CN114525342A - Linc02806在肝细胞癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于肝癌诊疗的生物标志物，具体的该标志物为LINC02806。本发明首次发现LINC02806的差异表达与肝癌的发生发展相关，在肝癌患者中，LINC02806的表达上调，提示干预LINC02806基因表达可能成为肝癌治疗的新途径。为了进一步验证，通过抑制剂降低LINC02806的表达发现可以显著降低肝癌细胞的增殖和细胞形成克隆集落数。

Description

LINC02806在肝细胞癌诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及LINC02806在肝细胞癌诊断和治疗中的应用。

背景技术

肝癌是全球癌症死亡的最大主要原因之一，特别是在中国，肝癌由于肝炎病毒的高感染率已成为最常见的癌症之一。在原发性肝癌中，肝细胞癌是最常见的类型。乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染仍然是肝细胞癌发病的主要原因。由于晚期诊断和有限的治疗选择，肝癌患者预后不良，在全球范围内发病率呈上升趋势。未接受治疗的晚期肝癌患者的中位生存期仅为7.1个月。即使在治疗后，肿瘤复发也是一个问题。例如，复发发生在近70％的患者术后5年，降低了患者的生存率。因此，迫切需要阐明肝癌进展的分子发病机制，确定最佳的诊断和治疗策略，从而有助于开发新的诊断标志物和治疗靶点，在临床上提高治疗效率和预后。

lncRNA是非开放阅读框的RNA分子，长度>200个核苷酸。尽管lncRNA没有蛋白质编码能力，但它们在表观遗传学和调节基因表达方面很重要。大量研究已经证实lncRNA参与大脑发育、胚胎发育、组织分化和器官发生。近年来已经看到lncRNA在包括肝癌在内的多种人类疾病中的关键作用。例如,lncRNA MAGI2-AS3可能对肝癌有保护作用，lncRNA-HIS被认为促进了HCC的发生增殖和转移，以及lncRNA-DUXAP10通过microRNA-1914起到抑制肝癌细胞增殖的作用。这意味着lncRNA可能成为潜在有效的肝癌诊断和治疗生物标志物。

目前lncRNA在肝癌中的调控分子机制仍处于探索阶段，还有很多未知的lncRNA在肝癌中的作用需要研究，对肝癌的诊断、预后和预测具有重要作用，并为肝癌的靶向治疗提供有效治疗靶点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种诊断早期肝癌的产品，使患者在早期就得以治疗，进而提高生存率和生活质量。

本发明的目的之二，提供一种治疗手段和药物组合物，实现肝癌的精准分子治疗。

本发明的目的之三，提供一种筛选预防或治疗肝癌待筛选物质的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测LINC02806的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。

所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LINC02806表达水平的试剂。

进一步，用实时定量PCR检测LINC02806的试剂至少包括一对特异性扩增LINC02806的引物。

进一步地，所述试剂包括：

特异性识别LINC02806的探针；或

特异性扩增LINC02806的引物。

进一步地，所述特异性扩增LINC02806的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种诊断肝癌的产品，所述产品包括检测样本中LINC02806表达水平的试剂。

所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测LINC02806转录水平的针对LINC02806的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括用于检测LINC02806转录水平的引物或芯片。

固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括LINC02806基因在内的多个基因(例如，与肝癌相关的多个基因)的表达水平，将肝癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝癌诊断的准确率。

进一步，所述检测样本中LINC02806的水平的试剂包括：

特异性识别LINC02806的探针；或

特异性扩增LINC02806的引物。

进一步，特异性扩增LINC02806的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了LINC02806在制备治疗肝癌的药物组合物中的应用。

进一步地，所述的药物组合物包括LINC02806的抑制剂，和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料，所述抑制剂能够抑制LINC02806或涉及LINC02806上游或下游途径的物质的表达。

进一步地，所述抑制剂为针对LINC02806的siRNA。

本发明在筛选有效的siRNA序列时，通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。在本发明的具体实施方式中，发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，结果检测出干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有SEQID NO.9、SEQ ID NO.10所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞实验而言抑制效率非常高。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。在具体的实施方案中，作为非限制性的实例，标志物基因LINC02806具有目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中LINC02806基因(NC_000001.11)所示的序列。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

在本发明中，药学上可接受的载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

在本发明中，药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、***给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本发明所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于降低内源性的LINC02806过表达，通过降低LINC02806的表达，从而治疗因LINC02806表上调导致的肝癌。

在本发明中，可将抑制LINC02806表达的化合物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含抑制LINC02806表达的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体等。

本发明的药物组合物可进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种抑制LINC02806基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的化疗剂，包括但不限于：微管激活剂、烷化剂、抗赘生抗代谢物、铂类化合物、DNA-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，微管蛋白稳定剂，微管蛋白去稳定剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，HMG-COA抑制剂，CDK抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋DNA，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。

本发明的药物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

本发明的药物组合物可以按药剂学上有效的量进行给药，本发明的用语“药剂学上有效的量”指的是以可适用于医学治疗或预防的合理的受惠/危险比率足以治疗或预防疾病的量，可根据包括疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、所使用的本发明组合物的给药时间、给药途径及排出比率、治疗时间、与所使用的本发明的组合物配合或同时使用的药物的要素及其它医学领域中公知的要素来决定有效用量水平。本发明的药物组合物可作为单独的治疗剂进行给药，或是与其它治疗剂并用地进行给药，可以与以往的治疗剂依次地或同时地进行给药。此外，可单次或多次地进行给药。重要的是，需要对上述要素均加以考虑，并且以无副作用的最少的量可取得最大效果的量进行给药。

术语“治疗”是指不以治愈为目的，而是减缓(减少)靶定的病理状况或病症或防止复发。如果接受治疗有效量的治疗剂之后，患者成功地被“治疗”，患者显示出可观测到的和/或可度量的一种或多种特定疾病的迹象和症状的减少或消失。例如，癌细胞数目显著减少或癌细胞消失，减少肿瘤尺寸；抑制(即，在某种程度上减缓，及优选地停止)肿瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；使在一定程度上减少和/或减轻与特定癌症相关联的一种或多种症状的时间增加；减少的发病率和死亡率，以及改善生活质量。疾病的迹象或症状的减轻能够为患者感知。治疗可以实现完全反应—定义为癌症的所有迹象消失，或部分反应—肿瘤尺寸减小，优选减小的比例超过50％、更优选75％。如果患者感受到疾病稳定，患者也被视为得到治疗。

在本发明中，术语“样本”包括(但不限于)细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。

本发明还提供了LINC02806在筛选预防或治疗肝癌的待筛选物质中的应用。

进一步，所述的筛选预防或治疗肝癌的待筛选物质的步骤包括：

待筛选物质处理表达或含有LINC02806基因的体系；和

检测所述体系中LINC02806基因的表达；

其中，若所述待筛选物质可降低LINC02806基因的表达或活性(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上，更佳的低80％以上)，则表明该待筛选物质是预防或治疗肝癌的待筛选物质。

进一步，上面所述的体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

与现有技术相比，本发明提供了一种诊断早期肝癌的产品，使患者在早期就得以治疗，进而提高生存率和生活治疗。本发明还提供一种治疗手段和药物组合物，实现肝癌的精准分子治疗。本发明提供一种筛选预防或治疗肝癌待筛选物质的方法，对肝癌的诊断、预后和预测具有重要作用。

附图说明

图1示利用QPCR检测LINC02806在肝癌患者中的表达情况图；

图2示利用QPCR检测LINC02806在肝癌细胞中的表达情况图；

图3是利用QPCR检测转染siRNA对在HepG2肝癌细胞中LINC02806的表达影响图；

图4是是利用CCK8检测LINC02806对HepG2肝癌细胞增殖的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：筛选与肝癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集5例肝癌患者的癌组织以及癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

采用R包DESeq2，对原始的count数据进行生物信息学分析，删除不易检测到的lncRNA，差异表达lncRNA筛选标准：FDR<0.05，abs(log2FC)>2。

7、结果

RNA-seq结果显示，LINC02806在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。

实施例2：QPCR测序验证LINC02806基因的差异表达

1、对LINC02806基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式收集肝癌组织和癌旁组织样本各50例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用20μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，预混试剂，模板RNA。37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃维持。

(3)QPCR扩增检验

根据LINC02806基因和管家基因GAPDH的序列设计引物，引物序列由上海生工合成。设计的引物序列如下所示：

LINC02806基因的引物序列为：

正向引物：5’-CACGATCCACATCTCAGGGG-3’(SEQ ID NO.1)

反向引物：5’-TCAACACACTCGGAAGAGGC-3’(SEQ ID NO.2)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3’(SEQ ID NO.4)

配制10μl以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系5μl，正反向引物(5μM)各2μl，模板cDNA 1μl。各项操作均于冰上进行。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。扩增程序为：95℃60s，(95℃10s，60℃30s)×40个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在7500Fast荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，LINC02806基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3：LINC02806基因在肝癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取

采用Qiagen的细胞RNA提取试剂盒对细胞中的RNA进行提取，实验操作按照说明书进行。

3、逆转录具体步骤同实施例2

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2所示，与正常肝细胞系相比，LINC02806基因在肝癌细胞HepG2、Huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例4LINC02806基因的沉默

1、细胞培养

培养人肝癌细胞株HepG2，具体操作同实施例3。

2、siRNA设计

根据LINC02806的序列设计干扰RNA，将实验分成四组：空白对照组(HepG2)，阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，其中阴性对照组siRNA与LINC02806基因的序列无同源性。设计的siRNA序列如下所示：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-AAAUCAGAGAAUAAUCUAGGA-3’(SEQ ID NO.5)，

反义链为5’-UUUAGUCUCUUAUUAGAUCCU-3’(SEQ ID NO.6)；

siRNA1：

正义链为5’-UAUUACUCCCCUUAUUGCGGG-3’(SEQ ID NO.7)，

反义链为5’-AUAAUGAGGGGAAUAACGCCC-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA2：

正义链为5’-UCAAUGUGUUUUUGGAAUGCA-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链为5’-AGUUACACAAAAACCUUACGU-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA3：

正义链为5’-AGAUACAGUAGGAAGAUGGCA-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-UCUAUGUCAUCCUUCUACCGU-3’(SEQ ID NO.12)

将细胞按2×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

3、QPCR检测LINC02806基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取具体步骤同实施例3。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰LINC02806基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图3显示，相比转染空载siRNA-NC，实验组中LINC02806mRNA的水平下降，其中siRNA2组的干扰效果最为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5CCK8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、CCK8检测细胞增殖

1)将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔2×103个细胞；将实验分为组(对照组、siRNA-NC组、siRNA2组)，每组设3个复孔；

2)分别在转染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔CCK8试剂；

3)2h后使用酶标仪检测A450的吸光值。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图4所示的结果显示：siRNA2组的细胞生长速度明显低对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明LINC02806的敲除能够抑制肝癌细胞的生长。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测LINC02806的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂包括：

特异性识别LINC02806的探针；或

特异性扩增LINC02806的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述特异性扩增LINC02806的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.一种诊断肝癌的产品，其特征在于：所述产品包括检测样本中LINC02806表达水平的试剂。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。

6.LINC02806在制备治疗肝癌的药物组合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的药物组合物包括LINC02806的抑制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抑制剂为针对LINC02806的siRNA。

9.LINC02806在筛选预防或治疗肝癌的待筛选物质中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述筛选预防或治疗肝癌的待筛选物质的步骤包括：

待筛选物质处理表达或含有LINC02806基因的体系；和

检测所述体系中LINC02806基因的表达；

其中，若所述待筛选物质可降低LINC02806基因的表达或活性，则表明该待筛选物质是预防或治疗肝癌的待筛选物质。

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