CN114574612A - 用于产生短枝玉米植物的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开属于植物育种领域。本公开提供了使用标记辅助选择培育具有短枝性状的玉米植物的方法。本公开还提供了用于在育种计划中将短枝性状渐渗入优良种质的短枝种质、与短枝性状相关联的标记。本公开还提供了具有等于或高于常规非短枝玉米品种的产量的短枝或矮秆优良玉米品种。

Description

用于产生短枝玉米植物的方法和组合物
本申请是申请日为2016年4月27日、申请号为201680024827.3、 发明名称为“用于产生短枝玉米植物的方法和组合物”的发明专利 申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于分别在2015年4月28日和2015年6月16日提 交的美国临时专利申请第62/153,831号和第62/180,430号的优先权 的权益，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
序列表的并入
文件中包含的称为“P34302WO00.txt”的序列表(其具有27,912字 节(在
Figure BDA0003491032120000011
中测量)并且创建于2015年4月19日)包含120 个核苷酸序列，随同所述文件以电子方式提交并通过引用整体并入 本文。
背景技术
在过去几十年中已实现了农作物产量的持续增长(例如，在小麦 和水稻中)。这种增长部分归因于化肥和农药的使用以及降低植物高 度的半显性矮化突变的引入。较高的植物更有可能响应强降雨或风 而倒伏，并且高产优良品种的较重的花序也使它们更容易倒伏。相 比之下，具有较矮株型的作物更能抗倒伏。此外，矮秆和半矮秆性 状还可提高种植密度，并有助于提高作物的收获指数和氮响应。小 麦和水稻矮秆品种的引进充当了20世纪末所谓“绿色革命”的基石。
玉蜀黍(Zea mays L.)，为禾本科(Gramineae)属的一个成员，提供 与其它草类似的圆柱状茎杆。玉米茎杆内部厚实且呈海绵状，且分 为称为节间和节的部分。取决于品种和生长条件，节点数量的范围 为8至40。商业杂交玉蜀黍通常生长至高于2米的高度，每株植物 具有1或2个穗。穗通常生长在植物的大致上三分之一处，或距离 地面约3英尺。因此，玉蜀黍植物，除了大量的叶和茎结构之外还 提供大穗，可具有相当大的机械稳定性问题。降低玉蜀黍植物的高 度可提高植物的机械稳定性。
已经在玉蜀黍中描述了超过40个单基因矮化突变体。这些突变 体中的大多数导致谷物产量大幅度降低，因此，它们一直未被用于 增加易倒伏的种质的作物产量。因此，玉米育种的一个重要目标是 鉴定和使用矮秆或半矮秆突变，所述突变赋予矮株型，而不会严重 影响其它器官，特别是繁殖器官(例如，穗)。
在玉蜀黍中，短枝突变体由于节间长度的缩短(但无节间数量或 其它器官(包括叶、穗和雄花穗)的数量和尺寸的相应减少)而显示矮 株型。见Kempton J.Hered.11:111-115(1920)；Pilu等，Molecular Breeding,20:83-91(2007)。迄今为止，已在玉蜀黍中分离出三个短枝 突变体：短枝1(br1)、短枝2(br2)和短枝3(br3)。br1和br3突变均 导致玉米植物高度降低，所述降低由于对产量的潜在影响，对于商 业开发而言，被认为太严重。相比之下，br2突变体因下茎的节间短 缩并且无其它植物器官的明显减少而具有特殊的农艺潜力。此外， br2品系表现出不寻常的茎杆强度和对风倒伏的耐受性，而叶子通常 比野生型植物的叶子更暗，且活性绿持续的时间更长。br2表型对赤 霉素、生长素、油菜素类固醇和细胞***素的处理不敏感，表明br2 突变不改变这些激素的生物合成。
Multani等鉴定了Br2基因的基因组序列，并将其在GenBank登 录号AY366085下保藏。见Science,302(5642)81-84(2003)。Br2被注 释来编码类似于P-糖蛋白(PGP)的多重耐药性(MDR)种类的三磷酸 腺苷(ATP)结合盒转运蛋白的推定蛋白质。Pilu等报道了在Br2基因 的3'末端中具有8-bp缺失的br2-23等位基因，并且声称在它们的 br2-23植物中该缺失与短枝表型之间存在直接关系。见Pilu等，Molecular Breeding，20：83-91(2007)。然而，在玉米中使用短枝突变还 没有被商业利用，部分原因是可用的短枝突变型等位基因的严重性。
在玉米育种中需要鉴定提供新型和商业上相关的短枝突变型等 位基因(例如赋予中间短枝表型并保持或提高籽粒产量的那些等位基 因)的玉米种质。还需要开发用于监测和渐渗新型短枝突变型等位基 因的多态性标记，并且进一步开发包含用于提高植物生产力的短枝 性状的农艺上优良的玉米品系。
发明概述
本公开提供了选择玉米植物或种子的方法，所述方法包括(a)在 玉米植物或种子的群体中检测在多态性基因座处包含短枝等位基因 的玉米植物或种子，其中所述多态性基因座与选自由SEQ ID No： 1-22和86-109组成的组的标记相关联或连锁；和(b)选择包含短枝等 位基因的玉米植物或种子。在一些方面，这些方法包括检测在选自 由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的约20cM、10cM、 5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内的多态性基因座处的短 枝等位基因。在一些方面，这些方法包括检测在选自由SEQ ID No： 5-8、11-22和86-95组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、 0.5cM或小于0.5cM的范围内的多态性基因座处的短枝等位基因。 在其它方面，这些方法包括检测选自由SEQ ID No：1-22和86-109 组成的组的标记的短枝等位基因。在一些方面，这些方法包括检测 选自由SEQID No：5-8、9-22和86-95组成的组的标记的短枝等位 基因。在一些方面，这些方法包括检测选自由SEQ ID No：7和95 组成的组的标记的短枝等位基因。在一些方面，所检测的短枝等位 基因选自由SEQ ID No：27-48组成的组。在一些方面，这些方法包 括将包含短枝等位基因的第一玉米植物与第二玉米植物杂交以产生 玉米植物或种子的群体。在其它方面，这些方法还包括与第二玉米 植物回交。在一些方面，这些方法从分离群体或单倍体育种群体中 选择玉米植物或种子。在其它方面，这些方法从一个或多个地方品 种或双单倍体种群中选择玉米植物或种子。在一些方面，这些方法 的步骤(b)包括使用本文提供的标记测定。在其它方面，这些方法还 包括针对选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多个多态性序 列对玉米植物或种子的群体进行基因分型。在另外的方面，这些方 法还包括检测选自由SEQ ID No：71-75组成的组的标记的短枝等位 基因。在一些方面，所检测的短枝等位基因选自由SEQ ID No：76-80 组成的组。
在一个方面，本公开提供了产生包含至少一个与短枝性状相关 联的等位基因的玉米植物群体的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 对玉米植物的第一群体进行基因分型，所述群体包含至少一个与短 枝性状相关联的等位基因，其中所述至少一个短枝等位基因与选自 由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记相关联；(b)从第一群 体中选择一株或多株包含至少一个短枝等位基因的玉米植物；和(c) 从所选择的玉米植物产生第二群体，从而产生包含至少一个短枝等 位基因的玉米植物的群体。在一些方面，这些方法包括针对选自由 SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、 1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内的至少一个短枝等位基因对基 因座进行基因分型。在一些方面，这些方法包括针对选自由SEQ ID No：5-8、11-22和86-95组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内的至少一个短枝等位基因对基 因座进行基因分型。在其它方面，这些方法包括对选自由SEQ ID No： 1-22和86-109组成的组的标记进行基因分型。在一些方面，这些方 法包括针对选自由SEQ ID No：5-8、11-22和86-95组成的组的标记 的至少一个短枝等位基因对基因座进行基因分型。在一些方面，这 些方法包括针对选自由SEQ ID No：7和95组成的组的标记的至少 一个短枝等位基因对基因座进行基因分型。在一些方面，所述短枝 等位基因选自由SEQ ID No：27-48组成的组。在其它方面，这些方 法还包括针对选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多个多态 性序列对玉米植物的第一群体进行基因分型。在一些方面，这些方 法的步骤(a)还包括针对选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或 多个多态性序列对玉米植物的第一群体进行基因分型。在另外的方面，这些方法的步骤(a)还包括针对选自由SEQ ID No：76-80组成的 组的短枝等位基因对玉米植物的第一群体进行基因分型。
在一个方面，本公开提供了选择玉米植物或种子的方法，所述 方法包括：(a)针对与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的 标记相关联的多态性基因座对玉米植物或种子的群体进行基因分 型；和(b)选择在所述多态性基因座处包含短枝等位基因的玉米植物 或种子。在一些方面，这些方法包括对选自由SEQ ID No：1-22和 86-109组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或 小于0.5cM的范围内的多态性基因座进行基因分型。在其它方面， 这些方法包括对选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记 进行基因分型。在一些方面，这些方法包括对选自由SEQ ID No： 5-8、11-22和86-95组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、 0.5cM或小于0.5cM的范围内的基因座进行基因分型。在一些方面， 这些方法包括对选自由SEQ ID No：5-8、11-22和86-95组成的组的 基因座进行基因分型。在一些方面，这些方法包括对选自由SEQ ID No：7和95组成的组的基因座进行基因分型。在一些方面，通过这 些方法选择的植物或种子包含选自由SEQ ID No：27-48组成的组的 短枝等位基因。在其它方面，这些方法还包括针对选自由SEQ ID No： 71-75组成的组的一个或多个多态性序列对玉米植物或种子的群体 进行基因分型。在一些方面，这些方法的步骤(a)还包括针对选自由 SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多个多态性序列对玉米植物的 第一群体进行基因分型。在另外的方面，这些方法的步骤(a)还包括 针对选自由SEQID No：76-80组成的组的短枝等位基因对玉米植物 的第一群体进行基因分型。
在一个方面，本公开提供了选择玉米植物或种子的方法，所述 方法包括：(a)从玉米植物或种子分离核酸；(b)分析所述核酸以检测 与短枝单倍型相关的多态性标记，所述短枝单倍型包含选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的1个或多个、2个或更多个、 3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或 更多个或8个或更多个短枝等位基因；和(c)选择包含所述短枝单倍 型的玉米植物或种子。在一些方面，这些方法包括检测在短枝单倍 型的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围 内的多态性标记。在其它方面，这些方法包括检测包含选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的1个或多个、2个或更多个、3 个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或 更多个或8个或更多个短枝等位基因的短枝单倍型。在一些方面， 这些方法包括对基因座SEQ ID No：7和95进行基因分型。在一些 方面，所述短枝单倍型包含选自由SEQ IDNo：27-48组成的组的1 个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更 多个、6个或更多个、7个或更多个或8个或更多个序列。在其它方 面，这些方法还包括分析核酸以检测选自由SEQ ID No：71-75组成 的组的一个或多个多态性序列。在一些方面，这些方法的步骤(b)还 包括分析核酸以检测选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多 个多态性序列。在另外的方面，这些方法还包括分析核酸以检测选 自由SEQ ID No：76-80组成的组的一个或多个短枝等位基因。
在一个方面，本公开提供了将短枝性状渐渗入玉米品种的方法， 所述方法包括：(a)将包含短枝性状的第一玉米品种与不包含短枝性 状的第二玉米品种杂交以产生一株或多株后代玉米植物；(b)分析所 述一株或多株后代玉米植物以检测短枝等位基因，其中所述短枝等 位基因与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记连锁； 和(c)选择包含短枝等位基因的后代玉米植物。在一些方面，这些方 法包括检测在选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的 约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内的短枝等位基因。在一些方面，这些方法包括检测在选自由SEQ ID No： 5-8、11-22和86-95组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、 0.5cM或小于0.5cM的范围内的短枝等位基因。在一些方面，这些 方法包括检测选自由SEQ ID No：5-8、11-22和86-95组成的组的基 因座的短枝等位基因。在一些方面，这些方法包括检测选自由SEQ ID No：7和95组成的组的基因座的短枝等位基因。在其它方面，这些 方法包括检测选自由SEQ ID No：1-22、71-75和86-109组成的组的 标记的短枝等位基因。在一些方面，所述短枝等位基因选自由SEQ ID No：27-48和76-80组成的组。
使用本文公开的方法选择或产生的玉米植物或种子可具有Br2 基因组区域的单个基因转化。在一些方面，所述玉米植物或种子相 较于不具有短枝等位基因的对照植物，包含降低的Br2 mRNA或蛋 白质水平。在其它方面，所述玉米植物或种子相较于不具有短枝等 位基因的对照植物，包含降低的Br2蛋白活性。在一些方面，所选 择的植物在成熟时的高度相较于不具有短枝等位基因的对照植物， 降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在其它方面， 所选择的植物的产量等于或大于不具有短枝等位基因的对照植物的产量。在一些方面，使用这些方法选择的玉米植物或种子需要比对 照植物少约5％、10％、15％、20％或25％的热单位来达到花开期。 在其它方面，使用这些方法选择的玉米植物或种子具有比对照植物 的相对成熟度少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％的天数的相对成熟度。
另一方面，本公开提供了杂交短枝、矮秆或半矮秆玉米植物或 其植物部分，其包含特征在于选自由SEQ ID No：27-48组成的组的 一个或多个序列的短枝等位基因。在某些方面，本文提供的玉米植 物是优良品系。这些优良品系可以是转基因或非转基因近交系或杂 种。
在一个方面，本公开提供了一容器的包含特征在于选自由SEQ ID No：27-48组成的组的一个或多个序列的短枝等位基因的优良玉 米种子。这些种子可以是转基因的或非转基因的。它们也可以是近 交种子或杂交种子。
序列简述
SEQ ID No：1至22列出了与短枝性状一致的多态性标记序列。 SEQ ID No：23至26列出了用于对标记SEQ ID No：7进行基因分 型的示例性引物和探针序列。SEQ ID No：27至48列出了如表2所 示的相应的示例性短枝等位基因。SEQ ID No：49至70列出了如表 2所示的相应的示例性非短枝等位基因。SEQ ID No：71至75列出 了另外的多态性标记序列。SEQID No：76至80列出了如表7所示 的相应的示例性短枝等位基因。SEQ ID No：81至85列出了如表7 所示的相应的示例性非短枝等位基因。SEQ ID No：86至109列出了 另外的Br2相关多态性序列。SEQ ID No：112至116列出了用于对 标记SEQ ID No：95进行基因分型的示例性引物和探针序列。本领 域普通技术人员将理解本文公开的多态性标记包含多种等位基因， 其包括但不限于所列出的示例性等位基因。
发明详述
除非本文另有定义，否则术语将根据相关领域的普通技术人员 的常规使用来理解。描述本文使用的许多与分子生物学有关的术语 的来源的实例可见于Alberts等，Molecular Biology of The Cell，第5 版，Garland Science Publishing，Inc.：NewYork，2007；Rieger等， Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag： New York，1991；King等，A Dictionary of Genetics，第6版，OxfordUniversity Press：New York，2002；和Lewin，Genes IX，Oxford University Press：NewYork，2007。使用如在37C.F.R.§1.822所示的 DNA碱基的命名法。
如本文中所用，除非上下文明确地另外规定，否则以单数表示 的术语和单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”例如 包括复数指示物。因此，例如，提及“植物”、“该/所述植物”或“一株 (a)植物”也包括多株植物；另外，根据上下文，术语“植物”的使用还 可包括该植物的遗传上相似或相同的后代；术语“核酸”的使用任选 地实际上包括该核酸分子的多个拷贝；类似地，术语“探针”任选地(和 通常)包含许多相似或相同的探针分子。
如本文中所用，“植物”是指整株植物、其任何部分，或源自植物 的细胞或组织培养物，其包含以下任何一种：整株植物、植物组分 或器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其 后代。后代植物可以来自任何子代，例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、 F7等。植物细胞是从植物获取的或通过培养获自植物的细胞衍生的 植物的生物细胞。
如本文中所用，“玉米植物”或“玉蜀黍植物”是指“玉蜀黍(Zea mays L)种的植物，并且包括可用玉米育种的所有植物品种，包括野 生玉蜀黍种。
如本文中所用，“矮秆”植物是指非典型小的植物。通常，此类“矮 秆植物”具有相较于对照野生型植物(例如，包含除矮秆性状外的所有 其它性状的同胞植物)减少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、 60％或更大的株型或高度。“半矮秆植物”是指具有相较于对照野生型 植物减少约5％、10％、15％、20％、25％、30％或更少的株型或高度 的植物。通常但非排他地，当与对照野生型植物相比较时，此类矮 秆植物的特征在于缩短的茎、茎杆或主干长度。
如本文所用，“短枝植物”是指由于节间长度的缩短但无节间数量 或其它器官(包括但不限于叶、穗和雄花穗)的数量和尺寸的相应减少 而显示矮株型的植物。“短枝”是指特征在于节间缩短而其它植物部 分没有相应的减小的植物的异常变异。
如本文中所用，“种质”是指遗传物质的活体来源。种质可以是生 物体或细胞的一部分，或可以与生物体或细胞分离。一般地，种质 提供了具有特定分子构成的遗传物质，其为生物体或细胞培养物的 某些或所有遗传性质提供了物理基础。如本文所用，种质包括可从 其生长新的植物的细胞、种子或组织，或可将其培养成整株植物的 植物部分，诸如叶、茎、花粉或细胞。
如本文所用，短语“与……相关联”或“与……连锁”是指两个实体 之间的可识别和/或可测定的关系。例如，短语“与短枝性状相关联的” 是指其存在或不存在可影响植物或其目标部分具有短枝性状的程 度、度和/或比率的性状、基因座、基因、等位基因、标记、表型等， 或其表达。因此，当标记与性状连锁时以及当所述标记的存在是所 需性状或性状形式是否将存在于包含所述标记的植物/种质中和/或 以何种程度存在于所述植物/种质中的指标时，所述标记与性状“相关 联”。类似地，当标记与等位基因连锁时以及当所述标记的存在是所 述等位基因是否存在于包含所述标记的植物/种质中的指标时，所述 标记与等位基因“相关联”。例如，“与短枝表型相关联的标记”是指其 存在或不存在可用于预测植物是否显示短枝表型以及在何种程度上 显示短枝表型的标记。
如本文中所用，厘摩(“cM”)是两个基因座之间的重组频率和遗传 距离的测量单位。1cM等于在单代中一个遗传基因座处的标记因交 换而与第二基因座处的标记分离的1％概率。遗传距离可使用 Kosambi函数(Kosambi,The estimation of map distancesfrom recombination values.Annals of Eugenics,12:172–75(1944))从重组 值计算。
如本文中所用，“紧密连锁的”意指标记或基因座在另一个标记或 基因座的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的 范围内。例如，20cM意指标记与基因座之间的重组频率等于或小于 约20％。
如本文中所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标 记位于其中的染色体区域。基因座可表示基因组区域中的单个核苷 酸、几个核苷酸或大量核苷酸。本公开的基因座包含群体中的一个 或多个多态性；例如，在一些个体中存在替代性等位基因。“基因基 因座”是可在其中找到特定基因的物种的基因组中的特定染色*** 置。
如本文中所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代性核酸序 列。等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基。例如，第一等位基 因可存在于一条染色体上，而第二等位基因可存在于第二同源染色 体上，例如，如存在于杂合个体的不同染色体上，或者存在于群体中的不同纯合或杂合个体之间。
如本文中所用，“短枝等位基因”是赋予或促成短枝表型的特定基 因座处的等位基因，或者可选择地，是允许鉴定包含短枝表型的植 物或可产生具有短枝表型的后代的植物的等位基因。例如，标记的 短枝等位基因可以是与短枝表型分离的标记等位基因。
如本文中所用，“等位基因频率”是指等位基因存在于个体内、品 系内或品系的群体内的基因座处的频率(比例或百分比)。例如，对于 等位基因“A”，基因型“AA”、“Aa”或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、 0.5或0.0的等位基因频率。可通过对来自该品系的个体的样本的等 位基因频率进行平均来估计品系内的等位基因频率。类似地，可通 过对构成群体的品系的等位基因频率进行平均来计算品系群体内的 等位基因频率。对于具有有限数目的个体或品系的群体，等位基因 频率可表示为包含所述等位基因的个体或品系(或任何其它指定的分 组)的计数。当等位基因与性状连锁时以及当等位基因的存在是所需 性状或性状形式将存在于包含所述等位基因的植物中的指标时，所 述等位基因与所述性状正相关。当等位基因与性状连锁时以及当所 述等位基因的存在是所需性状或性状形式将不存在于包含所述等位 基因的植物中的指标时，所述等位基因与所述性状负相关。
如本文中所用，“杂交的”或“杂交”意指通过受精(例如细胞、种 子或植物)产生后代，并且包括植物之间的杂交(有性)和自体受精(自 交)。
如本文中所用，“回交(backcross)”和“回交(backcrossing)”是指借 以将后代植物反复地返回与其亲本之一杂交的过程。在回交方案中， “供体”亲本是指具有待渐渗的所需基因或基因座的亲本植物。“受体” 亲本(被使用一次或多次)或“轮回”亲本(被使用两次或更多次)是指将 基因或基因座渐渗入其中的亲本植物。例如，见Ragot等， Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example，于TECHNIQUES ET UTILISATIONS DESMARQUEURS MOLECULAIRES LES COLLOQUES，第72卷，第45-56页(1995)中；和Openshaw等，Marker-assisted Selection in Backcross Breeding，于PROCEEDINGS OF THESYMPOSIUM“ANALYSIS OF MOLECULAR MARKER DATA,”第41-43页(1994)中。初始杂交产生了F1代。术语“BC1”是 指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，依此 类推。在一些方面，反复进行回交，将每个连续回交世代的后代个 体本身与同一亲本基因型回交。
如本文中所用，“优良品系”是指已通过针对优良农艺性能育种和 选择产生的任何品系。类似地，“优良种质”或优良种质株系是农艺 上优良的种质。许多优良品系是可获得的并且对于玉米育种领域的 技术人员来说是已知的。
如本文中所用，“遗传元件”或“基因”是指具有功能意义的可遗传 的DNA序列，例如基因组序列。术语“基因”也可用于指例如由基因 组序列编码的cDNA和/或mRNA以及该基因组序列。
如本文中所用，与可观察的性状(表型)相比，“基因型”是个体(或 个体组)在一个或多个遗传基因座处的遗传构成。基因型由个体从其 亲本遗传的一个或多个已知基因座的等位基因定义。术语基因型可 用于指个体在单个基因座、多个基因座处的遗传构成，或者更通常 地，术语基因型可用于指个体对于其基因组中所有基因的遗传组成。 术语基因型还可指确定个体(或个体组)在一个或多个遗传基因座处 的遗传构成。
如本文中所用，“单倍型”是个体在多个遗传基因座处的基因型。 通常，由单倍型描述的遗传基因座在物理上和遗传上连锁，例如在 相同的染色体区间中。单倍型还可指位于单个基因内的SNP等位基 因的组合。
如本文中所用，术语“表型”或“表型性状”或“性状”是指可受基因 型影响的细胞或生物体的一种或多种可检测的特征。肉眼可以观察 到表型，或者可以通过本领域已知的任何其它评价方法，例如显微 镜检查、生物化学分析、基因组分析、特定疾病耐受性的测定等来 观察表型。在某些情况下，表型直接由单个基因或遗传基因座控制， 例如“单基因性状”。在其它情况下，表型是几种基因的结果。
如本文中所用，“连锁不平衡”(LD)是指遗传基因座或性状(或两 者)的非随机分离。在任一种情况下，连锁不平衡意味着相关基因座 沿着染色体长度在物理上充分接近，以便它们以大于随机(即，非随 机)频率的方式一起分离(在共分离性状的情况下，构成性状的基础的 基因座彼此充分接近)。连锁的基因座共分离超过50％的时间，例如 从约51％至约100％的时间。可以使用Hedrick,Gametic disequilibrium measures:proceed withcaution.Genetics,117:331–41(1987)中提供的 任一种方法测量连锁不平衡。术语“物理连锁的”有时用于表示两个 基因座(例如两个标记基因座)在物理上存在于同一染色体上。有利的 是，两个连锁的基因座位于非常接近的位置，使得同源染色体对之 间的重组不会在减数***期间在两个基因座之间高频发生，例如， 使得连锁的基因座在至少约90％的时间，例如91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.75％或更多的时间中共分 离。
如本文中所用，“标记测定”意指用于使用特定方法检测特定基因 座处的多态性的方法，所述特定方法是例如，至少一种表型(诸如种 子颜色、花色或其它可视觉检测的性状)的测量、限制性片段长度多 态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核 苷酸杂交(ASO)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术 和核酸测序技术等。
如本文中所用，“标记辅助选择”(MAS)是借以基于标记基因型选 择表型的过程。“标记辅助选择育种”是指通过检测来自植物的一种 或多种核酸(其中所述核酸与所需性状连锁)，然后选择具有这样的一 种或多种核酸的植物或种质来选择单株或多株植物中的所需一个或 多个性状的过程。
如本文中所用，“多态性”意指群体中存在一个或多个变异。多态 性可以表现为核酸的核苷酸序列的变异或蛋白质的氨基酸序列的变 异。多态性包括在一个或多个个体的群体中的一个或多个基因座处 存在核酸序列或核酸特性的一个或多个变异。所述变异可包括但不 限于一个或多个核苷酸碱基变化、一个或多个核苷酸的***或一个 或多个核苷酸的缺失。多态性可从核酸复制中的随机过程产生，通 过诱变产生，作为移动基因组元件的结果产生，从拷贝数变异和在 减数***过程(诸如不等交换、基因组复制以及染色体断裂和融合) 中产生。所述变异通常可见于群体内，或可以以低频率存在于群体 内，前者在一般植物育种中具有更大的效用，后者可与罕见但重要 的表型变异相关。有用的多态性可能包括单核苷酸多态性(SNP)、 DNA序列中的***或缺失(***缺失(Indel))、DNA序列的简单序列 重复(SSR)、限制性片段长度多态性和标签SNP。遗传标记、基因、 DNA衍生序列、RNA衍生序列、启动子、基因的5'非翻译区、基因 的3'非翻译区、微小RNA、siRNA、耐受性基因座、卫星标记、转 基因、mRNA、双链mRNA、转录谱和甲基化模式也可以包含多态 性。另外，前述的拷贝数的存在、不存在或变异可包括多态性。
如本文中所用，“SNP”或“单核苷酸多态性”意指当基因组序列中 的单个核苷酸(A、T、C或G)被改变或可变时发生的序列变异。当 SNP被作图到基因组上的位点时，存在“SNP标记”。
如本文中所用，“标记”或“分子标记”或“标记基因座”是用于表示 足够独特以表征基因组上特定基因座的核酸或氨基酸序列的术语。 任何可检测的多态性性状可用作标记，只要其被差异遗传并显示与 目标表型性状的连锁不平衡。已为玉米开发了许多标记和综合遗传 图谱，例如UMC 98图谱、嵌套关联作图(Nested Association Mapping) (NAM)图谱、Intermated B73/Mo17(IBM2)遗传图谱和LHRF Gnp2004 图谱。关于更多信息，见maizegdb.org/data_center/map。所有标记用 于在玉米基因组中界定特定基因座。已对大量的这些标记进行了作 图。见maizegdb.org/data_center/marker。因此，每个标记是具有独特 核苷酸序列的DNA的特定区段的指标。图谱位置提供特定标记相对 于彼此的相对位置的量度。当一种性状被认为与给定标记连锁时， 应当理解其序列影响性状的实际DNA片段通常与标记共分离。如果 在性状两侧鉴定了标记，则可获得性状的更精确和明确的定位。通 过测量标记在杂交后代中的出现，可通过相对简单的分子测试来检 测性状的存在，而无需实际评价性状本身的出现(这可能是困难和耗 时的)，因为性状的实际评价需要将植物生长至其中可以表达性状的 阶段和/或在其中可表达性状的环境条件下生长所述植物。分子标记 已被广泛用于确定玉米的遗传组成。在一些方面，本文使用的标记 对于目标关联性状(例如，短枝状态)表现出为2或更大、3或更大、 4或更大、5或更大、6或更大、7或更大、8或更大或9或更大的 LOD评分，所述评分使用本领域已知的方法诸如Qgene 2.23版(1996) 和默认参数来测量。
如本文中所用，“遗传重组频率”是两个遗传基因座之间的交换事 件(重组)的频率。可通过追踪减数***后标记和/或性状的分离来观 察重组频率。在一些情况下，两个不同的标记可具有相同的遗传图 谱坐标。在该情况下，所述两个标记如此地彼此紧密接近，使得在 它们之间以如此低的频率发生重组，使得所述重组不能被检测到。
如本文中所用，“遗传图谱”是给定物种中的一条或多条染色体 (或连锁群)上的基因座之间的遗传连锁关系，通常以图示或表格形式 描述。“遗传作图”是通过使用遗传标记、标记的群体分离和重组频 率的标准遗传原理来确定基因座的连锁关系的过程。“遗传图谱位 置”是遗传图谱上相对于其中可在给定物种中发现指定标记的相同 连锁群上的周围遗传标记的位置。相比之下，基因组的“物理图谱” 是指绝对距离(例如，以碱基对或分离和重叠的连续遗传片段(例如， 重叠群)测量的)。通常，两个标记或基因组基因座在遗传图谱上越接 近，则它们在物理图谱上彼此相距越近。基因组的物理图谱没有考 虑物理图谱上不同点之间的遗传行为(例如，重组频率)。由于遗传重 组的可能性在整个基因组中不均匀的事实，因此在遗传距离与物理 距离之间缺乏精确的比例性可能存在；一些染色体区域是交换“热 点”，而其它区域仅显示罕见的重组事件(如果有的话)。在同一作物 种的不同种群之间还可观察到遗传作图变异性。尽管存在可在群体 之间发生的遗传图谱的该变异性，但在具有所需性状的植物的鉴定 中、具有不期望的性状的植物的反选择中以及在MAS育种中，来源 于一个群体的遗传图谱和标记信息通常在多个种群中仍然有用。如 本领域技术人员将认识到的，任何特定群体中的重组频率(以及作为 结果，遗传图谱位置)不是静态的。分隔两个标记(或标记与QTL)的 遗传距离可取决于如何测定图谱位置而变化。例如，诸如所使用的 亲本作图群体、用于标记作图或QTL作图的软件以及用户对作图软 件输入的参数的变量可促成QTL标记遗传图谱关系。然而，并不意 图将本公开限于任何特定的作图群体、任何特定软件的使用或任何 特定的一组软件参数来确定特定标记或单倍型与所需表型的连锁。 将本文所描述的新颖特性外推到任何基因库或目标群体以及使用任 何特定的软件和软件参数都完全在本领域普通技术人员的能力之 内。实际上，除了本文所述的那些之外，关于群体中的遗传标记和 单倍型的观察可使用本公开的教导来容易地进行。在一些方面，使 用Kosambi函数(Kosambi,The estimation of map distances fromrecombination values.Annals of Eugenics,12:172–75(1944))从重组 值计算本文提及的遗传距离。
如本文中所用，标记辅助选择或育种的上下文中的“选择 (selecting)”或“选择(selection)”是指通常根据某些预定标准从群体中 挑选或选择所需个体的行为。
如本文中所用，“引物”是指寡核苷酸(合成的或天然存在的)，当 置于其中通过聚合酶催化互补链合成的条件下时，其能够用作沿互 补链的核酸合成或复制起始点。通常，引物长度为约10个至30个 核苷酸，但可采用更长或更短的序列。引物可以以双链形式提供， 尽管单链形式更常被使用。引物还可包含可检测的标记，例如5'末 端标记。
如本文中所用，“探针”是指与目标多核苷酸互补(但不必完全互 补)并通过与目标多核苷酸的至少一条链杂交形成双链体结构的寡核 苷酸(合成的或天然存在的)。通常，探针是长度为10个至50个核苷 酸的寡核苷酸，但可采用更长或更短的序列。探针还可包含可检测 的标记。
如本文中所用，“植物的群体”或“植物群体”意指包含任何数量 (包括1个)的从其获取样本以用于评价的个体、对象或数据的组。最 常见的是，所述术语涉及在育种计划中从其选择成员并将其杂交以 产生后代的植物的育种群体。植物群体可包括单次育种杂交或多次 育种杂交的后代，并且可以是实际植物或植物衍生的材料，或植物 的计算机表示。群体成员不必与被选择用于随后的分析周期的群体 成员或最终被选择来获得最终后代植物的群体成员相同。通常，植 物群体来源于单次双亲杂交，但也可来源于相同或不同亲本之间的 两次或更多次杂交。虽然植物群体可以包括任何数量的个体，但是 本领域技术人员将认识到，植物育种者通常使用范围在100个或200 个个体至数千个个体内的群体大小，以及群体中性能最高的5-20％ 是通常被选择用于随后杂交以提高群体的随后世代的性能。
如本文中所用，“栽培种”和“品种”被同义地使用，意指物种(例 如，玉蜀黍(Z.mays L.))内的一组植物，所述植物共享将它们与该物 种内的其它可能的品种分离的某些遗传性状。玉米栽培种可以是近 交系品种或杂种，尽管商业玉米栽培种大多是杂种以利用杂种优势。 玉米杂交栽培种中的个体是同质的，遗传上几乎一致，大多数基因 座以杂合状态存在。
如本文中所用，“地方品种”是指具有历史来源、独特身份并且缺 乏正式作物改良，以及通常具有遗传多样性、地方适应性并与传统 耕作制度相关联的栽培植物的动态种群。见Camacho Villa等，Plant Genetic Resources:Characterization and Utilization3(3):373-84 (2006)。
如本文中所用，术语“近交系”意指已进行育种以获得遗传同质性 的品系。
如本文中所用，术语“杂种”是指在至少两个遗传上不同的亲本之 间交配的后代。交配方案的实例包括但不限于单杂交、改良单杂交、 双改良单杂交、三元杂交、改良三元杂交和双杂交，其中改良杂交 中的至少一个亲本是姊妹系之间杂交的后代。
如本文所用，“渐渗”是指基因座的所需等位基因从一个遗传背景 至另一个遗传背景的传递。
如本文所用，“单基因转化的”或“单基因转化”是指使用称为回交 的植物育种技术或通过遗传工程开发的植物，其中除了通过回交技 术或通过遗传工程转移至品种中的单个基因以外，品种的基本上所 有的所需形态学和生理学特征也得到恢复。
短枝玉米突变体由于节间长度的缩短而显示矮株型，但无节间 数量或其它器官(包括叶、穗和雄花穗)的数量和尺寸的相应减少。见 Pilu等，Molecular Breeding,20:83-91(2007)。已经分离了3个短枝突 变体短枝1(br1)、短枝2(br2)和短枝3(br3)。具有特定农艺潜力的 玉米短枝突变体是隐性突变br2，其导致下茎节间的缩短，其它植物 器官没有明显的减少。另外，br2品系表现出不寻常的茎杆强度和对 风倒伏的耐受性，而叶子通常比野生型植物更暗，并且活性绿的持 续时间更长。br2表型对于利用GA、生长素、油菜素类固醇和细胞 ***素的处理不敏感，这表明br2突变不改变这些激素的生物合成。 Multani等鉴定了Br2基因的基因组序列，并将其在GenBank登录号 AY366085下保藏。见Science,302(5642)81-84(2003)。Br2被注释来 编码类似于P-糖蛋白(PGP)的多重耐药性(MDR)种类的三磷酸腺苷 (ATP)结合盒转运蛋白的推定蛋白质。
本文公开的短枝、矮秆或半矮秆玉米可以具有使其适合于粮 食和饲料生产，特别是在短季环境中生产的特征。特别地，短季 环境中的有限的热量单位可减少粮食产量，降低农作物在给定年 度达到生理成熟度的概率。所公开的短枝、矮秆或半矮秆玉米植
此外，所公开的短枝、矮秆或半矮秆玉米的改变的植物结构和 减少的每植物叶面积允许更高的种植密度以使粮食和饲料产量最大 化。常规玉米栽培种通常在每公顷种植80,000株至90,000株植物， 间隔的行距为0.76m。相比之下，可将本文公开的玉米植物作为小 的谷物种植，使用约0.25m的较窄行距，种植密度高达每公顷 200,000株。玉米种植密度影响光照条件，这进而影响植物生长速度。 因此，本文公开的玉米植物提供优良的群体结构、对阳光的充分暴 露和高粮食产量。以这样的高植物种群密度生产本文公开的玉米进一步提供了农业生态学益处，诸如降低的杂草压力、地表径流和蒸 散量。例如，具有较少和较短叶片的较短植物比高种植密度下的较 高植物更适应于水分胁迫。另外，本文提供的玉米植物在低氮条件 下与常规玉米相比表现更好，并且对减少的光照具有较高的耐受性。
Pilu等先前报道了在Br2基因的3'末端具有8-bp缺失的br2-23 等位基因，并且断定了他们的br2-23植物中该缺失与短枝表型之间 的直接关系。参见Pilu等，MolecularBreeding,20:83-91(2007)。基 于AY366085基因组序列参考，所述8-bp缺失始于Br2 mRNA序列 中的4148位。由于不存在8-bp缺失，因此Br2(PGP1)蛋白具有来自 受影响的密码子的氨基酸残基N-G-W(天冬酰胺-甘氨酸-色氨酸)。尽 管8-bp缺失导致移码，但新序列仍然编码N(天冬酰胺)，以及随后 编码G-W(甘氨酸-色氨酸)。与Pilu等描述的相反，BR2P_v1小组中 的8-bp缺失与短枝表型不一致。这表明单独的8-bp缺失与短枝表型 之间没有直接关系。然而，本公开设想了8-bp缺失与本文公开的与 短枝性状相关的一个或多个标记一起的基因分型。
在一个方面，本公开提供了选择玉米植物或种子的方法，所述 方法包括(a)提供玉米植物或种子的群体；(b)在群体中检测在多态性 基因座处包含短枝等位基因的玉米植物或种子，其中所述多态性基 因座与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记相关联； 和(c)选择包含短枝等位基因的玉米植物或种子。在一些方面，这些 方法包括检测在选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记 的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内 的多态性基因座处的短枝等位基因。在其它方面，这些方法包括检 测选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的短枝等位基 因。在一些方面，这些方法包括检测在选自由SEQ ID No：5-8、11-22 和86-95组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM 或小于0.5cM的范围内的多态性基因座处的短枝等位基因。在一些 方面，这些方法包括检测选自由SEQ ID No：5-8、9-22和86-95组 成的组的标记的短枝等位基因。在一些方面，这些方法包括检测选 自由SEQ ID No：7和95组成的组的标记的短枝等位基因。在一些方面，这些方法包括检测与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成 的组的标记处于连锁不平衡中，并且表现出为2或更大、3或更大、 4或更大、5或更大、6或更大、7或更大、8或更大或9或更大的 LOD评分的多态性基因座处的短枝等位基因。在一些方面，这些方 法的步骤(a)包括将包含短枝等位基因的第一玉米植物与第二玉米植 物杂交以产生玉米植物的群体。在其它方面，步骤(a)还包括与第二 玉米植物回交。在一些方面，这些方法从分离群体或单倍体育种群 体中选择玉米植物或种子。在其它方面，这些方法从一个或多个地 方品种中选择玉米植物或种子。在一些方面，这些地方品种源自北 美、墨西哥或意大利。在一些方面，这些方法的步骤(b)包括使用本 文提供的标记测定。在一些方面，这些方法的步骤(b)包括使用选自 由SEQ ID No：23和24组成的组的一种或多种引物。在其它方面， 这些方法的步骤(b)包括使用选自由SEQ ID No：25和26组成的组的 一种或多种探针。在另一方面，本公开提供了选择玉米植物或种子 的方法，所述方法包括(a)在玉米植物或种子群体中检测在多态性基 因座处包含短枝等位基因的玉米植物或种子，其中所述多态性基因 座与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记相关联；和 (b)选择包含短枝等位基因的玉米植物或种子。在其它方面，这些方 法还包括针对选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多个多态 性序列对玉米植物或种子的群体进行基因分型。在另外的方面，这 些方法还包括检测选自由SEQ ID No：71-75组成的组的标记的短枝 等位基因。在一些方面，所检测的短枝等位基因选自由SEQ ID No： 76-80组成的组。
在另一方面，本公开提供了选择玉米植物或种子的方法，所述 方法包括：(a)针对与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的 标记相关联的多态性基因座对玉米植物或种子的群体进行基因分 型；和(b)选择在所述多态性基因座处包含短枝等位基因的玉米植物 或种子。在一些方面，这些方法包括对在选自由SEQ ID No：1-22 和86-109组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM 或小于0.5cM的范围内的多态性基因座进行基因分型。在其它方面， 这些方法包括对选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记 进行基因分型。在一些方面，这些方法包括针对在选自由SEQ ID No： 5-8、11-22和86-95组成的组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、 0.5cM或小于0.5cM的范围内的至少一个短枝等位基因对基因座进 行基因分型。在一些方面，这些方法包括针对选自由SEQ ID No： 5-8、11-22和86-95组成的组的标记的至少一个短枝等位基因对基因 座进行基因分型。在一些方面，这些方法包括针对选自由SEQ ID No：7和95组成的组的标记的至少一个短枝等位基因对基因座进行基因 分型。在一些方面，通过这些方法选择的植物或种子包含选自由SEQ ID No：27-48组成的组的短枝等位基因。在其它方面，这些方法还 包括针对选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多个多态性序 列对玉米植物或种子的群体进行基因分型。在一些方面，这些方法 的步骤(a)还包括针对选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多 个多态性序列对玉米植物的第一群体进行基因分型。在另外的方面， 这些方法的步骤(a)还包括针对选自由SEQ ID No：76-80组成的组的 短枝等位基因对玉米植物的第一群体进行基因分型。
在一些方面，使用上述方法选择的玉米植物或种子对于短枝等 位基因是纯合的。在其它方面，使用这些方法选择的玉米植物或种 子对于短枝等位基因是杂合的。在某些方面，使用这些方法选择的 玉米植物或种子是近交种子。在某些方面，使用这些方法选择的玉 米植物或种子是杂交种子。在其它方面，使用这些方法选择的玉米 植物或种子处于农艺上优良背景中。在某些方面，使用这些方法选 择的玉米植物或种子提供矮秆、半矮秆或短枝植物。在一些方面， 使用这些方法选择的玉米植物或种子具有Br2基因组区域的单基因 转化。在一些方面，玉米植物或种子相较于不具有短枝等位基因的 对照植物，包含降低水平的Br2 mRNA或蛋白。在其它方面，玉米 植物或种子相较于不具有短枝等位基因的对照植物，包含降低的Br2 蛋白活性。在一些方面，所选择的植物在成熟时的高度相较于不具有短枝等位基因的对照植物降低约10％、20％、30％、40％、50％、 60％或70％。在其它方面，所选择的植物的产量等于或大于不具有 短枝等位基因的对照植物的产量。在一些方面，使用这些方法选择 的玉米植物或种子需要比对照植物少约5％、10％、15％、20％或25％ 的热单位来达到花开期。在其它方面，使用这些方法选择的玉米植 物或种子具有比对照植物的相对成熟度少约10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％或45％的天数的相对成熟度。
在一个方面，本公开提供了产生包含至少一个与短枝性状相关 联的等位基因的玉米植物群体的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 对玉米植物的第一群体进行基因分型，所述群体包含至少一个与短 枝性状相关联的等位基因，其中所述至少一个短枝等位基因与选自 由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记相关联；(b)从第一群 体中选择一株或多株包含至少一个短枝等位基因的玉米植物；和(c) 从所选择的玉米植物产生第二群体，从而产生包含至少一个短枝等 位基因的玉米植物的群体。在一些方面，这些方法包括针对在选自 由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的约20cM、10cM、 5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内的至少一个短枝等位基 因对基因座进行基因分型。在其它方面，这些方法包括对选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记进行基因分型。在其它方面， 这些方法包括对在选自由SEQ ID No：5-8、11-22和86-95组成的组 的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的 范围内的基因座进行基因分型。在一些方面，这些方法包括针对选 自由SEQ ID No：5-8、11-22和86-95组成的组的基因座进行基因分 型。在一些方面，这些方法包括对选自由SEQ ID No：7和95组成 的组的基因座进行基因分型。在一些方面，这些方法包括检测与选 自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记处于连锁不平衡中， 并且表现出为2或更大、3或更大、4或更大、5或更大、6或更大、 7或更大、8或更大或9或更大的LOD评分的多态性基因座处的短 枝等位基因。在一些方面，这些方法包括对分离群体或单倍体育种 群体进行基因分型。在一些方面，这些方法的步骤(a)包括使用本文 提供的标记测定。在一些方面，这些方法的步骤(a)包括使用选自由 SEQ ID No：23和24组成的组的一种或多种引物。在其它方面，这 些方法的步骤(a)包括使用选自由SEQ IDNo：25和26组成的组的一 种或多种探针。在一些方面，通过这些方法产生的玉米植物的群体 对于短枝等位基因是纯合的。在其它方面，通过这些方法产生的玉 米植物的群体对于短枝等位基因是杂合的。在一些方面，通过这些 方法产生的玉米植物的群体是近交系。在一些方面，通过这些方法 产生的玉米植物的群体是杂种。在其它方面，通过这些方法产生的 玉米植物的群体处于农艺上优良背景中。在一些方面，通过这些方 法产生的玉米植物的群体提供矮秆、半矮秆或短枝植物。在一些方 面，通过这些方法产生的玉米植物的群体具有Br2基因组区域的单 基因转化。在一些方面，通过这些方法产生的玉米植物相较于不具 有短枝等位基因的对照植物，包含降低水平的Br2 mRNA或蛋白。 在其它方面，通过这些方法产生的玉米植物相较于不具有短枝等位 基因的对照植物包含降低的Br2蛋白活性。在一些方面，所产生的 植物在成熟时的高度相较于不具有短枝等位基因的对照植物，降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在其它方面，所产 生的植物的产量等于或大于不具有短枝等位基因的对照植物的产 量。在一些方面，通过这些方法产生的玉米植物比对照植物需要少 约5％、10％、15％、20％或25％的热单位来达到花开期。在其它方 面，通过这些方法产生的玉米植物具有比对照植物的相对成熟度少 约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％的天数的相对 成熟度。
在一个方面，本公开提供了选择玉米植物或种子的方法，所述 方法包括：(a)从玉米植物或种子分离核酸；(b)分析核酸以检测与短 枝单倍型相关的多态性标记，所述短枝单倍型包含选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记的1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或 更多个或8个或更多个的短枝等位基因；和(c)选择包含所述短枝单 倍型的玉米植物或种子。在一些方面，这些方法包括检测在短枝单 倍型的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范 围内的多态性标记。在其它方面，这些方法包括检测包含选自由SEQ ID NO：1-22和86-109组成的组的标记的1个或多个、2个或更多个、 3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或 更多个或8个或更多个的短枝等位基因的短枝单倍型。在一些方面， 这些方法包括对基因座SEQ ID No：7和95进行基因分型。在一些 方面，这些方法的步骤(b)还包括分析核酸以检测选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多个多态性序列。在另外的方面，这些方法还包括分析核酸以检测选自由SEQ ID No：76-80组成的组的一个或 多个短枝等位基因。
在一个方面，本公开提供了将短枝性状渐渗入玉米品种的方法， 所述方法包括：(a)将包含短枝性状的第一玉米品种与不包含短枝性 状的第二玉米品种杂交以产生一株或多株后代玉米植物；(b)分析所 述一株或多株后代玉米植物以检测短枝等位基因，其中所述短枝等 位基因与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记连锁； 和(c)选择包含短枝等位基因的后代玉米植物。在一些方面，这些方 法包括检测在选自由SEQ ID No：1-22和86-109以及71-75组成的 组的标记的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内的短枝等位基因。在其它方面，这些方法包括检测选自由SEQ ID No：1-22和86-109以及71-75组成的组的标记的短枝等位基因。
在另一方面，本公开内容提供了杂交短枝、矮秆或半矮秆玉米 植物或其植物部分，其包含特征在于选自由SEQ ID No：27-48组成 的组的一个或多个序列的短枝等位基因。在一些方面，本文提供的 玉米植物是优良品系。在一些方面，本文提供的优良玉米植物对于 短枝等位基因是纯合的。在其它方面，本文提供的优良玉米植物对 于短枝等位基因是杂合的。在一些方面，本文提供的优良玉米植物 是近交系。在一些方面，本文提供的优良玉米植物是杂种。在其它 方面，本文提供的优良玉米植物是转基因的。在一些方面，本文提供的优良玉米植物需要比对照植物少约5％、10％、15％、20％或25％ 的热单位来达到花开期。在其它方面，本文提供的优良玉米植物具 有比对照植物的相对成熟度少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、 40％或45％的天数的相对成熟度。在一些方面，本文提供的优良玉米植物具有Br2基因组区域的单基因转化。在一些方面，本文提供 的优良玉米植物相较于不具有短枝等位基因的对照植物，包含降低 水平的Br2 mRNA或蛋白。在其它方面，本文提供的优良玉米植物 相较于不具有短枝等位基因的对照植物包含降低的Br2蛋白活性。 在一些方面，本文提供的优良玉米植物在成熟时的高度相较于不具 有短枝等位基因的对照植物，降低了约10％、20％、30％、40％、50％、 60％或70％。在其它方面，本文提供的优良玉米植物的产量等于或 大于不具有短枝等位基因的对照植物的产量。
在一个方面，本公开提供了一容器的优良玉米种子，所述种子 包含特征在于选自由SEQ ID No：27-48组成的组的一个或多个序列 的短枝等位基因。在另外的方面，本发明提供了一容器的转基因优 良玉米种子，所述种子包含特征在于选自由SEQ ID No：27-48组成 的组的一个或多个序列的短枝等位基因。在一些方面，这些转基因 种子是杂交种子。一容器的本公开的玉米种子可包含任何数量、重 量或体积的种子。例如，容器可包含至少或大于约100粒、200粒、 300粒、400粒、500粒、600粒、700粒、800粒、900粒、1000粒、 1500粒、2000粒、2500粒、3000粒、3500粒、4000粒或更多种子。 或者，容器可包含至少或大于约1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2 磅、3磅、4磅、5磅或更多种子。玉米种子的容器可以是本领域中可获得的任何容器。作为非限制性示例，容器可以是盒、袋、包、 小袋、带卷、管或瓶。
在一个方面，可将本文公开的玉米种子经历各种处理。例如， 可通过引发种子或通过消毒(以保护免受种子传播的病原体侵害)来 处理种子以改善萌发。在另一方面，可用任何可用的包衣涂覆种子， 以改善例如适种性、种子萌发和免受种子传播的病原体侵害的保护 作用。种子包衣可以是任何形式的种子包衣，包括但不限于造粒、 薄膜包衣和结壳。在一些方面，将本文公开的玉米植物或方法与一 种或多种农药组合使用，所述农药包括但不限于除草剂、杀真菌剂、 杀虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂、驱虫剂、杀菌剂和用于防治害虫的其它物质。在其它方面，将本文公开的玉米植物或方法与一种或 多种***类、嗜球果伞素类(strobilurins)、酰基氨基酸类、嘧啶类、 吡啶类、芳基苯基酮类、酰胺类、苯甲酰苯胺类、咪唑类、二硝基 苯酚类、吗啉类、苯基磺酰胺类和有机磷化合物、其衍生物及其组 合组合使用，可将所述农药用作种子、叶面浸渍或滴灌处理。
在一个方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的自 然繁殖的玉米植物细胞、组织和器官。在另一方面，本公开还提供 了为繁殖材料并介导植物的自然繁殖的玉米植物细胞、组织和器官。 在另一方面，本公开提供了不能通过光合作用维持它们自身的玉米 植物细胞、组织和器官。在另一方面，本公开提供了体细胞玉米植 物细胞。体细胞与生殖细胞相反，不介导植物繁殖。
所提供的细胞、组织和器官可来自种子、果实、叶、子叶、下 胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、芽、茎、荚、花、花序、茎杆、 花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、 胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。在另一方面，本公开提供了一种 玉米植物叶绿体。在另外的方面，本公开提供了表皮细胞、气孔细 胞、叶或根毛、储藏根或块茎。在另一方面，本公开提供了玉米原 生质体。
技术人员了解，玉米植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性 繁殖或营养繁殖。在一个方面，本公开提供了玉米胚乳。在另一方 面，本公开提供了玉米胚乳细胞。在另一方面，本公开提供了雄性 或雌性无菌玉米植物，其在不经人为干预的情况下不能繁殖。
在一个方面，本文公开的玉米植物选自玉蜀黍亚种某些玉米种 (Zea maysL.ssp.mays)。在另一方面，本文公开的玉米植物选自类 群玉蜀黍马齿型玉米亚种(Zeamays L.subsp.mays Indentata)，另称为 马齿型玉米。在另一方面，本文公开的玉米植物选自类群玉蜀黍硬 粒型玉米亚种(Zea mays L.subsp.mays Indurata)，另称为硬粒玉米。在一个方面，本文公开的玉米植物选自类群玉蜀黍甜质型玉米亚种 (Zea maysL.subsp.mays Saccharata)，另称为甜玉米。在另一方面， 本文公开的玉米植物选自类群玉蜀黍粉质型玉米亚种(Zea mays L. subsp.mays Amylacea)，另称为粉质型玉米。在另一方面，本文公开 的玉米植物选自类群玉蜀黍爆裂型玉米亚种(Zea mays L.subsp.maysEverta)，另称为爆粒型玉米。本文公开的植物还包括杂种、近交系、 部分近交系或定义的或未定义的群体的成员。
在另一方面，本公开提供了由所公开的玉米植物制成的加工产 品。此类产品包括但不限于膳食、油、植物提取物、淀粉或发酵产 物或消化产物。另一方面，本公开还提供了玉米面粉，其基本上不 含油，并且使用本文公开的任何植物的油籽来生产。在另一方面，本公开还提供了通过粉碎本文公开的任何植物的油籽来提供玉米面 粉的方法。
本文公开的各种玉米品系可用于使用各种异花授粉和选择方法 来将本文所公开的短枝等位基因转移至新品种中。育种者还可使用 此处描述的玉米植物获得杂种。通过使用标准杂交、回交和选择技 术，本领域技术人员可获得具有除了矮小状态以外的各种所需性状 的商业玉米品种。例如，育种者可获得商业矮秆玉米品系和额外的 性状，诸如高营养利用效率、新的除草剂耐受性、增加的产量、昆 虫控制、真菌抗病性、病毒抗性、线虫抗性、细菌抗病性、高油产 量、高蛋白质产量、萌发和幼苗生长控制、增强的动物和人营养、 耐环境胁迫(例如，干旱胁迫)、增加的消化率、工业酶的生产、药物 蛋白质的生产、药物肽的生产、药物小分子的生产、改善的加工性 状、改善的风味、改善的杂交种子生产、降低的过敏原性、改善的 生物聚合物或生物燃料的生产以及细胞质雄性不育。
还可将本文公开的玉米植物或细胞系进行遗传工程来表达各种 农艺目标表型。涉及这方面的示例性基因包括但不限于赋予对害虫 或疾病的抗性的基因，赋予对除草剂的抗性或耐受性的基因，改变 油含量的基因，控制雄性不育的基因，影响非生物胁迫抗性的基因， 以及影响植物生长和农艺性状诸如产量、开花、植物生长或植物结 构的其它基因和转录因子。
玉米转化
还可对本文公开的玉米植物进行遗传转化。已开发出许多用于 植物转化的方法，包括生物和物理植物转化方案。见例如，Mild等， “Procedures for Introducing ForeignDNA into Plants”在Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,GlickB.R.和Thompson,J. E.编辑(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)第67-88页。另外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法是可获 得的。见例如，Gruber等，“Vectors for Plant Transformation”在Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,Glick B.R.和 Thompson,J.E.编辑(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)第89-119 页。
将表达载体导入植物的一种方法是基于农杆菌属(Agrobacterium) 的天然转化***。见，例如，Horsch等，Science 227:1229(1985)。 根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是遗传转化 植物细胞的植物病原性土壤细菌。用于农杆菌属介导的基因转移的 农杆菌属载体***和方法的描述由例如美国专利第5,563,055号(Townsend和Thomas)(通过引用整体并入本文)提供。
已经开发了几种植物转化方法(统称为直接基因转移)作为农杆 菌介导的转化的替代方法。通常适用的植物转化方法是微粒 (microprojectile)介导的转化，其中在微粒的表面上携带DNA。利用 生物射弹装置(biolistic device)将表达载体引入植物组织中，所述装置 将微粒加速到300至600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和 膜。
用于将DNA物理递送至植物的另一种方法是靶细胞的超声处 理。或者，脂质体和原生质球融合已被用于将表达载体引入植物中。 还可使用原生质体以及全细胞和组织的电穿孔。
在转化玉米靶组织之后，使用本领域公知的再生和选择方法， 可选择的标记基因的表达允许优先选择转化的细胞、组织和/或植物。
用于转化的前述方法通常用于产生转基因品种。然后可将转基 因品种与另一(非转化的或转化的)品种杂交，以产生新的转基因品 种。或者，可使用植物育种领域公知的常规回交技术，将已使用前 述转化技术将其工程化至特定玉米品系的遗传性状移至另一品系 中。例如，可使用回交方法将工程化的性状从公开的非优良品种移 至优良品种中，或将从在其基因组中包含外来基因的品种移至不含 该基因的一个或多个品种中。
本文公开的玉米植物或种子也可通过一种或多种基因组工程技 术或经历进一步的基因组编辑来产生。例如，可将一个或多个短枝 等位基因引入非短枝背景。示例性基因组工程技术包括大范围核酸 酶、锌指核酸酶、TALEN和CRISPR-cas9***。见例如Gaj等，Trends in Biotechnology，31(7)：397-405(2013)。
额外的育种
还可使用本领域中的一种或多种已知方法(例如，谱系育种、轮 回选择、混合选择和突变育种)将本文公开的玉米植物经历额外的育 种。谱系育种始于两种基因型(诸如包含本文公开的短枝等位基因的 玉米品种和缺少该等位基因的另一玉米品种)的杂交。如果两个原始 亲本没有提供所有所需特征，则其它来源可包括在育种种群中。在 谱系方法中，将优良植物自交，并在后续子代中进行选择。在后续 子代中，作为自花授粉和选择的结果，将杂合条件赋予同质品种。 通常在谱系育种方法中，实施5个或更多个后续子代的自交和选择： F1至F2、F2至F3、F3至F4、F4至F5等。在经过足够量的近交后，后 续子代将用于增加开发的品种的种子。开发的品种可在约95％或更 多的其基因座处包含纯合的等位基因。
除了用于产生回交转化以外，还可将回交与谱系育种结合使用。 如前所述，回交可用于将一个或多个特别需要的性状从一个品种(供 体亲本)转移至称为轮回亲本的开发的品种，所述开发的品种具有总 体良好的农艺特征，但缺乏所需的一个或多个性状。然而，可使用 相同的方法来将后代移向轮回亲本的基因型，但同时通过在早期停 止回交并继续进行自交和选择，仍保留非轮回亲本的许多组分。例 如，可将玉米品种与另一品种杂交以产生第一代后代植物。然后可 将第一代后代植物与其亲代品种之一回交以产生BC1或BC2。将后 代植物自交并进行选择，使得新开发的品种具有轮回亲本的许多属 性以及非轮回亲本的几个所需属性。该方法将轮回亲本的价值和优 势充分用于新的玉米品种。
轮回选择是用于植物育种计划以改善植物群体的方法。该方法 需要个体植物相互异花授粉以形成后代。使后代生长，并通过任意 数量的选择方法来选择优良的后代，其包括个体植物、半同胞后代、 全同胞后代和自交后代。将所选择的后代相互异花授粉，以形成另 一群体的后代。种植该群体，并再次选择优良的植物来相互异花授 粉。轮回选择是循环过程，因此可以根据需要重复多次。轮回选择 的目的是改善群体的性状。然后，可将改善的群体用作育种材料的 来源，以获得用于商业或育种用途(包括合成品系的产生)的新品种。 合成品系是通过几个选定品种的互交形成的所得后代。
当与分子标记增强选择结合使用时，混合选择是另一种有用的 技术。在混合选择中，基于表型或基因型选择来自个体的种子。然 后将这些选择的种子混合(bulked)并用于生长下一代。混合选择需要 在大块土地上种植植物的群体，允许植物自花授粉，混合收获种子， 然后使用混合收获的种子样本种植下一代。此外，代替自花授粉， 可将定向授粉用作育种计划的一部分。
还可将突变育种用于将新的性状引入本文公开的玉米植物中。 自发发生的或人工诱导的突变对于植物育种者来说可以是有用的变 异性来源。人工诱变的目标是增加所需特征的突变率。突变率可通 过许多不同的手段来增加，包括温度、长期种子储存、组织培养条 件、辐射；诸如X射线、γ射线(例如钴60或铯137)、中子(原子反 应堆中的铀235的核裂变产物)、β辐射(从放射性同位素诸如磷32 或碳14发射的)或紫外线辐射(从2500nm到2900nm)或化学诱变剂 (诸如碱基类似物(5-溴-尿嘧啶)、相关化合物(8-乙氧基咖啡因)、抗生 素(链黑菌素(streptonigrin))、烷化剂(硫芥子类、氮芥类、环氧化物类、 亚乙基胺类、硫酸盐类、磺酸盐类、砜类、内酯类)、叠氮化物、羟 胺、亚硝酸或吖啶。一旦通过诱变观察到所需性状，然后就可通过 常规育种技术将性状并入现有的种质。
在一些方面，本公开提供了包含短枝性状或短枝标记等位基因 的双单倍体玉米植物和种子。双单倍体(DH)方法在较短的时间范围 内实现了同基因植物，特别适用于产生近交系和定量遗传学研究。 DH植物可按照本领域已知的方法产生。例如，初始步骤涉及植物的 单倍体化，这导致包含单倍体种子的群体的产生。将非纯合品系与 诱导系亲本杂交，导致单倍体种子的产生。具有单倍体胚胎但正常 三倍体胚乳的种子进入第二阶段。从群体中选择单倍体种子后，所 选择的种子经历染色体加倍以产生双单倍体种子。细胞谱系中的自 发染色体加倍将导致正常的配子产生或从单倍体细胞谱系产生未减 数配子。可使用化合物诸如秋水仙碱的应用来增加二倍体化的比率。 秋水仙碱与微管蛋白结合并防止其聚合成微管，从而在中期阻止有 丝***，可用于增加二倍体化(即染色体数量的加倍)的比率。将这些 嵌合植物自花授粉以产生二倍体(双单倍体)种子。栽培该DH种子， 随后进行评价并用于混合测交生产。
本公开还提供了包含本文公开的一个或多个短枝等位基因并显 示出短枝、矮秆或半矮秆表型的杂交种子的产生。在玉米植物育种 计划中开发玉米杂交种涉及三个步骤：(1)从各种种质库选择植物用 于初始育种杂交；(2)将从育种杂交选择的植物自交几代，以产生一 系列近交系，所述近交系尽管彼此不同，但为纯育并且高度均质； 和(3)将选择的近交系与不同的近交系杂交以产生杂种。在玉米的近 交过程中，品系的活力下降。当将两个不同的近交系杂交以产生杂 种时，活力恢复。近交系的纯合性和同质性的一个重要结果是，一 对确定的近交系之间的杂种总是相同的。一旦鉴定了产生优良杂种 的近交系，只要保持近交亲本的同质性，就可无限期地繁殖杂交种 子。
品系的组合能力以及品系的性能是可用作用于杂种生产的近交 系的改良玉米品系的选择中的一个因素。组合能力是指当与其它品 系杂交以形成杂种时，品系作为亲本的贡献。出于选择优良品系的 目的形成的杂种被指定为测交。测量组合能力的一种方法是使用育 种值。育种值基于许多测交的总体平均值。然后调整该平均值以消 除环境影响，并根据已知的品系间的遗传关系进行调整。
杂交种子生产需要使由母本产生的花粉失活。花粉不完全失活 提供了自花授粉的潜力。该无意间自花授粉的种子可能被无意中收 获并与杂交种子一起包装。类似地，由于父本在田间被种植在母本 边上，所以也可能可无意中收获雄性自交系种子并与杂交种子一起 包装。一旦种植来自杂种袋的种子，就有可能鉴定和选择这些自花 授粉的植物。这些自花授粉的植物将在遗传上等同于用于生产杂交 种子的近交系之一。虽然存在近交系被包含在杂交种子袋中的可能 性，但由于非常注意避免此类夹杂，所以发生是罕见的。这些自花 授粉的植物可由本领域技术人员通过目视或分子方法来鉴定和选 择。
标记检测
本公开还提供了可用于选择短枝玉米植物的来自Br2基因组区 域的新型多态性标记。示例性多态性标记示于表2和表7中，其中 列出了它们的短枝等位基因。还可从已知技术鉴定这些示例性标记 的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内 的标记，并将其用于本文公开的方法中。
遗传标记是可基于多核苷酸长度和/或序列彼此区分的(以及可 与任一个特定标记的多个等位基因区分的)。通常，在后代中分离的 任何差异遗传的多态性性状(包括核酸多态性)是潜在的遗传标记。
当作为一组使用时，多态性标记用作用于对植物进行指纹分析 以告知品系或品种的一致性程度的有用工具。这些标记可形成确定 与表型的关联性的基础，并且可用于驱动遗传增益。标记辅助选择 的实现取决于检测和分析个体之间潜在遗传差异的能力。
在本文中，核酸分析方法包括但不限于基于PCR的检测方法、 微阵列方法、基于质谱法的方法和/或核酸测序方法。在一个方面， 可通过使用核酸扩增方法促进DNA、RNA或cDNA样本中多态性位 点的检测。这些方法特别地增加跨越多态性位点的多核苷酸的浓度，或包括位于其远端或近端的位点和序列。此类扩增分子可通过凝胶 电泳、荧光检测方法或其它方法来容易地检测。
实现此类扩增的方法应用聚合酶链反应(PCR)，所述反应使用能 够与以其双链形式限定其多态性的近端序列杂交的引物对。已在美 国专利6,613,509和6,503,710以及其中所见的参考资料中公开了基 于质谱对DNA分型的方法。
可通过本领域公知的各种有效方法检测DNA序列中的多态性 或对其进行分型，所述方法包括但不限于美国专利第5,468,613号、 第5,217,863号、第5,210,015号、第5,876,930号、第6,030,787号、 第6,004,744号、第6,013,431号、第5,595,890号、第5,762,876号、第5,945,283号、第5,468,613号、第6,090,558号、第5,800,944号、 第5,616,464号、第7,312,039号、第7,238,476号、第7,297,485号、 第7,282,355号、第7,270,981号和第7,250,252号(所述美国专利全部 通过引用整体并入本文)中公开的那些方法。然而，可将本公开的组 合物和方法与任何多态性分型方法结合使用以对基因组DNA样本 中的多态性进行分型。所使用的这些基因组DNA样本包括但不限于 直接从植物或种子分离的基因组DNA、克隆的基因组DNA或扩增 的基因组DNA。
例如，如美国专利5,468,613和5,217,863中所公开的，可通过 与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交来检测DNA序列中的多 态性。美国专利5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其 可通过这样的方法在核酸中检测核酸序列中的单个或多个核苷酸变 异，在所述方法中，扩增包含核苷酸变异的序列，将其点在膜上并 用标记的序列特异性寡核苷酸探针进行处理。
靶核酸序列也可通过如美国专利5,800,944中公开的探针连接方 法来检测，在所述方法中扩增目标序列并将其与探针杂交，然后连 接以检测探针的标记部分。
还可将微阵列用于多态性检测，其中将寡核苷酸探针组以重叠 的方式组装以代表单个序列，使得在一个点处的靶序列差异可导致 部分探针杂交(Borevitz等，GenomeRes.13:513-523(2003)；Cui等， Bioinformatics 21:3852-3858(2005))。在任何一个微阵列上，预期将 存在多个靶序列，其可代表基因和/或非编码区，其中每个靶序列由 一系列重叠寡核苷酸而非单个探针代表。该平台提供了多个多态性 的高通量筛选。单特征多态性(SFP)是通过寡核苷酸阵列中的单个探 针检测到的多态性，其中特征是阵列中的探针。在美国专利 6,799,122、6,913,879和6,996,476中公开了通过基于微阵列的方法对 靶序列的分型。
靶核酸序列也可通过如美国专利5,616,464中公开的探针连接方 法检测，所述方法采用至少一对具有与靶核酸序列的相邻部分同源 且具有在探针与靶核酸序列碱基配对时非共价结合以形成茎的侧链 的探针。侧链中的至少一个具有能够与茎的另一侧链成员形成共价 交联的可光活化的基团。
用于检测SNP和***缺失的其它方法包括单碱基延伸(SBE)法。 SBE法的实例包括但不限于美国专利6,004,744、6,013,431、 5,595,890、5,762,876和5,945,283中公开的那些方法。SBE法基于与 多态性相邻的核苷酸引物的延伸，以在引物延伸时掺入可检测的核苷酸残基。在某些方面，SBE法使用四种合成的寡核苷酸。所述寡 核苷酸中的两种用作PCR引物，并且与包含待测定的多态性的区域 侧翼的基因组DNA的基因座的序列互补。在扩增包含多态性的基因 组的区域后，将PCR产物与第三和第四寡核苷酸(称为延伸引物)混 合，所述寡核苷酸被设计来在DNA聚合酶和两种差异化标记的双脱 氧核苷酸三磷酸存在的情况下与与多态性相邻的扩增的DNA杂交。 如果多态性存在于模板上，则在单碱基链延伸中可将标记的双脱氧 核苷酸三磷酸之一添加至引物中。然后通过确定两个差异标记中的 哪一个被添加至延伸引物中来推断存在的等位基因。纯合样本将导 致两种待掺入的标记的碱基中只有一种被掺入，从而只能检测到两 种标记中的一种。杂合样本具有两种存在的等位基因，从而将引导 两种标记的掺入(至延伸引物的不同分子中)，因此将检测到两种标记。
在用于检测多态性的另一种方法中，可通过美国专利第 5,210,015号、第5,876,930号和第6,030,787号中公开的方法检测SNP 和***缺失，其中寡核苷酸探针具有与探针的5'和3'末端共价连接的 5'荧光报告染料和3'淬灭染料。当探针完整时，报告染料与淬灭染料 的接近导致报告染料荧光的抑制(例如，通过福斯特型(Forster-type) 能量转移)。在PCR期间，正向和反向引物与多态性侧翼的靶DNA 的特异性序列杂交，而杂交探针与扩增的PCR产物内含多态性的序 列杂交。在随后的PCR循环中，具有5'→3'外切核酸酶活性的DNA 聚合酶切割探针并将报告染料与淬灭染料分离，从而导致报告基因 的荧光增加。
在另一方面，可使用核酸测序技术对一个或多个目标基因座进 行直接测序。用于核酸测序的方法是本领域已知的，包括由454Life Sciences(Branford,CT)、AgencourtBioscience(Beverly,MA)、Applied Biosystems(Foster City,CA)、LI-COR Biosciences(Lincoln,NE)、 NimbleGen Systems(Madison,WI)、Illumina(San Diego,CA)和 VisiGenBiotechnologies(Houston,TX)提供的技术。此类核酸测序技 术包括诸如平行珠阵列、连接法测序、毛细管电泳、电子微芯片、“生 物芯片”、微阵列、平行微芯片和单分子阵列的格式，如由Service, Science 311:1544-46(2006)综述的。
在替代方面，可使用计算机方法来检测目标标记基因座。例如， 可将包含目标标记基因座的核酸的序列存储在计算机中。可使用如 通过例如在诸如BLAST的这样容易获得的程序中提供的或由甚至 简单的文字处理器提供的合适的核酸搜索算法来鉴定所需标记基因 座序列或其同源物。
上述标记类型中的任一种可用于本公开的上下文中以鉴定与矮 小相关联的短枝等位基因或短枝单倍型。
本公开的方法中使用的标记应当优选地是来源的诊断，以便对 随后的群体进行推论。迄今为止的经验表明，SNP标记对于作图可 以是理想的，因为特定SNP等位基因来源于特定物种的现存群体中 的独立来源的可能性非常低。因此，SNP标记似乎可用于QTL的追踪和辅助渐渗，特别是在基因型的情况下。
在一些方面，本文公开的玉米基因分型，包括SNP检测可以是 通过高通量、非破坏性种子取样。在一些方面，以该方式对单倍体 种子进行采样，并且仅将具有至少一个目标标记基因型的种子优先 用于加倍。已描述了用于种子的高通量、非破坏性取样的装置和方法，所述装置和方法通过允许个体种子分析来克服统计样本的障碍。 例如，美国专利申请序列号11/213,430(2005年8月26日提交的)、 美国专利申请序列号11/213,431(2005年8月26日提交的)、美国专 利申请序列号11/213,432(2005年8月26日提交的)、美国专利申请序列号11/213,434(2005年8月26日提交的)以及美国专利申请序列 号11/213,435(2005年8月26日提交的)、美国专利申请序列号 11/680,611(2007年3月2日提交的)(所述专利申请序列通过引用整 体并入本文)公开了用于种子自动取样的装置和***以及取样、测试 和散装种子的方法。
关联作图
在一个方面，本公开还提供用于进行全基因组关联作图的单倍 型、标记基因座、种质。示例性标记基因座和短枝等位基因列于表2 中。通过调查整个基因组中的遗传变异，进行全基因组关联作图以 找出各种复杂性状的关联信号。关联作图依赖于许多世代的染色体 重组机会，在一个物种的历史中，这允许去除QTL与不与其紧密连 锁的任何标记之间的关联，从而提高真实关联的发现率(Jannink and Walsh，Quantitative Genetics，Genomics and Plant Breeding，Kang，编辑 CAB International，(2002)第59-68页)。
用于将表型变异与遗传基因座发生关联的方法是标记-性状关联 (MTA)作图，也称为连锁不平衡(LD)作图。随着高通量基因分型技术 的出现，LD作图成为1990年代初的重要基因作图工具，并且已被 广泛应用于人类遗传学以鉴定影响人疾病的基因。该方法在2000年 代初被引入并开始在植物基因作图研究中被采用(Flint-Garcia等 (2003)AnnuRev Plant Biol 54：357-374)。
LD作图假定LD的主要原因是将同一染色体上的基因座结合在 一起传递到下一代的连锁。然而，由于自然群体中多代累积的重组 事件，每个染色体已经被深度改组，使得染色体已被分解成许多其 中基因座保持一起传递的微小区域，但来自不同区域的基因座倾向 于独立地传递，就如同它们来自不同的染色体。通常将其中基因座 结合在一起传递的染色体区域称为LD区块(Reich等(2001)Nature 411：199-204)。LD作图通过基因所位于的LD区块上的遗传标记鉴定 目标基因。这通过利用针对选择的一组覆盖候选基因区域或全基因 组的标记基因分型的以及针对一组目标性状基因分型的不相关个体 的样本或不相关谱系的样本，检测标记与基因所影响的性状之间的 显著关联性来进行。
与通常基于人工双亲分离群体(例如，F2、BC、DH、RIL等)的 传统连锁作图方法相比，LD作图通常由于LD区块的较小尺寸而产 生更好的作图分辨率。此外，LD作图可用于鉴定种质中相关标记处 的两个以上的功能等位基因。另外，LD作图对于评价自然群体是有效的。
QTL的鉴定
在一些方面，本文提供的标记、等位基因和单倍型可用于鉴定 与玉米植物高度和植物结构相关联的QTL。QTL鉴定的统计原理包 括惩罚回归分析、岭回归、单点标记分析、复杂谱系分析、贝叶斯 (Bayesian)MCMC、血缘同一性分析、区间作图、复合区间作图(CIM) 和Haseman-Elston回归。
SNP标记对于作图是理想的，因为特定SNP等位基因来源于特 定物种的现存群体中的独立来源的可能性非常低。因此，SNP标记 可用于QTL的追踪和辅助渐渗，特别是在单倍型的情况下。
另外的标记分子的遗传连锁可通过基因作图模型来建立，所述 模型诸如但不限于由Lander和Botstein，Genetics,121:185-199(1989) 报道的侧翼标记模型，和基于由Lander和Botstein,Genetics, 121:185-199(1989)描述的最大似然法并在软件包MAPMAKER/QTL (Lincoln和Lander,Mapping Genes Controlling Quantitative TraitsUsing MAPMAKER/QTL,Whitehead Institute for Biomedical Research,Massachusetts,(1990))中执行的区间作图。另外的软件包括Qgene, 2.23版(1996),Department of Plant Breeding and Biometry,266Emerson Hall,Cornell University,Ithaca,NY，其手册通过引用整体并入本文)。
计算标记存在的最大似然估计(MLE)以及假设没有QTL效应的 MLE，以避免假阳性。然后将比值比(odds ratio)的log10(LOD)计算为： LOD＝log10(没有给出连锁的QTL的QTL/MLE的存在的MLE)。LOD 评分实质上表示假设QTL存在比其不存在时数据更可能产生的程 度。对于给定的置信度(例如95％)，避免假阳性的LOD阈值取决于 标记的数量和基因组的长度。指示LOD阈值的图表示于Lander和 Botstein,Genetics,121:185-199(1989)中，并由Arús和 Moreno-González,Plant Breeding,Hayward,Bosemark,Romagosa(编 辑)Chapman&Hall,London，第314-331页(1993)进一步描述。
可使用另外的模型。已报道了对区间作图的许多改进和替代方 法，包括非参数方法(Kruglyak和Lander，Genetics,139:1421-1428 (1995)，其全部内容通过引用并入本文)的使用。还可使用多种回归 方法或模型，其中性状是在大量标记上进行回归的(Jansen,Biometrics in Plant Breed,van Oijen,Jansen(编辑)Proceedings of the NinthMeeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding,The Netherlands，第116-124页(1994)；Weber和Wricke,Advances in Plant Breeding,Blackwell,Berlin,16(1994))。将区间作图与回归分析相结 合的方法(借此将表型对给定的标记区间处的单个假定的QTL以及 同时对用作‘辅因子’的许多标记进行回归)已由Jansen和Stam，Genetics,136:1447-1455(1994)以及Zeng,Genetics,136:1457-1468 (1994)报道。通常辅因子的使用减少估计的QTL位置的偏差和取样 误差(Utz和Melchinger,Biometrics inPlant Breeding,van Oijen,Jansen (编辑)Proceedings of the Ninth Meeting of theEucarpia Section Biometrics in Plant Breeding,The Netherlands，第195-204页(1994))， 从而提高了QTL作图的精确度和效率(Zeng,Genetics,136:1457-1468 (1994))。这些模型可被扩展至多环境实验，以分析基因型-环境相互 作用(Jansen等，Theo.Appl.Genet.91:33-37(1995))。
本公开的组合物和方法可以用于指导MAS，或培育具有与优良 农艺性能(例如短枝状态或矮小状态)相关的等位基因形式的期望补 充(组)的玉米品种。可将任何公开的标记等位基因通过常规育种，经 由渐渗(或经由转化引入，或两者)引入玉米品系，以产生具有优良农 艺性能的玉米植物。
作为被设计来改善玉米结构并提高玉米产量的整体MAS育种 计划的一部分，可将这些标记基因座渐渗入任何所需基因组背景、 种质、植物、品系、品种等。
本公开还扩展至制备后代玉米植物的方法和所得的后代玉米植 物。在一个方面，所述方法包括将第一亲本玉米植物与第二玉米植 物杂交，并在植物生长条件下使玉米植物亲本生长以产生玉米植物 后代。杂交和生长玉米植物的方法完全在本领域普通技术人员的能 力之内。如本文所公开的，可测定此类玉米植物后代的短枝等位基 因，从而选择所需后代。此类后代植物或其种子可商业销售用于玉 米生产，用于食品，用于加工以获得所需玉米成分，或进一步用于 后续轮的育种。第一或第二玉米植物中的至少一种可以是本公开的 玉米植物，因为其包含本公开的标记的等位基因形式中的至少一种， 使得后代能够遗传该等位基因。
标记辅助选择(MAS)育种
本文中提供的多形态标记及其短枝等位基因可用于短枝玉米的 MAS育种。在一些方面，本文公开的多态性标记在致病基因的编码 序列内。它们对于MAS是理想的，因为预期在它们与负责表型的 DNA序列之间没有重组。标记不必包含或对应于因果突变来以便在MAS中有效。
在作物种类中开发分子标记可通过MAS增加植物育种的效率。 遗传标记用于鉴定在一个或多个基因座处包含所需基因型，并且预 期将所需基因型以及所需表型转移至其后代的植物。遗传标记可用 于鉴定在一个基因座处或在几个未连锁的或连锁的基因座(例如，单 倍型)处包含所需基因型，并且预期将所需基因型以及所需表型转移 至其后代的植物。本公开提供了鉴定具有短枝等位基因并因此为短 枝的或可以产生短枝植物的植物的手段。
鉴定包括与所需一个或多个性状连锁的一个或多个标记基因座 的植物或种质为进行MAS提供了基础。选择包含有利标记或有利等 位基因的植物，同时可选择包含与所需性状负相关的标记或等位基 因的植物。可将所需标记和/或等位基因渐渗入具有期望(例如，优良 或外来)遗传背景的植物中以产生具有所需性状的渐渗的植物或种 质。在一些方面，设想了相继或同时选择和/或渐渗用于所需性状的 多个标记。被选择用于单一植物的标记的组合不受限制，并且可包 括本文公开的标记或与本文公开的标记连锁的任何标记，或位于本 文定义的QTL区间内的任何标记的任意组合。
在一些方面，可将表现出所需性状的第一玉米植物或种质(供体， 例如，短枝玉米)与第二玉米植物或种质(受体，例如优良或外来玉米， 取决于在后代中所需特征)杂交以作为育种计划的一部分来产生渐渗 的玉米植物或种质。在一些方面，受体植物还可包含与一个或多个 所需性状相关联的一个或多个基因座，其可以是定性或定量的性状 基因座。在另一方面，受体植物可包含转基因。
在一些方面，相较于第一玉米植物或种质，受体玉米植物或种 质通常缺少所需性状，而相较于第二植物或种质，渐渗的玉米植物 或种质将显示出改善的性状。通过这些方法产生的渐渗的玉米植物 或种质也是本公开的特征。
MAS是选择所需表型并将所需性状渐渗入栽培种(例如，将所需 性状渐渗入优良品系)的强大捷径。MAS易于适应高通量分子分析方 法，所述方法可快速筛选出大量植物或种质遗传物质的目标标记， 并且比栽培并观察植物的可见性状更具成本效益。
使用MAS进行短枝性状的渐渗
本公开提供了使用MAS将短枝性状渐渗入新的玉米品种的方 法和标记。多种方法可用于实现渐渗。例如，通过同一物种的两个 亲本之间的杂交，可将指定的基因座处的所需等位基因的渐渗传递 给至少一个后代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基 因。或者，例如，等位基因的传递可通过两个供体基因组之间的重 组(例如，在融合的原生质体中，其中供体原生质体中的至少一个在 其基因组中具有所需等位基因)进行。所需等位基因可以是例如标记 的选定等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，包含所需等位基因的子代可以被反复回交至具有所需遗传背景的品系，并选择所 需等位基因，以使等位基因在选择的遗传背景中变得固定。
将一个或多个所需基因座从供体品系渐渗入另一个品系中可通 过与轮回亲本反复回交，同时进行选择以保留来自供体亲本的一个 或多个基因座来实现。在后代中测定与短枝性状相关的标记，并选 择具有一个或多个所需标记的那些后代以用于进一步处理。在另一 方面，可在后代中测定一个或多个标记，以选择具有农艺上优良的 亲本的基因型的植物。
通常预期性状渐渗活动将需要不止一代，其中将后代与轮回(农 艺上优良的)亲本杂交或自交。基于一个或多个与短枝性状连锁的标 记的存在进行选择，还可基于轮回亲本的基因型进行选择，其中基 于遗传标记和/或表型进行筛选。在另一方面，可将本公开的标记与 其它标记(理想地玉米基因组的每条染色体上至少一个)结合使用，以 追踪短枝性状至优良种质中的渐渗。利用该方法和组合物来整合短 枝性状在本公开的范围内。本发明人设想了本公开将用于开发具有 短枝性状和其它农艺上优良的表型的商业品种。
下面列出的是本公开的示例性实施方案。
实施方案1.一种用于选择玉米植物或种子的方法，所述方法包 括：
a.在玉米植物或种子的群体中检测在多态性基因座处包含短枝 等位基因的玉米植物或种子，其中所述多态性基因座与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记相关联；和
b.选择包含所述短枝等位基因的所述玉米植物或种子。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述多态性基因座 在选自由SEQ IDNo：1-22和86-109组成的组的所述标记的约20 cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内。
实施方案3.如实施方案1所述的方法，其中所述多态性基因座 选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组。
实施方案4.如实施方案1所述的方法，其中所述多态性基因座 与选自由SEQ IDNo：1-22和86-109组成的组的所述标记处于连锁 不平衡中，并且表现出为2或更大、3或更大、4或更大、5或更大、6或更大、7或更大、8或更大或9或更大的LOD评分。
实施方案5.如实施方案1所述的方法，其中所述方法包括将包 含所述短枝等位基因的第一玉米植物与第二玉米植物杂交以产生所 述玉米植物或种子的群体。
实施方案6.如实施方案5所述的方法，其中所述方法还包括与 所述第二玉米植物回交。
实施方案7.如实施方案1所述的方法，其中所述玉米植物或种 子的群体是分离群体。
实施方案8.如实施方案1所述的方法，其中所述玉米植物或种 子的群体是单倍体育种群体。
实施方案9.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(a)包括标 记测定。
实施方案10.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(a)包括 使用选自由SEQ IDNo：23和24组成的组的一种或多种引物。
实施方案11.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(a)包括 使用选自由SEQ IDNo：25和26组成的组的一种或多种探针。
实施方案12.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 或种子对于所述短枝等位基因是纯合的。
实施方案13.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物或 种子对于所述短枝等位基因是杂合的。
实施方案14.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 或种子是近交种子。
实施方案15.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 或种子是杂交种子。
实施方案16.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 或种子处于农艺上优良的背景中。
实施方案17.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 是矮秆的。
实施方案18.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 是半矮秆的。
实施方案19.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 是短枝的。
实施方案20.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 或种子包含Br2基因组区域的单基因转化。
实施方案21.如实施方案1所述的方法，其中所述玉米植物或 种子的群体来自一个或多个地方品种。
实施方案22.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 或种子相较于不具有所述短枝等位基因的对照植物，包含降低水平 的Br2 mRNA或蛋白。
实施方案23.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 或种子相较于不具有所述短枝等位基因的对照植物，包含降低的Br2 蛋白活性。
实施方案24.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 在成熟时的高度相较于不具有所述短枝等位基因的对照植物，降低 约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
实施方案25.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 的产量等于或大于不具有所述短枝等位基因的对照植物的产量。
实施方案26.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 需要比对照非短枝植物少约5％、10％、15％、20％或25％的热单位 来达到花开期。
实施方案27.如实施方案1所述的方法，其中所述选择的植物 具有比对照非短枝植物的相对成熟度少约10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％或45％的天数的相对成熟度。
实施方案28.如实施方案1所述的方法，其中所述短枝等位基 因以至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％ 或100％的准确度预测短枝性状。
实施方案29.一种用于选择玉米植物或种子的方法，所述方法 包括：
a.针对与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记相 关联的多态性基因座对玉米植物或种子的群体进行基因分型；和
b.选择在所述多态性基因座处包含短枝等位基因的玉米植物或 种子。
实施方案30.如实施方案29所述的方法，其中所述多态性基因 座在选自由SEQ IDNo：1-22和86-109组成的组的所述标记的约20 cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内。
实施方案31.如实施方案29所述的方法，其中所述多态性基因 座选自由SEQ IDNo：1-22和86-109组成的组。
实施方案32.一种产生包含至少一个与短枝性状相关联的等位 基因的玉米植物的群体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.对玉米植物的第一群体进行基因分型，所述群体包含至少一 个与短枝性状相关联的等位基因，其中所述至少一个短枝等位基因 与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记相关联；
b.从所述第一群体中选择一株或多株包含所述至少一个短枝等 位基因的玉米植物；和
c.从所述选择的玉米植物产生第二群体，从而产生包含所述至 少一个短枝等位基因的玉米植物的群体。
实施方案33.如实施方案32所述的方法，其中所述至少一个短 枝等位基因在选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的所述标 记的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围 内。
实施方案34.如实施方案32所述的方法，其中所述至少一个短 枝等位基因位于选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标记 处。
实施方案35.一种用于选择玉米植物或种子的方法，所述方法 包括：
a.从玉米植物或种子分离核酸；
b.分析所述核酸以检测与短枝单倍型相关联的多态性标记，所 述短枝单倍型包含选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组的标 记的1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5 个或更多个、6个或更多个、7个或更多个或8个或更多个短枝等位 基因；和
c.选择包含所述短枝单倍型的玉米植物或种子。
实施方案36.如实施方案35所述的方法，其中所述多态性标记 在所述短枝单倍型的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于 0.5cM的范围内。
实施方案37.如实施方案35所述的方法，其中所述多态性标记 选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组。
实施方案38.一种用于将短枝性状渐渗入玉米品种的方法，所 述方法包括：
a.将包含短枝性状的第一玉米品种与不包含所述短枝性状的第 二玉米品种杂交以产生一株或多株后代玉米植物；
b.分析所述一株或多株后代玉米植物以检测短枝等位基因，其 中所述短枝等位基因与选自由SEQ ID No：1-22和86-109组成的组 的标记连锁；和
c.选择包含所述短枝等位基因的后代玉米植物。
实施方案39.如实施方案38所述的方法，其中所述短枝等位基 因在选自由SEQ IDNo：1-22和86-109组成的组的所述标记的约20 cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM的范围内。
实施方案40.如实施方案39所述的方法，其中所述短枝等位基 因位于选自由SEQID No：1-22和86-109组成的组的所述标记处。
实施方案41.如实施方案39所述的方法，所述方法还包括：
d.将所述选择的后代植物与其自身或与所述第二玉米植物杂交 以产生一种或多种另外的后代玉米植物；和
e.选择包含所述短枝等位基因的另外的后代植物。
实施方案42.如实施方案41所述的方法，其中选择的步骤(e) 包括标记辅助选择。
实施方案43.一种杂交矮秆或半矮秆玉米品种或其植物部分， 其包含特征在于选自由SEQ ID No：27-48组成的组的一个或多个序 列的短枝等位基因。
实施方案44.如权利要求43所述的杂交矮秆或半矮秆玉米品种 或其植物部分，其中所述品种对于所述短枝等位基因是纯合的。
实施方案45.如权利要求43所述的杂交矮秆或半矮秆玉米品种 或其植物部分，其中所述品种是转基因的。
实施方案46.如实施方案1所述的方法，其中所述方法还包括 针对选自由SEQ IDNo：71-75组成的组的一个或多个多态性序列对 所述玉米植物或种子的群体进行基因分型。
实施方案47.如实施方案1所述的方法，其中所述步骤(a)还包 括检测选自由SEQID No：71-75组成的组的多态性基因座处的短枝 等位基因。
实施方案48.如实施方案29所述的方法，其中所述方法还包括 针对选自由SEQ IDNo：71-75组成的组的一个或多个多态性序列对 所述玉米植物或种子的群体进行基因分型。
实施方案49.如实施方案29所述的方法，其中所述方法还包括 选择包含选自由SEQ ID No：76-80组成的组的短枝等位基因的玉米 植物或种子。
实施方案50.如实施方案32所述的方法，其中所述方法还包括 针对选自由SEQ IDNo：71-75组成的组的一个或多个多态性序列对 所述玉米植物的第一群体进行基因分型。
实施方案51.如实施方案32所述的方法，其中所述方法的步骤 (a)还包括对选自由SEQ ID No：76-80组成的组的至少一个短枝等位 基因进行基因分型。
实施方案52.如实施方案35所述的方法，其中所述方法还包括 分析所述核酸以检测选自由SEQ ID No：71-75组成的组的一个或多 个多态性序列。
实施方案53.如实施方案35所述的方法，其中所述方法的步骤 (b)还包括分析所述核酸以检测选自由SEQ ID No：76-80组成的组的 至少一个短枝等位基因。
具体实施方案
实施例1.短枝和非短枝植物小组中的Br2基因组区域的测序。
在23个专有玉蜀黍近交系的集合(表1)中进行Br2基因组区域 的靶向测序。以下将此品系集合称为BR2P_v1小组。所述小组包括 来自北美的4个短枝品系、来自墨西哥的6个短枝品系、来自意大 利的2个短枝品系以及1个未知来源的短枝品系。北美和墨西哥的近交系均来源于源自巴西的短枝种质资源。意大利的近交系来自独 立的欧洲短枝种质资源。所述小组还包括来自这些相同地区的10个 非短枝品系以用于比较。
Multani等鉴定了Br2基因的基因组序列，并将其以GenBank登 录号AY366085保藏。见Science，302(5642)81-84(2003)。Br2被注释 来编码类似于P-糖蛋白(PGP)的多重耐药性(MDR)种类的三磷酸腺 苷(ATP)结合盒转运蛋白的推定蛋白质。分析来自含Br2基因的基因 组区域的内部重叠群序列，并在表1中将其命名为Mon B73。
为了对Br2基因组区域进行测序，通过使用DNAStar比对Br2 基因的Mon B73序列来设计16组引物。这些引物可扩增整个Br2 基因组基因，包括1kb的上游侧翼序列和2kb的下游侧翼序列(总共 约11,000bp)。使用从BR2P_v1小组中的每个品系提取的基因组DNA 进行PCR扩增。PCR热循环条件包括在98℃下30秒，35个循环(在 98℃下5秒，在60℃下5秒，在72℃下15秒)，在72℃下1.0分钟。 对于50μl体积的PCR反应，使用10ng/μl的基因组DNA、10μM 的每种引物(正向和反向)和1x Phire Hot Start II DNA聚合酶PCR混 合物(ThermoScientific)。然后用ExoSap方案(Affymetrix)净化PCR 产物，并提交用于Sanger测序。使用SeqMan Pro将序列重叠群组装 成完整的Br2基因组序列以用于随后的多态性鉴定。
表1：用于Br2(PGP1)基因组区域的靶向测序的参考品系和 BR2P_v1小组
Figure BDA0003491032120000501
Figure BDA0003491032120000511
*BR2：非短枝表型；**br2：短枝表型；干na：不可用的；I294213 (见美国专利7,166,779)；I285291(见美国专利7,211,717)；CV995128 (见美国专利8,319,066)；CV760185(见美国专利8,581,076)；“性别” 表示品系以何种方式用于杂种构成组合；M(雄性)；F(雌性)。
实施例2.新的br2多态性的鉴定
除了Br2基因组区域以外，还从BR2P_v1小组收集Br2基因的 下游区域的序列数据。基于从BR2P_v1小组获得的Br2基因组和下 游序列鉴定序列多态性。总共鉴定了190个多态性，包括SNP和 INDEL。多态性被定义为23个测序的品系中的任一个相较于参考序 列(MON_B73或AY366085)之间或BR2P_v1小组中所述品系中的任 一个相互比较之间的DNA序列差异。取决于多态性的位置，也确定 了由多态性导致的任何氨基酸变化。
分析190个鉴定的多态性与短枝表型的一致性。其中，SEQ ID No：1-22中显示的多态性与BR2P_v1小组中的墨西哥和北美品系中 的短枝表型完全一致(表2)。一致性被定义为来自墨西哥和北美的所 有短枝品系具有来自列出的多态性的一个等位基因，并且所有其它 品系具有不同的等位基因。
Pilu等先前报道了在Br2基因的3'末端具有8-bp缺失的br2-23 等位基因，并且断定了它们的br2-23植物中该缺失和短枝表型之间 的直接关系。见Pilu等，MolecularBreeding,20:83-91(2007)；也见， Cassani等，Plant Growth Regul.,64(2):185-92(2011)。在BR2P_v1小 组中存在相同的8-bp缺失，此处将其命名为“8-bp缺失”。基于AY366085基因组序列参考，8-bp缺失始于Br2 mRNA序列中的4148 位。在没有8-bp缺失的情况下，Br2(PGP1)蛋白具有来自受影响的 密码子的氨基酸残基N-G-W(天冬酰胺-甘氨酸-色氨酸)。尽管8-bp 缺失导致移码，但新序列仍然编码N(天冬酰胺)，接着是G-W(甘氨 酸-色氨酸)。这是因为缺失的8-bp序列是小的四核苷酸重复的一部 分，导致蛋白质中重复的氨基酸残基。由于移码，预计8-bp缺失导 致从翻译的Br2蛋白中去除三个氨基酸。然而，尚不清楚丢失的氨 基酸对Br2蛋白功能有什么影响(如果有的话)。
与Pilu等描述的内容相反，BR2P_v1小组中的8-bp缺失与短枝 表型不一致。然而，该缺失与来源于北美、墨西哥和意大利的非短 枝雄性品系相一致(在表3中以粗体文本突出显示)。这表明单独的 8-bp缺失和短枝表型之间没有直接的关系。
Figure BDA0003491032120000531
Figure BDA0003491032120000541
Figure BDA0003491032120000551
表3：BR2P_v1小组中的8-bp缺失的调查。
样本ID 8-bp缺失 短枝状态
MON_B73 无缺失 BR2
AY366085 无缺失 BR2
MPL1 无缺失 br2
MPL2 无缺失 br2
MPL3 无缺失 br2
MPL4 无缺失 br2
MPL5 无缺失 br2
MPL6 无缺失 br2
MPL7 无缺失 br2
MPL8 无缺失 br2
MPL9 无缺失 br2
MPL10 无缺失 br2
MPL11 无缺失 br2
MPL12 无缺失 br2
MPL13 无缺失 br2
I294213 无缺失 BR2
I285291 缺失 BR2
CV995128 无缺失 BR2
CV760185 缺失 BR2
MPL14 无缺失 BR2
MPL15 无缺失 BR2
MPL16 缺失 BR2
MPL17 缺失 BR2
MPL18 缺失 BR2
MPL19 无缺失 BR2
实施例3.多态性标记SEQ ID 7的预测能力。
SEQ ID 7在Br2外显子4中提供了具有短枝等位基因(T等位基 因)和非短枝等位基因(G等位基因)的单核苷酸多态性(SNP)。该SNP 位于基于AY366085的Br2(PGP1)的mRNA序列的1560位，且对应 于蛋白质的第520个氨基酸残基。由于两个等位基因提供亮氨酸的密码子，所以该SNP导致同义取代(表4)。
在BR2P_v1小组中具有短枝表型的墨西哥和北美品系携带SEQ ID 7的短枝等位基因(T等位基因)。非短枝品系携带非短枝等位基因 (G等位基因)。短枝性状是隐性的。使用BR2P_v1小组中不存在的 另外的玉米品种进一步测试SEQ ID7与短枝状态之间的关联。SEQID 7对于预测北美品系(n＝20)中的短枝状态有100％的准确度，且对 于墨西哥品系(n＝47)有98％的准确度。SEQ ID 7对于预测意大利品 系(n＝14)中的短枝状态有50％的准确度(表5)。这些结果显示，SEQ ID 7与墨西哥和北美品系中的短枝性状高度相关，但在意大利品系 中相关性没有这么高。
表4：用于检测多态性SEQ ID 7的引物和探针。
Figure BDA0003491032120000571
T＝短枝(br2)；G＝非短枝(Br2)
实施例4.内含子剪接分析
SEQ ID 7已在来自墨西哥的一小组短枝和非短枝材料上获得验 证，并且发现96％预测为短枝表型。由于验证小组中的几个非短枝 墨西哥品系经基因分型具有短枝TT等位基因，因此可能存在对这些 品系中的短枝性状具有功能性作用的另外的多态性。BR2P_v1小组 中与短枝表型完全一致的另外10个多态性位于内含子3和内含子4 中。这表明这些多态性可影响内含子/外显子剪接接合，并因此改变 mRNA加工。
VISTA-Point(可在网页pipeline.lbl.gov/cgi-bin/gateway2获得)用 于在单子叶植物中的成对比较中发现内在保守的岛。鉴定了基于 AY366085序列的PGP1基因的剪接位点基序、分支点和保守区。标 记SEQ ID 8在内含子4的起始点和假定剪接位点的最后一个核苷酸 处含有5′-GTCCGT-3′***。该***序列包括共有剪接位点核苷酸 “GTNNGT”(Reddy等，Annu.Rev.Plant Biol.58：267-94(2007))。该插 入与外显子4的3′末端和可能的剪接位点的接近度表明高的功能性 概率。
表5：SEQ ID 7准确度的表征。
Figure BDA0003491032120000581
Figure BDA0003491032120000591
表6：用于预测北美或墨西哥来源的品系中的短枝性状的SEQ ID 7准确度的进一步验证。
Figure BDA0003491032120000592
实施例5：使br2短枝等位基因渐渗以产生新的短枝品种。
将包含本文公开的短枝等位基因的玉米植物与包含所需性状(例 如，在干旱、寒冷、热胁迫条件下提高的产量)的另一种非短枝玉米 品系杂交。测定来自该杂交的F1后代植物的表2中举例说明的一个 或多个SNP标记，以选择短枝等位基因。然后将选择的F1后代植物 与包含所需性状的亲本非短枝玉米品系(轮回亲本)回交。来自BC1 代的植物也使用表2中举例说明的SNP标记进行基因分型，以选择 短枝等位基因。在多轮回交(例如，5-7代)后，获得了在轮回亲本优 良品系中包含所需性状的新的短枝玉米品系。
实施例6：外显子5中的另外的Br2多态性。
在Br2编码序列的外显子5中鉴定了另外的Br2多态性。这些多态 性序列列于表7中。标记是从这些多态性开发出来的，并且可自身用 于或与表2中列出的一种或多种多态性组合用于监测短枝性状。
表7：Bt2编码序列的外显子5中鉴定的另外的多态性。
Figure BDA0003491032120000601
1AY366085上的基因组位置，始于编码区的第一个核苷酸，并 且包括内含子。
2mRNA位置，始于编码区的第一个核苷酸并且不包括内含子。
实施例7：墨西哥和北美品系的另外的Br2多态性和标记。
表1中的BR2P_v1小组的进一步测序揭示了更多的Br2多态性 序列，并且还为先前鉴定的多态性提供了更新的序列信息。这些新 的多态性序列和标记，包括它们的示例性短枝和非短枝等位基因列 于表8中。表8的多态性与BR2P_v1小组中的墨西哥和北美品系中的短枝表型完全一致。
Figure BDA0003491032120000611
Figure BDA0003491032120000621
Figure BDA0003491032120000631
Figure BDA0003491032120000641
在这些新标记中，SEQ ID No：86和87位于与SEQ ID No：1至4相同 的区域中，并为先前的四种多态性标记提供更新的序列。SEQ ID No：88表 示SEQ ID No：9和10中的多态性的整合。
实施例8：意大利品系的另外的Br2多态性和标记。
另外的意大利短枝品系的进一步测序提供了与来自表1的BR2P_v1小 组的意大利品系中的短枝表型相一致的新的Br2多态性标记(SEQ ID No：95， 表9)。该标记对于意大利来源的短枝品系是独特的。SEQ ID No：95的非短 枝等位基因包含579-bp的***。
还在意大利短枝品系(表9)中鉴定了另外的多态性(SEQ ID No：96至 109，表9)。令人惊讶的是，这些标记虽然对意大利短枝品系而言是独特的， 但短枝等位基因似乎与参考B73(非短枝)序列相似。
针对SEQ ID No：95估计标记选择准确度。在SEQ ID No：95处进行基 因分型的34个意大利品系中，8个品系是短枝的，且另外26个品系是非短 枝的。8个短枝品系中有7个携带579-bp的***(短枝等位基因，***序列 显示于SEQ ID No.110中)，而26个非短枝品系均不携带这样的***。因此， 总体预测准确度为97％(表10)。用于对标记SEQ ID No：95进行基因分型的 示例性引物和探针序列列于表11中。
表10：针对意大利品系的SEQ ID No.95标记准确度的表征。
Figure BDA0003491032120000651
表11：用于检测多态性SEQ ID No.95的引物和探针。
Figure BDA0003491032120000652
Figure BDA0003491032120000661
由于可在不脱离本公开的范围的情况下在本文描述和举例说明的构 造和方法中进行各种修改，所以上述说明书中包含的所有内容意欲应被 解释为说明性的且不是限定性的。本公开的宽度和范围不应该由上述示 例性实施方案中的任一个限制，而是应仅根据以下所附权利要求及其等 同物来限定。本说明书中引用的所有专利和非专利文献通过引用整体并 入本文。
Figure IDA0003491032160000011
Figure IDA0003491032160000021
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Figure IDA0003491032160000171
Figure IDA0003491032160000181
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Figure IDA0003491032160000221
Figure IDA0003491032160000231
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Figure IDA0003491032160000271
Figure IDA0003491032160000281
Figure IDA0003491032160000291
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Claims (18)

1.一种选择玉米植物或种子的方法，所述方法包括：
a.将在多态性基因座处包含至少一个短枝等位基因的第一玉米植物与第二玉米植物杂交以产生玉米植物或后代种子的后代群体；
b.进行标记测定以在所述玉米植物或后代种子的后代群体中检测在选自SEQ ID NO:5、6、8、11-22和86-95的多态性基因座处包含短枝等位基因的玉米植物或种子；和
c.选择包含所述短枝等位基因的所述玉米植物或种子；和
其中：
SEQ ID NO:5处的所述短枝等位基因包含从第70位开始的3个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:6处的所述短枝等位基因在第70位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:8处的所述短枝等位基因包含从第72位开始的GTCCGT核苷酸***，
SEQ ID NO:11处的所述短枝等位基因在第62位包含A核苷酸，
SEQ ID NO:12处的所述短链等位基因在第70位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:13处的所述短枝等位基因在第72位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:14处的所述短链等位基因在第72位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:15处的所述短枝等位基因在第72位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:16处的所述短枝等位基因在第72位包含A核苷酸，
SEQ ID NO:17处的所述短链等位基因在第72位包含C核苷酸，
SEQ ID NO:18处的所述短枝等位基因在第72位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:19处的所述短枝等位基因在第72位包含C核苷酸，
SEQ ID NO:20处的所述短枝等位基因在第72位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:21处的所述短枝等位基因在第72位包含C核苷酸，
SEQ ID NO:22处的所述短枝等位基因包含从第72位开始的CTCG核苷酸***，
SEQ ID NO:86处的所述短枝等位基因包含从第72位开始的6个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:87处的所述短枝等位基因包含从第76位开始的TG核苷酸***，
SEQ ID NO:88处的所述短枝等位基因包含从第66位开始的GGTA核苷酸***，
SEQ ID NO:89处的所述短枝等位基因包含从第71位开始的6个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:90处的所述短链等位基因在第77位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:91处的所述短枝等位基因包含从第60位开始的TT核苷酸***，
SEQ ID NO:92处的所述短枝等位基因包含从第63位开始的多千碱基***，
SEQ ID NO:93处的所述短枝等位基因包含从第51位开始的85个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:94处的所述短枝等位基因包含从第52位开始的18个核苷酸***，或
SEQ ID NO:95处的所述短枝等位基因包含从第66位开始的579个核苷酸***。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述选择的玉米植物或从所述种子生长的玉米植物与所述第二玉米植物回交。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述选择的玉米植物或种子对于所述短枝等位基因是纯合的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述选择的玉米植物或从所述种子生长的玉米植物在成熟时的高度相较于不具有所述短枝等位基因的对照植物，降低10％-70％。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述选择的玉米植物或从所述种子生长的玉米植物的产量等于或大于不具有所述短枝等位基因的对照植物的产量。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述选择的玉米植物或从所述种子生长的玉米植物需要比不具有所述短枝等位基因的对照植物少5％-25％的热单位来达到花开期。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述选择的玉米植物或从所述种子生长的玉米植物具有比不具有所述短枝等位基因的对照植物的相对成熟度少10％-45％的天数的相对成熟度。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述短枝等位基因以至少50％的准确度预测短枝性状。
9.一种产生玉米植物的群体的方法，所述方法包括：
a.对玉米植物的第一群体进行基因分型，所述群体包含多态性基因座的至少一个短枝等位基因，其中所述多态性基因座选自SEQ ID NO:5、6、8、11-22和86-95；
b.从所述第一群体中选择一株或多株包含所述至少一个短枝等位基因的玉米植物；和
c.将所述选择的一株或多株玉米植物杂交或自交以产生第二群体，其中所述玉米植物的第二群体包含所述至少一个短枝等位基因，和
其中：
SEQ ID NO:5处的所述短枝等位基因包含从第70位开始的3个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:6处的所述短枝等位基因在第70位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:8处的所述短枝等位基因包含从第72位开始的GTCCGT核苷酸***，
SEQ ID NO:11处的所述短枝等位基因在第62位包含A核苷酸，
SEQ ID NO:12处的所述短链等位基因在第70位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:13处的所述短枝等位基因在第72位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:14处的所述短链等位基因在第72位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:15处的所述短枝等位基因在第72位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:16处的所述短枝等位基因在第72位包含A核苷酸，
SEQ ID NO:17处的所述短链等位基因在第72位包含C核苷酸，
SEQ ID NO:18处的所述短枝等位基因在第72位包含G核苷酸，
SEQ ID NO:19处的所述短枝等位基因在第72位包含C核苷酸，
SEQ ID NO:20处的所述短枝等位基因在第72位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:21处的所述短枝等位基因在第72位包含C核苷酸，
SEQ ID NO:22处的所述短枝等位基因包含从第72位开始的CTCG核苷酸***，
SEQ ID NO:86处的所述短枝等位基因包含从第72位开始的6个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:87处的所述短枝等位基因包含从第76位开始的TG核苷酸***，
SEQ ID NO:88处的所述短枝等位基因包含从第66位开始的GGTA核苷酸***，
SEQ ID NO:89处的所述短枝等位基因包含从第71位开始的6个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:90处的所述短链等位基因在第77位包含T核苷酸，
SEQ ID NO:91处的所述短枝等位基因包含从第60位开始的TT核苷酸***，
SEQ ID NO:92处的所述短枝等位基因包含从第63位开始的多千碱基***，
SEQ ID NO:93处的所述短枝等位基因包含从第51位开始的85个核苷酸缺失，
SEQ ID NO:94处的所述短枝等位基因包含从第52位开始的18个核苷酸***，或
SEQ ID NO:95处的所述短枝等位基因包含从第66位开始的579个核苷酸***。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述玉米植物的群体是杂交矮化或杂交半矮化品种。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述选择的玉米植物或种子是杂种。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法进一步包括将来自所述第二群体的至少一株玉米植物与来自所述第一群体的玉米植物回交。
13.根据权利要求9的方法，其中所述基因分型包括标记测定。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述玉米植物的第二群体对于所述短枝等位基因是纯合的。
15.根据权利要求14所述的方法，其中来自所述第二群体的玉米植物在成熟时的高度相较于不具有所述短枝等位基因的对照植物，降低10％-70％。
16.根据权利要求14所述的方法，其中来自所述第二群体的玉米植物的产量等于或大于不具有所述短枝等位基因的对照植物的产量。
17.根据权利要求14所述的方法，其中来自所述第二群体的玉米植物需要比不具有所述短枝等位基因的对照植物少5％-25％的热单位来达到花开期。
18.根据权利要求14所述的方法，其中来自所述第二群体的玉米植物具有比不具有所述短枝等位基因的对照植物的相对成熟度少10％-45％的天数的相对成熟度。
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