CN114574603A - 荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的rpa-lfs检测引物探针组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA‑LFS检测引物探针组合及其应用；本发明的引物探针组合具有很好的特异性，对其他的菌株均无交叉扩增，能检测1CFU/ul的流感嗜血杆菌，并且检测灵敏度不受其他病原菌的干扰。本研究与双重PCR检测的结果一致，分别从209份样本中检出203份流感嗜血杆菌和63份荚膜型流感嗜血杆菌，检出率分别为97.1％和63.2％。RPA‑LFS与双重PCR具有相同的实际应用性。本研究成功建立了基于Omp6和BexA基因检测荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA‑LFS检测方法，为后续快速检测流感嗜血杆菌提供了方案，确保了患者的及时诊断和抗生素治疗。

Description

荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA-LFS检测引物探针组 合及其应用
技术领域
本发明涉及荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA-LFS检测引物探针组合及其应用。
背景技术
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，H.influenzae)是一类革兰氏阴性菌，。流感嗜血杆菌可以分为荚膜型和非荚膜型，荚膜型流感嗜血杆菌按血清学实验结果可分为6种，分别为a型、b型、c型、d型、e型和f型。研究发现，不同地区血清型分布差异很大，其中b型流感嗜血杆菌致病性最强可以造成严重的脑膜炎和脓毒症等。在一些发达国家，已经使用b型H.influenzae结合疫苗进行常规免疫，并显著降低了与b型H.influenzae相关的疾病的发病率，但大部分国家的发病率仍然较高。目前，传统的细菌培养法是检测流感嗜血杆菌的金标准，但流感嗜血杆菌是苛养菌，培样营养要求高，除需厌氧环境外还需要一些特殊的生长因子，且培养时间较长，操作工序繁杂，因此流感嗜血杆菌培养分离率一直较低。这无疑延误患者的诊断与治疗时间并加速病情的恶化，快速、准确检测流感嗜血杆菌并能鉴别出流感嗜血杆菌分型的方法迫在眉睫。
随着分子诊断技术的快速发展，PCR技术已经被广泛应用于各种微生物检测。TIANGuo Zhong建立了基于16S RNA基因检测流感嗜血杆菌的PCR方法。该方法检出流感嗜血杆菌敏感性为97.53％，但该方法不能鉴别出荚膜型和非荚膜型的流感嗜血杆菌。R.J.VANKETEL等基于Omp6和bexA基因建立了PCR检测荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的方法，该方法根据荚膜相关蛋白bexA基因只存在于荚膜型流感嗜血杆菌，Omp6基因存在于所有流感嗜血杆菌中，成功建立了能够区分不同分型流感嗜血杆菌的PCR方法。但该方法依赖于昂贵的仪器设备和专业的操作技术人员。Qilong Cao等人建立了基于Omp6基因检测流感嗜血杆菌的MCDA-LFB(the multiple cross displacement amplification and nanoparticle-based lateral flow biosensor)方法，该方法能在58–65℃反应1h，结合胶体金试纸条的方法快速检测流感嗜血杆菌。该方法虽然不依赖于昂贵的仪器设备，但存在引物设计复杂、反应时间较长以及假阳性等风险。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplication，RPA)技术是最近兴起的恒温扩增技术，与其他技术相比该技术具有更好的特异性、灵敏度和操作便携性。RPA利用重组酶打开双链并使引物与目的片段结合，利用具有链置换活性的聚合酶Bsu识别引物3’端进行稳定扩增，只需在30-45℃反应20min即可获得大量的扩增产物。因此，该技术不依赖于精密的仪器设备和专业的操作人员。RPA扩增产物可以使用凝胶电泳、荧光检测法和胶体金试纸条法。与凝胶电泳、荧光检测法等不同的是，胶体金试纸条该技术是利用抗原-抗体结合原理实现扩增产物的检测。通过在RPA反应体系中加入一条5’端标记FITC的探针，并使反向引物的5‘端标记Biotin，以获得两端均带有标记的扩增产物。并将扩增产物使用特异性标记的试纸条检测，根据检测线是否显色实现检测扩增产物的目的。RPA技术与胶体金试纸条结合进一步增加了该技术的定点检测特性。目前，RPA-LFS已经被应用于各种病原菌检测当中，如：金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌等。
发明内容
本发明利用RPA-LFS技术建立了基于Omp6基因和bexA基因的快速鉴别荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的方法，该方法满足了快速、灵敏、便携的定点检测需求。
为了区分荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌，分别在Omp6基因和bexA基因的保守区设计了两对引物(表1)，每两对引物用于检测非包膜流感嗜血杆菌和荚膜流感嗜血杆菌。其中omp6-F1/R1和bexA-F2/R2的扩增条扩增效率更高。于是对omp6-F1/R1和bexA-F2/R2进行了后续实验。
表1：引物设计表
Figure BDA0003568437840000031
为了提高特异性和灵敏度，在引物对omp6-F1/R1和bexA-F2/R2的靶区设计了相应的探针。虽然探针的引入可以减少引物二聚体的产生，但假阳性信号仍然无法避免。假阳性信号主要是由于探针和反向引物之间可以形成具有稳定扩增能力的二聚体。我们使用Primer Premier 5软件分析设计的探针和反向引物之间形成的二聚体，每个探针和相应的反向引物都有一定的互补片段，有的覆盖THF位点或暴露反向引物的3'-OH末端。这些二聚体可以被聚合酶Bsu稳定扩增，因此，假阳性信号会不断被放大。研究表明，RPA可以耐受一定的碱基错配而不影响扩增效率，许多研究已经成功地将这一理论应用于RPA-LFS方法的建立中。因此，为了避免假阳性，我们在探针和正向和反向引物上引入了错配碱基，以减少探针和反向引物之间二聚体的产生。引入错配碱基的原则是：1.探针和反向引物的连续互补碱基不超过3个；2.探针和引物的互补区不覆盖THF位点；3.反向引物3'端与探针互补配对不超过3个碱基，4.优先使用A-G和T-C互换。通过引入错配，我们成功筛选出合适的探针和反向引物。
为了验证bexA-F3/R1B/P只能扩增荚膜流感嗜血杆菌，而omp6-F3/R1B/P可以扩增所有的非流感嗜血杆菌。用这两个基因对应的两个引物分别扩增收集的10株非荚膜型流感嗜血杆菌和10株荚膜型流感嗜血杆菌(均已用传统培养方法验证)。结果如图2A和B所示，omp6-F3/R1B/P可以检测出所有未包膜的流感嗜血杆菌，而bexA-F3/R1B/P只能检测包膜型流感嗜血杆菌，证明使用bexA-F3/R1B/P和omp6-F3/R1B/P引物可以正确识别包膜和非包膜流感嗜血杆菌。并且验证了omp6-F3/R1B/P只能扩增流感嗜血杆菌对其他病原体没有特异性，我们选择了23种病原体进行种间特异性验证。结果表明，只有流感嗜血杆菌在检测线和控制线均出现红色条带，而其他23种病原体仅在控制线出现红色条带。
本发明所达到的有益效果是：
本发明的方法具有更高的灵敏度和特异性，并且引物设计简单，不依赖于昂贵的仪器设备等。本研究在不影响引物扩增效率的前提下，通过在探针和引物上引入错配，从而解决了引物二聚体造成的假阳性问题。为能准确判断流感嗜血杆菌的分型易于后续的抗生素治疗，本研究在Omp6和BexA基因上分别设计了特异性的正反引物和探针，能分别筛选出荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌。同时对Omp6基因上引物的特异性进行了验证，结果表明该引物具有很好的特异性，对其他的菌株均无交叉扩增。为了验证两对引物的灵敏度，分别检测了标准荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌，同时在不同浓度的流感嗜血杆菌灭活菌液中加入等量的105cfu的肺炎链球菌，结果发现该方法的能检测1CFU/ul的流感嗜血杆菌，并且检测灵敏度不受其他病原菌的干扰。临床样本检测结果表明，本研究与双重PCR检测的结果一致，分别从209份样本中检出203份流感嗜血杆菌和63份荚膜型流感嗜血杆菌，检出率分别为97.1％和63.2％。RPA-LFS与双重PCR具有相同的实际应用性。本研究成功建立了基于Omp6和BexA基因检测荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA-LFS检测方法，为后续快速检测流感嗜血杆菌提供了方案，确保了患者的及时诊断和抗生素治疗。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1显示了引物和探针的筛选；
图2显示了omp6-F3/R1B/P和bexA-F3/R1B/P对荚膜和非荚膜流感病毒的鉴别验证；
图3显示了使用RPA-LFS对OMP6-F3/R1B/P进行特异性检测；
图4显示了RPA-LFS***的检测限。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
细菌菌株和基因组模板制备
非荚膜型流感嗜血杆菌(ATCC No.49247)和荚膜型流感嗜血杆菌(ATCC 9334)购自上海柯维化工科技有限公司。从痰液中分离出10株流感嗜血杆菌(Non-Podoconiosis)和10株流感嗜血杆菌(Podoconiosis)。其他23种常见病原菌由本实验室提供用于验证基于Omp6基因的RPA-LFS方法的特异性，包括醋酸钙不动杆菌、洛氏不动杆菌、溶血不动杆菌、朱尼不动杆菌、约氏不动杆菌、白色念珠菌，阴沟肠杆菌，粪肠球菌，大肠杆菌O157，结核分枝杆菌H37Ra株，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌，人葡萄球菌，腐生葡萄球菌，沃氏葡萄球菌，嗜麦芽窄食，肺炎链球菌，草绿色链球菌，肺炎克雷伯氏菌,鲍曼不动杆菌。从连云港市第一人民医院、连云港市第二人民医院、连云港市第三人民医院、淮安市第一人民医院、宿迁人民医院等连云港市各医院及周边城市医院共采集疑似流感嗜血杆菌感染患者的痰液样本209份。所有细菌菌株或样品在作为模板之前在100℃下孵育10分钟。如果未指定，则以105CFU/mL的1μL热处理培养物作为模板。
RPA引物
使用Primer Premier 5.0软件(Premier Biosoft International,CA,USA)设计了分别基于Omp6和BexA基因保守序列的两对RPA引物。对于引物，在输入特定靶向区域的序列后，参数设置如下：产物大小设置为100bp-300bp。引物大小设置为30bp-35bp。获得的引物对如果在3′末端存在超过三个连续碱基的互补配对，则该引物对将被放弃。然后使用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上的Primer-BLAST确认引物和探针的序列的物种特异性。
RPA反应
根据制造商的说明，使用
Figure BDA0003568437840000061
Liquid DNA Amplification Kit(TwistDxInc.,Maidenhead,UK)进行RPA反应。50μL反应体系包含25μL2×反应缓冲液、5μL 10×Basic e-mix、2.5μL 20×core mix、2.4μL 10μM正向引物、2.4μL 10μM反向引物和9.2μL蒸馏水。将2.5μL的280mM醋酸镁和1μL的模板添加到反应管的盖子中。短暂离心后，将反应混合物在37℃下孵育30分钟。使用PCR清洁试剂盒(上海明治生物技术有限公司，中国上海)纯化RPA扩增产物，并在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。
RPA-LFS探针设计
使用Primer Premier 5软件分别在Omp6和bexA基因的正向和反向引物靶向序列之间的设计特异性探针，理论上尽可能避免探针和反向引物之间形成二聚体、发夹结构等。设计原则为：(1)探针大小为46-51bp，GC含量为20-80％，Tm为57-80℃；(2)最大发夹分数为9，最大引物-二聚体分数设置为9。最大poly-X设置为5，其他参数设置为默认值；(3)探针5'端用FITC标记，3'端用SpC3封闭，探针中间的碱基换成四氢呋喃(THF)，在THF位点之前至少有30bp碱基，而后至少有15bp的碱基；(4)反向引物的5'端用生物素标记。
RPA-LFS反应
使用
Figure BDA0003568437840000062
DNA Amplification nfo Kit(TwistDx)建立RPA-LFS反应。反应混合物由29.5μL再水化缓冲液、2.1μL 10μM正向引物、2.1μL10μM反向引物、0.6μL 10μM探针和12.2μL蒸馏水组成。为了启动反应，将1μL模板和2.5μL 280mM醋酸镁添加到混合物中。短暂离心后，将反应混合物在30-45℃下孵育30分钟。
由于胶体金试纸的灵敏度非常高，只需少量扩增产物即可，若产品浓度过高时需适当稀释。总共2μL扩增产物用于LFS检测(Ustar Biotechnologies Ltd.，杭州，中国)。将扩增产物添加到LFS的样品垫中，将LFS的棒***100μL样品缓冲液(Ustar Biotech)中2分钟，然后目测检测结果。
RPA-LFS技术的检测限
将ddH2O连续10倍梯度稀释灭活标准荚膜型流感嗜血杆菌ATCC9334(b型)和非荚膜型流感嗜血杆菌(106～100CFU)并用作RPA-LFS检测的模板。为了确定其他菌株的污染是否会干扰检测灵敏度，将105CFU/μL热失活的肺炎链球菌培养物添加到灭活的荚膜型流感嗜血杆菌ATCC9334(b型)和非荚膜流感嗜血杆菌培养物的梯度稀释液中(106–100CFU/μL)，并分别进行RPA-LFS的灵敏度检测。
双重PCR
本实验以赵瑛等人建立的基于Omp6基因和bexA基因的双重PCR方法作为对照组，引物见表1。PCR反应总体积50μl，含2.5mol/L dNTP，omp6基因和bexA基因的上游引物和下游引物各250nmol/L，2.5U Ex-Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，2μl模板，1×PCR缓冲液(pH＝8.3)。PCR参数：94℃4min；94℃30秒、54℃30秒、72℃45秒和72℃5分钟的35个循环。通过在预染有1μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。
RPA-LFS技术在临床标本检查中的应用评价。
为了验证RPA-LFS的实际应用能力，将RPA-LFS的实际应用效果与赵瑛等人建立的双重PCR方法进行了对比。分别使用RPA-LFS和双重PCR检测209份临床标本，并与传统培养法结果比较。
流感嗜血杆菌检测引物的设计与筛选
为了区分荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌，分别在Omp6基因和bexA基因的保守区设计了两对引物(表1)，每两对引物用于检测非包膜流感嗜血杆菌和荚膜流感嗜血杆菌。其检测结果如图1中A所示，每对引物都可以扩增对应的目标菌株。从胶图结果看，除目标条带外，无任何的非特异性条带和引物二聚体。然而，从凝胶图的结果来看，omp6-F1/R1和BexA-F2/R2的扩增条带比另一个更亮，这表明它们的扩增效率更高。于是对omp6-F1/R1和BexA-F2/R2进行了后续实验。
表1 Primers and probes
Figure BDA0003568437840000081
F:forward primer；R:reverse primer；P:probe
大量研究结果表明，在RPA***中引入探针不仅可以提高反应的特异性和灵敏度，还可以减少引物二聚体的产生。为了提高特异性和灵敏度，在引物对omp6-F1/R1和bexA-F2/R2的靶区设计了相应的探针。虽然探针的引入可以减少引物二聚体的产生，但假阳性信号仍然无法避免。假阳性信号主要是由于探针和反向引物之间可以形成具有稳定扩增能力的二聚体。我们使用Primer Premier 5软件分析设计的探针和反向引物之间形成的二聚体，结果如图1B所示。每个探针和相应的反向引物都有一定的互补片段，有的覆盖THF位点或暴露反向引物的3'-OH末端。这些二聚体可以被聚合酶Bsu稳定扩增，因此，假阳性信号会不断被放大。研究表明，RPA可以耐受一定的碱基错配而不影响扩增效率，许多研究已经成功地将这一理论应用于RPA-LFS方法的建立中。因此，为了避免假阳性，我们在探针和正向和反向引物上引入了错配碱基，以减少探针和反向引物之间二聚体的产生。引入错配碱基的原则是：1.探针和反向引物的连续互补碱基不超过3个；2.探针和引物的互补区不覆盖THF位点；3.反向引物3'端与探针互补配对不超过3个碱基，4.优先使用A-G和T-C互换。通过引入错配，我们成功筛选出合适的探针和反向引物(表1)。实验结果表明(图1中C处)，实验组检测线有明显的红色条带，NTC组检测线不存在假阳性信号。
图1为引物和探针的筛选。图1中A处为用RPA反应筛选引物。琼脂糖凝胶图像显示针对两个毒力基因Omp6和bexA的引物对的扩增结果。引物对的名称在每个泳道的顶部显示。NTC泳道是紧邻左侧泳道的各自RPA反应的无模板对照。DNA梯子的条带大小显示在右边。这些图片代表了三个独立实验的结果。B处为基于Omp6基因设计的探针-反转引物和探针-探针之间形成的二聚体。C处为基于bexA基因设计的探针-反转引物和探针之间形成的二聚体。D处为在RPA-LFS上测试修改后的引物-探针组。图片显示了RPA扩增的LFS结果。每个引物-探针组的名称标在相应条带的上面。以106CFU/mL的煮沸的非荚膜流感杆菌和荚膜流感杆菌培养物共1μL作为模板。NTC条是紧挨着的左边条上各自RPA反应的无模板对照。测试线和对照线的位置标在条形图的右边。反应在37℃下进行，时间为30分钟。该图像代表了三个独立实验的结果。
RPA-LFS的特异性验证
为了验证bexA-F3/R1B/P只能扩增荚膜流感嗜血杆菌，而omp6-F3/R1B/P可以扩增所有的非流感嗜血杆菌。用这两个基因对应的两个引物分别扩增收集的10株非荚膜型流感嗜血杆菌和10株荚膜型流感嗜血杆菌(均已用传统培养方法验证)。结果如图2中A和B处所示，omp6-F3/R1B/P可以检测出所有未包膜的流感嗜血杆菌，而bexA-F3/R1B/P只能检测包膜型流感嗜血杆菌，证明使用omp6-F3/R1B/P和omp6-F3/R1B/P引物可以正确识别包膜和非包膜流感嗜血杆菌。此外，为了证明omp6-F3/R1B/P只能扩增流感嗜血杆菌对其他病原体没有特异性，我们选择了23种病原体进行种间特异性验证(表2)。结果显示如图3所示，只有流感嗜血杆菌在检测线和控制线均出现红色条带，而其他23种病原体仅在控制线出现红色条带。
表2.Bacterial strains used in the study
Figure BDA0003568437840000101
Figure BDA0003568437840000111
图2为omp6-F3/R1B/P和bexA-F3/R1B/P对荚膜和非荚膜流感病毒的鉴别验证。-1是指Omp6-F1/R1的测试结果，-2是指bexA-F2/R2的测试结果。图2中A处为#1-#10是指从痰中分离出的10个非荚膜型流感病毒。图2中B处#1-#10是指从痰中分离出的10个荚膜的流感病毒。NTC条带被用作没有模板的对照反应。测试线和对照线的位置被标记在条带图像的右边。
图3为使用RPA-LFS对OMP6-F3/R1B/P进行特异性检测。总共1微升106CFU/mL的煮沸的细菌培养物被用作模板。对其他致病菌进行了测试。参考菌株H.influenzae ATCC49247被用来作为阳性对照。细菌的种类名称在每个条带的顶部标明。NTC条是无模板对照。测试线和对照线的位置标在条形图的右边。反应在37℃下进行30分钟。图片代表三个独立实验的结果。
验证RPA-LFS的检测限
为了验证RPA-LFS的检测限，将灭活的荚膜和非荚膜型流感嗜血杆菌培养液分别进行10倍梯度稀释，范围从106到100CFU/ul(50mL/反应体积，每个反应中加入1uL稀释的培养物)。
图4为RPA-LFS***的检测限。A处和B处为用不同数量的非荚膜流感病毒培养物进行RPA扩增的LFS结果。在每个条形图的顶部标明了加入到RPA反应中的数量(以CFU为单位)。在B处，除了非荚膜的流感病毒培养物外，还在反应中加入了105CFU/μL的肺炎链球菌培养物。C处和D处为使用不同数量的荚膜型流感病毒培养物进行RPA扩增的LFS结果。加入RPA反应的数量在每个条带的顶部标明。在D处中，除了封装的流感病毒培养物外，还在反应中加入了105CFU/μL的肺炎链球菌培养物。NTC，无模板对照。反应在37℃下进行30分钟。图片右侧标明了对照线和测试线的位置。
如图4中A处和C处所示。omp6-F3/R1B/P和bexA-F3/R1B/P的最低线均是100CFU/反应。该结果表明我们建立的RPA-LFS反应***具有与PCR相同的灵敏性。通过将肺炎链球菌添加到不同浓度的流感嗜血杆菌中，结果发现RPA-LFS检测流感嗜血杆菌的灵敏度不受其他病原体的影响，其最低检测线仍为100CFU/反应(图4中B处和D处所示)。
RPA-LFS技术在临床标本检查中的应用评价
为了验证RPA-LFS的实际应用效果，采集了209个临床样本进行检测。结果如表3所示，203份样本属于流感嗜血杆菌，检出率为97.1％。与双重PCR和传统培养方法的检测结果一致。为了从检测到的流感嗜血杆菌中筛选出荚膜流感嗜血杆菌，使用引物bexA-F3/R1B/P对所有流感嗜血杆菌进行RPA-LFS，同时与已建立的双链PCR测试结果进行比较。结果显示，RPA-LFS和Dual-PCR均检出128株荚膜型流感嗜血杆菌，检出率为63.2％。实验结果表明，RPA-LFS与双重PCR具有相同的准确性，且这些结果与传统培养方法的结果一致。
表3 209 strains using RPA-LFS and dual PCR
Figure BDA0003568437840000121
N:number。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 连云港市第二人民医院(连云港市临床肿瘤研究所）
<120> 荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的 RPA-LFS检测引物探针组合及其应用
<141> 2022-03-28
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acactgatga acgtggtaca ccagaataca a 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accagctaaa taacctttaa ctgcatctgc a 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaacttttg gcggttactc tgttgctgat c 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgtctaag atttgaacgt attcaccagt a 31
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggttgagtt tgattgttat ttaattgatg ag 32
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtgaaacta aaatgataga acggtctttg c 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctatcattt tagtttcaca tagcccgagt g 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtagtattg atacgctttg tccatgtctt c 31
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acactgatga acgtgataca ccataataca aatcgtatta ggccaa 46
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accagctgag taacctttaa ctagatctgc a 31
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggaaatgg tgctgctcaa acttttggcg gttac 35
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggttgagta tgattgttat gtaattgatg agtgattgta gtaggg 46
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtgaaacga aaatgataga acggtctttg c 31
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggaaatgg tgctgctcaa acttttggcg gttac 35
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgaacaaat ttgttaaatc a 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgcgatgttg tattcaggtg ta 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtttgtatg atgttgatcc a 21
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtccatgtc ttcaaaatg 19

Claims (3)

1.荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA-LFS检测引物探针组合，其特征在于，包括omp6-F3/R1B/P引物探针组合和bexA-F3/R1B/P引物探针组合；
所述omp6-F3/R1B/P引物探针组合中
omp6-F3的序列为：CAGGAAATGGTGCTGCTCAAACTTTTGGCGGTTAC；
omp6-R1B的序列为Biotin-ACCAGCTGAGTAACCTTTAACTAGATCTGCA；
omp6-/P的序列为：
FITC-ACACTGATGAACGTGATACACCATAATACAA[THF]ATCGTATTAGGCCAA-C3spacer；
所述bexA-F3/R1B/P引物探针组合中
引物探针组合中
bexA-F3的序列为：CAGGAAATGGTGCTGCTCAAACTTTTGGCGGTTAC；
bexA-R1B的序列为：Biotin-ACCAGCTGAGTAACCTTTAACTAGATCTGCA；
bexA-P的序列为：
FITC-CGGTTGAGTATGATTGTTATGTAATTGATGAG[THF]TGATTGTAGTAGGG-C3spacer。
2.权利要求1所述的引物探针组合在荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA-LFS检测引物探针组合检测中或检测试剂盒的制备中的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，采用omp6-F3/R1B/P检测出非荚膜型流感嗜血杆菌，采用bexA-F3/R1B/P荚膜型流感嗜血杆菌。
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CN109266658B (zh) * 2018-10-17 2022-08-19 昆明理工大学 一种鲍曼不动杆菌的特异基因及其引物和应用

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