CN114544552A - 一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改善表面等离子体共振全息显微术(SPRHM)成像像质的方法。利用空间光调制器产生两束平行光对称激发表面等离子体共振(SPR)，利用偏振‑角度复用技术记录四光束干涉产生的复合全息图，使用计算机对全息图作离散傅里叶变换得到其频谱图，通过选频重建得到像质改善的SPR强度图像，同时，通过选频重建得到两幅单光束照明的SPR相位图像并利用加权平均滤波算法将两幅相位图像进行合成，最终得到像质改善的SPR相位图像。相比于传统的SPRHM，所公开的方法可以有效提高图像信噪比并改善SPR强度和相位图像的像质。

Description

一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法
技术领域
本发明涉及光学领域和数字图像处理领域，特别涉及表面等离子体共振和数字全息显微术领域。
背景技术
表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是一种金属表面处电子的集体振荡现象，其基本原理是当激发光波与表面等离子体波满足波矢匹配条件时，会引起金属表面电子发生共振并产生疏密分布。基于这一原理发展了表面等离子体共振显微术，通过探测反射光波的振幅或相位进而计算出近场区域介质折射率或厚度等物理参量的微小变化。数字全息显微术是光学领域常用的一种定量相位成像方法，由于其具备快速实时、非破坏性、非侵入性、全场测量等优点，已被广泛应用于与三维形貌及折射率变化相关的测量及成像领域，如微透镜阵列检测、MEMS器件成像、光学元件微小缺陷检测等。表面等离子体共振全息显微术(Surface Plasmon Resonance Holographic Microscopy,SPRHM)将数字全息显微术与表面等离子体共振显微术相结合，可以实现近场区域样品参量微小变化的宽场、实时、定量振幅和相位成像。然而，由于表面等离子体波的横向衰减传播特性，导致其与样品发生相互作用后，引起成像结果中出现沿表面等离子体波传播方向的图像模糊，称为图像拖尾现象。理论上，表面等离子体波的传播长度可以达到几十甚至上百微米，远大于受衍射极限限制的传统光学成像***的分辨极限，导致表面等离子体共振全息显微术的成像分辨率远低于传统光学显微镜(H.Yu,X.Shan,S.Wang,H.Chen,and N.Tao,"Molecularscale origin of surface plasmon resonance biosensors,"Anal.Chem.86,8992-8997(2014).)，因而成像的像质相对较差。
表面等离子体共振显微术成像质量较差的问题限制了其进一步应用，尤其是在对微小样品成像测量方面。为此，一些像质改善方案被提出。例如，利用数字微镜阵列进行扫描旋转照明(Kuai,Y.et.al.,Label-free surface-sensitive photonic microscopywith high spatial resolution using azimuthal rotation illumination.Sci Adv2019,5(3),eaav5335.)，或者利用紧聚焦光束进行逐点扫描成像(C.Zhang,R.Wang,Y.Wang,S.Zhu,C.Min,and X.C.Yuan,"Phase-stepping technique for highlysensitive microscopic surface plasmon resonance biosensor,"Appl.Opt.53,836-840(2014).)。然而，这些扫描成像方法的时间分辨率较差，无法实现动态甚至实时成像，更重要的是，这些方法并不适用于基于复振幅成像的表面等离子体共振全息显微术，其根本原因是获取光波复振幅一般需要采集干涉图样。
为使表面等离子体共振全息显微术能够有效应用于生物组织近场成像、片上微纳结构检测、单分子成像等，需要找到能够有效改善表面等离子体共振全息显微术成像质量的方法。
发明内容
为实现上述目的，本发明提出一种基于双向对称照明的改善表面等离子体共振全息显微术成像质量的方法与***。本方法利用空间光调制器产生空间完全对称的两束激发光，以一定角度同时对称照明金层表面并激发其表面等离子体共振，然后利用沃拉斯顿棱镜和偏振片分别进行分束和检偏，从而实现两束物光和两束参考光的混合干涉，形成复合全息图，进而通过频域滤波和数字图像处理，最终实现表面等离子体共振全息显微术成像分辨率的增强和像质改善。
技术方案
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：调整光路，使一束准直激光束垂直入射到反射式空间光调制器靶面并被其完全调制，在空间光调制器上加载合适的正弦光栅结构调制，使反射光波产生多个衍射级次，然后利用会聚透镜将各衍射光束进行会聚，经过偏振片调制光束的偏振态，并利用分束镜将光反射到显微物镜的后焦平面上，利用双孔滤波器滤出±1级衍射光，之后该两束衍射光进入物镜并以相同的激发角θ入射到样品的下表面。
步骤2：经样品调制和显微物镜收集的两束反射光E1和E2分别被渥拉斯顿棱镜分成偏振态正交的两束物光EO1,EO2,和参考光ER1和ER2，再经过透光轴为45度的偏振片进行检偏后，四束光波以不同的空间载频发生离轴干涉，形成全息图并由图像采集器件记录。
步骤3：在未放置样品前，记录一幅全息图作为背景全息图；放置样品后再次记录全息图。对两幅全息图分别作离散傅里叶变换得到其频谱图。对于强度成像，在频域选择两束物光彼此干涉的频谱，通过彼此干涉可以使样品位置处信号增强而拖尾相应的被抑制，然后利用卷积法进行数值重建，得到信噪比增强的强度图像；对于相位成像，在频域分别选择两束物参光彼此干涉的频谱进行数值重建，得到单束光波激发表面等离子共振下的相位图像，将两幅相位图像进行加权滤波合成，得到信噪比增强的相位图像；
所述步骤1包含以下步骤：
(1)由激光器输出的激光束经光学元件获得扩束准直后变为线偏振光束，然后透过分束镜垂直入射到反射式空间光调制器靶面。
(2)在空间光调制器上加载光栅结构使反射光产生多束衍射光波，衍射光波依次经过分束镜反射，半波片调制为45度线偏振，然后经过会聚透镜和分束镜聚焦到显微物镜后焦平面，在显微物镜后焦平面附近放置一个双孔滤波器以滤出聚焦的±1级衍射光波，此两束衍射光波相对于物镜中心轴对称入射到显微物镜，从显微物镜出射的光束近似为平行光，并对称地入射到金层表面，以相同的入射角激发表面等离子体共振，其中入射角θ可以通过空间光调制器上加载的光栅周期定量确定，其关系如下，dsinθ0＝±jλ,j＝0,1,2,...,d为光栅常数，θ0为各衍射级次与零级衍射的夹角，λ为激光波长，θ＝arcsin(f1sinθ0/fM),f1和fM分别为会聚透镜和显微物镜的焦距。
所述步骤2包含以下步骤：
(1)经样品反射的光束E1和E2分别包含携带样品信息的p分量和不携带样品信息的s分量，经显微物镜收集并沿着与入射方向对称的方向出射，依次透过滤波器和分束镜后，再经成像透镜准直并在图像采集器件靶面上重合。
(2)在图像采集器件前加入一个渥拉斯顿棱镜，使两束倾斜入射的准直光E1和E2分别沿着与入射面正交的方向分为p偏振光和s偏振光，再利用透光轴沿45度方向的检偏器对四束光波进行检偏，得到偏振态相同、空间载频不同的两束物光EO1,EO2,和两束参考光ER1和ER2。
(3)四束光EO1,EO2,ER1和ER2在图像采集器件靶面相互干涉形成一幅复合全息图。
所述步骤3包含以下步骤：
(1)根据步骤2分别记录无样品时的背景全息图I0，然后记录有样品时的全息图I，其中
I0(x,y)＝|EO10(x,y)+ER10(x,y)+EO20(x,y)+ER20(x,y)|2；
I(x,y)＝|EO1(x,y)+ER1(x,y)+EO2(x,y)+ER2(x,y)|2
(2)对两幅数字全息图分别进行离散傅里叶变换得到其频谱图，由于载频不同，四束光波两两干涉的频谱分别位于不同位置，可以通过选频操作将其分开。在频域选择EO1和EO2干涉产生的频谱分量，并进行数值重建，得到信噪比显著增强的强度图像
Figure BDA0003357550960000051
(3)进一步，通过选择EO1和ER2，EO2和ER1分别干涉的频谱分量并进行数值重建和二次曝光，得到单束光波照明下的物光波复振幅分布EO1和EO2。对获得的复振幅进行如下运算，
Figure BDA0003357550960000052
获得对应的相位分布
Figure BDA0003357550960000053
和
Figure BDA0003357550960000054
(4)对于重建得到的相位分布图像
Figure BDA0003357550960000055
和
Figure BDA0003357550960000056
利用加权平均滤波算法进行图像合成，其中加权平均滤波算法公式如下所示：
Figure BDA0003357550960000057
其中|▽|表示取相位梯度的模值。至此，得到了像质改善后的相位分布图像
Figure BDA0003357550960000058
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：包括一台激光器，一套滤波扩束准直装置，两个偏振片，一个半波片，两个透镜，一个显微物镜，一个双孔滤波器，一套样品装置，三个非偏振分束镜，一个渥拉斯顿棱镜，一个图像采集器件，一个空间光调制器和一台计算机。其中，所述激光器发出的细激光束经过所述滤波扩束准直装置后，再经过所述偏振片调制为对所述空间光调制器完全响应的偏振态，穿过所述非偏振分束镜后垂直入射到所述空间光调制器上，经过所述空间光调制器加载的一维光栅图案产生多级衍射光束，衍射光束零级沿***光轴方向传播，多级衍射光束经过所述半波片调制为45度线偏振，再经过所述会聚透镜会聚，并被所述非偏振分束镜反射到所述显微物镜的后焦平面，被放置在后焦平面的所述双孔滤波器滤出关于所述显微物镜中心轴线对称的±1级衍射光束，最终同时入射到所述显微物镜，经所述显微物镜准直后以相同并对称的SPR激发角入射到所述样品装置的下表面，记其入射面为zoy平面；两束光波被所述样品装置调制后反射回所述显微物镜，从所述显微物镜下方出射后，依次透过所述双孔滤波器、非偏振分束镜和成像透镜，然后被所述管透镜分别准直并同时汇聚到所述图像采集器件靶面上；由图像采集器件前方放置的所述渥拉斯顿棱镜分别分离出携带样品信息的物光和不携带样品信息的参考光，其中物光和参考光形成的平面分别与入射面zoy正交，再经过透光轴为45度的所述偏振片进行检偏，最终两束物光和两束参考光分别以不同的空间载频在所述图像采集器件的靶面发生多光束干涉形成复合全息图。由所述计算机将形成的复合全息图进行离散傅里叶变换得到其频谱图，在频谱图中通过选频选择出两束物光干涉的频谱分量并进行卷积重建得到信噪比增强和像质改善的振幅图像，在频谱图中通过选频分别选择出两束物光和各自参考光干涉的频谱分量并进行卷积重建得到单向照明的相位重建结果，然后利用加权平均滤波算法将两幅相位图像进行合成，最终得到信噪比增强和像质改善的相位图像。
有益效果
本发明利用空间光调制器产生对向照明的光波并激发SPR，结合光学元件产生复合全息图，再利用频域滤波技术和所提出的加权平均滤波算法最终获取信噪比增强、像质改善的强度和相位衬比型表面等离子体共振图像，可以有效抑制传统表面等离子体共振全息显微术中由表面等离子体波传播引起的图像拖尾现象，在生物小分子研究、微纳结构成像等领域具有重要意义。
附图说明
图1为基于双向对称照明的改善表面等离子体共振全息显微术像质的原理光路；
图2为实例样品装置示意图；
图3为基于双向对称照明改善表面等离子体共振全息显微术成像质量的图像处理流程；
图1中：1-激光器，2-滤波扩束准直装置，3-偏振片，4-非偏振分束镜1，5-空间光调制器，6-半波片，7-透镜，8-非偏振分束镜2，9-双孔滤波器，10-显微物镜，11-样品装置，12-透镜，13-渥拉斯顿棱镜，14-偏振片，15-图像采集器件。
图2中：1-盖玻片，2-厚度为1.5nm铬层，3-厚度为50nm金层，4-厚度为400nm光刻胶，5-光刻胶中刻蚀的空气隙结构。
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
实施例1：本发明设计的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的***如图1所示，工作流程如下：
激光器1发出的细激光束经过滤波扩束准直装置2准直后被偏振片3调制为对空间光调制器5完全响应的偏振态，光束穿过非偏振分束镜4后垂直入射到空间光调制器5上，经过空间光调制器5加载的一维光栅图案产生多级衍射光束，衍射光束的零级沿***光轴方向传播，高级次衍射光束经半波片6调制为45度线偏振，再经过会聚透镜7会聚，并被非偏振分束镜8反射到显微物镜10的后焦平面，被放置在后焦平面的双孔滤波器9滤出关于显微物镜中心轴线对称的±1级衍射光束，最终同时入射到显微物镜10，经显微物镜10准直后以相同且对称的SPR激发角入射到样品装置11的下表面，记其入射面为zoy平面；两束光被样品装置11调制后反射回显微物镜10，从显微物镜10下方出射后依次透过双孔滤波器9、非偏振分束镜8和管透镜12，然后被管透镜12分别准直并到达图像采集器件15的靶面上；由图像采集器件15前方放置的渥拉斯顿棱镜13分别分离出携带样品信息的物光和不携带样品信息的参考光，其中物参光形成的平面分别与入射面zoy正交，再经过透光轴为45度的偏振片14进行检偏，最终两束物光EO1,EO2和两束参考光ER1和ER2分别以不同的空间载频在图像采集器件15的靶面发生多光束干涉并形成复合全息图，首先将样品移出视场记录背景全息图I0，然后将样品移至视场中央记录物场全息图I，其中，
I0(x,y)＝|EO10(x,y)+ER10(x,y)+EO20(x,y)+ER20(x,y)|2，
I(x,y)＝|EO1(x,y)+ER1(x,y)+EO2(x,y)+ER2(x,y)|2。
利用计算机分别对两幅数字全息图进行离散傅里叶变换得到其频谱图，由于载频不同，四束光波两两干涉的频谱分别位于频谱图的不同位置，在频域选择EO1和EO2干涉产生的频谱分量，并利用卷积法和二次曝光法进行数值重建，得到信噪比增强的振幅图像
Figure BDA0003357550960000081
进一步，分别选择EO1和ER2，EO2和ER1干涉的频谱分量并进行数值重建，得到单向照明下的物光场复振幅分布EO1和EO2；对获得的复振幅进行如下运算，
Figure BDA0003357550960000082
获得对应的相位分布
Figure BDA0003357550960000083
和
Figure BDA0003357550960000084
利用加权平均滤波算法对两幅相位分布图像
Figure BDA0003357550960000085
和
Figure BDA0003357550960000086
进行图像合成，得到像质改善的相位分布图像
Figure BDA0003357550960000087
所用的加权平均滤波算法公式为：
Figure BDA0003357550960000091
其中|▽|代表取相位梯度的模值。

Claims (11)

1.一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：调整光路，使一束准直激光束垂直入射到反射式空间光调制器靶面并被其完全调制，在空间光调制器上加载合适的正弦光栅结构调制，使反射光波产生多个衍射级次，然后利用会聚透镜将各衍射光束进行会聚，经过偏振片调制光束的偏振态，并利用分束镜将光反射到显微物镜的后焦平面上，利用双孔滤波器滤出±1级衍射光，之后该两束衍射光进入物镜并以相同的激发角θ入射到样品的下表面；
步骤2：经样品调制和显微物镜收集的两束反射光E1和E2分别被渥拉斯顿棱镜分成偏振态正交的两束物光EO1,EO2,和参考光ER1和ER2，再经过透光轴为45度的偏振片进行检偏后，四束光波以不同的空间载频发生离轴干涉，形成全息图并由图像采集器件记录；
步骤3：在未放置样品前，记录一幅全息图作为背景全息图；放置样品后再次记录全息图。对两幅全息图分别作离散傅里叶变换得到其频谱图；对于强度成像，在频域选择两束物光彼此干涉的频谱，通过彼此干涉可以使样品位置处信号增强而拖尾相应的被抑制，然后利用卷积法进行数值重建，得到信噪比增强的强度图像；对于相位成像，在频域分别选择两束物参光彼此干涉的频谱进行数值重建，得到单束光波激发表面等离子共振下的相位图像，将两幅相位图像进行加权滤波合成，得到信噪比增强的相位图像；
所述步骤1包含以下步骤：
(1)由激光器输出的激光束经光学元件获得扩束准直后变为线偏振光束，然后透过分束镜垂直入射到反射式空间光调制器靶面；
(2)在空间光调制器上加载光栅结构使反射光产生多束衍射光波，衍射光波依次经过分束镜反射，半波片调制为45度线偏振，然后经过会聚透镜和分束镜聚焦到显微物镜后焦平面，在显微物镜后焦平面附近放置一个双孔滤波器以滤出聚焦的±1级衍射光波，此两束衍射光波相对于物镜中心轴对称入射到显微物镜，从显微物镜出射的光束近似为平行光，并对称地入射到金层表面，以相同的入射角激发表面等离子体共振，其中入射角θ可以通过空间光调制器上加载的光栅周期定量确定，其关系如下，dsinθ0＝±jλ,j＝0,1,2,...,d为光栅常数，θ0为各衍射级次与零级衍射的夹角，λ为激光波长，θ＝arcsin(f1sinθ0/fM),f1和fM分别为会聚透镜和显微物镜的焦距；
所述步骤2包含以下步骤：
(1)经样品反射的光束E1和E2分别包含携带样品信息的p分量和不携带样品信息的s分量，经显微物镜收集并沿着与入射方向对称的方向出射，依次透过滤波器和分束镜后，再经成像透镜准直并在图像采集器件靶面上重合；
(2)在图像采集器件前加入一个渥拉斯顿棱镜，使两束倾斜入射的准直光E1和E2分别沿着与入射面正交的方向分为p偏振光和s偏振光，再利用透光轴沿45度方向的检偏器对四束光波进行检偏，得到偏振态相同、空间载频不同的两束物光EO1,EO2,和两束参考光ER1和ER2；
(3)四束光EO1,EO2,ER1和ER2在图像采集器件靶面相互干涉形成一幅复合全息图；
所述步骤3包含以下步骤：
(1)根据步骤2分别记录无样品时的背景全息图I0，然后记录有样品时的全息图I，其中
I0(x,y)＝|EO10(x,y)+ER10(x,y)+EO20(x,y)+ER20(x,y)|2；
I(x,y)＝|EO1(x,y)+ER1(x,y)+EO2(x,y)+ER2(x,y)|2
(2)对两幅数字全息图分别进行离散傅里叶变换得到其频谱图，由于载频不同，四束光波两两干涉的频谱分别位于不同位置，可以通过选频操作将其分开；在频域选择EO1和EO2干涉产生的频谱分量，并进行数值重建，得到信噪比显著增强的强度图像
Figure FDA0003357550950000039
(3)进一步，通过选择EO1和ER2，EO2和ER1分别干涉的频谱分量并进行数值重建和二次曝光，得到单束光波照明下的物光波复振幅分布EO1和EO2；对获得的复振幅进行如下运算，
Figure FDA0003357550950000031
获得对应的相位分布
Figure FDA0003357550950000032
和
Figure FDA0003357550950000033
(4)对于重建得到的相位分布图像
Figure FDA0003357550950000034
和
Figure FDA0003357550950000035
利用加权平均滤波算法进行图像合成，其中加权平均滤波算法公式如下所示：
Figure FDA0003357550950000036
其中
Figure FDA0003357550950000037
表示取相位梯度的模值；至此，得到了像质改善后的相位分布图像
Figure FDA0003357550950000038
2.根据权利要求1所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于解决其技术问题所采用的技术方案包括一台激光器，一套滤波扩束准直装置，两个偏振片，一个半波片，两个透镜，一个显微物镜，一个双孔滤波器，一套样品装置，三个非偏振分束镜，一个渥拉斯顿棱镜，一个图像采集器件，一个空间光调制器和一台计算机。其中，所述激光器发出的细激光束经过所述滤波扩束准直装置后，再经过所述偏振片调制为对所述空间光调制器完全响应的偏振态，穿过所述非偏振分束镜后垂直入射到所述空间光调制器上，经过所述空间光调制器加载的一维光栅图案产生多级衍射光束，衍射光束零级沿***光轴方向传播，多级衍射光束经过所述半波片调制为45度线偏振，再经过所述会聚透镜会聚，并被所述非偏振分束镜反射到所述显微物镜的后焦平面，被放置在后焦平面的所述双孔滤波器滤出关于所述显微物镜中心轴线对称的±1级衍射光束，最终同时入射到所述显微物镜，经所述显微物镜准直后以相同并对称的SPR激发角入射到所述样品装置的下表面，记其入射面为zoy平面；两束光波被所述样品装置调制后反射回所述显微物镜，从所述显微物镜下方出射后，依次透过所述双孔滤波器、非偏振分束镜和成像透镜，然后被所述管透镜分别准直并同时汇聚到所述图像采集器件靶面上；由图像采集器件前方放置的所述渥拉斯顿棱镜分别分离出携带样品信息的物光和不携带样品信息的参考光，其中物光和参考光形成的平面分别与入射面zoy正交，再经过透光轴为45度的所述偏振片进行检偏，最终两束物光和两束参考光分别以不同的空间载频在所述图像采集器件的靶面发生多光束干涉形成复合全息图。由所述计算机将形成的复合全息图进行离散傅里叶变换得到其频谱图，在频谱图中通过选频选择出两束物光干涉的频谱分量并进行卷积重建得到信噪比增强和像质改善的振幅图像，在频谱图中通过选频分别选择出两束物光和各自参考光干涉的频谱分量并进行卷积重建得到单向照明的相位重建结果，然后利用加权平均滤波算法将两幅相位图像进行合成，最终得到信噪比增强和像质改善的相位图像。
3.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述扩束准直装置为一透镜组和针孔。
4.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述显微物镜为一高倍率、大数值孔径的油浸物镜。
5.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述非偏振分束镜用于将光束能量分为两部分。
6.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述空间光调制器用于产生对称照明的多光束，可以用数字微反射镜DMD或一维光栅代替。
7.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述空间光调制器不限于振幅型、相位型、反射式以及透射式。
8.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述渥拉斯顿棱镜用于小角度的偏振分光。
9.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述图像采集器件为CCD或CMOS等电荷耦合的图像采集设备。
10.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述激光器为可见光范围内的单色相干光源。
11.根据权利要求2所述的一种改善表面等离子体共振全息显微术像质的方法，其特征在于：所述双孔滤波器用于滤出衍射光束的正负一级。
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