式中，添加一定量的染料使得染料与抗体或约抗体的最终摩尔比为1∶1或约1∶1至1000∶1或约1000∶1、1∶1或约1∶1至100∶1或约100∶1、1∶1或约1∶1至10∶1或约10∶1、1∶1或约1∶1至4∶1或约4∶1或约4∶1或4∶1。
在一些实施方式中，选择染料与抗体的比率使得每一抗体并入所需数目的染料残基。在一些实施方式中，每一抗体的所需染料残基数目为1至5或约1至5、2至5或约2至5、2至3或约2至3或为约3或3。
在一些实施方式中，将染料和抗体在控制温度下接触，或在具有控制温度的单元(诸如孵育箱或冷冻机)中接触。在一些实施方式中，方法包括使酞菁染料(例如IR700)和抗体在介于4℃或约4℃至37℃或约37℃，诸如10℃或约10℃至30℃或约30℃、20℃或约20℃至30℃或约30℃、或23℃或约23℃至27℃或约27℃、或还即约25℃+2.0℃、25℃+1.0℃或25℃+0.3℃，诸如还即25℃或约25℃的范围内的温度下接触。在一些实施方式中，在室温下，诸如在21℃与25℃之间，诸如约23℃进行接触步骤。
在一些实施方式中，接触步骤包括孵育，诸如使染料和抗体反应。在一些实施方式中，接触可在反应容器中进行。在一些实施方式中，接触包括针对至少一部分的接触将合并的染料和抗体组合物混合(例如通过搅拌)。在一些实施方式中，诸如在搅拌盘上搅拌内容物。在一些实施方式中，将内容物搅拌约或至少5至30分钟，诸如约5至20分钟，诸如约10至15分钟。
在一些实施方式中，接触步骤进行至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少90分钟、至少120分钟、至少240分钟、至少360分钟、至少24小时、至少72小时或至少120小时。在一些实施方式中，接触步骤进行5分钟至150小时、5分钟至100小时、5分钟至48小时、5分钟至24小时、5分钟至6小时、5分钟至2小时、5分钟至90分钟、5分钟至60分钟、5分钟至30分钟、30分钟至150小时、30分钟至100小时、30分钟至48小时、30分钟至24小时、30分钟至6小时、30分钟至2小时、30分钟至90分钟、30分钟至60分钟、60分钟至150小时、60分钟至100小时、60分钟至48小时、60分钟至24小时、60分钟至6小时、60分钟至2小时、60分钟至90分钟、90分钟至150小时、90分钟至100小时、90分钟至48小时、90分钟至24小时、90分钟至6小时、90分钟至2小时、2小时至150小时、2小时至100小时、2小时至48小时、2小时至24小时、2小时至6小时、6小时至150小时、6小时至100小时、6小时至48小时、6小时至24小时、24小时至150小时、24小时至100小时、24小时至48小时、48小时至150小时、48小时至100小时或100小时至150小时。在一些实施方式中，接触进行5分钟至6小时(诸如5分钟至4小时、5分钟至2小时)、5分钟至60分钟、5分钟至30分钟(诸如约5分钟至20分钟，诸如约10分钟至15分钟)的一段时间。在一些实施方式中，方法包括诸如通过酞菁染料(例如IR700)和抗体(例如抗体)的孵育来接触至少或至少约15分钟、至少或至少约30分钟、至少或至少约60分钟、至少或至少约90分钟、至少或至少约120分钟或至少或至少约150分钟。在一些实施方式中，方法包括诸如使染料和抗体反应来接触介于或介于约90与150分钟之间，诸如120分钟。
在一些实施方式中，将染料和抗体在可包括诸如DMSO或DMF的有机溶剂的水性缓冲液中混合。在一些实施方式中，溶剂为基于水的溶剂。在一些实施方式中，缓冲液的pH在6与10之间或在约6与10之间，诸如在7与10之间或在约7与10之间，在8与10之间或在约8与10之间，或在8与9之间或在约8与9之间。
在一些实施方式中，在接触步骤之后，诸如通过添加诸如甘氨酸的淬灭剂来淬灭反应物。术语“淬灭”是指使未反应的反应性基团与过量非特异性淬灭剂(quenchingagent/quencher)反应，诸如停止染料与抗体之间的反应的过程。使用的特定试剂或淬灭剂取决于染料偶联的特定反应性基团。举例而言，NHS酯交联反应可在含有胺的缓冲液，诸如含有Tris或甘氨酸的缓冲液存在下淬灭。
在一些实施方式中，淬灭步骤移除任何未反应的染料。在一些实施方式中，淬灭步骤移除已与抗体上的非赖氨酸位置反应的任何染料，以便形成硫醇酯或酪氨酸酯。在一些实施方式中，进行淬灭步骤使得实质上所有与抗体反应的染料处于抗体上的一或多个赖氨酸位置。
在一些实施方式中，添加的淬灭剂的量为至少或至少约200mM、至少或至少约500mM、至少或至少约1M、至少或至少约2M、至少或至少约5M或至少或至少约10M。在一些实施方式中，淬灭反应包括添加1M甘氨酸。在一些实施方式中，在将淬灭剂添加至偶联反应之后，其最终浓度为至少或至少约1mM、至少或至少约2mM、至少或至少约3mM、至少或至少约4mM、至少或至少约5mM或至少或至少约10mM。在一些实施方式中，诸如甘氨酸的淬灭试剂的最终浓度为4.2nM或约4.2nM。在一些实施方式中，淬灭步骤的pH在6与10之间或在约6与10之间，诸如在7与10之间或在约7与10之间，在8与10之间或在约8与10之间或在8与9之间或在约8与9之间。在一些实施方式中，淬灭步骤的pH为或约8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。
在一些实施方式中，在淬灭步骤期间，将反应容器之内容物诸如在搅拌盘上混合(诸如搅拌)。在一些实施方式中，将反应容器之内容物在100rpm与1000rpm之间或在约100rpm与1000rpm之间、在200rpm与500rpm之间或在约200rpm与500rpm之间下搅拌，或在300+50rpm下或在300rpm下搅拌。在一些实施方式中，淬灭反应混合至少或至少约5分钟、至少或至少约10分钟或至少或至少约15分钟。在一些实施方式中，淬灭反应混合约10至12分钟。
在一些实施方式中，在混合淬灭反应之后，将诸如反应容器的容器诸如在孵育箱中返回至控制温度。在一些实施方式中，诸如自21℃或约21℃至30℃或约30℃，诸如自23℃或约23℃至27℃或约27℃，诸如25℃或约25℃孵育容器的内容物。在一些实施方式中，淬灭步骤的孵育(诸如在将淬灭剂与反应容器之内容物混合之后的额外孵育)进行至少或至少约30分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、12-15小时、12-16小时、15-20小时、12-24小时、约20小时或约24小时。在一些实施方式中，孵育进行12或约12小时或过夜。
在一些实施方式中，本文提供一种制造稳定偶联物的方法，其包含：a)使西妥昔单抗与IR700染料在产生偶联物的条件下接触，该偶联物包含在一或多个选自下组的西妥昔单抗的赖氨酸处偶联的IR700染料：K145(轻链)、K215(重链)、K292(重链)、K416(重链)和K449(重链)；b)使偶联物在偶联期间和/或之后经受一个步骤，该步骤实质上减少与西妥昔单抗非特异性偶联的IR700染料；c)在医药学上可接受的缓冲液中配制偶联物，其中在步骤a)至c)中的每一个中，染料和偶联物曝露的唯一光具有在约400nm至约650nm范围内的波长或具有小于500勒克斯的强度。在一些方面中，步骤b)包含在约8.4的pH下进行IR700染料与西妥昔单抗之间的偶联反应。在一些方面中，步骤b)包含在完成IR700染料与西妥昔单抗之间的偶联反应之后，使偶联物在约8.4的pH下经甘氨酸淬灭反应。在一些方面中，淬灭反应进行过夜或大于约6小时的持续时间。
在一些实施方式中，本文所提供的制造方法包括其中配制、纯化或分离偶联物以产生原料药的一或多个步骤。在一些实施方式中，将偶联物配制至浓度在0.1mg/mL或约0.1mg/mL至1000mg/mL或约1000mg/mL、0.1mg/mL至约500mg/mL、0.1mg/mL至约200mg/mL、0.1mg/mL至约100mg/mL、0.1mg/mL至约50mg/mL、0.1mg/mL至约10mg/mL、0.5mg/mL至约10mg/mL或0.5mg/mL至约5mg/mL的范围内。
在一些实施方式中，配制偶联物的方法可包括浓缩或稀释偶联物，将偶联物交换至医药学上可接受的缓冲液中或无菌处理。
在一些实施方式中，配制步骤包括浓缩偶联物。在一些实施方式中，浓缩步骤包括减小偶联物的体积。在一些实施方式中，使用超滤/渗滤***实现体积减小。在一些实施方式中，将偶联物的体积自或自约10L、15L、20L、25L、30L、40L或50L减小至或至约5L、8L、9L、10L、12L或15L。在一些实施方式中，浓缩之后的最终体积在8L与10L之间或在约8L与10L之间。在一些实施方式中，将偶联物浓缩至浓度介于或介于约0.1mg/mL至约1000mg/mL、0.1mg/mL至约500mg/mL、0.1mg/mL至约200mg/mL、0.1mg/mL至约100mg/mL、0.1mg/mL至约50mg/mL、0.1mg/mL至约10mg/mL、0.5mg/mL至约10mg/mL、0.5mg/mL至约5mg/mL或1.8mg/mL至约2.1mg/mL的范围内。在一些实施方式中，将偶联物浓缩至或至约2.0mg/mL、约5.0mg/mL或约10mg/mL。
在一些实施方式中，配制步骤包括稀释偶联物。在一些实施方式中，偶联物的稀释包括将包含偶联物的缓冲液的体积诸如自或自约5L、10L、15L、20L、30L、40L或50L增加至或至约20L、30L、40L、50L或75L。在一些实施方式中，将偶联物稀释至浓度介于或介于约0.1mg/mL至约1000mg/mL、0.1mg/mL至约500mg/mL、0.1mg/mL至约200mg/mL、0.1mg/mL至约100mg/mL、0.1mg/mL至约50mg/mL、0.1mg/mL至约10mg/mL、0.5mg/mL至约10mg/mL或0.5mg/mL至约5mg/mL的范围内。
在一些实施方式中，配制步骤包括纯化偶联物。在一些实施方式中，通过凝胶渗透层析使用诸如SEPHADEX G-50管柱的设备或通过渗析来纯化偶联物以移除未偶联染料。在一些实施方式中，诸如通过使用切向流过滤(TFF)来超滤或透滤偶联物。在一些实施方式中，在暗处或避光条件下进行超滤/透滤以避免偶联物曝露于环境光。
在一些实施方式中，配制步骤包括将酞菁染料-抗体偶联物(诸如IR700-抗体偶联物)自反应缓冲液交换至医药学上可接受的缓冲液。在一些实施方式中，可通过超滤/透滤作用进行缓冲液交换。
在一些实施方式中，在诸如含有医药学上可接受的运载体或载剂的医药学上可接受的缓冲液中配制偶联物。一般而言，医药学上可接受的运载体或载剂，诸如存在于医药学上可接受的缓冲液中的那些，可为任何本领域中已知的。E.W.Martin，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，第19版(1995)的《雷明顿药物科学》(Remington′s PharmaceuticalSciences)描述适用于医药上递送一或多种治疗性化合物的组合物和配制物。含有偶联物的组合物可配制成适合的医药制剂(诸如溶液、悬浮液、锭剂、可分散锭剂、丸剂、胶囊、散剂、持续释放配制物或酏剂)以供经口给予，和配制成经皮贴片制剂和干粉吸入剂。通常，使用本领域中熟知的技术和程序将含有化合物的组合物配制成医药组合物(参见例如，《安塞尔药物剂型教案》(Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)，第四版，1985，126)。一般而言，配制模式随给药途径而变化。可例如以WO2019/035053公开的PCT/US2019/035053中所描述配制包含酞菁染料-抗体偶联物的医药组合物。
在一些实施方式中，组合物的pH在6与10之间或在约6与10之间，诸如在6与8之间或在约6与8之间，在6.9与7.3之间或在约6.9与7.3之间，诸如约pH 7.1。在一些实施方式中，医药学上可接受的缓冲液的pH为至少或至少约5、至少或至少约6、至少或至少约7、至少或至少约8、至少或至少约9、或至少或至少约10或为7.1。
在一些实施方式中，提供一种稳定的染料偶联物，诸如西妥昔单抗-IR700偶联物。在一些实施方式中，通过实践所提供的方法，偶联物的纯度、杂质、完整性、组合物和效能的变化不大于制造目的的可接受规格以支持临床或商业用途。在实施方式中，偶联物为稳定的且展现最小聚集且保留效能和活性，诸如在染料的加工、制造或储存之后。在一些实施方式中，染料偶联物稳定超过三个月、四个月、五个月，诸如通常超过6个月、超过7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。在一些实施方式中，当在低于30℃的温度下，诸如通常在2至8℃的温度下储存一段时间时，仍存在此类稳定性。
关于染料偶联物，诸如西妥昔单抗-IR700偶联物，术语“稳定”是指以下偶联物，其中与储存必要时间(例如，t＝0)之前的偶联物相比，在储存超过必要时间(诸如超过三个月，例如超过或超过约6个月、12个月或24个月)之后，大于或大于约90％的偶联物作为主要单体成分以样品中存在的偶联物的总分子量的百分比存在，不超过10.0％的偶联物作为高分子量组分以样品中存在的偶联物的总分子量的百分比存在或偶联物保留至少20％和至多100％的完整性，诸如其物理和功能质量，包括其纯度(例如，单体含量相对于聚集体的百分比，诸如较高分子量组分的含量)、相同性(例如，化学组成，诸如结构特征)、效能(例如，产生药理反应所需要的浓度或量)或活性(例如，PIT杀死)中的一个或多个。在一些实施方式中，保留至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度、相同性、效能或活性。
本文还提供通过如前述实施方式中任一种的方法制造的偶联物的稳定组合物。在一些实施方式中，偶联物的稳定组合物包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中当通过质谱法分析稳定偶联物时，在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽、在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽、在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽和在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽之间的比率为约1∶1∶1∶1(例如，参见示于SEQ ID NO：1中的重链序列和/或示于SEQ ID NO：2中的轻链序列中的位置编号)。
在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸215(K215)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸292(K292)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸292(K292)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，和/或在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸336(K336)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸336(K336)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，在偶联物的稳定组合物中，在重链中的赖氨酸416(K416)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
在一些实施方式中，提供一种一致的染料偶联物组合物。关于染料偶联物组合物，术语“一致”是指在淬灭步骤之后，组合物中具有低含量或实质上无游离染料且随时间推移在组合物中实质上无游离染料释放的组合物。举例而言，在淬灭步骤之后组合物中存在小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的游离染料且组合物中游离染料的量不在组合物储存期间增加，包括储存约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或至少1年、2年或超过2年。
关于制造偶联物的组合物的术语“一致”是指在不同制造批次之间轻链和/或重链上与此类IR700的酞菁染料偶联的特定位置的大致均一性。举例而言，在制造西妥昔单抗-IR700偶联物的本文所描述的组合物中，与染料偶联的主要赖氨酸位置和各赖氨酸位置处的偶联之间的比例在制造批次之间相对恒定。
V.治疗方法
所提供的组合物，诸如含有酞菁染料-抗体偶联物的医药组合物，诸如本文所描述的IR700-西妥昔单抗偶联物，可用于治疗方法或治疗方案(诸如光免疫疗法(PIT)方法)中。光免疫疗法为利用目标特异性光敏剂的分子靶向疗法，该目标特异性光敏剂是基于IR700酞菁染料，偶联至靶向分子(例如，西妥昔单抗)，靶向肿瘤细胞上细胞表面蛋白上的表皮生长因子受体(EGFR；ErbB-1；HER1；EGF受体)。所提供的偶联物和组合物(诸如医药组合物)的方法和用途包括例如涉及向患有疾病、病症或病状的对象给予分子，随后照射至PIT，由此引起此类细胞或病原体的光解以实现疾病或病症的治疗的治疗方法和用途。在一些实施方式中，方法可用于***或癌症，由此将给予的酞菁染料西妥昔单抗偶联物(诸如IR700-西妥昔单抗偶联物)靶向至与肿瘤相关的细胞，由此引起此类细胞的光解，且在一些情况下，导致肿瘤的治疗。用途包括组合物在此类方法和治疗(诸如治疗方案(therapeuticregimens/treatment regimens))中的用途，和此类组合物在制备药剂以进行此类治疗方法中的用途。在一些实施方式中，方法和用途由此治疗对象中的疾病或病症或病状，诸如肿瘤或癌症。
本文提供用西妥昔单抗-IR700偶联物进行PIT的方法。西妥昔单抗靶向肿瘤特异性细胞的表面上的EGFR。通过用吸收光照射活化染料偶联物激发光敏剂且引起肿瘤细胞的细胞杀伤。一般而言，靶向光毒性似乎主要取决于染料偶联物经由特异性靶向分子(例如，抗体)与细胞膜的偶联。举例而言，使用例示性抗体-IR700分子的研究指示偶联物必须结合至细胞膜以具有活性，且有效细胞杀伤不需要细胞内定位(参见例如，美国专利第8,524,239号和美国公开申请案第US20140120119号)。偶联物结合细胞的光活化引起快速细胞死亡和坏死。
通常，PIT主要引起在细胞经照射之后酞菁染料偶联物(诸如抗体-IR700偶联物)所结合的那些细胞的细胞死亡，而不表达抗体识别的细胞表面蛋白的细胞未大量杀死。因此，因为疗法特异性地靶向疾病细胞，诸如肿瘤细胞，所以与健康组织或细胞相比，其作用对疾病组织具有高度选择性。
本文提供组合物，其包括用于靶向表皮生长因子受体(EGFR；ErbB-1；HER1；EGF受体)(诸如癌细胞上的EGFR)的医药组合物。举例而言，EGF受体HER1通常发现于腺癌中，腺癌可见于许多器官，诸如胰腺、***、***和结肠中。
在一些实施方式中，方法包括用EGFR抗体-酞菁偶联物(诸如具有在癌症抗体的轻链和/或重链上的特定赖氨酸残基或赖氨酸位置偶联的IR700染料的西妥昔单抗-IR700偶联物)治疗癌前病变或癌症，其中癌症表达表皮生长因子受体(EGFR或HER1)抗原。此类癌症可包括(但不限于)头颈癌、癌前异常增生、神经胶母细胞瘤、食道癌、喉癌、甲状腺髓样癌、非黑素瘤皮肤SCC、乳癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、结肠直肠癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、外阴癌、***癌、***癌、罩丸癌和***癌。
在一些实施方式中，方法包括用西妥昔单抗-IR700偶联物或含有本文所描述的西妥昔单抗-IR700偶联物的群体的组合物治疗头颈癌。在一些实施方式中，治疗对象中来自头颈癌的不需要细胞的方法包括：(a)向对象给予包含西妥昔单抗-IR700偶联物或具有如本文所描述的在特定位置偶联至染料的西妥昔单抗-IR700偶联物的群体的组合物，和(b)以至少1J cm-2或1J/cm光纤长度的剂量在660至740nm的波长下照射不需要细胞，由此移除或杀死对象中的不需要细胞。在一些实施方式中，方法包括自本文所提供的避光装置中的任一种给予西妥昔单抗-IR700偶联物和/或其中在给药步骤之前和期间，组合物不曝露于强度大于500勒克斯的环境光。在一些实施方式中，在690nm下或在690nm±50nm下进行照射。在一些实施方式中，偶联物以为或约160mg/m2、320mg/m2、640mg/m2或1280mg/m2的量给予。
在一些实施方式中，治疗对象中的头颈癌的方法包括：(a)向患有头颈癌的对象静脉内给予作为经配制组合物的包含西妥昔单抗-IR700偶联物或具有如本文所描述的在特定位置偶联至染料的西妥昔单抗-IR700偶联物的群体的组合物，其中偶联物以为或约640mg/m2的量给予；和b)在给予偶联物之后，以至少或约至少或约50J cm-2或100J/cm光纤长度的剂量在690±20nm的波长下辐射病变，由此治疗对象中的癌症。在方法的一些实施方式中，在给予西妥昔单抗-IR700之后20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32小时或约这些时间给予或在给予西妥昔单抗-IR700后约24小时±4小时给予光照射以用于照射病变。
在一些实施方式中，本文提供一种杀死肿瘤细胞的方法，其包含：在或接近肿瘤细胞的部位给予包含本文所公开的偶联物的医药组合物；以约25J cm-2至约400J cm-2或约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量在600nm至850nm的波长下照射接近肿瘤细胞的区域，由此杀死肿瘤细胞。
在一些实施方式中，本文提供一种杀死肿瘤细胞的方法，其包含：在或接近肿瘤细胞的部位给予包含本文所公开的组合物的医药组合物；以约25J cm-2至约400J cm-2或约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量在600nm至850nm的波长下照射接近肿瘤细胞的区域，由此杀死肿瘤细胞。
在一些实施方式中，本文提供一种治疗疾病或病症的方法，其包含：向对象给予包含本文所公开的偶联物的医药组合物；以约25J cm-2至约400J cm-2或约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量在600nm至850nm的波长下照射对象中接近肿瘤或病变的区域，由此治疗疾病或病症。
在一些实施方式中，本文提供一种治疗疾病或病症的方法，其包含：向对象给予包含本文所公开的组合物的医药组合物；以约25J cm-2至约400J cm-2或约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量在600nm至850nm的波长下照射对象中接近肿瘤或病变的区域，由此治疗疾病或病症。
在方法的一些实施方式中，将待给予的西妥昔单抗-IR700偶联物配制于包含非离子表面活性剂和/或保护剂的组合物中。在一些实施方式中，将西妥昔单抗-IR700偶联物配制于包含非离子表面活性剂(诸如聚山梨醇酯、聚乙二醇、Triton X-100、CHAPS或普洛尼克酸(Pluronic acid)(F-68))和任选地保护剂(诸如海藻糖、山梨醇、木糖醇、甘露醇或蔗糖)的组合物中。在一些实施方式中，将西妥昔单抗-IR700偶联物配制于包含聚山梨醇酯和海藻糖的组合物中。在一些实施方式中，将西妥昔单抗-IR700偶联物配制于包含聚山梨醇酯-80和海藻糖的组合物中。在一些实施方式中，将西妥昔单抗-IR700偶联物配制于pH 7.1下包含10mM磷酸钠、0.02％(w/v)聚山梨醇酯-80和9％(w/v)海藻糖的组合物中。
在一些实施方式中，对象为人类或非人类哺乳动物。在一些实施方式中，对象为人类或兽医学对象，诸如小鼠。在一些实施方式中，对象为患有癌症或正针对癌症进行治疗的哺乳动物，诸如人类。在一些实施方式中，所公开的组合物用于治疗患有肿瘤(诸如本文所描述的肿瘤)的对象。在一些实施方式中，肿瘤先前已进行治疗，诸如以手术方式或以化学方式移除，且所公开的组合物随后用于杀死可能保留于对象中的任何剩余不希望的肿瘤细胞。
所提供的含有偶联物(诸如如本文所描述的西妥昔单抗-IR700偶联物)的组合物可用于治疗患有肿瘤(诸如癌症)或先前已进行此类移除或治疗的任何哺乳动物对象，诸如人类。需要所公开疗法的对象可包括患有癌症的人类对象，其中癌细胞在其表面上表达肿瘤特异性蛋白质，该肿瘤特异性蛋白质可特异性结合至酞菁染料-抗体偶联物。举例而言，所公开的组合物可单独或与放射或其他化学疗法组合用作癌症的初始治疗。所公开的组合物还可用于先前放射或化学疗法已失败的患者中。因此，在一些实施方式中，对象为已接受其他疗法的对象，但那些其他疗法尚未提供所需治疗反应。所公开的组合物还可用于患有局部和/或转移癌的患者中。
A.用额外治疗剂的组合治疗
在一些实施方式中，本文所公开的偶联物或组合物与用于治疗病变、疾病或病症的第二疗法(例如，额外治疗剂或抗癌治疗)的添加一起给予且本文的方法与该第二疗法的添加一起进行。在一些实施方式中，用于治疗的额外治疗剂或第二治疗剂为免疫调节剂、抗癌剂或其他药剂，其可增加***的功效，在一些情况下，其可增加治疗结果或经治疗对象的存活期。在一些实施方式中，额外治疗剂或第二治疗剂为免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，额外治疗剂或第二治疗剂为下文描述的任一种。
在给予含有酞菁染料-抗体偶联物(例如，西妥昔单抗-IR700偶联物)的组合物之前、期间或之后，对象可接受一或多种其他疗法。在一个实施例中，在给予偶联物之前，对象接受一或多种治疗以移除或减少肿瘤。在一些实施方式中，在给予含有酞菁染料-抗体偶联物的组合物之前、期间或之后，对象接受免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂为免疫检查点抑制剂。
在本文的方法和组合物的一些实施方式中，以与另一治疗剂(诸如免疫调节剂或抗癌剂中的一个或两者)组合提供酞菁染料-抗体偶联物，诸如西妥昔单抗-IR700。在一些实施方式中，酞菁染料-抗体偶联物和其他治疗剂可以单独组合物形式封装为制品用于一起、依序或间歇地给药。组合可以试剂盒形式封装。在一些实施方式中，将治疗剂和酞菁染料-抗体偶联物一起配制于同一组合物中。在一些实施方式中，治疗剂和酞菁染料-抗体偶联物经配制为单独的组合物。
在一些实施方式中，给予的一或多种其他或额外药剂或组合疗法中的额外药剂为未偶联抗体。在一些实施方式中，未偶联抗体与偶联物的抗体相同或实质上相同。举例而言，在一些实施方式中，在给予含有偶联物的组合物之前，向对象给予靶向蛋白质或抗原的未偶联抗体。在一些实施方式中，在给予偶联物之前至多96小时给予抗体。在一些实施方式中，以介于或介于约10mg/m2至约500mg/m2范围内的剂量给予抗体。举例而言，抗体为西妥昔单抗，且在给予含有偶联物的组合物之前至多96小时向对象给予西妥昔单抗。
在一些实施方式中，给予的一或多种其他或额外药剂或组合疗法中的额外药剂为免疫调节剂或抗癌剂。在一些实施方式中，免疫调节剂、抗癌剂和/或酞菁染料-抗体偶联物(例如，西妥昔单抗-IR700偶联物)经配制为单独的组合物。在一些实施方式中，免疫调节剂作为与酞菁染料-抗体偶联物的单独组合物提供，且分别给予两种组合物。在一些实施方式中，抗癌剂作为与酞菁染料-抗体偶联物的单独组合物提供，且分别给予两种组合物。在一些实施方式中，用一或多种稳定剂配制酞菁染料-抗体偶联物(例如，西妥昔单抗-IR700偶联物)，其中稳定剂为非离子表面活性剂和/或保护剂，且以单独和不同配制物给予免疫调节剂或抗癌剂。
在一些实施方式中，将免疫调节剂和/或抗癌剂和酞菁染料-抗体偶联物配制于同一组合物中。组合物可配制用于非经肠递送(还即，用于全身递送)。举例而言，组合物或组合物的组合经配制用于皮下递送或用于静脉内递送。诸如酞菁染料-抗体偶联物、免疫调节剂和/或抗癌剂的药剂可通过不同给药途径给予。
可与所公开的抗体-IR700偶联物组合用于治疗癌症或肿瘤的额外疗法(其可增强肿瘤对额外治疗剂的可及性)的实例包括(但不限于)用于移除或减少肿瘤的手术治疗，诸如手术切除、超低温疗法或化学药物栓塞治疗，以及抗肿瘤医药治疗，其可包括放射性治疗剂、抗赘生性化学治疗剂、抗生素、烷基化剂和抗氧化剂、激酶抑制剂和其他药剂。在一些实施例中，额外治疗剂偶联至纳米颗粒。可使用的额外治疗剂的特定实例包括微管结合剂、DNA嵌入剂或交联剂、DNA合成抑制剂、DNA和/或RNA转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂和基因调节剂。以治疗有效量给予的这些药剂和治疗可单独或呈组合形式使用。此类药剂的方法和治疗剂量为本领域技术人员已知的且可通过熟练的临床医师确定。
在一些实施方式中，在给予所公开的疗法(诸如给予酞菁染料-抗体偶联物)之前，以手术方式(例如经由超低温疗法、照射、化学治疗(例如经由化学药物栓塞治疗)或其组合)移除至少一部分肿瘤(诸如转移性肿瘤)。举例而言，患有转移性肿瘤的对象可在给予所公开的疗法之前已以手术方式切除全部或部分肿瘤。在一些实施方式中，在用偶联物和照射治疗之后，给予一或多种化学治疗剂。在一些实施方式中，对象患有转移性肿瘤且在给予所公开的疗法的同时给予放射疗法、化学药物栓塞治疗疗法或两者。
在一些实施方式中，免疫调节剂为或包含抗体或其抗原偶联片段、小分子或多肽。在一些实施方式中，免疫调节剂为或包含特异性结合选自以下中的分子的免疫调节剂：CD25、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28、VISTA、ICOS、ICOS-L、CD27、CD30、STING、CCR4和A2A腺苷受体。在一些实施方式中，免疫调节剂是选自以下：西米单抗(cemiplimab)、纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美单抗(tremelimumab)、IMP31、BMS-986016、乌瑞鲁单抗(urelumab)、TRX518、达西珠单抗(dacetuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、SEQ-CD40、CP-870、CP-893、MED16469、MED14736、MOXR0916、AMP-224和MSB001078C，或为其抗原结合片段。在一些实施方式中，在用偶联物和照射治疗之前，诸如在偶联物给药之前1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周给予免疫调节剂。在一些实施方式中，在用偶联物和照射治疗之后，诸如在偶联物给药之后1周、2周、3周或4周或约1周、2周、3周或4周给予免疫调节剂。在一些实施方式中，在用偶联物和照射治疗之前和之后，诸如以每1周、2周、3周或4周的周期给予免疫调节剂。
在一些实施方式中，抗癌剂为烷基化剂、铂药物、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓朴异构酶抑制剂、有丝***抑制剂、皮质类固醇、蛋白酶体抑制剂、激酶抑制剂、组蛋白-去乙酰酶抑制剂、抗肿瘤剂或其组合。在一些实施方式中，抗癌剂为抗体或其抗原结合片段、小分子或多肽。
在一些实施方式中，抗癌剂是选自以下中的一个或多个：5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸(leukovorin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、伊立替康(irinotecan)、瑞戈非尼(regorafenib)、兹弗-阿柏西普(ziv-afibercept)、卡培他滨(capecitabine)、顺铂、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拓朴替康(toptecan)、卡铂、吉西他滨(gemcitabine)、多烯紫杉醇(docetaxel)、5-FU、异环磷酰胺、丝裂霉素、培美曲塞(pemetrexed)、长春瑞滨(vinorelbine)、卡莫司汀药片(carmustine wager)、替莫唑胺(temozolomide)、甲胺喋呤、卡培他滨、拉帕替尼(lapatinib)、依托泊苷(etoposide)、达拉非尼(dabrafenib)、维罗非尼(vemurafenib)、脂质体阿糖胞苷、阿糖胞苷、干扰素α、埃罗替尼(erlotinib)、长春新碱(vincristine)、环磷酰胺、洛莫司汀(lomusine)、丙卡巴肼(procarbazine)、舒尼替尼(sunitinib)、生长抑素(somastostatin)、小红莓(doxorubicin)、聚乙二醇化脂质体囊封小红莓、表柔比星(epirubicin)、艾日布尔(eribulin)、白蛋白结合太平洋紫杉醇、伊沙匹隆(ixabepilone)、可曲恶唑(cotrimoxazole)、紫杉烷(taxane)、长春碱(vinblastine)、坦罗莫司(temsirolimus)、替莫唑胺、苯达莫司汀(bendamustine)、口服依托泊苷、依维莫司(everolimus)、奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanredtide)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、美司钠(mesna)、帕佐泮尼(pazopanib)、艾日布尔、伊马替尼(imatinib)、瑞戈非尼、索拉非尼(sorafenib)、尼罗替尼(nilotinib)、达沙替尼(dasantinib)、塞内昔布(celecoxib)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、更生霉素(dactinomycin)、西罗莫司(sirolimus)、克唑替尼(crizotinib)、赛尔替尼(certinib)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、乙酸阿比特龙(abiraterone acetate)、米托蒽醌、卡巴他赛(cabazitaxel)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、奥沙利铂、甲酰四氢叶酸、阿法替尼(afatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、吉非替尼(gefitinib)、卡博替尼(cabozantinib)、奥沙利铂(oxoliplatin)和奥洛拉嘧啶(auroropyrimidine)。在一些实施方式中，抗癌剂是选自以下中的一个或多个：贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、伊匹单抗、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、帕妥珠单抗(pertuzumab)、纳武单抗或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗癌剂是选自以下中的一个或多个：拉帕替尼、达拉非尼、维罗非尼、埃罗替尼、舒尼替尼、帕佐泮尼、伊马替尼、瑞戈非尼、索拉非尼、尼罗替尼、达沙替尼、塞内昔布、克唑替尼、赛尔替尼、阿法替尼、阿西替尼(axitinib)、贝伐单抗、博舒替尼(bosutinib)、卡博替尼、阿法替尼、吉非替尼、坦罗莫司、依维莫司、西罗莫司、依鲁替尼(ibrutinib)、伊马替尼、乐伐替尼(lenvatinib)、奥拉帕尼(olaparib)、帕博西尼(palbociclib)、鲁索替尼(ruxolitinib)、曲美替尼(trametinib)、凡德他尼(vandetanib)或维莫德吉(vismodegib)。
VI.定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语、表述和其他技术和科学名词或术语旨在具有与本领域技术人员通常所理解相同的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或便于参考，本文中定义具有通常所理解含义的术语，且本文中包括这些定义不应必然解释为表示与本领域中通常所理解的实质性差异。
除非本文另外明确规定，否则如本文所使用，单数形式“一(a/an)”和“该”包括复数个指示物。举例而言，“一(a/an)”表示“至少一个/种”或“一或多个/种”。应理解，本文所描述的方面和变体包括“由方面和变体组成”和/或“基本上由方面和变体组成”。
在整个本发明中，所要求的主题的各种方面以范围形式呈现。应理解，范围形式中的描述仅为了方便和简洁起见且不应视为对所要求主题的范畴的无弹性限制。因此，范围的描述应视为具有特定公开的所有可能子范围以及该范围内的个别数值。举例而言，在提供值范围的情况下，应理解该范围的上限与下限之间的各中间值和所述范围内的任何其他陈述值或中间值均考虑于所要求的主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括于较小范围内且还考虑于所要求的主题内，在所述范围内受到任何特定排除限制。在所陈述的范围包括限制中的一或两者的情况下，排除所包括限制中的一个或两者的范围还包括于所要求的主题中。不管范围的宽度，此均适用。
如本文所使用，术语“约”是指本领域技术人员易于知晓的各别值的常见误差范围。本文中对“约”一个值或参数的引用包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方式。举例而言，关于“约X”的描述包括“X”的描述。在一些实施方式中，“约一值”为或是指该值的±25％、±10％、±5％、±1％、±0.1％、±0.01％。
如本文所使用，“偶联物”是指直接或间接地连接至一或多个其他分子的多肽，诸如多肽或化学部分。此偶联物包括融合蛋白，通过化学偶联物产生的那些偶联物和通过任何其他方法产生的那些偶联物。举例而言，偶联物可指直接或间接地连接至一或多个其他分子(诸如抗体)的酞菁染料，诸如IR700分子。
如本文所使用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水溶液、非水溶液或其任何组合。
如本文所使用，“医药组合物”或“医药配制物”是指所呈形式准许其中所含活性成分的生物活性有效，且不含对配制物将给予的对象具有不可接受毒性的额外组分的制剂。
如本文所使用，“医药学上可接受的运载体”是指医药配制物中除活性成分以外的对对象无毒的成分。医药学上可接受的运载体包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所使用，“未经修饰的肽”是指在肽内不具有IR700分子偶联至赖氨酸的肽。此类肽不会排除以其他方式经修饰的肽，诸如通过氧化、磷酸化、乙酰化、烷基化、糖基化、失水或不包括IR700分子的其他修饰。
如本文所使用，试剂盒为封装组合，其任选地包括其他要素，诸如额外试剂和组合或其要素的使用说明书。
术语“药品说明书”用以指通常包括于治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗性产品有关的适应症、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。
如本文所使用，“制品(article of manufacture)”为制得的产物，且在一些情况下，其可出售。在一些实施方式中，术语可指包含于封装制品中(诸如容器中)的组合物。
如本文所使用，“疾病或病症”是指生物体中由包括(但不限于)感染、获得性病症、基因病症的病因或病症引起且特征为可鉴别的症状的病理性病症。本文所关注的疾病和病症为可由免疫球蛋白治疗的那些疾病和病症。
如本文所使用，“治疗”患有疾病或病症的对象表示在治疗之后对象的症状部分或完全缓解或保持静态。因此，治疗涵盖预防、疗法和/或治愈。预防是指预防潜在疾病和/或预防症状恶化或疾病进展。
如本文所使用，“治疗”表示改善或以其他方式有益地改变病症、病状或疾病或其他适应症的症状的任何方式。
如本文所使用，“治疗效果”表示由治疗对象产生的改变、通常改良或改善疾病或病症的症状或治愈疾病或病症的作用。
如本文所使用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指含有至少足以产生治疗效果的化合物的药剂、化合物、材料或组合物的量。因此，其为预防、治愈、改善、遏制或部分遏制疾病或病症的症状所需的量。
如本文所使用，通过治疗，诸如通过给予医药组合物或其他治疗剂来改善特定疾病或病症的症状是指可归因于组合物或治疗剂的给予或与其相关的任何症状减轻，不论永久性还是暂时性、持续或短暂的。
如本文所使用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物，诸如人类。
如本文所使用，“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可能发生或不发生，且描述包括其中该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形未发生的情况。举例而言，任选地经取代的基团表示该基团未经取代或经取代。
如本文所使用，术语“实质上”是指高程度的相似性。在一些实施方式中，实质上可指几乎全部或完全，诸如至少85％、90％、95％、99％、99.9％或99.99％完全。举例而言，在一些实施方式中，若药剂称为实质上处于一状态，则至少85％、90％、95％、99％、99.9％或99.99％的药剂处于该状态。
本申请案中所提及的所有公开案(包括专利文献、科学论文和数据库)出于所有目的均以全文引用的方式并入本文中，其引用的程度如同各个别公开案以引用的方式个别地并入一般。若本文所述的定义与以引用方式并入本文中的专利、申请案、公开申请案和其他公开案中所述的定义相反或另外不相同，则以本文所述的定义为准，而非以以引用的方式并入本文中的定义为准。
VII.例示性实施方式
在实施方式中，本文提供：
1.一种偶联物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗，其中至少一个IR700染料分子连接至西妥昔单抗的轻链中的赖氨酸(K)。
2.如实施方式1的偶联物，其中至少一个IR700染料分子在选自下组的位置处连接至赖氨酸：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207。
3.如实施方式1或实施方式2的偶联物，其中至少一个IR700染料分子连接至轻链中的K145。
4.如实施方式1至3中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条轻链中的两个或更多个赖氨酸位置处连接至IR700染料。
5.如实施方式1至4中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条轻链中的K145处连接至IR700染料。
6.如实施方式1至5中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的轻链中的K145处和西妥昔单抗的轻链或重链中的至少一个其他赖氨酸位置处连接至IR700染料。
7.一种偶联物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗，其中至少一个IR700染料分子连接至西妥昔单抗的重链中的赖氨酸(K)。
8.如实施方式7的偶联物，其中至少一个IR700染料分子在选自下组的位置处连接至赖氨酸：重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。
9.如实施方式7或实施方式8的偶联物，其中至少一个IR700染料分子在选自下组的位置处连接至赖氨酸：重链中的K215、K292、K336、K416和K449。
10.如实施方式7至9中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条重链中的两个或更多个赖氨酸位置处连接至IR700染料。
11.如实施方式7至10中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条重链中的三个或更多个赖氨酸位置处连接至IR700染料。
12.如实施方式7至11中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416和/或K449处连接至IR700染料。
13.如实施方式7至12中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的重链中的K215、K292、K336、K416和/或K449处和西妥昔单抗的轻链或重链中的至少一个其他赖氨酸位置处连接至IR700染料。
14.如实施方式7至13中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条轻链中的K145处连接至IR700染料。
15.一种偶联物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗，其中至少一个IR700染料分子连接至西妥昔单抗的轻链中的赖氨酸(K)，且至少一个IR700染料分子连接至西妥昔单抗的重链中的赖氨酸(K)。
16.如实施方式15的偶联物，其中轻链中的赖氨酸是选自下组：K107、K145、K188、K190和K207。
17.如实施方式15或实施方式16的偶联物，其中重链中的赖氨酸是选自下组：K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。
18.如实施方式15至17中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条轻链中的K145处连接至IR700染料。
19.如实施方式15至18中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416和/或K449处连接至IR700染料。
20.如实施方式15至19中任一项的偶联物，其中西妥昔单抗在西妥昔单抗的一条或两条轻链中的K145处和在西妥昔单抗的一条或两条重链中的K215、K292、K416和K449处连接至IR700染料。
21.如实施方式1至20中任一项的偶联物，其中IR700染料分子与西妥昔单抗的比率为1∶1、2∶1、3∶1或4∶1。
22.如实施方式1至21中任一项的偶联物，其中偶联物能够通过波长在约600nm与约850nm(例如，690nm±50nm)之间的照射而经活化且由此获取细胞杀伤活性。
23.一种组合物，其包含如实施方式1至22中任一项的偶联物和医药学上可接受的赋形剂。
24.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的轻链中的赖氨酸(K)的IR700染料分子。
25.如实施方式24的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条轻链中的K107、K145、K188、K190和/或K207的IR700染料分子。
26.如实施方式24或实施方式25的组合物，其中在群体中，偶联至IR700染料的主要轻链赖氨酸位置为K145。
27.如实施方式24至26中任一项的组合物，其中当西妥昔单抗分子通过改性质谱法分析时，在轻链K145处含有IR700染料偶联的肽可比含有偶联至其他轻链赖氨酸位置的IR700染料的肽更丰富。
28.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的重链中的赖氨酸(K)的IR700染料分子。
29.如实施方式28的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和/或K449的IR700染料分子。
30.如实施方式28或实施方式29的组合物，其中在群体中，偶联至IR700染料的主要重链赖氨酸位置为K215、K292、K336、K416和K449中的一个或多个。
31.如实施方式28至30中任一项的组合物，其中当西妥昔单抗分子通过质谱法分析时，在重链K215、K292、K336、K416或K449处含有IR700染料偶联的肽比含有偶联至其他重链赖氨酸位置的IR700染料的肽更丰富。
32.如实施方式28至31中任一项的组合物，其中至少70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条重链中的两个或更多个赖氨酸的IR700染料分子。
33.如实施方式24至32中任一项的组合物，其中不超过约20％的西妥昔单抗分子与IR700染料未偶联。
34.如实施方式33的组合物，其中小于10％的西妥昔单抗分子与IR700染料未偶联，且/或游离染料在组合物中的百分比小于3％。
35.如实施方式24至34中任一项的组合物，其中组合物中的IR700染料分子与群体中的西妥昔单抗分子的比率为约2∶1、约2.5∶1或约3∶1。
36.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的轻链或重链中的赖氨酸(K)的IR700染料分子。
37.如实施方式36的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条轻链中的K107、K145、K188、K190和/或K207或连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和/或K449的IR700染料分子。
38.如实施方式37的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条轻链中的K145或连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416或K449的IR700染料分子。
39.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的轻链中的赖氨酸(K)的IR700染料分子和至少一个连接至各西妥昔单抗分子的重链中的赖氨酸的IR700染料分子。
40.如实施方式39的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条轻链中的K107、K145、K188、K190和/或K207的酞菁IR700染料分子和至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和/或K449的IR700染料分子。
41.如实施方式40的组合物，其中至少50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条轻链中的K145的酞菁IR700染料分子和至少一个连接至各西妥昔单抗分子的一条或两条重链中的K215、K292、K336、K416或K449的IR700染料分子。
42.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中不超过约20％的西妥昔单抗分子在西妥昔单抗分子的轻链或重链中的赖氨酸(K)处与IR700染料未偶联。
43.如实施方式42的组合物，其中小于15％的西妥昔单抗分子与IR700染料未偶联。
44.如实施方式43的组合物，其中小于10％的西妥昔单抗分子与IR700染料未偶联。
45.如实施方式42至44中任一项的组合物，其中组合物中的游离染料在组合物中的所有染料分子中的百分比小于约3％、小于约2％、小于约1％或小于约0.5％。
46.如实施方式42至45中任一项的组合物，其中组合物中的IR700染料分子与群体中的西妥昔单抗分子的比率为约2∶1、约2.5∶1或约3∶1。
47.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中一或多个西妥昔单抗分子在一或多个西妥昔单抗分子的轻链或重链中的赖氨酸(K)处与IR700染料偶联，组合物中的IR700染料分子与群体中的西妥昔单抗分子的比率为约2∶1、约2.5∶1或约3∶1，小于10％的西妥昔单抗分子与IR700染料未偶联，且组合物中的游离染料在组合物中的所有染料分子中的百分比小于约0.5％。
48.一种组合物，其包含SEQ ID NO：1，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145偶联至IR700染料。
49.一种组合物，其包含SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449偶联至IR700染料。
50.一种组合物，其包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145偶联至IR700染料且SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449偶联至IR700染料。
51.如实施方式50的组合物，其在相同分子中包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145偶联至IR700染料且SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449偶联至IR700染料。
52.如实施方式50或实施方式51的组合物，其在不同分子中包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其中SEQ ID NO：1的赖氨酸145偶联至IR700染料且SEQ ID NO：2的赖氨酸215、赖氨酸292、赖氨酸416和/或赖氨酸449偶联至IR700染料。
53.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中小于15％的西妥昔单抗分子与IR700染料未偶联，组合物包含小于3％游离IR700染料，且游离染料在组合物中的百分比在储存约6个月之后实质上未改变。
54.一种组合物，其包含与IR700染料偶联的西妥昔单抗分子的群体，其中组合物包含小于或小于约0.6％、小于或小于约0.5％、小于或小于约0.4％，或小于或小于约0.3％游离染料。
55.如实施方式54的组合物，其中组合物包含至少或至少约95％、96％、97％或98％单体。
56.如实施方式55的组合物，其中组合物包含小于或小于约5％、4％或3％高分子量物质。
57.如实施方式54至56中任一项的组合物，其中组合物包含小于或小于约30％、20％、25％、20％、15％或10％未偶联抗体。
58.如实施方式54至57中任一项的组合物，其中在暗处或少光条件下储存组合物6个月之后，游离染料的百分比实质上未改变。
59.如实施方式53至58中任一项的组合物，其中至少70％、80％、90％或大于90％的西妥昔单抗分子具有至少一个IR700染料分子偶联至各西妥昔单抗分子的轻链中的赖氨酸(K)。
60.如实施方式59的组合物，其中在群体中，偶联至IR700染料的主要轻链赖氨酸位置为K145。
61.如实施方式53至60中任一项的组合物，其中至少70％、80％、90％或大于90％的群体具有至少一个IR700染料分子偶联至各西妥昔单抗分子的重链中的赖氨酸(K)。
62.如实施方式61的组合物，其中在群体中，偶联至IR700染料的主要重链赖氨酸位置为K215、K292、K336、K416和K449中的一个或多个。
63.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中约9％与约10％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽。
64.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中约9％与约11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽。
65.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中约9％与约11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽。
66.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中约10％与约12％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽。
67.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中约7％与约9％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700染料偶联的肽。
68.一种组合物，其包含西妥昔单抗分子的群体，其中：约9％与约10％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在轻链赖氨酸145(K145)处含有IR700染料偶联的肽；约9％与约11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸215(K215)处含有IR700染料偶联的肽；约9％与约11％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸292(K292)处含有IR700染料偶联的肽；约10％与约12％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸416(K416)处含有IR700染料偶联的肽；约7％与约9％之间的通过质谱法分析西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸449(K449)处含有IR700染料偶联的肽；和/或约5％与约7％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸336(K336)处含有IR700染料偶联的肽。
69.如实施方式63至68中任一项的组合物，其中：约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在轻链赖氨酸107(K107)处含有IR700染料偶联的肽；约1％与3％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在轻链赖氨酸188(K188)处含有IR700染料偶联的肽；约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在轻链赖氨酸190(K190)处含有IR700染料偶联的肽；约1％与3％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在轻链赖氨酸207(K207)处含有IR700染料偶联的肽；约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸5(K5)处含有IR700染料偶联的肽；约3％与4％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸75(K75)处含有IR700染料偶联的肽；约1％与2％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸248(K248)处含有IR700染料偶联的肽；和/或约1％与2％之间的通过质谱法分析的西妥昔单抗分子的总肽为在重链赖氨酸328(K328)处含有IR700染料偶联的肽。
70.一种组合物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中：在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸215(K215)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸292(K292)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在轻链中的赖氨酸145(K145)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
71.一种组合物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中：在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸292(K292)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链中的赖氨酸215(K215)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
72.一种组合物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中：在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸336(K336)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链中的赖氨酸292(K292)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
73.一种组合物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中：在重链中的赖氨酸336(K336)与重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1；和/或在重链中的赖氨酸336(K336)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
74.一种组合物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中在重链中的赖氨酸416(K416)与重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约2∶1至约1∶2，任选地约1∶1。
75.一种组合物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中在轻链中的赖氨酸145(K145)、重链中的赖氨酸215(K215)、重链中的赖氨酸292(K292)和重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约1∶1∶1∶1。
76.一种组合物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中在轻链中的赖氨酸145(K145)、重链中的赖氨酸215(K215)、重链中的赖氨酸292(K292)、重链中的赖氨酸336(K336)、重链中的赖氨酸416(K416)和重链中的赖氨酸449(K449)位置之间，偶联至赖氨酸的IR700染料在西妥昔单抗分子的群体中的比率为约1∶1∶1∶1∶1∶1。
77.如实施方式71至76中任一项的组合物，其中比率通过质谱法量测。
78.一种杀死肿瘤或癌细胞的方法，其包含：在或接近肿瘤或癌细胞的部位给予包含如实施方式1至77中任一项的偶联物或组合物的医药组合物；和在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近肿瘤细胞的区域，由此杀死肿瘤或癌细胞。
79.一种治疗对象中的疾病或病症(例如肿瘤或癌症)的方法，其包含：向对象给予包含如实施方式1至78中任一项的偶联物或组合物的医药组合物；和在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近对象中的病灶(例如，由肿瘤或癌症所导致的病灶)的区域，由此治疗疾病或病症。
80.如实施方式78或实施方式79的方法，其进一步包含在给予步骤之前提供医药组合物。
81.如实施方式78至80中任一项的方法，其中照射步骤是在690±50nm的波长或在或约690±20nm的波长进行。
82.如实施方式78至81中任一项的方法，其中照射步骤是在约690nm的波长进行。
83.如实施方式78至82中任一项的方法，其中肿瘤为膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、***癌、子***、食道癌或头颈癌。
84.如实施方式78至83中任一项的方法，其中癌症位于头颈部、***、肝脏、结肠、卵巢、***、胰腺、大脑、子宫颈、骨、皮肤、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺。
85.如实施方式78至84中任一项的方法，其中癌症为位于头颈部的癌症。
86.一种制造稳定偶联物的方法，其包含：a)使西妥昔单抗与IR700染料在产生偶联物的条件下接触，该偶联物包含连接至一或多个选自下组的西妥昔单抗的赖氨酸的IR700染料：K145(轻链)、K215(重链)、K292(重链)、K336(重链)、K416(重链)和K449(重链)；b)使偶联物在偶联期间和/或之后经受一个步骤，该步骤实质上减少与西妥昔单抗非特异性结合的IR700染料；c)在医药学上可接受的缓冲液中配制偶联物，其中在步骤a)至c)中的每一个中，染料和偶联物曝露的唯一光具有在约400nm至约650nm范围内的波长或具有小于500勒克斯的强度。
87.如实施方式86的方法，其中步骤b)包含使偶联物经受淬灭反应。
88.如实施方式86或实施方式87的方法，其中步骤b)包含在完成IR700染料与西妥昔单抗之间的偶联反应之后，使偶联物经甘氨酸淬灭反应。
89.如实施方式88的方法，其中淬灭反应进行过夜或大于约6小时的持续时间。
90.一种稳定偶联物，其由如实施方式86至89中的任一种的方法制造。
91.如实施方式90的稳定偶联物，其包含偶联至IR700染料的西妥昔单抗分子的群体，其中在轻链中的赖氨酸145(K145)、重链中的赖氨酸215(K215)、重链中的赖氨酸292(K292)和重链中的赖氨酸416(K416)位置之间，偶联至西妥昔单抗分子的赖氨酸的IR700染料在群体中的比率为约1∶1∶1∶1。
92.一种偶联物，其包含至少两个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少两个赖氨酸(K)位置，且其中至少两个赖氨酸位置独立地选自下组：对应于西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)。
93.如实施方式92的偶联物，其包含至少三个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少三个赖氨酸位置。
94.如实施方式93的偶联物，其中至少三个赖氨酸位置独立地选自下组：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207及重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。
95.如实施方式92至94中任一项的偶联物，其中偶联至IR700的赖氨酸位置中的至少一个是选自下组：轻链中的K145或重链中的K215、K416或K449。
96.如实施方式92至95中任一项的偶联物，其中至少一个IR700分子偶联至轻链中的赖氨酸，且至少一个IR700分子偶联至重链中的赖氨酸。
97.如实施方式92至96中任一项的偶联物，其中偶联物能够通过波长在690nm±50nm之间的光照射而经活化且由此在偶联物结合至细胞表面上的表位时展现细胞杀伤活性。
98.一种组合物，其包含如实施方式92至97中任一项的偶联物和医药学上可接受的赋形剂。
99.一种组合物，其包含偶联物的群体，其中群体中的偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的偶联物包含至少两个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少两个赖氨酸(K)位置，且其中两个赖氨酸位置独立地选自下组：对应于西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)。
100.如实施方式98或99的组合物，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的偶联物包含至少三个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少三个赖氨酸位置。
101.如实施方式100的组合物，其中至少三个赖氨酸位置独立地选自下组：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207及重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。
102.如实施方式98至101中任一项的组合物，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的偶联物包含至少一个IR700分子偶联至轻链中的K145或重链中的K215、K416或K449。
103.如实施方式98至102中任一项的组合物，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的偶联物包含IR700分子偶联至轻链中的K145和IR700分子偶联至重链中的K215、K416或K449中的至少一个。
104.如实施方式98至103中任一项的组合物，其中IR700分子与西妥昔单抗的比率在约2∶1至约4∶1之间。
105.如实施方式98至104中任一项的组合物，其中IR700分子与西妥昔单抗的比率为约2.5∶1、2.6∶1、2.7∶1、2.8∶1、2.9∶1、3.0∶1、3.1∶1、3.2∶1、3.3∶1或3.4∶1。
106.如实施方式98至104中任一项的组合物，其中IR700分子与西妥昔单抗的比率在约2.7∶1至约3.2∶1之间。
107.如实施方式98至106中任一项的组合物，其中组合物中不超过或不超过约15％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联。
108.如实施方式98至107中任一项的组合物，其中组合物中小于或小于约10％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联。
109.如实施方式98至108中任一项的组合物，其中游离染料在组合物中的百分比小于或小于约3％、小于或小于约2％、小于或小于约1％或小于或小于约0.5％。
110.一种组合物，其包含西妥昔单抗-IR700偶联物的群体，其中组合物中多种偶联物各包含IR700偶联至西妥昔单抗于西妥昔单抗的轻链或重链中选自下组的赖氨酸(K)：对应于西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)，且组合物包含以下特征：
(a)组合物中的IR700分子与群体中的西妥昔单抗分子的比率在约2∶1与约3∶5之间，
(b)小于或小于约10％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联，和
(c)组合物中的游离染料在组合物中的所有染料分子中的百分比小于或小于约3％。
111.如实施方式110的组合物，其中多种偶联物包含西妥昔单抗在轻链的K145与IR700偶联。
112.如实施方式110或111的组合物，其中多种偶联物包含西妥昔单抗在重链的K215、K416或K449与IR700偶联。
113.如实施方式110至112中任一项的组合物，其中多种偶联物包含西妥昔单抗与至少三个IR700分子偶联。
114.如实施方式110至113中任一项的组合物，其中多种偶联物包含组合物中的至少或至少约51％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％或至少或至少约80％的偶联物。
115.如实施方式110至114中任一项的组合物，其中游离染料在组合物中的百分比小于或小于约2％、小于或小于约1％或小于或小于约0.5％。
116.如实施方式98至115中任一项的组合物，其中西妥昔单抗包含SEQ ID NO：1中所述的重链序列、SEQ ID NO：2中所述的轻链序列或其组合。
117.如实施方式98至116中任一项的组合物，其中在暗处或少光条件下储存6个月之后，游离染料在组合物中的百分比实质上未改变。
118.如实施方式98至117中任一项的组合物，其中组合物包含至少或至少约95％、96％、97％或98％单体形式的偶联物。
119.如实施方式98至118中任一项的组合物，其中组合物包含小于或小于约5％、4％或3％高分子量物质。
120.一种杀死肿瘤或癌细胞的方法，该方法包含：
在或接近肿瘤或癌细胞的部位给予包含如实施方式92至119中任一项的偶联物或组合物的医药组合物；和
在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近肿瘤或癌细胞的区域，由此杀死肿瘤或癌细胞。
121.一种治疗对象中的疾病或病症的方法，该方法包含：
在或接近肿瘤或癌细胞的部位给予包含如实施方式92至119中任一项的偶联物或组合物的医药组合物；和
在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近对象的病灶或肿瘤的区域，由此治疗疾病或病症。
122.如实施方式120或121的方法，其中照射步骤是在690±50nm的波长或约690±20nm的波长进行。
123.如实施方式122的方法，其中照射步骤是在约690nm的波长进行。
124.如实施方式121至123中任一项的方法，其中疾病或病症为肿瘤或癌症。
125.如实施方式120至124中任一项的方法，其中肿瘤或癌细胞包含或疾病或病症为以下肿瘤：膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、***癌、子***、食道癌或头颈癌。
126.如实施方式120至124中任一项的方法，其中肿瘤或癌细胞包含或疾病或病症为位于以下的癌症：头颈部、***、肝脏、结肠、卵巢、***、胰腺、大脑、子宫颈、骨、皮肤、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺。
127.如实施方式126的方法，其中癌症为头颈癌。
128.一种制造稳定偶联物的方法，该方法包含：
a)使西妥昔单抗与IR700在产生西妥昔单抗-IR700偶联物的条件下接触，其中偶联物包含至少两个偶联至IR700的赖氨酸(K)位置，该至少两个赖氨酸(K)位置独立地选自下组：对应于西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)；
b)使偶联物在偶联期间和/或之后经受一个步骤，该步骤实质上减少与西妥昔单抗非特异性结合的IR700；和
c)在医药学上可接受的缓冲液中配制偶联物，
其中在步骤a)至c)中的每一个中，染料和偶联物曝露的唯一光具有在约400nm至约650nm范围内的波长或具有小于或小于约500勒克斯的强度。
129.如实施方式128的方法，其中步骤b)包含在完成IR700与西妥昔单抗之间的偶联反应之后，使偶联物经甘氨酸淬灭反应。
130.如实施方式129的方法，其中淬灭反应进行过夜或大于或大于约6小时的持续时间。
131.一种稳定偶联物，其由如实施方式128至130中任一项的方法制造。
132.一种组合物，其包含多种偶联物，其中偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中组合物经胰蛋白酶消化产生包含以下肽的群体：
a)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)；
b)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)；
c)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)；和
d)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)。
133.如实施方式132的组合物，其中肽的群体进一步包含：
e)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)；和
f)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)。
134.如实施方式132或133的组合物，其中肽的群体进一步包含：
g)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)；
h)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)；
i)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)；和
j)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)。
135.如实施方式132至134中任一项的组合物，其中肽的群体进一步包含以下中的一个或多个：
k)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)；
l)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)；
m)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)；和
n)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)。
136.一种组合物，其包含多种偶联物，其中偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中组合物经胰蛋白酶消化产生包含以下肽的群体：
a)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)；
b)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)；
c)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)；
d)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)；
e)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)；
f)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)；
g)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)；
h)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)；
i)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)；
j)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)；
k)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)；
l)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)；
m)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)；和
n)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)。
137.如实施方式132至136中任一项的组合物，其中肽通过正离子模式质谱法来检测。
138.如实施方式137的组合物，其中当针对由正离子模式质谱法检测的肽产生提取离子层析图(EIC)时：
对应于a)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于a)的肽的EIC峰积分面积的总和的3％或约3％与5％或约5％之间；
对应于b)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于b)的肽的EIC峰积分面积的总和的3％或约3％与5％或约5％之间；
对应于c)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于c)的肽的EIC峰积分面积的总和的8％或约8％与11％或约11％之间；
对应于d)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于d)的肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与2.5％或约2.5％之间；
对应于e)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于e)的肽的EIC峰积分面积的总和的8％或约8％与12％或约12％之间；
对应于f)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于f)的肽的EIC峰积分面积的总和的0.2％或约0.2％与2.5％或约2.5％之间；
对应于g)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于g)的肽的EIC峰积分面积的总和的4.5％或约4.5％与7％或约7％之间；
对应于h)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于h)的肽的EIC峰积分面积的总和的9.5％或约9.5％与13％或约13％之间；
对应于i)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于i)的肽的EIC峰积分面积的总和的6％或约6％与10％或约10％之间；
对应于j)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于j)的肽的EIC峰积分面积的总和的2％或约2％与5％或约5％之间；
对应于k)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于k)的肽的EIC峰积分面积的总和的7％或约7％与11％或约11％之间；
对应于l)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于l)的肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间；
对应于m)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于m)的肽的EIC峰积分面积的总和的1.5％或约1.5％与5％或约5％之间；和
对应于n)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于n)的肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间。
139.如实施方式138的组合物，其中：
对应于a)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于a)的肽的EIC峰积分面积的总和的约3.8±1％；
对应于b)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于b)的肽的EIC峰积分面积的总和的约3.5±1％；
对应于c)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于c)的肽的EIC峰积分面积的总和的约10.0±1％；
对应于d)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于d)的肽的EIC峰积分面积的总和的约1.7±1％；
对应于e)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于e)的肽的EIC峰积分面积的总和的约10.2±1％；
对应于f)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于f)的肽的EIC峰积分面积的总和的约1.3±1％；
对应于g)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于g)的肽的EIC峰积分面积的总和的约5.9±1％；
对应于h)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于h)的肽的EIC峰积分面积的总和的约11.2±1％；
对应于i)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于i)的肽的EIC峰积分面积的总和的约7.6±1％；
对应于j)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于j)的肽的EIC峰积分面积的总和的约3.4±1％；
对应于k)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于k)的肽的EIC峰积分面积的总和的约9.3±1％；
对应于l)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于l)的肽的EIC峰积分面积的总和的约2.1±1％；
对应于m)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于m)的肽的EIC峰积分面积的总和的约3.5±1％；和
对应于n)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于n)的肽的EIC峰积分面积的总和的约2.0±1％。
140.如实施方式132至139中任一项的组合物，其中：
a)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-38；
b)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸72-81；
c)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸213-216；
d)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸225-250；
e)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸291-294；
f)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸325-336；
g)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸329-340；
h)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸412-418；
i)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的氨基酸442-449；
j)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸104-108；
k)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸143-149；
l)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸184-190；
m)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸189-207；和
n)的肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸191-211。
141.一种组合物，其包含多种偶联物，其中偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，且其中组合物的胰蛋白酶消化产生肽，这些肽产生包含对应于以下的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8％。
142.如实施方式141的组合物，其中组合物的胰蛋白酶消化进一步产生包含对应于以下中的一个或多个的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约5％；和/或
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约3.5％。
143.如实施方式141或142的组合物，其中组合物的胰蛋白酶消化进一步产生包含对应于以下中的一个或多个的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2％；和/或
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％。
144.一种组合物，其包含多种偶联物，其中偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，且其中组合物的胰蛋白酶消化产生肽，这些肽产生包含对应于以下的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；和/或
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约4.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约7％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约1％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；和
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约1％。
145.如实施方式141至144中任一项的组合物，其中：
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.8±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.0±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.7±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.2±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.3±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约5.9±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约11.2±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，偶联的EIC峰的面积百分比为约7.6±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.4±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约9.3±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2.1±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；和
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2±1％。
146.如实施方式141至145中任一项的组合物，其中包含IR700分子偶联至赖氨酸的肽包含一或多个选自以下中的氨基酸序列：
对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-38、氨基酸72-81、氨基酸213-216、氨基酸225-250、氨基酸291-294、氨基酸325-336、氨基酸329-340、氨基酸412-418和氨基酸442-449的氨基酸序列，
对应于SEQ ID NO：2的氨基酸104-108、氨基酸143-149、氨基酸184-190、氨基酸189-207和氨基酸191-211的氨基酸序列。
VIII.实施例
以下实施例仅出于说明目的而包括在内，且并不旨在限制本发明的范畴。
实施例1：产生西妥昔单抗-IR700偶联物
在此实施例中，西妥昔单抗-IR700偶联物使用限制染料和偶联物曝露于光的方法来产生，此是由于染料的光敏性，包括在制造设备中使用波长为425至575nm且强度小于200勒克斯的低水平的绿光。以下缓冲液用于偶联：偶联缓冲液(100mM磷酸钠，pH 8.65)、淬灭缓冲液(1.0M甘氨酸，pH 9)和最终磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制物缓冲液：(5.60mM Na2HPO4，1.058mM KH2PO4，154mM NaCl，pH 7.1)。
A.制备染料和西妥昔单抗
1.制备西妥昔单抗
在偶联之前，将西妥昔单抗经由0.5/0.2μm PES Millipore SHC过滤器过滤，汇集且储存在2-8℃下。
接着通过超滤/透滤(UF/DF)进行浓缩和缓冲液交换步骤。UF/DF装置经清洁且用100mM磷酸钠，pH 8.65缓冲液平衡。在UF/DF操作之前，通过在25℃下将其置放于孵育箱中120至150min来升温经汇集过滤的西妥昔单抗。首先将材料浓缩至17至20g/L的目标浓度且接着透滤至PBS pH 7.1±0.2缓冲液中。测定经透滤西妥昔单抗产物浓度且接着将其调节至30至38g/L的目标浓度。将所得溶液经由0.5/0.2μm PES Millipore SHC过滤器过滤，最终浓度为20至40g/L。在偶联之前，将抗体溶液在100mM磷酸钠pH 8.65±0.15缓冲液中调节至10g/L的浓度，最终目标pH为8.0至8.6。
2.制备染料
在偶联之前，IRDye 700DX NHS酯(染料；目录号929-70011；Li-COR，Lincoln，NE)通过在无水DMSO中将其溶解至10mg/mL的浓度来制备。步骤在绿光(例如，波长为425至575nm且强度小于200勒克斯)下进行以保护染料免受由染料强烈吸收的光波长的影响。
B.偶联
偶联和淬灭步骤在含有经透滤西妥昔单抗的容器或槽中进行，包覆在铝箔或类似材料中用于避光。步骤在室温下在绿光(例如，波长为425至575nm且强度小于200勒克斯)下进行以保护偶联物免于光降解。
在DMSO中，以4∶1(IRDye 700DX NHS酯：西妥昔单抗)的最终摩尔比与IRDye 700DXNHS酯进行偶联反应，以实现每一西妥昔单抗分子偶联约2至3个染料残基。将IRDye 700DXNHS酯添加至含有西妥昔单抗的酸瓶中且在搅拌盘上混合10至15min。接着通过将容器置放于25℃孵育箱(范围23至27℃)中来进行偶联反应60至90min。
通过与1.0M甘氨酸pH 9.0±0.2混合至20mM甘氨酸的最终目标浓度来淬灭偶联反应物。将容器在25℃(范围23至27℃)下再孵育16至24小时。
进行最终UF/DF步骤以将偶联产物交换至最终PBS配制物缓冲液中。将经淬灭偶联物转移至UF/DF***且首先浓缩至9至11g/L，随后用8至12透滤体积(diavolume)的10mM磷酸钠pH 7.1±0.2进行透滤。测定蛋白浓度且若需要，进一步进行缓冲液稀释以达至9至11g/L的最终目标产物浓度。
经由0.5/0.2μm PES Millipore SHC过滤器进行过滤且西妥昔单抗-IR700偶联物在2至8℃下在黑暗中储存于覆盖有铝箔的容器中以保护内容物免受光照。在室温下在绿光下进行这些步骤以保护西妥昔单抗-IR700偶联物。将偶联物在10mM磷酸钠Ph 7.1±0.2中稀释至6.7g/L的浓度。接着在4倍浓缩赋形剂缓冲液：10mM磷酸钠、36％海藻糖、0.06％PS-80pH 7.1±0.2(w/v)、0.5至0.8mg/mL聚山梨醇酯-80中将此偶联物溶液稀释至5g/L的浓度。使用0.2μm PVDF Millipore Durapore过滤器进行最终过滤步骤且所得偶联物在10mM磷酸钠、9％海藻糖、0.02％聚山梨醇酯-80，pH 7.1±0.2中配制为5g/L。
将所得偶联物提供用于SEC-HPLC分析以测定浓度、染料与抗体比(DAR)、相同性和纯度且测定外观、pH、生物负荷和内毒素含量。
实施例2：西妥昔单抗-IR700偶联物的偶联位置的图谱绘制(Mapping)
A.通过肽谱(Peptide Mapping)分析IR700位点占用
在变性缓冲液(6M胍-HCl，0.1M tris pH 8.0)中使用DTT来还原西妥昔单抗-IR700偶联物，随后用碘乙酰胺烷基化。将经还原和烷基化的样本脱盐至胰蛋白酶消化缓冲液(25mM tris，10mM氯化钙pH7.5)中且用蛋白酶以1∶20(蛋白酶：蛋白质)的比率处理且在37℃下孵育过夜。为确定IR700偶联的位点，将经胰蛋白酶消化的样本用1％TFA处理且在37℃下再加热两小时。在表E1中所概述的条件下，经TFA处理的样本通过在C18管柱(Waters)上用220nm和690nm检测和MS检测进行RP-HPLC分析来分析。
表E1：
在690nm下分析IR700偶联且通过质谱法以正离子模式确认。IR700偶联的定量通过积分与偶联肽和未经修饰肽相关的提取离子层析图峰来测定，使用下式以确定偶联量：
在三个单独生产的偶联物批次中定位IR700染料在西妥昔单抗的轻链和重链上的偶联位置，且所选择的偶联肽和对应的未经修饰的肽的结果、滞留时间(RT)和质量(m/z)如表E2(轻链)和表E3(重链)所显示。
表E2：
表E3：
B.强阴离子交换(SAX)HPLC的未偶联抗体
强阴离子交换(SAX)HPLC用于基于电荷分离样本中的组分。西妥昔单抗与IRDye700 DX(IR700)之间的偶联改变抗体的电荷，使得偶联和未偶联的抗体组分具有不同的电荷分布。出于此原因，SAX柱用于将这两个组分彼此分离且测量原料药物质(bulk drugsubstance)和药品中未偶联抗体的含量。含量报导为相对于总峰面积的面积百分比。通过280nm处的吸光度进行检测，以690nm的吸光度进行校正。此例示性方法用于释放和稳定性测试。
在表E4中所显示的条件下，将样本用低导电性缓冲液稀释且施加至SAX HPLC柱上。IR700染料的显著电荷贡献通过SAX-HPLC提供未偶联西妥昔单抗抗体与IR700-偶联物的分解。如表E5中所显示，在不同批次中，未偶联抗体的百分比介于4.6％至7.1％之间。
表E4：
表E5：
| 西妥昔单抗-IR700偶联物样本 | 未偶联抗体％ |
| 第1批，350g规模 | 6.9％ |
| 第2批，350g规模 | 7.1％ |
| 第3批，2kg规模 | 4.6％ |
实施例3：评估西妥昔单抗-IR700偶联物
与参考标准相比，测试西妥昔单抗-IR700偶联物批次的EGFR结合和光免疫疗法(PIT)活性。
A.EGFR结合
针对上文实施例2中所描述的三个批次的偶联物中的每一个，通过ELISA测量相对于参考标准，西妥昔单抗-IR700偶联物与人类表皮生长因子受体(EGFR)的结合。与参考标准相比，偶联物分别展现103％、97％和101％的相对EGFR结合。
B.PIT
将BxPC3细胞接种于微量滴定板中，使一些孔无细胞(对照物)。使细胞黏附至微量滴定板，在37℃，5％CO2下过夜孵育。将西妥昔单抗-IR700偶联物的参考材料和样本连续稀释且施加于板的孔中的细胞。将完整的细胞培养基添加至无细胞孔中。在37℃，5％CO2下孵育一小时之后，以150mW/cm2的功率密度用690nm光照射微量滴定板，改变曝露时间以获得所需光通量(J/cm2)。在曝光后，将含有经光处理的细胞的微量滴定盘在37℃，5％CO2下孵育22+/-2小时。在过夜孵育后，通过添加荧光细胞存活率试剂(CellTiter-Glo 2.0)来测定细胞存活率。不同批次的基于细胞的光免疫疗法(PIT)分析的结果显示于图1中，且批次中的每一个的相对效能显示于下表E6中。收集原始荧光单位且绘制为4参数逻辑曲线，表明样本相对于参考标准的细胞杀伤活性。
表E6：
| 西妥昔单抗-IR700偶联物样本 | 相对效能％ |
| 第1批，350g规模 | 95％ |
| 第2批，350g规模 | 88％ |
| 第3批，2kg规模 | 91％ |
实施例4：通过西妥昔单抗-IR700偶联物的尺寸排阻(SEC)HPLC来测量残余游离IR700
SEC-HPLC用以基于分子量和流体动力比来分级分离样本。在等度条件下进行该方法。通过在690nm(A690)和280(A280)nm处的吸光度进行染料的检测，且含量报导为相对于总峰面积的面积百分比。两种波长的使用允许评估相同性(在A690下)、产物浓度(在A280下，具有背景校正)、纯度和杂质含量(在A690和A280下)、游离IR700含量(在A690下)和染料与抗体比(DAR；A690和A280)。这与表明稳定性的测量相关，这是因为曝露于光的样本中发生高分子量物质的增加和主峰定量的减少。该方法用于在表E7中所显示的条件下评估3批偶联物(第1批至第3批)，且结果显示于图2中，其中蓝色迹线指示批号1的西妥昔单抗-IR700偶联物，红色迹线指示批号2的西妥昔单抗-IR700偶联物且绿色迹线指示批号3的西妥昔单抗-IR700偶联物。该方法可用于原料药物质和药品的释放和稳定性测试。
表E7：
| 方法参数 | 条件/要求 |
| 移动相 | 磷酸盐缓冲盐水，pH 7.1 |
| 流速 | 0.5mL/min |
| 柱 | Shodex Protein KW-803 |
| 标称柱负荷 | 100μg |
| 检测器波长 | 280nm和690nm |
| 运行时间 | 20min |
| 洗脱模式 | 等度 |
| 温度 | 25±2℃ |
| 自动取样器温度 | 4±2℃ |
如下表E8中所显示，所有3个批次的西妥昔单抗-IR700偶联物展现至少97％单体、小于3％高分子量物质(HMW)和小于或等于0.3％游离IR700染料(例如，未偶联染料)。
表E8：
本发明并不旨在限制于所公开的特定实施方式的范畴内，这些实施方式经提供例如以说明本发明的各种方面。对组合物和方法的各种修改将自本文中的描述和启示变得显而易见。此类变化形式可在不背离本发明的真正范畴和精神的情况下实践且旨在属于本发明的范畴内。
序列表
<110> 乐天医药生技股份有限公司（Rakuten Medical, Inc.）
<120> 西妥昔单抗-IR700偶联物组合物
<130> 75170-20016.40
<140> 未指定
<141> 同时附上
<150> 62/883,825
<151> 2019-08-07
<160> 2
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗重链
<400> 1
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗轻链
<400> 2
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Ala
210
Claims (50)
1.一种偶联物，其包含至少两个IR700分子偶联至西妥昔单抗中的至少两个赖氨酸(K)位置，且其中所述至少两个赖氨酸位置独立地选自下组：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)。
2.如权利要求1所述的偶联物，其包含至少三个IR700分子偶联至该西妥昔单抗中的至少三个赖氨酸位置。
3.如权利要求2所述的偶联物，其中所述至少三个赖氨酸位置独立地选自下组：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207及重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。
4.如权利要求1至3中任一项所述的偶联物，其中偶联至IR700的这些赖氨酸位置中的至少一个是选自下组：轻链中的K145或重链中的K215、K416或K449。
5.如权利要求1至4中任一项所述的偶联物，其中至少一个IR700分子偶联至轻链中的赖氨酸，且至少一个IR700分子偶联至重链中的赖氨酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的偶联物，其中该偶联物能够通过波长在690nm±50nm之间的光照射而活化且由此在该偶联物结合至细胞表面上的表位时展现细胞杀伤活性。
7.一种组合物，其包含如权利要求1至6中任一项所述的偶联物和医药学上可接受的赋形剂。
8.一种组合物，其包含偶联物的群体，其中所述群体中的偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的这些偶联物包含至少两个IR700分子偶联至该西妥昔单抗中的至少两个赖氨酸(K)位置，且其中该两个赖氨酸位置独立地选自下组：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)。
9.如权利要求7或8所述的组合物，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的这些偶联物包含至少三个IR700分子偶联至该西妥昔单抗中的至少三个赖氨酸位置。
10.如权利要求9所述的组合物，其中该至少三个赖氨酸位置独立地选自下组：轻链中的K107、K145、K188、K190和K207及重链中的K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416和K449。
11.如权利要求7至10中任一项所述的组合物，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的这些偶联物包含至少一个IR700分子偶联至轻链中的K145或重链中的K215、K416或K449。
12.如权利要求7至11中任一项所述的组合物，其中至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或大于或大于约90％的这些偶联物包含IR700分子偶联至轻链中的K145和IR700分子偶联至重链中的K215、K416或K449中的至少一个。
13.如权利要求7至12中任一项所述的组合物，其中IR700分子与该西妥昔单抗的比率在约2∶1至约4∶1之间。
14.如权利要求7至13中任一项所述的组合物，其中IR700分子与该西妥昔单抗的比率为约2.5∶1、2.6∶1、2.7∶1、2.8∶1、2.9∶1、3.0∶1、3.1∶1、3.2∶1、3.3∶1或3.4∶1。
15.如权利要求7至13中任一项所述的组合物，其中IR700分子与该西妥昔单抗的比率在约2.7∶1至约3.2∶1之间。
16.如权利要求7至15中任一项所述的组合物，其中该组合物中不超过或不超过约15％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联。
17.如权利要求7至16中任一项所述的组合物，其中该组合物中小于或小于约10％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联。
18.如权利要求7至17中任一项所述的组合物，其中游离染料在该组合物中的百分比小于或小于约3％、小于或小于约2％、小于或小于约1％，或小于或小于约0.5％。
19.一种组合物，其包含西妥昔单抗-IR700偶联物的群体，其中该组合物中多种偶联物各包含IR700偶联至西妥昔单抗于西妥昔单抗的轻链或重链中选自下组的赖氨酸(K)：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)，且该组合物包含以下特征：
(a)该组合物中的IR700分子与该群体中西妥昔单抗分子的比率在约2∶1与约3∶5之间，
(b)小于或小于约10％的西妥昔单抗分子未与IR700偶联，和
(c)该组合物中的游离染料在该组合物中的所有染料分子中的百分比小于或小于约3％。
20.如权利要求19所述的组合物，其中多种偶联物包含在轻链的K145与IR700偶联的西妥昔单抗。
21.如权利要求19或20所述的组合物，其中多种偶联物包含在重链的K215、K416或K449与IR700偶联的西妥昔单抗。
22.如权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中多种偶联物包含与至少三个IR700分子偶联的西妥昔单抗。
23.如权利要求19至22中任一项所述的组合物，其中该多种偶联物包含该组合物中的至少或至少约51％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％或至少或至少约80％的偶联物。
24.如权利要求19至23中任一项所述的组合物，其中游离染料在该组合物中的百分比小于或小于约2％、小于或小于约1％或小于或小于约0.5％。
25.如权利要求7至24中任一项所述的组合物，其中该西妥昔单抗包含SEQ ID NO：1中所述的重链序列、SEQ ID NO：2中所述的轻链序列，或其组合。
26.如权利要求7至25中任一项所述的组合物，其中在暗处或少光条件下储存6个月之后，游离染料在该组合物中的百分比实质上未改变。
27.如权利要求7至26中任一项所述的组合物，其中该组合物包含至少或至少约95％、96％、97％或98％单体形式的该偶联物。
28.如权利要求7至27中任一项所述的组合物，其中该组合物包含小于或小于约5％、4％或3％高分子量物质。
29.一种杀死肿瘤或癌细胞的方法，所述方法包括：
在或接近该肿瘤或该癌细胞的部位给予包含如权利要求1至28中任一项所述的偶联物或组合物的医药组合物；和
在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近该肿瘤或该癌细胞的区域，由此杀死所述肿瘤或癌细胞。
30.一种治疗个体的疾病或病症的方法，所述方法包括：
在或接近该肿瘤或该癌细胞的部位给予包含如权利要求1至28中任一项所述的偶联物或组合物的医药组合物；和
在约600nm至约850nm的波长以由约25J cm-2至约400J cm-2或由约25J/cm光纤长度至约500J/cm光纤长度的剂量照射接近个体的病灶或肿瘤的区域，由此治疗所述疾病或病症。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中该照射步骤是在690±50nm的波长或在约690±20nm的波长进行。
32.如权利要求31所述的方法，其中该照射步骤是在约690nm的波长进行。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症为肿瘤或癌症。
34.如权利要求29至33中任一项所述的方法，其中该肿瘤或癌细胞包含以下肿瘤或该疾病或病症为以下肿瘤：膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、***癌、子***、食道癌或头颈癌。
35.如权利要求29至33中任一项所述的方法，其中该肿瘤或癌细胞包含以下癌症或该疾病或病症为以下癌症：位于头颈部、***、肝脏、结肠、卵巢、***、胰腺、脑、子宫颈、骨、皮肤、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺的癌症。
36.如权利要求35所述的方法，其中该癌症为头颈癌。
37.一种制造稳定偶联物的方法，所述方法包括：
a)使西妥昔单抗与IR700在产生西妥昔单抗-IR700偶联物的条件下接触，其中该偶联物包含至少两个偶联至IR700的赖氨酸(K)位置独立地选自下组：对应于该西妥昔单抗的轻链中的位置107的赖氨酸(K107)、对应于位置145的赖氨酸(K145)、对应于位置188的赖氨酸(K188)、对应于位置190的赖氨酸(K190)和对应于位置207的赖氨酸(K207)和对应于该西妥昔单抗的重链中的位置5的赖氨酸(K5)、对应于位置75的赖氨酸(K75)、对应于位置215的赖氨酸(K215)、对应于位置248的赖氨酸(K248)、对应于位置292的赖氨酸(K292)、对应于位置328的赖氨酸(K328)、对应于位置336的赖氨酸(K336)、对应于位置416的赖氨酸(K416)和对应于位置449的赖氨酸(K449)；
b)使该偶联物在偶联期间和/或之后经受一个步骤，该步骤实质上减少与该西妥昔单抗非特异性结合的IR700；和
c)在医药学上可接受的缓冲液中配制该偶联物，
其中在步骤a)至c)中的每一个中，该染料和偶联物曝露的唯一光具有在约400nm至约650nm范围内的波长或具有小于或小于约500勒克斯的强度。
38.如权利要求37所述的方法，其中步骤b)包含在完成IR700与该西妥昔单抗之间的偶联反应之后，使该偶联物经甘氨酸淬灭反应。
39.如权利要求38所述的方法，其中该淬灭反应进行过夜或大于或大于约6小时的持续时间。
40.一种稳定偶联物，其是通过如权利要求37至39中任一项所述的方法制造。
41.一种组合物，其包含多种偶联物，其中这些偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中该组合物经胰蛋白酶消化产生包含以下肽的群体：
a)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)；
b)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)；
c)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)；和
d)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)。
42.如权利要求41所述的组合物，其中该肽的群体进一步包含：
e)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)；和
f)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)。
43.如权利要求41或42所述的组合物，其中该肽的群体进一步包含：
g)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)；
h)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)；
i)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)；和
j)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)。
44.如权利要求41至43中任一项所述的组合物，其中该肽的群体进一步包含以下中的一个或多个：
k)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)；
l)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)；
m)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)；和
n)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)。
45.一种组合物，其包含多种偶联物，其中这些偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，其中该组合物经胰蛋白酶消化产生包含以下肽的群体：
a)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)；
b)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)；
c)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)；
d)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)；
e)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)；
f)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)；
g)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)；
h)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)；
i)西妥昔单抗的重链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)；
j)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)；
k)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)；
l)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)；
m)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)；和
n)西妥昔单抗的轻链的肽，其包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)。
46.如权利要求41至45中任一项所述的组合物，其中这些肽是通过正离子模式质谱法检测。
47.如权利要求46所述的组合物，其中当针对由正离子模式质谱法检测的肽产生提取离子层析图(EIC)时：
对应于a)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于a)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的3％或约3％与5％或约5％之间；
对应于b)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于b)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的3％或约3％与5％或约5％之间；
对应于c)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于c)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的8％或约8％与11％或约11％之间；
对应于d)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于d)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与2.5％或约2.5％之间；
对应于e)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于e)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的8％或约8％与12％或约12％之间；
对应于f)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于f)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.2％或约0.2％与2.5％或约2.5％之间；
对应于g)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于g)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的4.5％或约4.5％与7％或约7％之间；
对应于h)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于h)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的9.5％或约9.5％与13％或约13％之间；
对应于i)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于i)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的6％或约6％与10％或约10％之间；
对应于j)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于j)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的2％或约2％与5％或约5％之间；
对应于k)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于k)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的7％或约7％与11％或约11％之间；
对应于l)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于l)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间；
对应于m)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于m)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的1.5％或约1.5％与5％或约5％之间；和
对应于n)的肽的EIC峰积分面积是在对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于n)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的0.5％或约0.5％与4％或约4％之间。
48.如权利要求47所述的组合物，其中：
对应于a)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于a)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.8±1％；
对应于b)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于b)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.5±1％；
对应于c)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于c)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约10.0±1％；
对应于d)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于d)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约1.7±1％；
对应于e)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于e)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约10.2±1％；
对应于f)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于f)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约1.3±1％；
对应于g)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于g)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约5.9±1％；
对应于h)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于h)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约11.2±1％；
对应于i)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于i)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约7.6±1％；
对应于j)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于j)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.4±1％；
对应于k)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于k)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约9.3±1％；
对应于l)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于l)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约2.1±1％；
对应于m)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于m)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约3.5±1％；和
对应于n)的肽的EIC峰积分面积是对应的未经修饰肽的EIC峰积分面积和对应于n)的这些肽的EIC峰积分面积的总和的约2.0±1％。
49.一种组合物，其包含多种偶联物，其中所述偶联物包含IR700偶联至西妥昔单抗，且其中所述组合物经胰蛋白酶消化产生肽，这些肽产生包含对应于以下的提取离子层析图(EIC)峰的质谱：
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；和/或
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约0.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约4.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约9％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约7％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约8.5％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约1％；
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约2.5％；和
包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，其中偶联EIC峰的面积百分比是对应的经修饰和未经修饰的多肽的EIC峰总面积的至少或至少约1％。
50.如权利要求49所述的组合物，其中：
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置5的赖氨酸(K5)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.8±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置75的赖氨酸(K75)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置215的赖氨酸(K215)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.0±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置248的赖氨酸(K248)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.7±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置292的赖氨酸(K292)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约10.2±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置328的赖氨酸(K328)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约1.3±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置336的赖氨酸(K336)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约5.9±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置416的赖氨酸(K416)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约11.2±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：1的位置449的赖氨酸(K449)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约7.6±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置107的赖氨酸(K107)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.4±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置145的赖氨酸(K145)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约9.3±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置188的赖氨酸(K188)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2.1±1％；
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置190的赖氨酸(K190)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约3.5±1％；和
对于包含IR700分子偶联至对应于SEQ ID NO：2的位置207的赖氨酸(K207)的肽，偶联EIC峰的面积百分比为约2±1％。
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