CN114573715A

CN114573715A - 一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用

Info

Publication number: CN114573715A
Application number: CN202210248210.7A
Authority: CN
Inventors: 王一; 顾耀东; 俞婷婷; 梁译冰; 赵子言
Original assignee: Jiangsu Yashen Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Yashen Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-14
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2022-06-03

Abstract

本发明公开了一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用，涉及透明质酸酶制备技术领域。重组长效人透明质酸酶为人免疫球蛋白IgG1Fc片段和人透明质酸酶PH20细胞外部分的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，融合的多肽属于人源蛋白质，具有较低的免疫原性，体内使用更安全。本发明构建了表达PH20－IgFc融合蛋白的真核表达载体，并且获得了稳定表达PH20－IgFc融合蛋白的基因工程CHO细胞系。

Description

一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用

技术领域

本发明涉及透明质酸酶制备技术领域，具体而言，涉及一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用。

背景技术

透明质酸(HA)又名玻尿酸，是由N-乙酰氨基葡萄糖与D-葡萄糖醛酸为双糖单位聚合而成的糖胺聚糖，其双糖单位中的N-乙酰氨基葡萄糖与D-葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键相连，双糖单位之间则以β-1，4糖苷键进行聚合。由于双糖单位聚合度的差异，导致透明质酸的分子量分布较为宽泛，天然的HA主要以高分子透明质酸(HMW HA，Mr2×10⁶Da)方式存在。分子量是决定HA生物学功能的重要参数。细胞外基质的主要成分是HMW HA，其高粘弹性是细胞外基质得以抵抗外界压缩力的根源，依赖于高粘弹性，HMW HA也用于眼科手术。低分子量透明质酸(LMW HA，1×10⁵DaMr2×10⁶Da)具有良好的保湿性和润滑性，广泛用于化妆品；研究发现，超低分子量透明质酸(VLMW HA，Mr1×10⁵Da)具有促血管生成作用、促创伤愈合作用、免疫调节活性和抗肿瘤活性，在机体愈合、免疫增强和肿瘤治疗等领域有重要的潜在应用价值。

人源性透明质酸酶主要有三种:HAase 1、HAase 2和PH20,其中 PH20是降解人体内HA的主要酶类。透明质酸酶可以降解人工生产的重组大分子量透明质酸，产生出小分子量透明质酸。目前，市售的透明质酸酶大多为国外企业垄断，且种类较少。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种重组长效人透明质酸酶，重组长效人透明质酸酶为人免疫球蛋白IgG1Fc片段和人透明质酸酶PH20细胞外部分的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，属于人源蛋白质，体内使用更安全。

本发明还提供了一种重组长效人透明质酸酶的编码基因，其具有如SEQ ID No.2所示的序列。

本发明还提供了一种表达载体，其包括上述重组长效人透明质酸酶的编码基因。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包括上述的重组长效人透明质酸酶的编码基因。在一种可选的实施方式中，上述宿主细胞选自CHO 细胞。

本发明还提供了一种生产重组长效人透明质酸酶的方法，方法包括：使用动物细胞表达载体pMH2或pMH7在中国地仓鼠细胞CHO 内表达基因序列SEQ ID No.2以获得的PH20-IgFc融合蛋白，然后进行分离纯化即得；表达载体pMH2和pMH7的基因序列参照http://www.biovector.net/提供的载体序列，可市售购买或合成获得。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述PH20-IgFc使用Protein G亲和纯化方法进行分离纯化。

本发明还提供了一种重组长效人透明质酸酶制剂，其包括上述重组长效人透明质酸酶或由上述方法制备的重组长效人透明质酸酶，制剂包括200-1200IU的重组长效人透明质酸酶，10-15mM Na₂HPO₄， 0.01-0.03％CaCl₂，0.1-0.2％EDTA-Na₂，145-150mM NaCl，0.1-0.2％ HSA，0.1-0.15％甘露醇，且pH值为5-6。

例如：200、500、700、800、900、1000、1200IU的重组长效人透明质酸酶。

本发明还提供了一种复方制剂，包括重组长效人透明质酸酶制剂和药物。

上述复方制剂的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂。

在一种可选的实施方式中，上述复方制剂还包括药学上可接受的盐或赋形剂。

在一种可选的实施方式中，上述药物为实体瘤治疗药物。实体瘤包括不限于头颈部肿瘤(例如喉癌)、胸部肿瘤(例如乳腺癌、肺癌)、消化***肿瘤(例如胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌)、泌尿生殖***肿瘤(例如卵巢癌、***、***癌)、骨肿瘤、中枢神经***肿瘤、软组织肿瘤、皮肤及附件肿瘤等。

本发明还提供了一种重组长效人透明质酸酶或由上述方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备配合使用药物的用途，人透明质酸酶制备的配合使用药物用于在其活性不被降解的情况下传递到人免疫球蛋白结合的组织或器官；或用于将特定治疗药物传递到疾病所在的组织或器官。

上述配合使用药物的用途包括不限于：化疗，放射疗法，光敏剂，光热剂或免疫疗法。

本发明还提供了重组长效人透明质酸酶或上述方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备化学偶联剂的用途，人透明质酸酶制备的化学偶联剂用于通过重组长效透明质酸酶的IgFc提供非功能位点来化学偶联诊断剂、显影剂、药物、治疗用毒素、基因进入疾病组织器官。

在一种可选的实施方式中，将上述方法制备的重组长效人透明质酸酶用于皮下输液、眼周手术麻醉、化药和生物药促渗、尿路造影术中造影剂的吸收。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，两段多肽属于人源蛋白质，具有较低的免疫原性，体内使用更安全。本发明构建了表达PH20－IgFc融合蛋白的真核表达载体，并且获得了稳定表达PH20－IgFc融合蛋白的基因工程 CHO细胞系。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的融合蛋白PH20－IgFc 37℃稳定性试验结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了融合蛋白PH20－IgFc的基因表达载体的构建方法及融合蛋白的表达、免疫学检测、人透明质酸酶活性检测和反应器生产。

基因表达载体的构建方法包括：

通过PCR的方法将结构基因PH20－IgFc(SEQ ID No.2)分别构建到表达载体pMH2和pMH7中，二者均为基于GC-Rich机制超高能力哺乳动物细胞表达载体质粒，由试剂公司合成获得。并进行小量制备这两种表达质粒。

将上述制备的两种表达质粒稳定转染到无血清悬浮培养的CHO 细胞中。通过G418筛选，用枪头手动挑取稳定克隆到96孔板中。当细胞汇合度大于55％时，更换无血清新鲜培养基；3-6小时后，收集培养基样品，通过抗IgG1 Fc抗体点杂交或ELISA方法检测表达量，选出表达量最高的多个单克隆，继续在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定性研究；选出传代稳定的克隆在激流式反应器内进行扩增。

结果显示：(1)融合蛋白PH20－IgFc在CHO细胞中成功表达，点杂交和westernblot结果表明筛选到融合蛋白PH20－IgFc稳定高表达克隆所产生的条带分子量大小正确；(2)高表达克隆在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定；(3)稳定的高表达克隆在激流式反应器内进行流加培养扩增，各批次丰收液中透明质酸酶活性达到 200－1200活性单位/毫升，达到了工业化生产水平。

实施例2

本实施例提供了融合蛋白PH20－IgFc的分离纯化方法。具体采用Protein G亲和纯化。

收获上述PH20－IgFc高表达的克隆，采用6000rpm离心8min，取离心上清液进行过滤。上样至已用平衡液A液 (20mM Tris+100mM NaCl，pH 7.4)平衡好的Native Protein G(Alkaline Phosphatase)(ab7461)，淋洗至基线不变后，采用洗脱液B 液(100mM Gly+50mMArg+0.01％Tween 80，pH 3.5)进行洗脱。通过SDS－PAGE检测产物的分离纯化情况。

融合蛋白PH20－IgFc的纯度在95％以上，收率大于30％。

实施例3

本实施例提供了一种融合蛋白PH20－IgFc的重组长效人透明质酸酶制剂和体内外活性研究。

重组长效人透明质酸酶制剂为针剂，其配方如下：

PH20-IgFc+12mM Na₂HPO₄+0.01％CaCl₂+0.1％EDTA－ Na₂+150mM NaCl+0.2％HAS+0.1％甘露醇，pH 5-6。

将600U/ml PH20－IgFc过滤后的溶液分装至2ml安培瓶中，将 25瓶溶液置于37℃，湿度为75±5％的加速试验培养箱中。分别在第0、7、14、21、28、35、42天取样按照2010版药典附录玻璃酸酶活性检测，稳定性试验结果(表1、图1)显示，从第42天开始，透明质酸酶的活性出现显著性下降(约12％)。

表1PH20－IgFc 37℃稳定性试验结果

时间(天)	重复1	重复2	重复3	平均值(U/mL)	偏差	CV
							0	582	609	573	588.00	18.73	0.03
7	610	576	615	600.33	21.22	0.04
							14	593	559	585	579.00	17.78	0.03
21	576	542	622	580.00	40.15	0.07
							28	554	548	579	560.33	16.44	0.03
35	548	541	570	553.00	15.13	0.03
							42	543	521	536	533.33	11.24	0.02

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏雅酶医药科技有限公司

<120> 一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 676

<212> PRT

<213> ARTIFICIAL

<400> 1

Met Glu Arg Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val

20 25 30

Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys

35 40 45

Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro

50 55 60

Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg

65 70 75 80

Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn

85 90 95

Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Ala Lys

100 105 110

Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val

115 120 125

Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro

130 135 140

Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn

145 150 155 160

Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe

165 170 175

Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys

180 185 190

Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys

195 200 205

Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn

210 215 220

Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser

225 230 235 240

Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val

245 250 255

Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val

260 265 270

Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr

275 280 285

Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu

290 295 300

Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile

305 310 315 320

Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu

325 330 335

Leu Leu Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val

340 345 350

Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly

355 360 365

Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn

370 375 380

Pro Asp Asn Phe Ala Ile Asn Leu Arg Lys Val Glu Ser Ser Gln Tyr

385 390 395 400

Val Glu Asn Arg His Leu Lys Thr Trp Ser Asn Phe Leu Lys Asn Phe

405 410 415

Ile Ala Ala Val Ile Ala Pro Val Val Arg Arg Lys Leu Met Lys Thr

420 425 430

Leu Met Leu Leu Met Cys Val Leu Leu Met Val Ser Val Met Leu Phe

435 440 445

Asn Leu Pro Trp Arg Gln Lys Asn Leu Lys Phe Ser Thr Ser Ser Ala

450 455 460

His Arg Gly Thr Thr Pro Gly Gly Thr Val Ser Leu Pro Leu Pro Pro

465 470 475 480

Lys Thr Gln Gly His Pro His Asp Leu Pro Asp Pro Gly His Met Arg

485 490 495

Gly Gly Gly Arg Glu Pro Arg Arg Pro Gly Gln Val Gln Leu Val Arg

500 505 510

Gly Arg Arg Gly Gly Ala Cys Gln Asp Lys Ala Ala Gly Gly Ala Val

515 520 525

Gln Gln His Val Pro Cys Gly Gln Arg Pro His Arg Pro Ala Pro Gly

530 535 540

Leu Ala Glu Trp Gln Gly Val Gln Val Gln Gly Leu Gln Gln Ser Pro

545 550 555 560

Pro Ser Pro His Arg Glu Asn His Leu Gln Ser Gln Arg Ala Ala Pro

565 570 575

Arg Ser Thr Gly Val Pro Ala Pro Ile Pro Gly Ala Asp Gln Glu Pro

580 585 590

Gly Gln Pro Asp Leu Pro Gly Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg His Arg

595 600 605

Arg Gly Val Gly Glu Gln Trp Ala Ala Gly Glu Gln Leu Gln Asp His

610 615 620

Ala Ser Arg Ala Gly Leu Arg Arg Leu Leu Leu Pro Leu Gln Gln Ala

625 630 635 640

His Arg Gly Gln Glu Gln Val Ala Ala Gly Glu Arg Leu Leu Met Leu

645 650 655

Arg Asp Ala Trp Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

660 665 670

Leu Ser Pro Gly

675

<210> 2

<211> 2064

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<400> 2

atggagagag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

ctgaatttca gagcacctcc tgttattcca aatgtgcctt tcctctgggc ctggaatgcc 120

ccaagtgaat tttgtcttgg aaaatttgat gagccactag atatgagcct cttctctttc 180

ataggaagcc cccgaataaa cgccaccggg caaggtgtta caatatttta tgttgataga 240

cttggctact atccttacat agattcaatc acaggagtaa ctgtgaatgg aggaatcccc 300

cagaagattt ccttacaaga ccatctggac adagctaaga aagacattac attttatatg 360

ccagtagaca atttgggaat ggctgttatt gactgggaag aatggagacc cacttgggca 420

agaaactgga aacctaaaga tgtttacaag aataggtcta ttgaattggt tcagcaacaa 480

aatgtacaac ttagtctcac agaggccact gagaaagcaa aacaagaatt tgaaaaggca 540

gggaaggatt tcctggtaga gactataaaa ttgggaaaat tacttcggcc aaatcacttg 600

tggggttatt atctttttcc ggattgttac aaccatcact ataagaaacc cggttacaat 660

ggaagttgct tcaatgtaga aataaaaaga aatgatgatc tcagctggtt gtggaatgaa 720

agcactgctc tttacccatc catttatttg aacactcagc agtctcctgt agctgctaca 780

ctctatgtgc gcaatcgagt tcgggaagcc atcagagttt ccaaaatacc tgatgcaaaa 840

agtccacttc cggtttttgc atatacccgc atagttttta ctgatcaagt tttgaaattc 900

ctttctcaag atgaacttgt gtatacattt ggcgaaactg ttgctctggg tgcttctgga 960

attgtaatat ggggaaccct cagtataatg cgaagtatga aatcttgctt gctcctagad 1020

aattacatgg agactatact gaatccttac ataatcaacg tcacactagc agccaaaatg 1080

tgtagtcaag tgctttgcca ggagcaagga gtgtgtataa ggaaaaactg gaactcaagt 1140

gactatcttc acctcaaccc agataatttt gctatcaact tgagaaaggt ggaaagttca 1200

cagtacgtgg aaaaccgaca cttgaagacc tggagcaatt ttctgaaaaa ttttattgca 1260

gctgttatag caccttgagt tgtaaggaga aagctgatgt aaaagacact gatgctgttg 1320

atgtgtgtat tgctgatggt gtctgtatag atgcttttct aaaacctccc atggagacag 1380

aagaacctca aattttctac gtcgagtgcc caccgtggca cctgaactcc tggggggacc 1440

gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga 1500

ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta 1560

cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1620

cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga 1680

gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa 1740

agccaaaggg cagccccgag atccacaggt gtacctgccc ccatcccggg atgagctgac 1800

caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt 1860

ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 1920

ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca 1980

ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tggggtctgc acaaccacta cacgcagaag 2040

agcctctccc tgtctccggg taaa 2064

Claims

1.一种重组长效人透明质酸酶，其特征在于，所述重组长效人透明质酸酶为人免疫球蛋白IgG1Fc片段和人透明质酸酶PH20细胞外部分的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.一种重组长效人透明质酸酶的编码基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No.2所示的序列。

3.一种表达载体，其特征在于，其包括权利要求2所述的重组长效人透明质酸酶的编码基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，其包括权利要求2所述的重组长效人透明质酸酶的编码基因。

5.一种生产重组长效人透明质酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括：使用动物细胞表达载体pMH2或pMH7在中国地仓鼠细胞CHO内表达基因序列SEQ ID No.2以获得PH20-IgFc融合蛋白，然后进行分离纯化即得。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PH20-IgFc使用Protein G亲和纯化方法进行分离纯化。

7.一种重组长效人透明质酸酶制剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的重组长效人透明质酸酶或权利要求5-6任一项所述的方法制备的重组长效人透明质酸酶，所述制剂包括200-1200IU的重组长效人透明质酸酶，10-15mM Na₂HPO₄，0.01-0.03％CaCl₂，0.1-0.2％EDTA-Na₂，145-150mM NaCl，0.1-0.2％HSA，0.1-0.15％甘露醇，且pH值为5-6。

8.一种复方制剂，其特征在于，包括权利要求7所述的重组长效人透明质酸酶制剂和药物；

优选地，所述药物为实体瘤治疗药物。

9.权利要求1所述的重组长效人透明质酸酶或权利要求5-6任一项所述的方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备配合使用药物的用途，其特征在于，所述人透明质酸酶制备的配合使用药物用于在其活性不被降解的情况下传递到人免疫球蛋白结合的组织或器官；或用于将特定治疗药物传递到疾病所在的组织或器官。

10.权利要求1所述的重组长效人透明质酸酶或权利要求5-6任一项所述的方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备化学偶联剂的用途，所述人透明质酸酶制备的化学偶联剂用于通过所述重组长效透明质酸酶的IgFc提供非功能位点来化学偶联诊断剂、显影剂、药物、治疗用毒素、基因进入疾病组织器官。