CN114525361B

CN114525361B - 一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114525361B
Application number: CN202210227612.9A
Authority: CN
Inventors: 王振宝; 杨妍妍; 刘冰江; 霍雨猛; 徐宏志; 孙亚玲; 李艳伟; 吴雄
Original assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-03-08
Also published as: CN114525361A

Abstract

本发明涉及一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记及其应用。本发明根据洋葱花青素合成酶基因序列设计引物，以30天苗龄紫皮、黄皮洋葱假茎为试材，提取总RNA，再反转录成cDNA，以Actin基因为对照进行花青素合成酶基因的差异表达分析，开发了区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记，利用得到的cDNA分子标记能够快速、准确的区分紫皮和黄皮洋葱。并利用其它紫皮、黄皮洋葱品种对这一标记进行了验证。本发明获得了区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记，可以应用于洋葱种子纯度鉴定，与传统种子纯度鉴定法相比，能快速、准确区分紫皮和黄皮洋葱，具有较大的商业应用价值，也可以应用于洋葱种质资源鉴定和辅助育种方面。

Description

一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记及其应用

技术领域

本发明属于作物分子育种技术领域，具体涉及一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记及其在洋葱种质资源鉴定和辅助育种方面的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

洋葱(Allium cepa.L)，别名球葱、圆葱、玉葱、葱头、皮牙子等，百合科葱属二年生草本植物，是一种世界性蔬菜，至少有175个国家栽培洋葱。洋葱于近代传入我国，由于具有适应性强，耐贮藏和运输的特点，在我国广泛栽培，是一种重要的出口创汇蔬菜。我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，生产面积和总产量约占全世界的30％。洋葱以肉质鳞茎为主要食用器官，营养物质丰富，不仅可以鲜食，也可以用于加工，有“蔬菜皇后”的美誉。洋葱中含有的类黄酮、槲皮素、有机硫等具有重要的生物和药用保健价值，有抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、降低血栓形成、消炎、防癌等作用。

洋葱为两年生蔬菜，在中日照生态区一般7月初采种结束，经过一个多月的清理、晾晒、包装、销售，最后进入种植户手中。洋葱种植具有严格的播种育苗时间，中日照生态区需要在9月中上旬播种育苗，而现有的形态学检测技术手段还不能在2个月内准确检区分不同皮色的洋葱种子。在洋葱种子生产过程中，由于亲本不完全纯合、群体自然分离、机械混杂等因素会造成种子纯度不合格。为了避免因种子纯度不合格带来的风险，种子生产企业要将新采收的洋葱种子在仓库储存一年，采取传统田间种植法来检测种子纯度。在种子储藏过程中，不仅给经销商带来较大的库存周转压力，种子的发芽率和发芽势均会出现一定程度的降低。

种子纯度检验技术已经由外观形态发展到生理生化水平和分子水平上的检测，检验方法有生理生化指标检测法、蛋白质电泳技术检测法和分子标记技术检测法，能够快速、准确鉴定种子纯度。关于通过生物技术手段检测洋葱种子纯度的研究较少，茹鲜(茹鲜,王建华,孙群.洋葱幼苗形态快速鉴定技术研究，园林园艺科学,2003,19(6):190-191)通过采用不同光质培养与幼苗叶绿素测定的方法，可以鉴定白皮洋葱与有色洋葱种子，但无法有效的区分紫皮洋葱与黄皮洋葱。张彦萍(张彦萍,刘海河,马德伟.利用种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定洋葱品种类型,种子,2003,128(2):16,20)利用种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定洋葱品种类型，可以区分长日型与短日型洋葱，但是无法区分相同日照类型的不同皮色的洋葱。分子标记技术检验法是利用品种间形态和生化上的区别，归根结底是品种间在基因上的区别，分子标记技术是通过开发与品种特性相连锁的分子标记，对基因序列的差异进行分析，从而鉴定不同品种，达到检测种子纯度的目的，其检测对象是种子或幼苗的基因片段，不受环境的影响，具有较高的准确性、稳定性和重复性，能快速、准确的鉴定种子纯度。

花青素是植物产生紫、红、蓝颜色的主要因素之一，花青素合成酶在植物花青素生物合成途径中的作用是将无色花青素转化为有色花青素。花青素生物合成途径结构基因的表达或表达量的上调都可以造成植物组织器官中花青素的累积，从而产生颜色上的差异。花青素合成酶基因的表达与花青素的累积量呈正相关，颜色越深或越鲜艳的组织部位花青素合成酶基因的表达量越高。花青素合成酶基因的差异表达是洋葱产生不同皮色的重要因素，通过研究不同皮色洋葱花青素合成酶基因的表达情况，获得在不同皮色洋葱中差异表达的片段，开发分子标记，达到快速、准确区分不同皮色洋葱的目的。

发明内容

本发明提供了一种能够区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记及其应用。本发明以洋葱花青素合成酶基因序列设计引物，以cDNA为模板进行不同皮色洋葱幼苗的差异表达分析，获得差异表达的cDNA分子标记，命名为ANS390。本发明基于该分子标记ANS390，对已知皮色的5个紫皮洋葱品种和5个黄皮品种进行了PCR验证，所有紫皮洋葱品种均扩增出了390bp大小的条带，而黄皮洋葱中没有扩增产物，PCR扩增结果与洋葱品种实际颜色特征相符。上述鉴别方法可在30天苗龄期对紫皮洋葱和黄皮洋葱进行区分，应用该cDNA分子标记可以快速、准确区分紫皮和黄皮洋葱，从而达到检测种子纯度的目的，可用于洋葱种质资源鉴定和辅助育种。

基于上述技术成果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记，所述cDNA分子标记长度为390bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。

上述第一方面提供的cDNA分子标记可用于多个品种紫皮和黄皮洋葱的区别鉴定，所述紫皮洋葱包括但不限于天正201、赤玉3号、早生紫丰、紫玲、改良赤玉品种；所述黄皮洋葱包括但不限于天正105、黄金大玉葱、红叶3号、地球、早黄金品种。

本发明第二方面，提供一种区分紫皮和黄皮洋葱的引物，所述引物序列如下：

正向引物ANS-F：5′-CTAACGATCAATCTAAAGGGA-3′(SEQ ID NO.2)；

反向引物ANS-R：5′-GCAGTATGAACGATAAGGCAC-3′(SEQ ID NO.3)。

通过上述第二方面所述引物对洋葱cDNA进行扩增，紫皮洋葱则能够扩增得到第一方面所述的cDNA分子标记。

本发明第三方面，提供一种用于区分紫皮和黄皮洋葱的试剂组合，所述试剂组合中包括第二方面所述的引物。

本发明第四方面，提供第一方面所述cDNA分子标记、第二方面所述引物和/或第三方面所述试剂组合在洋葱种质资源鉴定和辅助育种方面的应用。

第四方面所述应用至少包括以下两方面：

(1)将所述第二方面所述引物和/或第三方面所述试剂组合用于制备鉴别洋葱皮色的产品；

(2)通过第一方面所述cDNA分子标记、第二方面所述引物和/或第三方面所述试剂组合对洋葱种子的纯度进行鉴定。

上述(1)方面中，所述鉴别洋葱的产品的具体实施方式如试剂盒，本发明第五方面，提供一种用于区分紫皮和黄皮洋葱的试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述引物和/或第三方面所述试剂组合。

优选的，所述试剂盒中，还包括对照基因扩增引物；所述对照基因的一种实例如Actin基因，所述对照基因的扩增引物序列如下：

上游引物Actin-F：5′-ACACGGCCTGGATAGCAACAT-3′(SEQ ID NO.4)；

下游引物Actin-R：5′-AGAGCAGTATTCCCAAGCATT-3′(SEQ ID NO.5)。

优选的，所述试剂盒中，还包括洋葱总RNA提取试剂及反转录试剂。

优选的，所述试剂盒中，还包括PCR反应扩增体系。

本发明第六方面，提供一种洋葱品种鉴别方法，所述方法包括以下步骤：提取洋葱总RNA，经反转录获得cDNA，利用第二方面所述引物对上述cDNA进行PCR扩增；若第二方面所述引物不能扩增得到特异性条带，则判断为黄皮洋葱；若扩增后能够获得长度为390bp的条带，则判断为紫皮洋葱。

上述第六方面的一种实施方式中，采用假茎为试材对洋葱品种进行鉴别，具体鉴别步骤如下：

(1)选用紫皮洋葱育种材料和黄皮洋葱育种材料；

(2)Trizol法提取洋葱幼苗假茎总RNA；

(3)将提取的总RNA用反转录试剂盒反转录成cDNA；

(4)以Actin基因为对照，利用ANS390标记引物进行PCR扩增；

(5)对已知皮色的紫皮、黄皮洋葱品种进行验证。

上述步骤(2)中，洋葱总RNA提取采用Trizol法；PCR扩增在美国伯乐的TC-XP-D型基因扩增仪上进行，25μL体系，其中2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH₂O 8.5μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸30sec，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙啶染色，凝胶成像***自动成像。其结果为，使用第二方面所述扩增引物进行紫皮、黄皮洋葱花青素合成酶基因的表达分析，以Actin基因作对照，发现在紫皮洋葱中能扩增出390bp大小的特异性条带，而黄皮洋葱中无特异性扩增。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明选用紫皮和黄皮洋葱幼苗假茎的cDNA进行PCR扩增，获得了区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记，为利用分子标记检测洋葱种子纯度奠定了基础，能够通过30天苗龄的洋葱幼苗鉴定洋葱种子的纯度，与目前技术相比，其优点是：(1)标记稳定：本发明选用紫皮洋葱育种系175F和黄皮洋葱育种系DH17-1的cDNA进行PCR扩增，获得了区分两种颜色洋葱的稳定的cDNA标记，并对5个紫皮洋葱品种和5个黄皮洋葱品种进行了验证，其颜色与分子标记鉴定结果完全一致。(2)分子标记技术检验法操作简便、缩短检测时间、节约成本：洋葱是两年生植物，田间小区种植鉴定所需时间长、用地较多、成本高，并且该鉴定方法难以鉴定当年生产的种子的纯度；而现有的生理生化指标检测法和蛋白质电泳技术检测法还无法有效鉴别紫皮和黄皮洋葱。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中紫皮、黄皮洋葱假茎总RNA电泳图片；

其中1、2、3为紫皮洋葱育种系175F不同单株假茎的总RNA；4、5、6为黄皮洋葱育种系DH17-1不同单株假茎的总RNA。

图2为实施例1中ANS390标记在紫皮、黄皮洋葱育种材料中扩增情况；

其中1、2、3为ANS390标记在紫皮洋葱育种系175F不同单株的扩增情况；4、5、6为ANS390标记在黄皮洋葱育种系DH17-1不同单株的扩增情况。

图3为实施例1中不同品种紫皮、黄皮洋葱品种假茎总RNA电泳图片；

其中1、2、3、4、5分别为紫皮洋葱品种天正201、赤玉3号、早生紫丰、紫玲、改良赤玉假茎的总RNA；6、7、8、9、10分别为黄皮洋葱品种天正105、黄金大玉葱、红叶3号、地球、早黄金假茎的总RNA。

图4为实施例1中ANS390标记在不同品种紫皮、黄皮洋葱单株中的验证；

其中1、2、3、4、5分别为ANS390标记在紫皮洋葱品种天正201、赤玉3号、早生紫丰、紫玲、改良赤玉中的扩增情况；6、7、8、9、10分别为ANS390标记在黄皮洋葱品种天正105、黄金大玉葱、红叶3号、地球、早黄金中的扩增情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

(一)材料与方法

1、植物材料

选用紫皮洋葱育种系材料175F、黄皮洋葱育种系材料DH17-1以及紫皮洋葱品种(天正201、赤玉3号、早生紫丰、紫玲、改良赤玉)、黄皮洋葱品种(天正105、黄金大玉葱、红叶3号、地球、早黄金)。

2、总RNA的提取与检测

选取30天苗龄洋葱的假茎，采用Trizol法(Invitrogen,California,USA)提取洋葱假茎的总RNA，琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测。

3、总RNA的反转录

参照PrimeScript^TM RT reagent kit with gDNA Eraser(宝生物工程大连有限公司)反转录试剂盒操作说明书。

4、引物的设计与合成

参照缪军(缪军,刘冰江,吴雄,等.洋葱花青素合成酶基因的克隆和序列分析[J].山东农业科,2010(1):1-5.)克隆的洋葱花青素合成酶基因序列，设计了一对cDNA标记引物ANS-F：5′-CTAACGATCAATCTAAAGGGA-3′，ANS-R：5′-GCAGTATGAACGATAAGGCAC-3′；根据根据NCBI-GenBank Actin基因设计了对照引物Actin-F：5′-ACACGGCCTGGATAGCAACAT-3′，Actin-R：5′-AGAGCAGTATTCCCAAGCATT-3′，由青岛蔚来生物科技有限公司合成，PAGE纯化。

5、PCR扩增程序及检测

PCR扩增在美国伯乐的TC-XP-D型基因扩增仪上进行。扩增体系和反应程序：25μL体系，其中2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH₂O 8.5μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像***自动成像。

6、ANS390标记在育种系材料中的验证

选取紫皮洋葱育种系175F和黄皮洋葱育种系DH17-1，30天苗龄期提取假茎总RNA，反转录成cDNA，然后进行PCR扩增，以ANS390(ANS-F，ANS-R)为扩增引物，Actin(Actin-F，Actin-R)为对照引物，反应体系、程序以及检测方法参照6。对紫皮洋葱育种系175F、黄皮洋葱育种系DH17-1的不同单株进行PCR扩增。

7、ANS390标记在其它紫皮、黄皮洋葱品种中的验证

利用cDNA分子标记ANS390(ANS-F，ANS-R)引物和Actin(Actin-F，Actin-R)对照引物，对已知皮色的紫皮洋葱品种和黄皮洋葱品种进行PCR验证，反应体系、扩增程序以及检测方法参照6。

(二)结果与分析

1、不同皮色洋葱假茎总RNA检测分析

应用Trizol法提取不同皮色洋葱假茎的总RNA。对提取的总RNA进行分光光度计检测，其中OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间；琼脂糖凝胶电泳可以看出28s、18s条带清晰、无弥散，未检测到DNA残留(图1)。证实提取的总RNA样品质量可靠，可以进行下一步的试验。

2、ANS390标记在育种材料中检验

以ANS390(ANS-F，ANS-R)为扩增引物，Actin(Actin-F，Actin-R)为对照引物，对紫皮洋葱育种系175F、黄皮洋葱育种系DH17-1的不同单株进行半定量表达分析。结果表明在紫皮洋葱中均有390bp条带的特异性扩增，而在黄皮洋葱中无特异性扩增(图2)。

3、ANS390标记通用性验证

分别提取30天苗龄期紫皮洋葱品种天正201、赤玉3号、早生紫丰、紫玲、改良赤玉和黄皮洋葱品种天正105、黄金大玉葱、红叶3号、地球、早黄金假茎的总RNA(图3)，然后反转录成cDNA，以ANS-F和ANS-R为扩增引物，Actin-F和Actin-R为对照引物，进行半定量表达分析。结果表明在紫皮洋葱品种中均有390bp条带的特异性扩增，而黄皮洋葱品种中无此特异性扩增(图4)。

ANS390:

ANS-F：5′-CTAACGATCAATCTAAAGGGA-3′

ANS-R：5′-GCAGTATGAACGATAAGGCAC-3′

Actin：

Actin-F：5′-ACACGGCCTGGATAGCAACAT-3′

Actin-R：5′-AGAGCAGTATTCCCAAGCATT-3′。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院

<120> 一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记及其应用

<130> 2010

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctaacgatca atctaaaggg aagatccaag ggtatggaag taaactggca aataatgcaa 60

gcgggcaact cgagtgggag gactactttt ttcatctcat ttttcctgat gacaaggtcg 120

atctctccgt ttggcctaaa cagccttccg actacattga aattatgcaa gagtttggaa 180

gtcagctgag aatattagcc agcaaaatgc tatccatact ttcattgggc ttacaactac 240

caaccaagga caggctagaa caagaactaa aaggaccaga agacttactt ctccagctga 300

aaataaacta ctacccaaaa tgcccccagc cacatctggc attaggagtg gaagcccaca 360

cggacgtgag tgccttatcg ttcatactgc 390

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctaacgatca atctaaaggg a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcagtatgaa cgataaggca c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acacggcctg gatagcaaca t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagcagtat tcccaagcat t 21

Claims

1. cDNA分子标记、引物和/或试剂组合在洋葱种质资源鉴定和辅助育种方面的应用，其特征在于，所述cDNA分子标记长度为390bp，其序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物序列如下：

正向引物ANS-F： 5′-CTAACGATCAATCTAAAGGGA-3′

反向引物ANS-R： 5′-GCAGTATGAACGATAAGGCAC-3′；

所述应用至少包括以下两方面：

（1）将所述引物和/或试剂组合用于鉴别紫皮和黄皮洋葱；

（2）通过所述cDNA分子标记、引物和/或试剂组合对洋葱种子的纯度进行鉴定；

样本为：选取30天苗龄洋葱的假茎；

扩增体系和反应程序：25μL体系，其中2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像***自动成像；

所述试剂组合中包括所述的引物。

2.一种洋葱品种鉴别方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：提取30天苗龄洋葱幼苗假茎总RNA，经反转录获得cDNA，利用权利要求1中所述的引物对上述cDNA进行PCR扩增；若所述引物不能扩增得到特异性条带，则判断为黄皮洋葱；若扩增后能够获得长度为390bp的条带，则判断为紫皮洋葱；

样本为：选取30天苗龄洋葱的假茎；

扩增体系和反应程序：25μL体系，其中2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像***自动成像。