CN114540409A

CN114540409A - 褐飞虱基因片段NlVgN在提高水稻抗虫性中的应用

Info

Publication number: CN114540409A
Application number: CN202210131664.6A
Authority: CN
Inventors: 娄永根; 曾佳妹; 叶文丰; 金啸琛
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-02-14
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2042-02-14
Also published as: CN114540409B

Abstract

本发明公开了一种褐飞虱基因片段NlVgN及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。该抗虫基因为SEQ ID No.1的DNA序列，编码438个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现该基因及其编码产物与水稻的抗虫性密切相关，通过将NlVgN蛋白体外表达后直接应用于水稻体，或通过在水稻中过量表达NlVgN基因，均能有效提高水稻对稻飞虱的直接抗性和间接抗性。本发明将在作物害虫防控和抗虫育种，特别是在水稻害虫防控和抗虫育种中得到广泛应用。

Description

褐飞虱基因片段NlVgN在提高水稻抗虫性中的应用

技术领域

本发明属于植物抗虫性领域，尤其涉及一种褐飞虱基因片段NlVgN及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。

背景技术

害虫是造成全球粮食生产损失，威胁食品安全的重要因素，如何科学有效、绿色环保地减少每年由虫害造成的巨大粮食损失，是人们一直以来亟需解决的问题。水稻(Oryzasativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一，为全球近一半人口提供主食来源。稻飞虱是水稻上主要的一类害虫，属昆虫纲半翅目(Hemiptera)飞虱科(Delphacidae)，常见的主要有褐飞虱(Nilaparvata lugens)、白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Laodelphax striatellus)，它们通过刺吸植物汁液、产卵损伤以及传播病毒等方式对我国水稻粮食生产造成了严重危害。

农药一直是控制水稻害虫的最有效的手段，具有生效快、适用范围广、使用便利等特点，但是过多的使用农药对环境和农产品的安全以及生物的多样性造成了严重的影响。因此，减少化学农药使用量、开发害虫绿色防控技术，如提升水稻抗虫性、培育抗虫水稻品种等等是今后害虫防控中的迫切需求。

植物在遭受植食性昆虫攻击时，会通过识别植食性昆虫相关的激发子，启动下游相关的信号通路，如钙离子流、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、促***原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)级联以及植物激素(如茉莉酸、水杨酸、乙烯等)介导的信号途径等，进而快速且特异性地重置它们的转录组、蛋白质组和代谢组，最后对植食性昆虫产生直接和(或)间接抗性。直接抗性是指植物所产生的防御反应直接降低植食性昆虫的种群适合度或驱避植食性昆虫的为害，而间接抗性则是指植物所产生的防御反应通过增强植食性昆虫天敌的作用控制植食性昆虫的为害。通过揭示植物产生直接和间接抗性的机理，从而通过一定途径提高植物的抗虫性，就可以达到安全有效控制害虫为害的目的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种褐飞虱基因片段NlVgN及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐飞虱基因片段NlVgN及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。

进一步地，所述褐飞虱基因NlVgN具有SEQ ID NO.1的DNA序列。

进一步地，所述褐飞虱基因NlVgN的编码蛋白具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

进一步地，所述抗虫性为，提高水稻对褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的直接抗性，和通过增强水稻对稻飞虱天敌引诱作用而提高的间接抗性。

进一步地，将体外表达的NlVgN纯化蛋白直接应用于水稻体，或在水稻中表达所述褐飞虱基因NlVgN。

本发明的有益效果是：本发明通过外用褐飞虱基因NlVgN编码蛋白NlVgN处理水稻植物体或在水稻中表达基因NlVgN，发现与对照水稻相比，可以显著提高水稻对稻飞虱的直接和间接抗性，验证了褐飞虱基因NlVgN及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。对水稻的抗虫育种，尤其是抗稻飞虱的水稻品种培育，具有十分重要的指导和促进作用。

附图说明

图1是用于体外表达NlVgN的载体构建示意图；

图2是不同处理下水稻叶鞘茉莉酸(A)和茉莉酸-异亮氨酸共轭物(B)的含量(均值+标准误，n＝5)示意图；空白对照(Con)、机械损伤加施用空载体对照纯化产物(W+EV)及机械损伤加施用NlVgN纯化蛋白(W+NlVgN)植株；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(P<0.05，Tukey’s HSD post-hoc test)；

图3是不同处理下褐飞虱产卵量(A)及卵的孵化率(B，均值+标准误，n＝10)示意图；Con、W+EV和W+NlVgN分别表示未处理水稻、机械损伤加空载体纯化产物处理水稻和机械损伤加NlVgN纯化蛋白处理水稻；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(P<0.05，Tukey’s HSD post-hoc test)；

图4是不同处理后水稻释放的挥发物组份及含量示意图(均值+标准误，n＝5)；Con、W+EV和W+NlVgN分别表示未处理水稻、机械损伤加空载体纯化产物处理水稻和机械损伤加NlVgN纯化蛋白处理水稻；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(P<0.05，Tukey’s HSD post-hoc test)；

图5是不同处理水稻对稻虱缨小蜂行为反应效果图(n＝60)；W+EV和W+NlVgN分别表示机械损伤加空载体纯化产物处理水稻和机械损伤加NlVgN纯化蛋白处理水稻；星号表示不同处理之间存在显著性差异(P<0.05，卡方检验)；

图6是在水稻植株中过量表达NlVgN的遗传转化载体的构建示意图；

图7是不同水稻品系上稻飞虱卵孵化率结果图；A、B和C分为15头产卵褐飞虱雌成虫(BPH)，10头产卵白背飞虱雌成虫(WBPH)以及10头产卵灰飞虱雌成虫(SBPH)在野生型植株(WT，XS11)和过量表达NlVgN品系oe-1和oe-3植株上产卵为害24h后，稻飞虱卵的孵化率；星号表示不同处理之间存在显著性差异(***P<0.001，Student’s t test)；柱状图为均值+标准误(n＝10)；不同字母表示不同处理之间存在显著性差异(P<0.05，Tukey’s HSD post-hoc test)。

具体实施方式

本发明一种褐飞虱基因片段NlVgN及其编码产物在提高水稻抗虫性中的应用，利用PCR、原核表达、蛋白纯化、农杆菌转化等分子生物学技术，结合多种生物学测定方法，对目标基因及其编码产物在提高水稻抗虫性中的作用进行了研究，结果证明将褐飞虱NlVgN蛋白直接作用于水稻体，或在水稻中过量表达所述褐飞虱基因NlVgN，可激发水稻抗虫性，提高水稻对稻飞虱的抗性。

本发明通过将基因片段NlVgN编码产物应用到水稻植物体，或在水稻中过表达基因片段NlVgN，来提高水稻植株的抗虫性。所述褐飞虱基因片段NlVgN，具有SEQ ID No.1的DNA序列。具体地，为了提高水稻植株的抗虫性，可以通过两种方案来实现：

(1)通过体外表达褐飞虱基因片段NlVgN，获得蛋白NlVgN，然后应用于植物体；

(2)利用转基因技术将基因片段NlVgN在植物中表达。

本发明提供了两种提高水稻抗虫性的方法，包括：将体外表达的褐飞虱基因片段NlVgN编码蛋白NlVgN应用于水稻植物体以及在水稻中过量表达褐飞虱基因片段NlVgN，获得转NlVgN基因水稻植株。

针对基因NlVgN对虫害的适用范围，本发明提供了外用NlVgN处理水稻，或转NlVgN基因水稻，提高对褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱直接抗性和间接抗性的验证实验；发现与正常的水稻相比，外用NlVgN处理水稻或转NlVgN基因水稻，可以降低稻飞虱卵孵化率、增强对稻飞虱卵期寄生蜂稻虱缨小峰的引诱作用。

本发明抗虫基因为SEQ ID No.1的DNA序列，编码438个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现该基因及其编码产物与水稻的抗虫性密切相关，通过将NlVgN蛋白体外表达后直接应用于水稻体，或通过在水稻中过量表达NlVgN基因，均能有效提高水稻对稻飞虱的直接抗性和间接抗性。本发明将在作物害虫防控和抗虫育种，特别是在水稻害虫防控和抗虫育种中得到广泛应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但应申明，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明保护范围。

实施例1：褐飞虱基因NlVgN编码产物的体外获得。

1)取10头褐飞虱怀卵雌成虫，利用SV Total RNA Isolation System(Promega)试剂盒提取总RNA，反转为cDNA。

2)通过PCR技术，扩增基因NlVgN的ORF序列片段。所使用的特异性引物如下：

NlVgN-F1:5’-CCGGAATTCAGCGGCAGTGGACCATGGAA-3’

NlVgN-R1:

其中下划线位置为酶切位点，粗体为终止密码子。

3)PCR产物回收纯化后和pET-28a(Novagen)表达载体同时分别做双酶切(EcoRⅠ和XhoⅠ)；酶切后，用T4连接酶将PCR片段酶切产物克隆至表达载体上，如图1所示。

4)重组载体及pET-28a空载体(作为对照)转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Transgen#CD601)，经过细菌培养、单克隆的挑选和细菌扩增，提取质粒用以测序。

5)测序正确后，在37℃、200r/min的摇床中，将含有重组质粒及空载的大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩大培养至菌液OD₆₀₀达到0.5-0.6之间，加入IPTG(终浓度1mmol/L)，在16℃、150r/min的摇床中过夜诱导表达蛋白。

6)使用Ni-NTA agarose(QIAGEN#30310)，按照说明书步骤纯化重组蛋白及空载产物。

7)纯化蛋白使用Pierce^TMBCA Protein Assay Kit测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书配制反应液及标线。最终纯化蛋白产物加入蛋白酶抑制剂(PMSF终浓度1mmol/L)保存于-80℃冰箱。

实施例2：NlVgN蛋白处理水稻显著提高茉莉酸和茉莉酸-异亮氨酸共轭物的合成。

1)水稻处理：每株水稻叶鞘部位先用3#昆虫针针刺80下，然后均匀涂抹40μL的NlVgN纯化蛋白溶液，以水稻叶鞘部位针刺80下，然后均匀涂抹40μL的空载体纯化产物溶液或未做任何处理的稻株为对照。所采用的NlVgN纯化蛋白的浓度为26ng/μL。分别于0.5、1、3、6、12和24h后剪取处理部位的水稻叶鞘，液氮速冻保存。

2)水稻茉莉酸和茉莉酸-异亮氨酸共轭物的提取与含量测定方法参照Lu J,Robert C A M,Riemann M,et al.Induced jasmonate signaling leads to contrastingeffects on root damage and herbivore performance[J].Plant Physiology,2015,167(3):1100-1116。

实验于温度28±2℃、湿度70-80％、光照14h的人工气候室内进行，每种处理在每个时间点各设置5个生物学重复。从图2可见，与对照相比，NlVgN纯化蛋白处理水稻可显著提高水稻茉莉酸和茉莉酸-异亮氨酸共轭物的含量。

实施例3：NlVgN蛋白处理水稻显著降低褐飞虱的产卵量及卵孵化率。

1)本实施例中，水稻处理方法与实施例2相同。

2)处理24h后(期间共处理2次，第0小时和第12小时)，在每株水稻上套上一个特制玻璃罩(直径4cm，高8cm，筒壁均匀颁布48个直径0.8mm的小孔)，在玻璃罩内接入15头褐飞虱产卵雌成虫，玻璃罩的顶部使用圆形海绵封口。

3)产卵24h后去除所有雌成虫，每天观察并记录植株上孵化出的若虫数量，直至无若虫孵化后，剪取水稻，体视显微镜下解剖并记录每株植物上未孵化的卵量，整理数据，计算并统计卵的孵化率。

实验于温度28±2℃、湿度70-80％、光照14h的人工气候室内进行，每种处理各设置10个生物学重复。从图3可见，NlVgN纯化蛋白处理显著降低了褐飞虱的产卵量及卵孵化率，表明NlVgN蛋白处理可显著提高水稻对褐飞虱的直接抗性。

实施例4：NlVgN蛋白处理水稻显著增加水稻挥发物的释放量。

1)本实施例中，水稻处理方法与实施例2相同。

2)处理12h后，开始捕集三种处理水稻所释放的挥发物，持续收集8h。挥发物的捕集与鉴定方法参照Lou Y G,Ma B,Cheng J A.Attraction of the parasitoid Anagrusnilaparvatae to rice volatiles induced by the rice brown planthopperNilaparvata lugens[J].Journal of Chemical Ecology,2005,31(10):2357-2372。

实验于温度28±2℃、湿度70-80％、光照14h的人工气候室内进行，每种处理各设置5个生物学重复。从图4中可见，NlVgN蛋白处理能显著提高水稻挥发物的释放，在检测的21种挥发物中，有9种化合物的释放量要显著高于相对应的对照植株，这9种化合物分别为α-蒎烯、倍半侧柏烯、α-雪松烯、(E)-β-石竹烯、(E)-α-佛手柑油烯、倍半香桧烯、α-姜黄烯及2种未知化合物；同时，水稻经NlVgN纯化蛋白处理后，所释放的挥发物总量也显著高于相应的对照植株：分别为空载体纯化产物处理稻株释放总量的1.74倍和未处理稻株释放总量的2.22倍。

实施例5：NlVgN蛋白处理显著提高水稻挥发物对褐飞虱卵寄生蜂稻虱缨小蜂的引诱作用。

1)本实施例中，稻虱缨小蜂(Anagrus nilaparvatae)为本实验室饲养种群。水稻处理方法与实施例2相同。

2)水稻处理12h后用于稻虱缨小蜂的行为测定。20头雌蜂为一组，共测试3组，每组均更换味源水稻(8株水稻苗为一组味源)，具体方法参照Lou Y G,Ma B,Cheng JA.Attraction of the parasitoid Anagrus nilaparvatae to rice volatiles inducedby the rice brown planthopper Nilaparvata lugens[J].Journal of chemicalecology,2005,31(10):2357-2372。

从图5可见，NlVgN蛋白处理后，水稻挥发物对褐飞虱卵寄生蜂稻虱缨小蜂具有显著的吸引作用，表明NlVgN蛋白处理能提高水稻对褐飞虱的间接抗性。

实施例6：过表达NlVgN的转基因品系水稻的获得。

1)利用特异性引物(见下)，通过RT-PCR扩增NlVgN全长ORF；利用DNA亚克隆方法将其连入pCAMBIA-1301载体，获得过表达载体，如图6所示。通过电击法，将过表达载体转入农杆菌EHA105中，用于后续植物转化。引物如下：

NlVgN-F2:

NlVgN–R2:

其中下划线位置为酶切位点，斜体为His tag，粗体为终止密码子。

2)用含有过表达载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织。经过筛选和分化，得到完整的T₀代植株。

3)T₀代转基因植株获得的T₁代种子，经GUS染色筛选，去除未转入NlVgN基因的植株，并单株种植，收获T₂代种子。对每个单株的种子进行鉴定。获得转NlVgN基因的纯合品系oe-1和oe-3，用于后面的生物学功能分析。

实施例7：NlVgN过表达品系显著降低稻飞虱卵孵化率。

1)将供试水稻(XS11，oe-1，oe-3品系)去除黄叶后，单株移至约含有500ml营养液的塑料杯中(用海绵固定水稻带孔的塑料板上)；每株水稻的基部罩以两头通透的圆柱形玻璃罩(直径4cm，长8cm，筒壁均匀分布48个直径0.88mm的小孔)，水稻恢复2-3天供实验用。

2)按照实施例3中的方法，测定不同水稻品系上3种稻飞虱，包括褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱，卵的孵化率，每种处理各设置10个生物学重复。

从图7可见，在水稻中过表达NlVgN能够显著降低3种稻飞虱的卵孵化率，即显著提高了水稻对稻飞虱的直接抗性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 褐飞虱基因片段NlVgN在提高水稻抗虫性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens)

<400> 1

agcggcagtg gaccatggaa cagcaaccag cagtaccgct accatgtgca aggcagatca 60

ctgtcagcca tgcaccagtc aggatcaaac cagtacgtgg gcatgcacct gagagcagaa 120

ttggaagttg aggcgaagaa tgagaaccag gctgtgttca agatctccaa ggccgagtac 180

gccgatgtgc accagaacct aagtggaggc tggcaacaag agttacgcag caatgagctg 240

cagtacaagc agttgcccct gtcgcaagca aaccaagtct ttcaagtcaa ctacaagcag 300

ggagcagtgc gcagtctgca ggtcaacagg aacacaccca cctgggaact gaacatgatc 360

aagggattcg tcagcctgtt ccaggtcgat gtgactggcc agaatgccat caagtctagg 420

cgcaacattg tgcccaatgg ccagcaggtg agtggctcgt tcaaggttat ggaggactct 480

gtcaccggca agtgtgagac ccactacgat gttgatgagc tgccaatgag agttgtgcaa 540

cagcacccag agattgcacc acttgcagtt aagcagcagg gccagggcca gggccagagc 600

cacagccgtc tcattcaggt ggtcaagtca aggaacttta gcaactgtga taacccagtc 660

acctaccact ttggattcac tcaggaaagc aactttgagc cagccagcaa ccagatgggc 720

aaccttgtca gccgtgccgc agtgggccgt atcattattg ctgaagaacc agacagttac 780

accatccact catcggtcac tcagaatgag attgccatca gtccattcgg ctacaaccag 840

cagaagggag tagttggcac actcatgaat gccacccttg tctccgtgtc acatgcctct 900

tctggctctc ctcagtcagt ccagaaccca cagaaaatca acgatctggt ttatgagttc 960

aacccagcat caaacagtga gagcaaccaa agatctagcc actacaccag gcagcaggct 1020

gataatgaag atgacagcag ctcaagctca tctagcagtg actcttcttc atcatcctcc 1080

tcctcttcat ctagctcatc atcatcatcg agcagctcag aggagaacaa caagaatagt 1140

aagaagaaca acatcaagaa gaactggaac aacaagaacc aaaagaagaa caacaacaac 1200

aacaacagga acaaccataa tgacaatgac aacaaccagg ataactccaa tgaaaacaat 1260

aatgatgatg cttactggag gagccagcag aagaccaagt tcaggtcacg caggtaa 1317

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens)

<400> 2

Ser Gly Ser Gly Pro Trp Asn Ser Asn Gln Gln Tyr Arg Tyr His Val

1 5 10 15

Gln Gly Arg Ser Leu Ser Ala Met His Gln Ser Gly Ser Asn Gln Tyr

20 25 30

Val Gly Met His Leu Arg Ala Glu Leu Glu Val Glu Ala Lys Asn Glu

35 40 45

Asn Gln Ala Val Phe Lys Ile Ser Lys Ala Glu Tyr Ala Asp Val His

50 55 60

Gln Asn Leu Ser Gly Gly Trp Gln Gln Glu Leu Arg Ser Asn Glu Leu

65 70 75 80

Gln Tyr Lys Gln Leu Pro Leu Ser Gln Ala Asn Gln Val Phe Gln Val

85 90 95

Asn Tyr Lys Gln Gly Ala Val Arg Ser Leu Gln Val Asn Arg Asn Thr

100 105 110

Pro Thr Trp Glu Leu Asn Met Ile Lys Gly Phe Val Ser Leu Phe Gln

115 120 125

Val Asp Val Thr Gly Gln Asn Ala Ile Lys Ser Arg Arg Asn Ile Val

130 135 140

Pro Asn Gly Gln Gln Val Ser Gly Ser Phe Lys Val Met Glu Asp Ser

145 150 155 160

Val Thr Gly Lys Cys Glu Thr His Tyr Asp Val Asp Glu Leu Pro Met

165 170 175

Arg Val Val Gln Gln His Pro Glu Ile Ala Pro Leu Ala Val Lys Gln

180 185 190

Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Ser His Ser Arg Leu Ile Gln Val Val

195 200 205

Lys Ser Arg Asn Phe Ser Asn Cys Asp Asn Pro Val Thr Tyr His Phe

210 215 220

Gly Phe Thr Gln Glu Ser Asn Phe Glu Pro Ala Ser Asn Gln Met Gly

225 230 235 240

Asn Leu Val Ser Arg Ala Ala Val Gly Arg Ile Ile Ile Ala Glu Glu

245 250 255

Pro Asp Ser Tyr Thr Ile His Ser Ser Val Thr Gln Asn Glu Ile Ala

260 265 270

Ile Ser Pro Phe Gly Tyr Asn Gln Gln Lys Gly Val Val Gly Thr Leu

275 280 285

Met Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Ser His Ala Ser Ser Gly Ser Pro

290 295 300

Gln Ser Val Gln Asn Pro Gln Lys Ile Asn Asp Leu Val Tyr Glu Phe

305 310 315 320

Asn Pro Ala Ser Asn Ser Glu Ser Asn Gln Arg Ser Ser His Tyr Thr

325 330 335

Arg Gln Gln Ala Asp Asn Glu Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

340 345 350

Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

355 360 365

Ser Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asn Asn Lys Asn Ser Lys Lys Asn Asn

370 375 380

Ile Lys Lys Asn Trp Asn Asn Lys Asn Gln Lys Lys Asn Asn Asn Asn

385 390 395 400

Asn Asn Arg Asn Asn His Asn Asp Asn Asp Asn Asn Gln Asp Asn Ser

405 410 415

Asn Glu Asn Asn Asn Asp Asp Ala Tyr Trp Arg Ser Gln Gln Lys Thr

420 425 430

Lys Phe Arg Ser Arg Arg

435

Claims

1.一种褐飞虱基因片段NlVgN在提高水稻抗虫性中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述褐飞虱基因NlVgN具有SEQ ID NO.1的DNA序列。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗虫性包括，提高水稻对褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的直接抗性，和通过增强水稻对稻飞虱天敌引诱作用而提高的间接抗性。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于，将体外表达的NlVgN纯化蛋白直接应用于水稻体，或在水稻中表达所述褐飞虱基因NlVgN。

5.一种褐飞虱基因片段NlVgN的编码产物在提高水稻抗虫性中的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述褐飞虱基因NlVgN的编码产物具有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。