CN114522219A - 一种共递送聚合物前药及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种共递送聚合物前药及其制备方法和用途；具体涉及一种同时荷载化疗药物和免疫药物的共递送聚合物前药CPT‑SS‑Dex‑PTD及其纳米胶束，本递药***由聚合物前药载体Dex以酯键接枝化疗药物喜树碱CPT和免疫药物匹多莫德PTD；共递送聚合物前药CPT‑SS‑Dex‑PTD自组装形成胶束，给药后到达肿瘤组织，释放PTD，激发NK细胞及巨噬细胞，刺激细胞炎症因子ILN‑γ；肿瘤细胞内谷胱甘肽断裂二硫键从而快速释放喜树碱，杀死肿瘤细胞；激活的免疫细胞可释放抗肿瘤细胞因子，以及激活抗肿瘤免疫应答；进而协同抑杀肿瘤。本发明通过体内外抗肿瘤活性评价，证明了该***优于游离药物组，能够显著提高喜树碱抗癌活性，具有明确的协同治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，涉及一种共递送聚合物前药及其制备方法和用途，具体涉及一种同时荷载化疗药物和免疫药物的共输送递药***。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过激发肿瘤患者自身的免疫***，使之克服肿瘤的免疫耐受及逃逸机制，特异性地攻击并清除体内的肿瘤；其对复发性及迁移性肿瘤具有较好的疗效，已成为当前很具有吸引力的治疗手段之一。随着对肿瘤生物学与肿瘤免疫学的研究深入，并结合临床研究结果显示，在化疗(特别是在低剂量药物作用下)可通过增加肿瘤细胞的免疫原性、加强抗原的加工提呈、消除免疫抑制相关的MDSC和Treg细胞等方式，激发特异性抗肿瘤免疫反应；肿瘤疫苗、免疫细胞或免疫佐剂等可增强机体的抗肿瘤免疫应答或者直接杀伤肿瘤细胞，从而改善肿瘤细胞对化疗的敏感性以提高化疗效果。
在临床治疗中，大多数化疗药物由于自身缺乏选择性，在杀死肿瘤细胞的同时也会误伤免疫细胞及正常细胞，表现出免疫抑制以及毒副作用；虽然低剂量时对免疫抑制较轻，但抗肿瘤疗效也会下降，易于产生耐药性。同时，细胞因子或CAR-T细胞疗法等在治疗中，能激活强烈的肿瘤免疫应答，但也能活化非特异性免疫***攻击正常组织细胞，造成毒副作用。此外，这些免疫药物多为蛋白类物质，在体内易于降解，使得能够有效激活免疫细胞的抗原或佐剂的量不足。要解决这些问题，需要增加药物在治疗部位的浓度，又要能在传递中有效地保护药物，因而纳米药物传递***是较适宜的选择之一。
发明内容
匹多莫德(pidotimod，PTD)是一种水溶性的免疫促进剂，临床上用于反复发作的呼吸道、泌尿道感染，以及免疫功能低下的病毒感染及恶性肿瘤等。匹多莫德能够激活NK细胞及巨噬细胞，明显提高的巨噬细胞的吞噬能力和趋化性；可使免疫功能低下时的辅助性T细胞(CD8+)与抑制性T细胞(CD4+)的比值升高或恢复正常，以及刺激细胞炎症因子IL-2和IFN-γ等的分泌；并能够诱导树突细胞(dendritic cell，DC)成熟，以及刺激DC释放大量的促炎症因子如MCP-1、TNF-α，促进T细胞增殖，分化为Th1型。
免疫促进药物匹多莫德PTD的化学结构式如下：
喜树碱(camptothecin，CPT)为一种拓扑异构酶I抑制剂，其来源植物喜树，在江西分布广泛，资源较为丰富。喜树碱呈疏水性，在体内其内酯环易于开环并与血液中的血清白蛋白结合，导致毒副作用增强。研究显示，在高剂量时呈免疫抑制，低剂量时对免疫无影响；小剂量羟基喜树碱联用IL-2治疗癌腹膜转移具有较好的疗效，显著优于单一治疗组。由此可见，喜树碱的免疫抑制与剂量呈正相关，其与免疫治疗联用有一定的协同增效作用。
化疗药物喜树碱CPT的化学结构式如下：
基于这些现状，设计合理的递送***，为实现化药免疫协同抗肿瘤的效果，采用了生物相容性良好的葡聚糖作为骨架载体，通过具有还原响应性的二硫键连接喜树碱，通过酸碱敏感的酯键连接匹多莫德，喜树碱疏水性，匹多莫德亲水性，可自发形成胶束，给药后到达肿瘤组织后，释放匹多莫德可活化肿瘤微环境中的免疫细胞，产生杀伤肿瘤的细胞因子，从而改善肿瘤微环境的免疫抑制状态；喜树碱递送到肿瘤细胞，快速释放杀死肿瘤细胞；同时活化的抗原呈递细胞提呈肿瘤抗原，激活抗肿瘤免疫应答，从而协同增强抗肿瘤效应。
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种共递送化疗药物和免疫药物的纳米载体，本发明递药***能够将免疫药物和化疗药物递送到肿瘤组织，二者协同抑杀肿瘤细胞，达到协同***的目的，该递药***是可用于协同***的化疗药物和免疫药物共递送纳米给药***，涉及一种自组装形成共载化疗药物和免疫药物的纳米共递送***，本发明的自组装纳米递送***能够将化疗药物和免疫药物同时递送到肿瘤组织，化疗药物和免疫药物能协同抑杀肿瘤细胞。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种共递送聚合物前药，为共递送聚合物前药CPT-SS-Dex-PTD，CPT-SS-Dex-PTD的化学结构式如下：
其中，m、n为正整数。
所述共递送聚合物前药由聚合物前药载体葡聚糖Dex通过酯键连接匹多莫德PTD，以及喜树碱CPT，形成的共递送聚合物前药CPT-SS-Dex-PTD；
其中，聚合物前药载体葡聚糖Dex的化学结构式如下：其中，m、n为正整数，
本发明中，聚合物前药载体葡聚糖Dex的分子量为4000-80000Da，优选为40000Da。
共递送聚合物前药CPT-SS-Dex-PTD的制备方法包括：
葡聚糖Dex和匹多莫德PTD反应生成Dex-PTD，其中葡聚糖Dex、匹多莫德PTD、Dex-PTD的结构式分别为：
喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸反应生成CPT-SS-COOH，其中喜树碱CPT、3,3'-二巯基二丙酸、CPT-SS-COOH的结构式分别为：
Dex-PTD和CPT-SS-COOH反应生成CPT-SS-Dex-PTD。
在一些实施例中，所述葡聚糖Dex和匹多莫德PTD反应生成Dex-PTD，包括：采用DCC和DMAP活化羧基，葡聚糖Dex在有机溶剂(优选为无水DMSO)中与葡聚糖Dex反应生成Dex-PTD，过滤，透析，冷冻干燥，保存；
在一些实施例中，所述喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸反应生成CPT-SS-COOH，包括：采用EDC和DMAP活化羧基，3,3'-二巯基二丙酸在有机溶剂(优选为无水DMF)中与喜树碱CPT反应生成CPT-SS-COOH，静置，过滤，水洗，层析，避光保存；
在一些实施例中，所述Dex-PTD和CPT-SS-COOH反应生成CPT-SS-Dex-PTD，包括：采用DCC和DMAP活化羧基，CPT-SS-COOH在有机溶剂(优选为无水DMSO)中与Dex-PTD反应生成CPT-SS-Dex-PTD，过滤，透析，冷冻干燥即得。
所述有机溶剂选自无水DMSO、无水DMF、无水THF中的一种或几种混合。
在一些具体实施例中，CPT-SS-Dex-PTD的制备方法包括：
所述葡聚糖Dex和匹多莫德PTD反应生成Dex-PTD，包括：将聚合物前药载体Dex和4-二甲氨基吡啶DMAP溶于无水二甲基亚砜DMSO中，在搅拌下加入匹多莫德PTD和二环己基碳二亚胺DCC，之后加入三乙胺，混合物在20-30℃避光环境下搅拌12-36h，过滤，滤液经透析、冷冻干燥后即得Dex-PTD；
和/或，所述喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸反应生成CPT-SS-COOH，包括：将3,3'-二巯基二丙酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入4-二甲氨基吡啶DMAP、喜树碱CPT、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC，在室温下避光环境下搅拌6-20h，向反应液中加入冰水，静置过夜，过滤，水洗多次，将滤饼晾干，用硅胶柱层析法洗脱，即得CPT-SS-COOH；
和/或，所述Dex-PTD和CPT-SS-COOH反应生成CPT-SS-Dex-PTD，包括：将Dex-PTD和DMAP溶于无水DMSO中；然后在搅拌下加入CPT-SS-COOH和DCC，混合物在20-30℃避光环境下搅拌12-36h，过滤反应混合物，滤液放置入透析袋中，先后用DMSO及蒸馏水充分透析，透析结束后，将透析袋中的反应物转移到冰箱冷冻，再冷冻干燥后即得CPT-SS-Dex-PTD。
在一些实施例中，Dex-PTD的制备过程中，葡聚糖Dex和匹多莫德PTD加入的摩尔比为1:2～1:1，优选为1:1.33。
在一些实施例中，CPT-SS-COOH的制备过程中，喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸加入的摩尔比为0.5～1.5，优选为1。
在一些实施例中，CPT-SS-Dex-PTD的制备过程中，Dex-PTD和CPT-SS-COOH加入的摩尔比为1:2～1:1，优选为1:1.33。
另一方面，本发明提供一种共递送聚合物前药胶束，由所述的CPT-SS-Dex-PTD溶于DMSO后，转入透析袋中，蒸馏水透析，自组装形成共递送聚合物前药胶束。
在一些实施例中，共递送聚合物前药胶束的粒径范围为100-300nm，电位为-12mV±4mV。可适用于静脉注射给药。
本发明还提供所述的共递送聚合物前药、所述的共递送聚合物前药胶束在制备抗肿瘤药物中的用途，特别是针对乳腺癌、肺癌和肝癌等肿瘤疾病。
本递药***由聚合物前药载体葡聚糖Dex、化疗药物喜树碱CPT和免疫药物匹多莫德PTD，聚合物前药载体葡聚糖Dex通过酯键连接匹多莫德PTD和喜树碱CPT；可实现将化疗药物和免疫药物递送到肿瘤组织，并在肿瘤环境的响应下释放CPT，抑制拓扑异构酶I，促进凋亡，释放的PTD激发NK细胞及巨噬细胞，达到化药-免疫协同作用效果，共同杀灭肿瘤细胞。本发明通过体内外活性评价，证明了该***优于同时递送各单一组分，能够显著提高其抗癌活性，具有明确的协同治疗效果。
有益效果：本发明以葡聚糖为载体制备成聚合物前药CPT-SS-Dex-PTD，由于葡聚糖具有良好的生物相容性，以及纳米胶束的EPR效应，大大降低了CPT对正常组织的毒性，减少了CPT的毒副作用，使得药物在肿瘤部位聚集更多及具有长循环(Dex)功能。胶束中含有酸碱敏感的酯键和还原响应性的二硫键，可实现酸性条件下断裂、GSH条件下断裂等肿瘤微环境响应性，促进药物在肿瘤微环境和肿瘤细胞内释放。
共载化疗药物与免疫药物的共递送聚合物前药胶束，由于本身粒径范围为100-300nm，可适用于静脉注射给药。
采用葡聚糖连接化疗药物和免疫药物，载体生物相容性良好，可降解，安全无毒。
Zeta电位负电性使得纳米胶束在血液循环过程中，降低纳米胶束被网状内皮***识别和清除的可能。纳米胶束通过EPR效应进入肿瘤微环境后，在肿瘤微环境酸性刺激相应下释放PTD，在肿瘤细胞内高浓度GSH响应下释放CPT，两种药物协同作用于肿瘤细胞，抑杀肿瘤细胞，在肿瘤治疗效果上有较大提高。
附图说明
图1是本发明按照实施例2制备的CPT-SS-Dex-PTD前药的表征：(A)CPT-SS-Dex-PTD的核磁氢谱图，(B)CPT-SS-Dex-PTD的红外光谱图。
图2是本发明按照实施例4制备的CPT-SS-Dex-PTD聚合物胶束的(A)透射电镜图(B)粒径图和(C)Zeta电位图、(D)CPT载药量和PTD载药量等。
图3是本发明按照实施例5制备的CPT-SS-Dex-PTD聚合物胶束溶血实验考察结果分析图。
图4是本发明按照实施例6制备的CPT-SS-Dex-PTD聚合物胶束中CPT和PTD在不同环境刺激下的释放图。(A)CPT-SS-Dex-PTD聚合物胶束在pH7.4、pH6.5、pH7.4+GSH、pH6.5+GSH条件下，胶束中CPT的释放考察。(B)CPT-SS-Dex-PTD聚合物胶束在pH7.4、pH6.5条件下，胶束中PTD的释放考察。
图5是本发明按照实施例7的胶束体外药代动力学研究结果。
图6是本发明按照实施例8的胶束对4T1细胞的抑制结果。
图7是本发明按照实施例9的胶束对荷瘤小鼠的抗肿瘤考察结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有陈述，否则所有表达量、百分数或比例的数字及本说明书和所附权利要求书中所用的其它数值被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。此外，本文公开的所有范围都包括端点在内且可独立组合。
在一些实施例中，CPT-SS-Dex-PTD的合成路线包括：
其中，m、n为正整数，葡聚糖Dex的分子量为40000Da。
实施例1
CPT-SS-Dex-PTD前药的合成方案具体如下：
将葡聚糖(Dex，M＝40000Da)和匹多莫德(PTD)以反应基团摩尔比1:1.33投料，溶解于无水DMSO中，在搅拌下加入二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，之后加入微量三乙胺，混合物在室温避光环境下搅拌24h，过滤反应混合物以除去白色固体(二环己基脲，DUC)，滤液转入分子量截留值3500Da的透析袋中，分别用100％、75％、50％、25％DMSO及蒸馏水充分透析，透析结束后，将透析袋中的反应物放入冰箱冷冻，然后冷冻干燥后即得产物(Dex-PTD)，为白色粉末状固体，室温密闭保存备用。
将喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸以摩尔比1:1投料，溶解于无水DMF中，依次加入1二甲氨基吡啶(DMAP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，在室温避光环境下搅拌12h，向反应液中加入适量冰水停止反应，静置过夜，过滤，水洗多次，将滤饼晾干，再用硅胶柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝50:1、二氯甲烷:甲醇＝20:1)洗脱，即得浅黄色喜树碱-20-O-(3,3'-二硫代二丙酰)单酯(CPT-SS-COOH)。
将Dex-PTD和CPT-SS-COOH以反应基团摩尔比1:1.33投料，溶解于无水DMSO中，在搅拌下加入二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，混合物在室温避光环境下搅拌反应24h，过滤反应混合物以除去副产物(二环己基脲，DUC)，滤液转入分子量截留值3500Da的透析袋中，分别用100％、75％、50％、25％DMSO及蒸馏水充分透析，透析结束后，将透析袋中的反应物放入冰箱冷冻，然后冷冻干燥，冻干品即为产物共递送聚合物前药CPT-SS-Dex-PTD。为浅红色粉末状固体，密闭保存备用。
实施例2
CPT-SS-Dex-PTD聚合物的结构鉴定。
CPT-SS-Dex-PTD聚合物通过核磁共振氢谱和红外光谱来鉴定结构。图1(A)，氢谱结果显示：CPT-SS-Dex-PTD的氢谱谱图上，化学位移8.69ppm为CPT上B环上的氢的的特征峰，化学位移7.83ppm是PTD上酰胺上的氢的的特征峰，化学位移2.18-2.21ppm是PTD酰胺杂环上碳原子上氢的特征峰，化学位移4.5-5.0ppm是Dex上羟基氢的特征峰，化学位移2.49ppm、2.83ppm是连接二硫键两个碳原子上的氢的特征峰，上述特征峰均有显示，说明聚合物CPT-SS-Dex-PTD的合成成功。
图1(B)，红外光谱结果显示：CPT-SS-Dex-PTD在1740cm-1有C＝O伸缩振动峰，说明有酯键的形成。
实施例3
CPT-SS-Dex-PTD自组装纳米共递送***的制备。
制备方案具体如下：取适量CPT-SS-Dex-PTD，用少量DMSO溶解，转入透析袋(MW＝1000Da)中，用蒸馏水透析12h(每4h换一次蒸馏水)，即可自组装形成胶束。
实施例4
自组装胶束纳米粒的表征
图2(A)，复合物的形貌通过透射电镜观察。用蒸馏水稀释一定浓度使CPT-SS-Dex-PTD胶束均匀分散，静置20min，取适量滴在铜网支持膜上，使其自然晾干，采用透射电镜观察其外观形貌。
图2(B、C)，用激光纳米粒度仪测定喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-SS-Dex-PTD)胶束的粒径大小和Zeta电位。取适量喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-SS-Dex-PTD)胶束，用蒸馏水稀释一定浓度后，测定其粒径及zeta电位。粒径约180nm，Zeta电势约-12mV。
图2(D)CPT载药量的测定：精密称取CPT 5mg，DMSO定容于50ml容量瓶中，然后用DMSO稀释得4、8、12、16、20μg/ml浓度的喜树碱标准品溶液。通过紫外分光光度计进行吸光度的测定，以吸光度均值(A)为纵坐标，以喜树碱浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，并得到线性回归方程。精密称取喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-SS-Dex-PTD)5mg，DMSO定容于50ml容量瓶中，得浓度为100μg/ml的喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-SS-Dex-PTD)溶液。取适量通过紫外分光光度计测定其吸光度值，根据上述线性回归方程，计算喜树碱的载药量。结果显示CPT-SS-Dex-PTD胶束中CPT含量为11.43％。
PTD载药量的测定：采用HPLC对匹多莫德载药量进行测定，HPLC分析匹多莫德色谱条件：SunniestC18(5μm，4.6mm×250mm)，柱温30℃，流动相为甲醇-0.01mol/L NaH2PO4水溶液(10:90)，流速为1ml/min，检测波长为210nm，进样量为20μl。精密称取匹多莫德5mg，蒸馏水定容于50ml容量瓶中，然后用蒸馏水稀释得4、8、12、16、20μg/ml浓度的匹多莫德标准品溶液。通过HPLC进行测定，以峰面积均值(A)为纵坐标，以匹多莫德浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，并得到线性回归方程。精密取喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-Dex-PTD)胶束定量3份，分别放置于透析袋中(MW＝1000Da)，透析外液pH＝5.0的磷酸盐缓冲溶液，在气浴恒温振荡器中充分晃动，使胶束内PTD从Dex主链上完全裂解下来，取透析外液适量，按照上述色谱条件进行分析，测其峰面积；根据上述线性回归方程，计算匹多莫德的载药量。结果显示CPT-SS-Dex-PTD胶束中PTD含量为2.21％。
实施例5
溶血实验考察
采集小鼠的新鲜血液置于离心管中，加入等体积的生理盐水稀释后离心(4℃，1000r/min，10min)，收集沉淀得到红细胞。用生理盐水轻轻冲洗红细胞三次后离心(4℃，1000r/min，10min)，去除上清液，将沉淀用生理盐水稀释至浓度为2％(v/v)，即得到2％红细胞悬浮液。在离心管中分别加入2％红细胞悬浮液1ml，分别加入3ml浓度为50、100、200、300、400μg/ml的喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-Dex-PTD)胶束，阴性对照组加入3ml生理盐水，阳性对照组加入3ml蒸馏水。将上述实验组和对照组分别置于37℃恒温孵育4h后离心(4℃，3000r/min，10min)，拍照记录实验现象，用紫外分光光度计测定实验组和对照组离心后上清液570nm的吸光度值。溶血率按照下面公式计算：
溶血实验结果显示，胶束具有良好的生物相容性，不会引起溶血现象。
实施例6
药物释放考察
取12份相同浓度的喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-SS-Dex-PTD)胶束溶液各5ml，置于透析袋中(MW＝3500Da)，分别放置于盛有95ml的pH7.4的PBS、pH6.5的PBS、pH7.4的PBS+10mmol/l GSH、pH6.5的PBS+10mmol/l GSH的锥形瓶中，置于气浴恒温振荡器中震荡(100r/min，37℃)，分别于3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、72h取出3ml，再补充同温度同体积的新鲜透析液3ml。将取出的3ml透析液通过紫外分光光度计测定在367nm波长下的吸光度值，根据线性回归方程计算浓度C，计算喜树碱的累积释放度。CPT释放结果显示，CPT-SS-Dex-PTD胶束中CPT的释放具有GSH刺激响应性。
取6份相同浓度的喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-Dex-PTD)胶束溶液各5ml，置于透析袋中(MW＝3500Da)，分别放置于盛有95ml的pH7.4的PBS、pH6.5的PBS的锥形瓶中，放置于气浴恒温振荡器中震荡(100r/min，37℃)，分别于15min、30min、45min、60min、120min、240min、360min、480min、600min、720min、1440min取出1ml，再补充同温度同体积的新鲜透析液1ml。将取出的1ml透析液过滤后按照上述HPLC色谱方法进行测定，根据线性回归方程计算匹多莫德的累计释放度。PTD释放结果显示，CPT-SS-Dex-PTD胶束中PTD的释放具有pH酸性刺激响应性。
实施例7
药代动力学考察
取SD大鼠8只，适应性饲养1周后，禁食不禁水12h，随机分为两组，实验组和对照组，实验组尾静脉给予喜树碱-葡聚糖-匹多莫德(CPT-SS-Dex-PTD)胶束溶液(CPT当量5mg/kg、PTD当量1mg/kg)，对照组尾静脉给予游离(CPT+PTD)药物混合溶液(CPT 5mg/kg、PTD1mg/kg)，用1ml注射器尾静脉给药，给药结束后，分别在0h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h时间点从大鼠眼底静脉丛取血500μl，置于肝素化离心管中，肝素化血样在4℃、9000r/min离心机中离心10min，分离得到血浆，置于-80℃冰箱保存，待用。以CPT/PTD峰面积/内标峰面积(Y)为纵坐标，以CPT/PTD浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，并得相应线性回归方程。取血浆样品100μl，置于2ml离心管中，加入400μl无水乙腈，加入相应内标溶液100μg/ml 10μl，置于涡旋仪上涡旋2min，然后置于离心机中离心(4℃，5000r/min，10min)。取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，按照相应色谱条件进液相测定，以药物浓度(C)为纵坐标，以时间(T)为横坐标绘制药物浓度随时间变化曲线。药代动力学考察结果显示，胶束能够增加CPT和PTD的生物利用度。
实施例8
细胞毒性
采用MTT法分析CPT-SS-Dex-PTD纳米胶束对4T1细胞增殖抑制的影响。生长状态良好的4T1细胞以1×104细胞/孔加入96孔板中，过夜培养后，弃去培养基，分别加入不同浓度的含游离CPT、游离PTD、游离CPT+游离PTD、CPT-SS-Dex-PTD纳米胶束的培养基，每个样品至少3复孔，以正常细胞作为对照组，只加培养基的为空白组，继续培养48h。之后弃去孔中培养基，每孔加入100μl MTT溶液，并在培养箱中培养4h。随后小心移除孔中介质，并加入100μl DMSO以溶解产生的蓝紫色晶体(甲臜)，将该板轻轻摇晃10min，直至所有晶体溶解。由酶标仪记录波长为570nm下的光密度(OD)值。通过比较被处理细胞相对于未被处理细胞的吸光率来计算细胞的存活率。图6，细胞毒性结果显示，CPT-SS-Dex-PTD纳米胶束中CPT和PTD联用可协同抑制4T1细胞的增殖。
实施例9
体内抗肿瘤药效
4T1接种于Babl/c雌性小鼠右前肢腋下，待肿瘤长至100mm3时，随机分成5组，每组6只。实验分组分别为：对照组(生理盐水组)、游离CPT组、游离PTD组、游离CPT+游离PTD组、CPT-SS-Dex-PTD纳米胶束组。给药方案：荷瘤小鼠腋下瘤长至100mm3时开始尾静脉给药，以第一次给药计为第0天，分别于0、2、4、6、8、10、12天给药，给药剂量：CPT 5mg/kg，PTD 1mg/kg。隔天记录各组小鼠体重和肿瘤体积大小，治疗结束后，解剖取出肿瘤组织，按照每组排列好，拍照并称重。图7，通过A(肿瘤体积)、B(小鼠体重)、C(肿瘤重量)、D(肿瘤直观图)可以看出，体内抑瘤结果显示CPT-SS-Dex-PTD纳米胶束可明显抑制肿瘤的生长，并且大大减少了化疗药物的毒副作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种共递送聚合物前药，其特征在于，为共递送聚合物前药CPT-SS-Dex-PTD，CPT-SS-Dex-PTD的化学结构式如下：
其中，m、n为正整数。
2.根据权利要求1所述的共递送聚合物前药，其特征在于，共递送聚合物前药CPT-SS-Dex-PTD的制备方法包括：
葡聚糖Dex和匹多莫德PTD反应生成Dex-PTD，其中葡聚糖Dex、匹多莫德PTD、Dex-PTD的结构式分别为：
喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸反应生成CPT-SS-COOH，其中喜树碱CPT、CPT-SS-COOH的结构式分别为：
Dex-PTD和CPT-SS-COOH反应生成CPT-SS-Dex-PTD。
3.根据权利要求2所述的共递送聚合物前药，其特征在于，
所述葡聚糖Dex和匹多莫德PTD反应生成Dex-PTD，包括：采用DCC和DMAP活化PTD的羧基，在有机溶剂中与葡聚糖Dex反应生成Dex-PTD；
和/或，所述喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸反应生成CPT-SS-COOH，包括：采用EDC和DMAP活化3,3'-二巯基二丙酸的羧基，在有机溶剂中与喜树碱CPT反应生成CPT-SS-COOH；
和/或，所述Dex-PTD和CPT-SS-COOH反应生成CPT-SS-Dex-PTD，包括：采用DCC和DMAP活化CPT-SS-COOH的羧基，在有机溶剂中与Dex-PTD反应生成CPT-SS-Dex-PTD，过滤，透析，冷冻干燥即得。
4.根据权利要求3所述的共递送聚合物前药，其特征在于，
所述有机溶剂选自无水DMSO、无水DMF、无水THF中的一种或几种混合。
5.根据权利要求2所述的共递送聚合物前药，其特征在于，CPT-SS-Dex-PTD的制备方法包括：
所述葡聚糖Dex和匹多莫德PTD反应生成Dex-PTD，包括：将聚合物前药载体Dex和4-二甲氨基吡啶DMAP溶于无水二甲基亚砜DMSO中，在搅拌下加入匹多莫德PTD和二环己基碳二亚胺DCC，之后加入三乙胺，混合物在20-30℃避光环境下搅拌12-36h，过滤，滤液经透析、冷冻干燥后即得Dex-PTD；
和/或，所述喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸反应生成CPT-SS-COOH，包括：将3,3'-二巯基二丙酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入4-二甲氨基吡啶DMAP、喜树碱CPT、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC，在室温下避光环境下搅拌6-20h，向反应液中加入冰水，静置过夜，过滤，水洗多次，将滤饼晾干，用硅胶柱层析法洗脱，即得CPT-SS-COOH；
和/或，所述Dex-PTD和CPT-SS-COOH反应生成CPT-SS-Dex-PTD，包括：将Dex-PTD和DMAP溶于无水DMSO中；然后在搅拌下加入CPT-SS-COOH和DCC，混合物在20-30℃避光环境下搅拌12-36h，过滤反应混合物，滤液放置入透析袋中，先后用DMSO及蒸馏水充分透析，透析结束后，将透析袋中的反应物转移到冰箱冷冻，再冷冻干燥后即得CPT-SS-Dex-PTD。
6.根据权利要求1-5任一项所述的共递送聚合物前药，其特征在于，聚合物前药载体葡聚糖Dex的分子量为4000-80000Da，优选为40000Da。
7.根据权利要求2或3所述的共递送聚合物前药，其特征在于，Dex-PTD的制备过程中，葡聚糖Dex和匹多莫德PTD加入的摩尔比为1:2～1:1，优选为1:1.33；
和/或，CPT-SS-COOH的制备过程中，喜树碱CPT和3,3'-二巯基二丙酸加入的摩尔比为0.5～1.5，优选为1；
和/或，CPT-SS-Dex-PTD的制备过程中，Dex-PTD和CPT-SS-COOH加入的摩尔比为1:2～1:1，优选为1:1.33。
8.一种共递送聚合物前药胶束，其特征在于，由权利要求1所述的CPT-SS-Dex-PTD溶于DMSO后，转入透析袋中，外液用蒸馏水透析，自组装形成共递送聚合物前药胶束。
9.根据权利要求8所述的共递送聚合物前药胶束，其特征在于，共递送聚合物前药胶束的粒径范围为100-300nm。
10.根据权利要求1-7任一项所述的共递送聚合物前药、权利要求8-9任一项所述的共递送聚合物前药胶束在制备抗肿瘤药物中的用途。
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