CN114514327A - 使用同步标志物检测评估弥漫性神经胶质瘤和对治疗的应答性 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种用于同时检测受试者的生物样品中的突变和甲基化水平的方法。具体地，本公开涉及一种用于诊断受试者的中枢神经***肿瘤，如弥漫性神经胶质瘤的方法，并且包括以下步骤：同时确定一个或多个所关注区域中的突变的存在或不存在以及甲基化水平。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月11日提交的美国临时申请序列第62/914,141号的优先权，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于检测受试者的生物样品的弥漫性神经胶质瘤以及评估对治疗的应答性的方法。
序列表的引用
本申请含有已经以ASCII格式通过EFS-Web递交的序列表并且所述序列表特此通过引用整体并入本文。创建于2020年10月12日的所述ASCII副本命名为663400_SequnceListing_ST25并且大小为1,411字节。
背景技术
弥漫性神经胶质瘤(DG)占成人原发性恶性中枢神经***肿瘤的80％，并且传统上是根据病理标准进行诊断的，以确定组织学类型(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤或少突星形细胞瘤)和恶性等级(如，I-IV级)。在2016年，世界卫生组织(WHO)诊断指南将分子标志物并入到DG的分类中。这些诊断生物标志物中的许多诊断生物标志物还用作预后指标，并且神经肿瘤学界已经支持将分子标志物整合到临床实践中。然而，迄今为止，生物标志物评估中存在广泛的可变性，因为分子技术和测试有效性在全世界甚至在地理区域内都是不一致的。因此，使用可以同时评估多种生物标志物的新型测序技术是克服当前临床实践限制的有吸引力的选择。
因此，本领域需要可以同时评估多种生物标志物的测序技术，以在中枢神经***肿瘤的治疗和护理期间在决策过程中指导医师和患者。
发明内容
在本公开的各个方面中，提供了用于通过获得受试者的生物样品来检测所述受试者的弥漫性神经胶质瘤的方法；从所述样品中分离基因组DNA；同时检测所述基因组DNA的一个或多个所关注区域中的突变的存在或不存在以及甲基化水平；将所述一个或多个所关注区域的所述突变的存在或不存在以及所述甲基化水平与参考值进行比较；当测得的突变的存在或不存在以及所述甲基化水平偏离所述参考值时，将所述受试者分类为患有弥漫性神经胶质瘤。
在一些实施例中，所述方法包含在分离之后对魔力DNA进行处理以使游离DNA末端去磷酸化。在一些实施例中，所述DNA是用磷酸酶进行处理的。
在另一方面，所述方法包括使所述DNA与核酸酶接触以产生靶向双链断裂，由此产生一个或多个所关注区域。在示例性实施例中，一个或多个所关注区域包含IDH1、IDH2和MGMT基因，包含所述基因的5'和3'侧接区域。在一些实施例中，所述靶向双链断裂是通过CRISPR产生的。在示例性实施例中，用于MGMT的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:1-2，用于IDH1的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:3-4，并且用于IDH2的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:5-6。
在一些实施例中，所述方法包含在用核酸酶切割之后修饰所述所关注区域的游离末端以辅助测序衔接子的连接。因此，在一些实施例中，所述方法包含将一个或多个测序衔接子分子连接到所述一个或多个所关注区域；以及对所述所关注区域进行测序。在特定方面，使用纳米孔测序。
本公开还提供了用于通过获得患有或疑似患有弥漫性神经胶质瘤的受试者的生物样品来评估所述受试者对治疗剂的应答性的方法；从所述样品中分离基因组DNA；同时检测所述基因组DNA的一个或多个所关注区域中的突变的存在或不存在以及甲基化水平；将所述一个或多个所关注区域的所述突变的存在或不存在以及所述甲基化水平与参考值进行比较；基于所述突变的存在或者不存在以及所述甲基化水平来评估疗法应答性。
在一些实施例中，所述方法包含在分离之后对魔力DNA进行处理以使游离DNA末端去磷酸化。在一些实施例中，所述DNA是用磷酸酶进行处理的。
在另一方面，所述方法包括使所述DNA与核酸酶接触以产生靶向双链断裂，由此产生一个或多个所关注区域。在示例性实施例中，一个或多个所关注区域包含IDH1、IDH2和MGMT基因，包含所述基因的5'和3'侧接区域。在一些实施例中，所述靶向双链断裂是通过CRISPR产生的。在示例性实施例中，用于MGMT的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:1-2，用于IDH1的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:3-4，并且用于IDH2的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:5-6。
在一些实施例中，所述方法包含在用核酸酶切割之后修饰所述所关注区域的游离末端以辅助测序衔接子的连接。因此，在一些实施例中，所述方法包含将一个或多个测序衔接子分子连接到所述一个或多个所关注区域；以及对所述所关注区域进行测序。在特定方面，使用纳米孔测序。
在一些实施例中，所述方法包含评估对TMZ的应答性。
其它目的和特征将在下文中部分地显而易见并且部分地指出。
附图说明
申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供具有彩色附图的本专利申请公开的副本。
图1A-1D示出了使用充分表征的样品进行的突变和甲基化评估来开发nCATS工作流程。图1A示出了IDH1野生型、IDH2野生型、IDH2 R172K突变和IDH1 R132G突变的基因分型。用纳米孔技术对IDH1和IDH2的外显子4进行PCR扩增和测序。纳米抛光正确地对所有样品进行基因分型。图1B示出了在甲基化和未甲基化DNA标准品上检测到的观察和预期的CpG甲基化百分比。对CpG上100％甲基化或0％甲基化的标准品进行测序，并且用纳米抛光进行甲基化调用。通过从每种标准品随机采样读数，产生10％、25％、50％或75％甲基化CpG的数据；在≥20深度覆盖率(20X)下，可以区分0％、25％、50％、75％和100％的甲基化水平。数据表示第25百分位和第75百分位的中值。使用邦费罗尼校正(Bonferroni correction)的成对t测试，****P<0.0001。因此，在本研究中使用20X作为检测的理论极限。图1C示出了用MinION装置设计3个靶基因座(MGMT(SEQ ID NO:1-2)、IDH1(SEQ ID NO:3-4)和IDH2(SEQID NO:5-6))的指导RNA(crRNA)，并且用于纳米孔Cas9靶向测序(nCATS)。使用各种类型的样品来测试nCATS分析甲基化和突变的可行性。GBM，胶质母细胞瘤；TMZ，替莫唑胺。图1D示出了10个样品的每个基因座的中值覆盖率。
图2A-2D示出了对4个IDH突变体临床样品中的MGMT和IDH状态的同时评估。图2A示出了通过焦磷酸测序和nCATS在2个DNA标准品中测定甲基化：CpG甲基化(MetCtrl)和未甲基化(UnMetCtrl)。图2B示出了在从以下4个胶质母细胞瘤细胞系提取的DNA中测定甲基化：U87、U251、T98G和LN18。用P值计算nCATS与焦磷酸测序之间的甲基化水平的相关性(r)。每个黄色点是单独的CpG。图2C示出了在4个IDH突变体临床样品中通过焦磷酸测序、MassARRAY和nCATS测定甲基化模式。用P值计算nCATS与焦磷酸测序之间的甲基化水平的相关性(r)。每个黄色点是单独的CpG。图2D示出了用nCATS、Illumina和Sanger测序平台检测到IDH突变。在3名患者(蓝色行)中准确地检测到IDH1突变，并且在1名患者(橙色行)中检测到IDH2突变。饼图和百分比表示通过每种方法检测到的等位基因频率。
图3A-3E示出了不同基因座处的MGMT基因表达与CpG甲基化之间的相关性。图3A示出了在4个细胞系和4个IDH突变体肿瘤样品中用qRT-PCR测量MGMT基因表达。数据是平均值±SD(3次技术重复)。图3B示出了MGMT外显子1内的12个临床相关CpG位点的甲基化百分比。图3C示出了MGMT表达与通过焦磷酸测序相对于nCATS检测的甲基化之间的相关性。每个黄色点是单独的样品。图3D示出了外显子1CpG和内含子1CpG的一部分的甲基化百分比的热图和层次聚类。所选择的CpG(r>0.7或r<-0.7)用于聚类。图3E示出了MGMT表达与外显子1甲基化之间以及MGMT表达与内含子1甲基化之间的相关性。
图4A-4D示出了nCATS可以同时定量MGMT CpG甲基化并检测神经胶质瘤临床样品中的单核苷酸变体(SNV)。图4A示出了通过qRT-PCR在4个IDH野生型样品中的MGMT基因表达。数据是平均值±SD(3次技术重复)。图4B示出了nCATS和MassARRAY的甲基化模式。图4C示出了MGMT表达与外显子1甲基化之间以及MGMT表达与内含子1甲基化之间的相关性。图4D示出了在来自6名患者的肿瘤和唾液样品中用nCATS和Illumina测序测定MGMT和IDH1/2中的SNV。用trackViewer绘制数据。P785和P816的数据不可用。
具体实施方式
本公开至少部分地基于以下发现：基于长读纳米孔的测序技术能够同时检测从受试者获得的生物样品中的IDH突变状态和MGMT甲基化水平。当前，这些生物标志物是分开测定的，并且结果可能需要数天到数周。如本文所示，使用纳米孔Cas9靶向测序(nCATS)来鉴定36小时内的IDH1和IDH2突变，因此当前公开的方法表示对当前使用的临床方法的改进。也显示了nCATS不仅在启动子区域，如当前使用的方法，而且在跨近端启动子区域、整个外显子1和内含子1的一部分的CpG，同时用于提供MGMT甲基化水平的高分辨率评估。有趣的是，当将所有CpG的甲基化水平与MGMT表达进行比较时，观察到内含子1甲基化与MGMT表达之间的正相关。最后，鉴定了3个靶基因座中的单核苷酸变体。本公开证明了使用nCATS作为用于癌症精密医物的临床工具的可行性。
总而言之，本公开提供了多条证据，这些证据显示当前公开的方法在中枢神经***肿瘤的检测和预后中是有用的。因此，本公开涵盖了用于同时检测生物样品中的IDH突变状态和MGMT甲基化水平，以诊断如弥漫性神经胶质瘤等中枢神经***肿瘤、指导治疗决策、监测疾病进展并评估某些治疗干预的临床功效的方法的用途。下文更彻底地描述了本发明的其它方面和迭代。
I.方法
本公开的一个方面涵盖一种用于诊断受试者的中枢神经***肿瘤的方法，所述方法包括以下步骤：同时确定所述受试者的生物样品(例如，活检)中的一个或多个所关注区域的突变和甲基化水平；其中所述一个或多个所关注区域的突变和/或甲基化水平的存在指示疾病。在一些实施例中，中枢神经***肿瘤是弥漫性神经胶质瘤。根据本公开的弥漫性神经胶质瘤是用于涵盖各种中枢神经***肿瘤的术语，其在组织学上看起来类似于神经胶质细胞，如星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和少突星形细胞瘤，范围从WHO II级到IV级肿瘤。
与来自健康受试者的样品相比或相对于参考值，患病受试者的样品中可能存在某些突变和/或甲基化水平。因此，本公开涵盖确定所关注区域的一个或多个基因组突变的“存在”或“不存在”和/或确定所关注区域的基因组甲基化水平；以及将所确定的水平与参考水平进行比较。因此，本公开提供了以下步骤：确定一个或多个所关注区域的基因组突变的存在或不存在以及确定一个或多个所关注区域的基因组甲基化水平；其中在所确定的甲基化水平与所述参考甲基化水平之间存在一个或多个突变和/或不同的水平指示疾病。因此，本发明还涉及一种用于诊断中枢神经***肿瘤、确定对治疗剂的应答性和监测中枢神经***肿瘤进展的方法，所述方法包括以下步骤：确实一个或多个所关注区域中的一个或多个基因组突变的存在或不存在；以及确定一个或多个所关注区域中的基因组甲基化水平；其中在所确定的甲基化水平与所述参考甲基化水平之间存在一个或多个突变和/或不同的水平指示疾病、对治疗剂的应答性或疾病进展。
如本文所公开的方法通常包括提供或已经提供生物样品。如本文所使用的，术语“生物样品”意指从受试者分离的生物材料。含有适合于检测一个或多个所关注区域中的一个或多个基因组突变和/或甲基化水平的任何遗传物质并且可以包括从受试者获得的细胞和/或非细胞物质的任何生物样品都是合适的。非限制性实例包含血液、血浆、血清、尿液和组织。通常，样品是“临床样品”，其是源自患者的样品。典型的临床样品包含但不限于：体液样品，如滑液、痰液、血液、尿液、血浆、血清、汗液、粘液、唾液、淋巴液、支气管抽吸物、腹膜液、脑脊液和胸膜液；以及组织样品、组织或细针活检样品以及来自其中的脓肿或细胞。生物样品还可以包含组织切片，如冷冻切片或***固定切片，这些切片是出于组织学目的而截取的。在一些实施例中，生物样品选自唾液或脑组织。
“样品”也可以是起源于生物化学或化学反应的样品，如扩增反应的产物。液体样品可以在用于本公开之前经受一种或多种预处理。此类预处理包含但不限于稀释、过滤、离心、浓缩、沉降、沉淀或透析。预处理也可以包含向溶液中添加化学或生物化学物质，例如以便稳定样品和所含有的核酸，具体地基因组DNA。化学或生物化学物质的这种添加包含酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、活性染料、去污剂、乳化剂或螯合剂，如EDTA。例如，可以取出样品并且将其与此类物质直接混合。在一个实施例中，向样品中添加物质以稳定样品直到开始分析。在此上下文中，“稳定”意指防止待确定的所关注基因组区域的降解。在此上下文中，优选的稳定剂是EDTA，例如K2EDTA、DNase抑制剂、醇类，例如乙醇和异丙醇，用于盐析蛋白质(如RNAlater)的药剂。在一些实施例中，所述方法不包含硫酸氢盐修饰。在优选的实施例中，从生物样品提取基因组DNA，并且对包括经提取的基因组DNA的样品进行处理以使所有游离DNA末端去磷酸化。例如，将gDNA用如小牛肠磷酸酶(NEB)等磷酸酶进行处理，以减少所有游离DNA末端的去磷酸化。
如本领域技术人员将理解的，收集生物样品的方法可以并且将根据生物样品的性质和待进行的分析的类型而变化。可以利用本领域通常已知的多种方法中的任一种来收集生物样品。一般而言，所述方法优选地维持样品的完整性，使得可以根据本公开内容准确地检测到所关注基因组区域。
在一些实施例中，从受试者获得单个样品，以检测样品中的一个或多个所关注基因组区域。可替代地，可以在随着时间推移从受试者获得的样品中检测一个或多个所关注基因组区域。如此，可以随着时间推移从受试者收集多于一个样品。例如，可以随着时间推移从受试者收集2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或更多个样品。在一些实施例中，随时间推移从受试者收集2个、3个、4个、5个或6个样品。在其它实施例中，随时间推移从受试者收集6个、7个、8个、9个或10个样品。在又其它实施例中，随着时间推移从受试者收集10个、11个、12个、13个或14个样品。在其它实施例中，随着时间推移从受试者收集14个、15个、16个或更多个样品。
当随时间推移从受试者收集多于一个样品时，可以每0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或更多小时收集一次样品。在一些实施例中，每0.5小时、1小时、2小时、3小时或4小时收集一次样品。在其它实施例中，每4小时、5小时、6小时或7小时收集一次样品。在又其它实施例中，每7小时、8小时、9小时或10小时收集一次样品。在其它实施例中，每10小时、11小时、12小时或更多小时收集一次样品。另外，可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或更长时间收集一次样品。在一些实施例中，约每6天收集一次样品。在一些实施例中，每1天、2天、3天、4天或5天收集一次样品。在其它实施例中，每5天、6天、7天、8天或9天收集一次样品。在又其它实施例中，每9天、10天、11天、12天或更多天收集一次样品。
在一些实施例中，样品包括一种或多种核酸。术语“核酸”在此以其最广义使用，并且包括来自所有可能来源、处于所有长度和构型，如双链、单链、环状、线性或支化的核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。还包括所有亚单位和亚型，如单体核苷酸、寡聚体、质粒、病毒和细菌核酸，以及来自受试者的基因组和非基因组DNA和RNA、处于加工和未加工形式的环状RNA(circRNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、异源核RNA(hn-RNA)、核糖体RNA(rRNA)、互补DNA(cDNA)以及所有其它可能的核酸。然而，在最优选的实施例中，样品包括基因组DNA。
一般而言，如本文所公开的方法包含在检测步骤内，在基因组DNA中产生靶向双链断裂，以便从剩余的基因组DNA中分离所关注基因组区域。靶向双链断裂位于所关注基因组区域的上游和下游。因此，本文所提供的方法可用于探询连续基因组区域，即5'与3'靶向双链断裂之间的连续长度的DNA。这种连续基因组区域可以包括小部分，即约50kb的基因组序列，直到整个染色体或整个基因组。在一个实施例中，组合物和方法可用于探询基因组的功能元件。功能元件通常涵盖基因组的有限区域，如50、60、70、80、90到100kb的基因组DNA的区域。在一个实施例中，本文所述的方法包括除了所关注基因的编码区域之外，还探询非编码基因组区域，如所关注基因的编码区域的5'和3'区域。所述方法允许鉴定基因的5'和3'区域和编码区域中的靶标，所述靶标可以仅在特定情况下或仅针对生物体中的特定细胞或组织影响表型变化。
在某些实施例中，所关注基因组区域包括转录因子结合位点、DNase I超敏性区域、转录增强子或阻遏子元件、染色体或含有具有生物化学活性的序列的其它基因间区域。在其它实施例中，所关注基因组区域包括特定疾病或病症的表观遗传特征。另外或可替代地，所关注基因组区域可以包括表观遗传绝缘体。在其它实施例中，所关注基因组区域包括物理上相互作用的两个或更多个连续基因组区域。在仍其它实施例中，所关注基因组区域包括一个或多个易受组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、DNA甲基化或其缺乏中的一个或多个影响的位点。
使用本文所述的方法进行探询的所关注基因组区域的实例包含包括与信号传导生物化学途径相关的基因，例如信号传导生物化学途径相关的基因或多核苷酸或位于其5'或3'的区域。基因组区域的实例包括包含或位于基因编码区域和/或疾病相关基因或多核苷酸的5'和/或3'内的区域。在一个实施例中，位于基因的5'和/或3'的区域是指基因组或染色体的从基因组或染色体的第一核苷酸到基因组或染色体的第二核苷酸的基因组区域。第二核苷酸位于基因组或染色体中的第一核苷酸与基因之间。第一核苷酸距基因约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1kb、约2kb、约3kb、约4kb、约5kb、约6kb、约7kb、约8kb、约9kb、约10kb、约15kb、约20kb、约30kb、约40kb、约50kb、约60kb、约70kb、约80kb、约90kb、约100kb、约150kb、约200kb、约250kb、约300kb、约350kb、约400kb、约450kb、约500kb、约550kb、约600kb、约650kb、约700kb、约750kb、约800kb、约850kb、约900kb、约950kb或约1mb 5'或3'。“疾病相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在源自疾病影响的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。疾病相关基因的另一个实施例是以异常高水平表达的基因；其可以是以异常低水平表达的基因。改变的表达与疾病的发生和/或进展相关。经转录或经翻译的产物可能是已知的或未知的，并且可以以正常或异常的水平表达。可以通过访问公开可获得的数据库来确定所关注基因的DNA超敏性位点、转录因子结合位点和表观遗传标志物。在优选的实施例中，所关注基因组区域包括IDH1基因，包含所述基因5'或3'的碱基。在优选的实施例中，所关注基因组区域包括IDH2基因，包含所述基因5'或3'的碱基。在优选的实施例中，所关注基因组区域包括MGMT基因，包含所述基因5'或3'的碱基。
如CRISPR(特别是使用Cas9和指导RNA)、用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)进行编辑的技术可以用于产生根据本公开的双链断裂。“靶向基因组修饰”(可与“靶向基因组编辑”或“靶向遗传编辑”互换)能够在基因组中的预选位点处实现***、缺失和/或取代。根据本公开，基因组DNA通过从基因组DNA中去除一个或多个所关注区域经历靶向修饰。靶向修饰可以通过核酸酶依赖性方法来实现。因此，靶向修饰可以借助于通过特异性稀有切割核酸内切酶特异性引入双链断裂(DSB)以更高频率来实现。在一些实施例中，靶向核酸酶的非限制性实例包含：天然存在的核酸酶和重组核酸酶；来自包含以下的家族的CRISPR相关核酸酶：cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr；限制性核酸内切酶；大范围核酸酶；归巢核酸内切酶等。在示例性实施例中，CRISPR/Cas9需要两种主要组分：(1)Cas9核酸内切酶；以及(2)crRNA-tracrRNA复合物。当共表达时，这两种组分形成被募集到包括PAM和PAM附近的接种区域的靶DNA序列的复合物。crRNA和tracrRNA可以组合形成嵌合指导RNA(gRNA)以指导Cas9靶向所选择的序列。
除了本文所公开的CRISPR方法之外，本领域已知的另外的基因组修饰方法也可以用于在分离的基因组DNA中引入双链断裂。一些实例包含锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、限制性核酸内切酶、大范围核酸酶、归巢核酸内切酶等。
ZFN是包括与锌指DNA结合结构域(ZFBD)融合的核酸酶的靶向核酸酶，所述ZFBD是通过一个或多个锌指以序列特异性方式与DNA结合的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位而稳定。锌指的实例包含但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。设计的锌指域是一种不存在于自然界中的结构域，其设计/组成主要来源于合理标准，例如应用取代规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见例如美国专利第6,140,081号；第6,453,242号；和第6,534,261号；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。所选择的锌指结构域是一种在自然界中未发现的结构域，其产生主要来源于经验方法，如噬菌体展示、相互作用截留或杂交选择。在美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中更详细地描述了ZFN。ZFN的最公认实例是FokI核酸酶与锌指DNA结合结构域的融合体。
TALEN是包括与TAL效应物DNA结合结构域融合的核酸酶的靶向核酸酶。“转录激活因子样效应物DNA结合结构域”、“TAL效应物DNA结合结构域”或“TALE DNA结合结构域”是负责TAL效应蛋白与DNA结合的TAL效应蛋白的多肽结构域。TAL效应蛋白由黄单胞菌属(Xanthomonas)的植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核，通过其DNA结合结构域与效应子特异性DNA序列结合，并且通过其反式激活结构域在这些序列处激活基因转录。TAL效应物DNA结合结构域特异性取决于不完全的34个氨基酸重复序列的效应子可变数量，其包括所选择的重复位置处的多态性，称为重复可变双残基(RVD)。在美国专利申请第2011/0145940号中更详细地描述了TALEN。TALEN在本领域中的最公认实例是FokI核酸酶与TAL效应物DNA结合结构域的融合多肽。
在发生靶向双链断裂之后，从剩余的基因组DNA中分离一个或多个所关注区域，在切割位点处发生游离5'磷酸位点的富集。因此，可以修饰围绕所关注区域的独特的5'磷酸位点，以允许连接到测序衔接子分子。在非限制性实例中，可以使用DNA聚合酶，如Taq聚合酶和dATP，将腺嘌呤(A)-尾添加到切割的DNA片段的3'末端。A突出端可以与测序衔接子的T突出端配对。衔接子连接的DNA和阻断的DNA两者都可以添加到流动池中进行测序。在测序之前，任选地去除过量的未连接的衔接子。在优选的实施例中，使用纳米孔流动池，如minion或Fongle。纳米孔测序是能够直接、实时分析长DNA或RNA片段的独特的可扩展的技术。纳米孔测序通过监测核酸通过蛋白质纳米孔时电流的变化来起作用。将所得信号解码以提供特定的DNA或RNA序列信息。
结合本公开的一个或多个突变的“存在”或“不存在”或甲基化水平意指如单核苷酸突变等突变或甲基化水平以高于某一阈值或低于某一阈值的水平存在。在阈值为“0”的情况下，这将意味着“存在”是样品中的突变的实际存在，并且“不存”是实际不存在。然而，在本公开的上下文中，“存在”也可以意味着相应的甲基化水平以高于阈值的水平存在，例如在对照中确定的水平，在此上下文中，“不存在”意味着甲基化水平处于或低于某一阈值。
术语“参考水平”涉及所确定的水平与之进行比较以便区分突变的“存在”或“不存在”或甲基化水平的水平。参考水平包含对进行实际诊断或确定治疗剂功效的演绎步骤具有决定性的水平。在优选的实施例中，参考水平涉及健康受试者或健康受试者群体的所关注区域的甲基化水平或突变状态，即未患有待诊断疾病的受试者，例如未患有中枢神经***肿瘤，如弥漫性神经胶质瘤。熟悉本申请公开内容的技术人员能够使用常见的统计方法来确定合适的控制水平。
所关注对照区域的“参考水平”也可以意指甲基化水平或突变状态，其指示疾病状态的不存在或对治疗剂具有应答性。在一些实施例中，当受试者的甲基化水平或突变状态高于参考水平时，这指示疾病状态的存在或对治疗剂具有应答性。在一些实施例中，当受试者的甲基化水平或突变状态高于参考水平时，这指示疾病状态的不存在或对治疗剂无应答性。在一些实施例中，当受试者的甲基化水平或突变状态低于参考水平时，这指示疾病状态的存在或对治疗剂具有应答性。在一些实施例中，当受试者的甲基化水平或突变状态低于参考水平时，这指示疾病状态的缺乏或对治疗剂无应答性。在一些实施例中，当受试者的甲基化水平在参考水平内时，这指示对治疗剂具有应答性或无应答性。
一个或多个所关注区域的突变状态和/或甲基化水平可以用本领域的技术人员熟知的多种方式来分析。例如，可以将所获得的每个测定结果与“正常”或“对照”值或指示特定疾病或治疗结果的值进行比较。特定的诊断/预后可以取决于每个测定结果与这样的值的比较，所述值可以被称为诊断或预后“阈值”。在某些实施例中，用于一种或多种诊断或预后指标的测定仅通过测定中的突变的存在或不存在而与病状或疾病相关。例如，可以设计测定，使得阳性信号仅出现在所关注的特定阈值水平以上，并且在所述水平以下，所述测定不提供高于背景的信号。
本领域技术人员将理解，将诊断或预后指标与未来临床结果的诊断或预后风险相关联是统计分析。例如，低于X的标志物水平可以发信号通知患者比水平高于或等于X的患者更可能遭受不良结果，如通过统计学显著性水平所确定的。对于另一种标志物，高于X的标志物水平可以发信号通知患者比水平低于或等于X的患者更可能遭受不良结果，如通过统计显著性水平所确定的。另外，标志物浓度相对于基线水平的变化可以反映患者的预后，并且标志物水平的变化程度可以与不良事件的严重程度相关。统计显著性通常通过比较两个或更多个群体以及确定置信区间和/或p值来确定。参见例如Dowdy和Wearden,《统计分析(Statistics for Research)》,纽约的约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,New York),1983。本发明的优选的置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。对于某些组合，可以确定用于疾病诊断的合适的阈值水平。这可以例如通过根据患者的突变状态和/或甲基化水平将参考患者群体分组为某些分位数，例如四分位数、五分位数或甚至根据合适的百分位数来完成。对于高于和低于某些百分位的每个分位数或组，可以计算风险比，即比较患有某种疾病的那些患者与没有患有某种疾病的那些患者之间的不良结果，即“疾病”或“治疗结果”的风险。在这种情况下，风险比(HR)高于1指示患者出现不良结果的风险较高。HR低于1指示患者组中某种治疗的有益效果。HR为约1(例如，+/-0.1)指示特定患者组的风险没有升高。通过将患者的某些分位数之间的HR相互比较以及与患者的总群体的HR进行比较，有可能鉴定具有升高风险的患者的那些分位数和从药物受益的那些患者的分位数，并且由此根据本发明对受试者进行分层。
技术人员能够使用结合本发明的测序技术。测序技术包含但不限于Maxam-Gilbert测序、Sanger测序(使用ddNTP的链终止方法)和下一代测序方法，如大规模平行特征测序(MPSS)、polony测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序或离子激流半导体测序或单分子实时技术测序(SMRT)。
MGMT是编码O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶蛋白的基因。MGMT位于10号染色体(129467184-129768007染色***置(bp))上。关于MGMT的核酸和肽信息可以在公开可获得的数据库中找到，如Ensembl(ENSG00000170430)、Entrez基因(4255)和UniProt(P16455)。如本文所述，表达MGMT与受试者对如替莫唑胺(TMZ)等化疗剂的应答性相关。如本文所述，发现MGMT表达与外显子1甲基化水平负相关，并且MGMT表达与甲基化水平正相关。
IDH1是编码异柠檬酸脱氢酶(NADP(+))1，胞质蛋白的基因。IDH1位于2号染色体(208236227-208266074染色***置(bp))上。关于IDH1的核酸和肽信息可以在公开可获得的数据库中找到，如Ensembl(ENSG00000138413)、Entrez基因(3417)和UniProt(O75874)。IDH2是编码异柠檬酸脱氢酶(NADP(+))2，线粒体蛋白的基因。IDH2位于15号染色体(90083045-90102504染色***置(bp))上。关于IDH1的核酸和肽信息可以在公开可获得的数据库中找到，如Ensembl(ENSG00000182054)、Entrez基因(3418)和UniProt(P48735)。如本文所述，IDH1和/或IDH2中的突变的存在或不存在提供了用于确定弥漫性神经胶质瘤的存在或不存在的诊断信息。
本文所公开的一个或多个所关注区域涵盖在从受试者获得的生物样品中相对于可用于做出诊断和治疗决定的参考值鉴定的特征谱。参见例如以下实例。在各个实施例中，确定一个或多个所关注区域的突变状态和/或甲基化水平可以用诊断测定来补充，如用于确定存在、不存在、淀粉样斑块的测定、高级放射照相测定和诊断测定。
在一些实施例中，所述方法可以包括确定至少1个所关注区域、至少2个所关注区域、至少3个所关注区域、至少4个所关注区域、至少5个所关注区域、至少6个所关注区域、至少6个所关注区域、至少7个所关注区域、至少8个所关注区域、至少9个所关注区域、至少10个或更多个所关注区域的突变状态和/或甲基化水平。
本公开的一个方面涵盖用于检测受试者的弥漫性神经胶质瘤的方法，所述方法包括：提供或已经提供来自所述受试者的生物样品；同时检测一个或多个所关注区域中的突变的存在或不存在以及甲基化水平；将所述一个或多个所关注区域的所述突变的存在或不存在以及所述甲基化水平与参考值进行比较；当测得的突变的存在或不存在以及所述甲基化水平偏离所述参考值时，将所述受试者诊断为患有弥漫性神经胶质瘤。在一些方面，所述检测步骤可以包含以下中的一个或多个：从所述样品中分离基因组DNA；对所述基因组DNA进行处理以使游离DNA末端去磷酸化；在所述基因组DNA中引入靶向双链断裂以产生一个或多个所关注区域；修饰所关注区域的游离末端以辅助测序衔接子的连接；将一个或多个测序衔接子分子连接到所述一个或多个所关注区域；以及对所关注区域进行测序。在一些实施例中，使用纳米孔测序。在一些实施例中，所述一个或多个所关注区域包含IDH1、IDH2和MGMT基因，包含侧接所述基因的5'和3'区域。
在本公开的一个方面中涵盖了用于确定患有或疑似患有弥漫性神经胶质瘤的受试者对治疗剂的应答性的方法，所述方法包括：提供或已经提供来自所述受试者的生物样品；同时检测一个或多个所关注区域中的突变的存在或不存在以及甲基化水平；将所述一个或多个所关注区域的所述突变的存在或不存在以及所述甲基化水平与参考值进行比较；当测得的突变的存在或不存在以及甲基化水平偏离所述参考值时，评估所述受试者对治疗剂的应答性。在一些方面，所述检测步骤可以包含以下中的一个或多个：从所述样品中分离基因组DNA；对所述基因组DNA进行处理以使游离DNA末端去磷酸化；在所述基因组DNA中引入靶向双链断裂以产生一个或多个所关注区域；修饰所关注区域的游离末端以辅助测序衔接子的连接；将一个或多个测序衔接子分子连接到所述一个或多个所关注区域；以及对所关注区域进行测序。在一些实施例中，使用纳米孔测序。在一些实施例中，所述一个或多个所关注区域包含IDH1、IDH2和MGMT基因，包含侧接所述基因的5'和3'区域。在一些实施例中，所述治疗剂是TMZ。
II.治疗
本公开的另一方面是一种用于治疗有需要的受试者的方法。如本文所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指由经过培练且获得许可的专业人员向有需要的受试者提供医疗护理。医疗护理可以是诊断测试、治疗性治疗和/或预防性(prophylactic或preventative)措施。治疗性和预防性治疗的目的是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或疾病/病症。治疗性或预防性治疗的有益或期望的临床结果包含但不限于症状减轻、疾病程度降低、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的情况下的预期生存期相比，生存期延长。需要治疗的人包含那些已经患有疾病、病状或病症的人以及那些易于患有疾病、病状或病症的人或那些要预防疾病、病状或病症的人。在一些实施例中，接受治疗的受试者是无症状的。如本文所使用的，“无症状受试者”是指未表现出中枢神经***肿瘤的任何体征或症状的受试者。在其它实施例中，受试者可能表现出中枢神经***肿瘤的体征或症状(例如，记忆力丧失、情绪或行为改变、疼痛等)。
本公开的一个方面涉及用于基于如本文所公开的一个或多个所关注区域中的突变和甲基化水平的检测来评估患有或疑似患有对治疗剂(例如，化疗，如TMZ或放射疗法)具有应答或无应答的中枢神经***肿瘤的受试者的应答性或无应答性的方法。如本文所使用的，评估对治疗剂的“应答性”或“无应答性”是指确定受试者对治疗剂应答或无应答的可能性。
当如在本方法中研究多于一个所关注区域时，ROI的突变状态和甲基化水平可以通过例如计算程序处理以产生可以由表征ROI的图案的一个或多个数字表示的概况。
当受试者通过所描述的任何方法被确定为有应答或无应答时，此受试者可以经受针对中枢神经***肿瘤的治疗，包含本领域已知的并且本文所公开的任何中枢神经***肿瘤治疗。在一方面，受试者使用本文所述的方法被确定为可能有应答，然后可以向受试者施用有效量的化疗或放射疗法以治疗中枢神经***肿瘤。非限制性实例包含TMZ。
在某些方面，可以向受试者施用治疗有效量的药物组合物。使用标准有效技术进行施用，包含外周施用(即，不通过施用到中枢神经***)或局部施用到中枢神经***。外周施用包含但不限于口服施用、吸入施用、静脉内施用、腹膜内施用、关节内施用、皮下施用、肺施用、透皮施用、肌内施用、鼻内施用、颊施用、舌下施用或栓剂施用。局部施用包含但不限于通过腰椎、心室内或实质内导管或使用外科手术植入的控释调配物。施用途径可以由待治疗的疾病或病状决定。
用于有效施用的药物组合物被故意设计成适于所选择的施用模式，并且视情况而定，使用药学上可接受的赋形剂，如相容的分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。《雷明顿氏制药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton Pa.),第16版ISBN：0-912734-04-3,最新版，所述文献通过引用整体并入本文，提供了从业人员通常已知的调配物技术的概要。
在上述实施例的每个实施例中，药物组合物可以包括显像剂。显像剂的非限制性实例包含功能显像剂(例如，氟脱氧葡萄糖等)和分子显像剂(例如，匹兹堡化合物B(Pittsburgh compound B)、氟倍他苯(florbetaben)、氟贝他吡(florbetapir)、氟美他莫(flutemetamol)、放射性核素标记的抗体等)。
在一些实施例中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下逐步增加剂量。治疗有效剂量的确定和调整，以及对何时和如何进行这种调整的评估，对于医学领域的普通技术人员来说是已知的。
根据有效治疗症状的需要，给药频率可以是每天一次、或每周或每月一次、两次、三次或更多次。相对于疾病本身的治疗施用时间和治疗持续时间将由围绕病例的情况决定。治疗可以立即开始，如在由紧急医疗人员进行施用的受伤位点处。治疗可以在医院或诊所本身开始，或在出院后或在门诊就诊后的稍后时间开始。治疗的持续时间可以在从基于一次施用的单剂量到治疗性治疗的终生进程的范围内。
典型的剂量水平可以使用标准临床技术来确定和优化，并且将取决于施用模式。
受试者可以是啮齿动物、人、家畜动物、伴侣动物或动物学动物。在一个实施例中，受试者可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施例中，受试者可以是家畜动物。合适的家畜动物的非限制性实例可以包含猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在仍另一个实施例中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可以包含宠物，如狗、猫、兔和鸟。在又另一个实施例中，受试者可以是动物学动物。如本文所使用的，“动物学动物”是指可以在动物园中发现的动物。此类动物可以包含非人灵长类动物、大型猫科动物、狼和熊。在优选的实施例中，受试者是人。
III.试剂盒
还提供试剂盒。此类试剂盒可以包含本文所述的药剂或组合物，并且在某些实施例中，包含施用说明书。此类试剂盒可以促进本文所述的方法的执行。当以试剂盒的形式提供时，组合物的不同组分可以包装在单独的容器中并且在使用之前立即混合。组件包含但不限于***、测定、引物或软件。如果期望的话，这种组分的单独包装可以存在于包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置可以含有一个或多个含有组合物的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。在某些情况下，这种组分的单独包装还可以允许长期储存而不损失组分的活性。
试剂盒还可以包含单独容器中的试剂，例如待添加到单独包装的冻干活性组分中的无菌水或盐水。例如，密封的玻璃安瓿可以含有冻干组分，并且在单独的安瓿中含有无菌水、无菌盐水或无菌溶液，所述无菌水、无菌盐水或无菌溶液中的每一种都已经在中性非反应气体如氮气下包装。安瓿可以由任何合适的材料组成，如玻璃、有机聚合物，如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或通常用于容纳试剂的任何其它材料。合适的容器的其它实例包含可以由与安瓿类似的物质制造的瓶子，以及可以由如铝或合金等箔衬里的内部组成的封套。其它容器包含试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可以具有无菌进入口，如具有可以通过皮下注射针刺穿的塞子的瓶子。其它容器可以具有两个隔室，所述两个隔室由可容易去除的膜分开，所述膜在去除时允许组分混合。可去除膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
在某些实施例中，试剂盒可以提供有说明材料。说明书可以印刷在纸或其它基底上，和/或可以作为电子可读介质或视频提供。详细说明书可以不与试剂盒物理地相关联；相反，用户可以被引导到由试剂盒的制造商或经销商指定的互联网网站。
如本文所述的对照样品或参考样品可以是来自健康受试者或来自随机受试者组的样品。可以使用参考值代替先前从健康受试者或一组健康受试者获得的对照或参考样品。对照样品或参考样品也可以是具有已知量的可检测化合物的样品或加标样品。
本发明的方法和算法可以包含在控制器或处理器中。此外，本发明的方法和算法可以体现为用于执行一种或多种这种计算机实施的方法的一种或多种计算机实施的方法，并且还可以体现为含有计算机程序或其它机器可读指令(本文中称为“计算机程序”)的有形或非暂时性计算机可读存储介质的形式，其中当计算机程序被加载到计算机或其它处理器(本文中称为“计算机”)中和/或由计算机执行时，计算机变为用于实践所述一种或多种方法的设备。用于含有这种计算机程序的存储介质包含例如软盘和磁盘、光盘(CD)-ROM(无论是否可写)、DVD数字盘、RAM和ROM存储器、计算机硬盘驱动器和备份驱动器、外部硬盘驱动器、“拇指”驱动器以及计算机可读的任何其它存储介质。所述一种或多种方法还可以以计算机程序的形式来体现，例如，无论是存储在存储介质中还是通过如电导体、光纤或其它光导体等传输介质来传输，或者通过电磁辐射来传输，其中当计算机程序被加载到计算机中和/或由计算机执行时，计算机变为用于实践所述一种或多种方法的设备。所述一种或多种方法可以在通用微处理器上或在被专门配置成实践一个或多个过程的数字处理器上实施。当采用通用微处理器时，计算机程序代码配置微处理器的电路***以创建特定的逻辑电路布置。计算机可读的存储介质包含可以由计算机本身或由读取计算机指令的另一机器可读的介质，所述计算机指令用于向计算机提供用于控制计算机操作的那些指令。此类机器可以包含例如用于读取以上提及的存储介质的机器。
通用技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。在文献中充分解释了这些技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989),冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》,胡玛纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(CellBiology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,1989),学术出版社(AcademicPress)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱南出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8),约翰威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)：《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)》,(Mullis等人编辑,1994)；《免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(ShortProtocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practice approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A practical Approach)》,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑,1985)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1985)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,(1986)；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(IRL出版社,(1986)；和B.Perbal,《分子克隆实用指南(A practical Guide To Molecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义了某些术语。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明的实施例所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。与本文所述的方法和材料类似的、修改的或等效的许多方法和材料可以用于本发明的实施例的实践中而无需过多的实验，本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明的实施例时，将根据以下陈述的定义使用以下术语。
如本文所使用的，当术语“同时”是指检测IDH突变和MGMT时意指在单一反应混合物中同时检测前述标志物。因此，如本文所述，本公开证明nCATS能够富集基因组区域而无需扩增和定量分析天然DNA上的甲基化，并且可以同时检测单核苷酸变体的鉴定。
如本文所使用的术语“约”是指可以例如通过典型的测量技术和设备相对于任何可定量的变量，包含但不限于质量、体积、时间、距离和量而发生的数值数量的变化。另外，在现实世界中使用的固体和液体处置程序的情况下，存在某些无意的误差和变化，这可能由于用来制造组合物或实行方法等的成分的制造、来源或纯度的差异而引起。术语“约”还涵盖这些变化，所述变化可以高达±5％，但也可以是±4％、3％、2％、1％等。无论是否被术语“约”修饰，权利要求均包含所述数量的等效物。
当介绍本公开或其优选方面的要素时，冠词“一个(a)”、“一种(an)”、“所述(the)”和“所述(said)”旨在表示存在要素中的一个或多个要素。术语“包括(comprising)”、“包含(including)”和“具有(having)”旨在是包含性的并且意指可以存在除所列举要素之外的另外的要素。
“测量(measuring)”或“测量(measurement)”或可替代地“检测(detecting)”或“检测(detection)”意指确定临床或受试者源性样品内的给定物质的存在、不存在、数量或量(其可以是有效量)，包含此类物质的定性或定量浓度水平的推导，或以其它方式确定受试者的临床参数的值或分类。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指任何动物或其细胞，无论是体外还是原位，均可适用于本文所述的方法。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人。
如本文所使用的，“平台”或“技术”是指根据本公开的可以用于测量特征，例如基因表达水平的设备(例如，仪器和相关联部件、计算机、包括如本文所教导的一个或多个数据库的计算机可读介质、试剂等)。平台的实例包含但不限于阵列平台、热循环仪平台(例如，多重和/或实时PCR平台)、核酸测序平台、杂交和多信号编码(例如，荧光)检测器平台等、核酸质谱平台、磁共振平台和其组合。
在一些实施例中，平台被配置成半定量地测量基因表达水平，即，不是以离散或绝对表达进行测量，而是将表达水平测量为估计值和/或相对于彼此或一个或多个指定标志物(例如，另一个“标准”或“参考”基因的表达)。
在一些实施例中，半定量测量包含“实时PCR”，其通过进行PCR循环直到检测到指示指定mRNA的信号，并且使用直到检测所需的PCR循环的数量来提供特征内的基因的估计或相对表达水平。
实时PCR平台包含例如
低密度阵列(TLDA)，其中样品经历多重逆转录，随后在阵列卡上进行实时PCR，所述阵列卡具有进行实时PCR的孔的集合。实时PCR平台还包含例如Biocartis IdyllaTM样品到结果技术，其中裂解细胞、提取DNA/RNA并进行实时PCR并且检测结果。实时PCR平台还包含例如CyTOF分析：CyTOF(Fludigm)是最近引入的能够在单个细胞上同时检测与重金属缀合的多达40个标志物的质量细胞计数器。
磁共振平台包含例如T2
T2磁共振
技术，其中可以在生物样品中鉴定分子靶标而无需纯化。
术语“阵列”、“微阵列(microarray)”和“微阵列(micro array)”是可互换的并且是指存在于基底上的核苷酸序列的集合的排列。可以在本文所提供的方法中利用任何类型的阵列。例如，阵列可以在如载玻片等固体基底(固相阵列)上或在如硝酸纤维素膜等半固体基底上。阵列也可以呈现在珠上，即珠阵列。这些珠子通常是微观的，并且可以由例如聚苯乙烯制成。阵列也可以呈现在纳米颗粒上，所述纳米颗粒可以由例如特别是金，但也可以是银、钯或铂制成。参见例如使用金纳米颗粒探针技术的Nanosphere
System。也可以使用磁性纳米颗粒。其它实例包含核磁共振微线圈。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何排列(例如，核苷酸类似物，如锁定核酸(LNA)等)。在一些实施例中，核苷酸序列跨越外显子/内含子边界，以检测剪接或成熟RNA物种而不是基因组DNA的基因表达。核苷酸序列也可以是来自基因的部分序列、引物、全基因序列、非编码序列、编码序列、公开序列、已知序列或新序列。阵列可以另外地包括与蛋白质或代谢物特异性结合的其它化合物，如抗体、肽、蛋白质、组织、细胞、化学品、碳水化合物等。
阵列平台包含例如以上提及的
低密度阵列(TLDA)和
微阵列平台。
杂交和多信号编码检测器平台包含例如NanoString
技术，其中检测与靶特异性探针(例如，对应于所关注的基因表达转录物)连接的颜色编码的条形码的杂交；以及
技术，其中微球珠被颜色编码并且用靶特异性(例如，基因表达转录物)探针包被进行检测；以及
珠阵列，其中将微珠组装到光纤束或平面二氧化硅载玻片上并且用靶特异性(例如，基因表达转录物)探针包被进行检测。
核酸质谱平台包含例如Ibis Biosciences
检测器，其中DNA质谱用于使用质量分布图检测经扩增DNA。
热循环仪平台包含例如
多重PCR***，所述***从未加工的样品中提取和纯化核酸并且进行嵌套多重PCR；RainDrop数字PCR***，其是使用微流控芯片的基于液滴的PCR平台；以及GenMark eSensor或ePlex***。
术语“遗传物质”是指用于将遗传信息存储在生物体的细胞的细胞核或线粒体中的物质。遗传物质的实例包含但不限于双链和单链DNA、cDNA、RNA和mRNA。
术语“多个核酸寡聚体”是指两个或更多个核酸寡聚体，其可以是DNA或RNA。
范围：贯穿本公开，可以以范围格式呈现本发明的各个方面。应当理解的是，采用范围格式的描述仅仅是为了方便和清楚，而不应被理解为对本发明范围的僵化限制。因此，对范围的描述应被视为已经特定揭示所有可能的子范围以及所述范围内的个别数值。例如，对如1到6的范围的描述应被视为具有具体公开的子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的单独数量，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度为多少，这都适用。
如本文所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，优选地是人。哺乳动物包含但不限于人、灵长类动物、家畜、啮齿动物和宠物。受试者可能正在等待医疗护理或治疗，可能正在接受医疗护理或治疗，或者可能已经接受医疗护理或治疗。
如本文所使用的，术语“健康对照组”、“正常组”或来自“健康”受试者的样品意指由医师基于定性或定量测试结果诊断为未患有中枢神经***肿瘤或与中枢神经***肿瘤相关的临床疾病的受试者或一组受试者。“正常”受试者通常与待评估的个体的年龄大致相同，包含但不限于相同年龄的受试者和在5到10岁范围内的受试者。
本文所提供的方法可用于探询如上所述的所关注基因组区域。对于本领域的技术人员还将显而易见的是，本发明的方法中的术语“哺乳动物细胞的基因组或染色体的连续区域”可以与上述所关注的基因组区域可互换地使用。
无需进一步详细阐述，相信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
由于可以在不脱离本发明的范围的情况下对上述材料和方法进行各种改变，因此旨在以上描述中和以下给出的实例中含有的所有内容应被解释为说明性的而非限制性的。
实例
包含以下实例以证明本公开的各个实施例。本领域的技术人员应当理解，以下实例中所公开的技术表示由诸位发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用并且因此可以被认为构成本发明的优选实践模式的技术。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
实例1：用于在弥漫性神经胶质瘤的新鲜活检中同时检测IDH1/2突变和临床相关的MGMT甲基化的新颖的Cas9靶向长读测定
在本实例中，纳米孔Cas9靶向测序(nCATS)的使用被探索作为测序技术，其能够同时评估多个生物标志物，作为克服在中枢神经***肿瘤检测中的当前临床实践限制的有吸引力的选择。
为了诊断弥漫性神经胶质瘤(DG)，需要异柠檬酸脱氢酶1和2(IDH1/2)基因突变的存在进行亚型鉴定，并且也是预后分子标志物[Louis DN等人,《神经病理学学报(ActaNeuropathol.)》2016；131:803–820；Yan H等人(2009),《新英格兰医学杂志(N Engl JMed)》360:765-773]。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子的甲基化状态常规地用于指导化疗治疗决策，尤其是在胶质母细胞瘤(GBM)(例如，IV级星形细胞瘤)中，这是DG的最常见类型。
可以使用各种方法来筛选IDH1/2突变和MGMT启动子甲基化。通常，用对IDH1精氨酸132(精氨酸到组氨酸，R132H)处的最常见突变具有特异性的免疫组织化学(IHC)测定进行IDH1/2突变筛选。然而，IHC无法检测其它不太常见的突变，包含IDH1 R132S、R132C、R132G和R132L取代或IDH2 R172K。因此，建议将聚合酶链反应(PCR)或Sanger测序作为IHC阴性肿瘤的第二步测试[Louis DN等人,《神经病理学学报》,2016；131:803–820；Capper D等人(2010),《大脑病理学(Brain Pathol)》20:245-254]。
测定MGMT甲基化需要鉴定启动子中CpG岛上的胞嘧啶残基的修饰(CpG甲基化)，其包含围绕转录起始位点的98个CpG二核苷酸。这些测定在所使用的方法以及所评估的启动子区域方面有所不同。然而，大多数研究仅探询一部分CpG位点以预测MGMT基因的转录活性，并且进而预测对口服化疗药物替莫唑胺(TMZ)的潜在治疗应答。两个差异甲基化区域(DMR)覆盖CpG 25-50(DMR1)和CpG 73-90(DMR2)，并已经证明与转录沉默相关[BienkowskiM等人(2015),《临床神经病理学(Clin Neuropathol)》34:250-257]。DMR2具有一些在基于细胞的报告基因研究中控制MGMT的转录的顺式作用位点[Malley DS等人,(2011),《神经病理学学报》121:651-661]。MGMT启动子甲基化的存在预示着对TMZ治疗的应答性[
A等人(2012),《柳叶刀·肿瘤学(Lancet Oncol)》13:916-926；Wick W等人(2012),《柳叶刀·肿瘤学》13:707-715]，但对应于TMZ治疗应答的甲基化程度是争论的主题，并且关于哪种测定方法是最佳的没有一致意见。常用的方法，如甲基化特异性PCR、焦磷酸测序和质谱
会引入PCR偏倚，并且由于亚硫酸氢盐处理而被限制于研究有限的序列长度。
纳米孔技术(Oxford Nanopore
或ONT)可以克服前述测定的局限性，以评估甲基化和突变。借助于纳米孔测序，没有亚硫酸氢盐转化的定量甲基化评估是可能的，这是因为电解电流信号对胞嘧啶中的碳5(5mC)的甲基化敏感[Simpson JT等人(2017),《自然方法(Nat Methods)》14:407-410]。此外，借助于长读单分子测序的能力，可以捕获启动子区域和另外的周围区域中的多个CpG。在这里，应用纳米孔Cas9靶向测序(nCATS)[Gilpatrick T等人(2020),《自然生物技术：1-6(Nat Biotechnol:1-6)》]并且使用低成本纳米孔MinION装置(ONT)来同时测定IDH突变和MGMT甲基化。然后将所获得的结果与当前使用的临床测试进行比较。观察到所有捕获的CpG的甲基化与基因表达水平之间呈正相关，并且显示nCATS和现有深度测序方法两者在临床DG样品中检测到相同的单核苷酸变体。
方法
知情同意书：这项研究包含诊断患有神经胶质瘤的8名患者。审查病例记录，并且在阿肯色大学医学科学研究所审查委员会(the institutional review board at theUniversity of Arkansas for Medical Sciences)(IRB协议编号：228443)的批准下获得脑组织样品。所有患者都提供书面知情同意书。A.R选择具有IDH突变的四个样品和具有IDH野生型的4个样品。然而，在向分析组公开突变状态之前，将所有样品以单盲方式进行处理和分析(T.W.和P.J.)。
nCATS的DNA样品和DNA提取—对照DNA：IDH1/2野生型gDNA(基因组DNA)标准品(美国Horizon Discovery公司)用作通过PCR和纳米孔测序(美国ONT公司)进行基因分型的阴性对照。对于阳性对照，在本研究中，IDH1密码子132突变体DNA(CGT→GGT)从患者获得；IDH2密码子172突变体DNA(AGG→AAG)购自Horizon Discovery公司。使用特异性引物(美国整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,USA))扩增每种标准品的IDH1/2的外显子4。IDH1/2扩增的PCR条件是相同的，使用100ng gDNA、20mM引物和25μl LongAmp Taq 2x预混合液(美国纽英伦生物技术公司(NEB,USA))，具有程序如下：95℃2分钟；[95℃15秒；60℃30秒；65℃40秒]的25个循环；65℃10分钟，4℃保持。将PCR反应用AMPure XP珠(美国贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,USA))纯化并且在20μl无核酸酶水(NEB)中洗脱。经纯化的PCR产物用于文库制备，使用具有EXP-NBD103和SQK-LSK108协议(ONT)的1D天然条形码基因组DNA，以及使用R9.4.1/FLO-MIN106流动池(ONT)的纳米孔测序。
将含有5-mC和未修饰的胞嘧啶的CpGenomeTMDNA标准组(美国密理博西格玛公司(MilliporeSigma,USA))用于定量分析。标准DNA由具有52个CpG位点的线性双链DNA(897bp)组成；每个标准品含有100％5-mC或未修饰的胞嘧啶。
将CpGenomeTM人甲基化和非甲基化DNA标准组(密理博西格玛公司)用作用于nCATS和甲基化状态评估的阳性和阴性对照。甲基化DNA标准品在所有CpG二核苷酸处被酶促甲基化(>95％)。非甲基化DNA标准品含有小于5％的甲基化DNA。
细胞系gDNA：在本研究中使用四种GBM细胞系：U87、U251、T98G和LN18(美国西格玛公司(Sigma,USA))。将细胞在10cm培养皿中利用标准技术在具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM(U87)中；在具有2mM谷氨酰胺、1％NEAA、1mM丙酮酸钠和10％FBS的EMEM(U251和T98G)中；以及在具有5％FBS的DMEM(LN18)中生长到85-90％汇合。在用AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒(美国凯杰公司(Qiagen,USA))进行DNA提取之前，将细胞用PBS洗涤。使用AMPure XP珠纯化和浓缩洗脱的gDNA，并且在20–40μl无核酸酶水中洗脱并储存在-20℃下。
临床样品：本研究包含由经委员会认证的神经病理学家Murat Gokden M.D.根据2016年WHO弥漫性神经胶质瘤分类进行分级的8个脑组织样品(表1)。在手术切除之后，将组织样品立即在干冰上冷冻并且储存在-80℃下，直到DNA提取。如上所述，用AllPrep DNA/RNAMini试剂盒(凯杰公司)进行DNA提取。
表1：8名患者的人口统计学特征
RNA提取：对于所有细胞系和组织样品，从相同样品中提取RNA和DNA。AllPrepDNA/RNA Mini试剂盒(凯杰公司)允许从同一样品中同时纯化gDNA和总RNA。
DNA和RNA的纯度、数量和完整性：使用NanoDrop-2000分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific,USA))评估所有样品中的DNA和RNA纯度。使用Qubit3.0定量测定(赛默飞世尔科技公司)测量DNA浓度。使用TapeStation 2200(美国安捷伦科技公司(Agilent,USA))确定DNA和RNA的完整性。
单指导(sg)RNA设计：为了设计crRNA，使用ONT协议中所描述的CHOPCHOP[Labun K等人,(2019)《核酸研究(Nucleic Acids Res)》47:W171-W174]。使用UCSC In-Silico PCR工具测试crRNA的特异性，以针对人基因组(hg19)进行搜索。所设计的crRNA、tracrRNA和HiFi Cas9购自IDT。使用以下crRNA：MGMT_启动子_左：ATGAGGGGCCCACTAATTGA(SEQ ID NO:1)；MGMT_启动子_右：ACCTGAGTATAGCTCCGTAC(SEQ ID NO:2)；IDH1_左：ACAGTCCATGAATCAACCTG(SEQ ID NO:3)；IDH1_右：GGCACCATACGAAATATTCT(SEQ ID NO:4)；IDH2_左：GCTAGGCGAGGAGCTCCAGT(SEQ ID NO:5)；IDH2_右：GCTGTTGGGGCCGCTCTCGA(SEQ IDNO:6)。
用于通过ONT的靶向测序的nCATS文库制备：对于每个样品，3.5μg到5.5μg gDNA用作用于制备nCATS文库的输入。文库制备协议由ONT通过纳米孔社区的富集通道(协议版本：ENR_9084_v109_revA_04Dec2018)提供。简而言之，用小牛肠磷酸酶(NEB)处理gDNA末端以减少测序衔接子与非靶链的连接。然后，新鲜地制备Cas9核糖核蛋白复合物(Cas9 RNP)并且用于在阻断的DNA的靶向区域处产生双链断裂。使用Taq聚合酶和dATP(NEB)，将腺嘌呤(A)-尾立即添加到切割的DNA片段的3'末端。A突出端可以与纳米孔测序衔接子的T突出端配对。将衔接子连接的DNA和阻断的DNA两者添加到流动池进行测序。用AMPure XP珠(贝克曼库尔特公司)去除过量的未连接衔接子。使用MinION Mk1B对文库(连接到衔接子的分子)进行测序。每个文库在R9.4.1/FLO-MIN106流动池(ONT)上测序36小时。
生物信息学和统计分析-读数的数据处理和映射：使用GUPPY算法(版本3.0.3)将通过MinKnow软件(版本1.7.14)产生的ONT原始信号数据(FAST5文件)转化为DNA(FASTQ文件)。使用NanoFilt程序，基于高于Phred得分8的平均质量阈值和长于200个碱基的读取长度，进行ONT读取的质量控制以过滤FASTQ文件[PMID：29547981]。使用Minimap2将经过滤的读数与人参考基因组(Hg19)进行比对并且使用SAMtools(版本1.6)进行分类。
命令行：
guppy_basecaller--recursive--enable_trimming true--qscore_filtering--min_qscore 8
--kit SQK-LSK109--flowcell FLO-MIN106--input_path fast5_dir--save_path fastq_dir
cat fastq_dir/pass/*.fastq|NanoFilt-l 200>reads.fastq
minimap2-ax map-ont hg19.genome.fasta reads.fastq|samtools sort-Ttmp-o
reads.mappings.bam
samtools index reads.mappings.bam
纳米孔甲基化调用：对于每个样品，使用读数(FASTQ文件)、比对读数(BAM文件)和原始信号(FAST5文件)，使用Nanopolish v 0.11.0 9进行CpG甲基化(5mC)调用。然后使用来自纳米抛光软件包的“calculate_methylation_frequency.py”计算每个位置处的甲基化的甲基化频率和对数似然比。过滤掉每个样品中读数<10且对数似然比<2.5的任何位置。
命令行：
nanopolish index-d fast5_dir/reads.fastq
nanopolish call-methylation-r reads.fastq-b reads.mappings.bam-ghg19.genome.fasta
>methylation_calls.tsv
calculate_methylation_frequency.py-i methylation_calls.tsv|awk
'BEGIN{OFS＝"\t"}{if($5>＝10)print$1,$2,$3,$7}'>methylation_calls.bdg
单核苷酸变体调用：使用FASTQ文件、BAM文件和FAST5文件通过纳米抛光在靶区域上调用SNV。纳米抛光用于重新分析比对后的原始信号并从信号水平的ONT数据计算SNV等位基因频率。“纳米抛光变体”子程序用于通过修改的参数设置同时调用SNV：-min-candidate-frequency＝0.15,-min-candidate-depth＝10,--methylation-aware＝cpg,--snps,and--ploidy＝2。回顾了SNV的变体质量并且用整合基因组学观察器和追踪观察器将其可视化[Ou J等人,《自然方法》16(6):453–454,22；Robinson JT等人,(2011),《自然生物技术》29(1):24-26]。
命令行：
使用定量逆转录酶(qRT)-PCR进行的MGMT基因表达分析：使用Superscript IV逆转录酶(美国英杰公司)将总共1μg提取的RNA逆转录成cDNA。使用iTaq Universal SYBRGreen Supermix(美国伯乐公司(BioRad,USA))和StepOnePlus实时PCR***(美国应用生物***公司(Applied Biosystems,USA))进行qRT-PCR分析。实时PCR在技术上一式三份进行；其在95℃下运行10分钟，在95℃下运行40个循环持续15秒并且在60℃下运行60秒。将公开的引物组用于MGMT和β-肌动蛋白基因(ACTB)[Cartularo L等人,(2016)《共科学图书馆·综合(PLoS One)》11:e0155002；Chen X等人,(2018),《自然通讯(Nat Commun)》9:2949；UnoM等人,(2011)《临床(Clinics)》66:1747-1755]。对于数据分析，使用每个一式三份的平均结果。
患者肿瘤样品的Illumina测序：使用Tempus xT测定，对8名患者中的6名患者的临床肿瘤样本和唾液样品(来自与肿瘤样本相同的患者)进行DNA和RNA测序[Beaubier N等人,(2019)《自然生物技术》37:1351-1360]。简而言之，使用Chemagic360仪器和来源特异性磁珠协议从肿瘤细胞性大于20％的肿瘤组织切片中提取核酸。总核酸用于DNA文库构建，而RNA通过DNase I消化和磁珠纯化进一步纯化。用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒或Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))对核酸进行定量，并且用LabChip GX Touch HT基因组DNA试剂盒或LabChip RNA高HT Pico敏感性试剂试剂盒(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))确认质量。
对于DNA文库构建，使用Covaris超声发生器将来自肿瘤或正常样品的100ng DNA机械剪切至平均大小为200bp。使用KAPA Hyper Prep试剂盒制备文库。简而言之，DNA经历酶促末端修复和A加尾，随后是衔接子连接、基于珠的大小选择和PCR。使用KAPA HiFiHotStart ReadyMix扩增捕获的DNA靶标。使用模式化流动池技术在Illumina HiSeq4000***上对经扩增的靶标捕获的文库进行测序。
结果
(i)纳米孔测序准确地评估突变状态和甲基化水平
原始纳米孔测序读数的误差率持续下降，从而允许技术可用于基因分型和甲基化测定[Simpson JT等人,(2017),《自然方法》14:407-410]。纳米孔测序误差在很大程度上是随机的，并且使用来自足够读取深度的共有序列可以消除几乎所有的测序误差。为了证实纳米孔测序对IDH突变进行准确基因分型的能力，使用纳米孔MinION装置对为IDH1/2野生型或IDH1/2突变体的PCR扩增子进行测序。这项测试表明，可以准确地检测这2个基因中的杂合突变，但是人为误差是不可避免的(图1A)。
为了确定CpG甲基化的检测极限，对CpG上100％甲基化或0％甲基化的2种合成DNA标准品进行测序，并且然后使用纳米抛光进行甲基化调用[Simpson JT等人,(2017)《自然方法》14:407-410]。10％、25％、50％或75％甲基化CpG的数据是通过随机采样0％和100％甲基化标准品的读数产生的。发现在约10个读数(10X)的低测序覆盖率下，可以测量甲基化，但具有高变化。当观察到测序深度增加时，变异系数减小。在较高的深度，≥20X，标准偏差较低(图1B)，并且可以区分0％、25％、50％、75％和100％的甲基化水平。因此，在本实例中使用20X作为理论检测极限。
(ii)nCATS MGMT甲基化测定与焦磷酸测序测定是相当的
基于这些初步数据，然后设计用于纳米孔Cas9靶向测序(nCATS)工作流程的指导RNA，以对4种人GBM细胞系(2TMZ敏感[U87和U251]和2TMZ耐药性[T98G和LN18])和8个临床DG样品(4个IDH突变体和4个IDH野生型)进行测试(图1C和表1)。对于MGMT、IDH1和IDH2，测序深度覆盖率分别为184、664和939的平均值(图1D)。
然后使用nCATS对MGMT基因进行靶向测序；这种方法捕获98个CpG(位于启动子和外显子1中)和121个CpG(在内含子1的5'末端中)。表2示出了CpG基因座的基因组坐标。其它人已经研究了前98个CpG，并且此区域中的CpG的子集已经在临床上用来评估甲基化[Mansouri A等人,(2018),指导胶质母细胞瘤的疗法的MGMT启动子甲基化状态测试：基于新出现的证据和当前挑战，完善方法(MGMT promoter methylation status testing toguide therapy for glioblastoma:refining the approach based on emergingevidence and current challenges.)《神经肿瘤学(Neuro Oncol)》]。因此，首先关注98个CpG，并且使用其比较通过nCATS获得的甲基化水平与通过焦磷酸测序测定获得的水平。使用分别具有>95％对<5％甲基化的甲基化和未甲基化DNA标准品，nCATS在两个样品中提供了清晰的甲基化模式(图2A)，这与CpG 1-25和70-84的亚硫酸氢盐修饰-PCR-焦磷酸测序的结果是相当的。
表2：通过nCATS捕获的每个CpG的位置
接下来，将nCATS应用于4个充分表征的GBM细胞系(如上所述)。通过nCATS测定的这4个细胞系的甲基化百分比也与通过焦磷酸测序返回的甲基化百分比呈正相关(r＝0.73，P＝6.9×10-8到r＝0.94，P＝2.2×10-16)(图2B))。此时，得出的结论是，当应用于均质样品(例如，永生化神经胶质瘤细胞系)时，源自nCATS的甲基化数据与源自焦磷酸测序测定的数据相当。
(iii)患有弥漫性神经胶质瘤的患者的甲基化和突变生物标志物的同时评估
接下来，已证实，nCATS可以用于具有与神经胶质瘤细胞系相对的异源细胞群的临床样品中。为了测试nCATS测定临床样品中的MGMT甲基化和IDH1/2突变的准确性。对于MGMT甲基化，将nCATS数据与用亚硫酸氢盐修饰-PCR-焦磷酸测序或由2个独立的经临床实验室改进修正案(CLIA)认证的实验室进行的
***产生的数据进行比较。nCATS定量甲基化与焦磷酸测序之间存在统计学上显著的正相关(r＝00.64，P＝1.04×10-5到r＝0.80，P＝4.39×10-10)(图2C)。
结果是半定量的并且仅表示对于CpG位点70-81和84-87的3个类别中的甲基化水平(未检测到：<10％；低甲基化：10-30％；检测到：>30％)。这些
结果还显示出与相同CpG位点上的nCATS结果类似的趋势。
来自患者553的样品在靶向的CpG位点上具有8％甲基化，并且
确定其具有低水平甲基化。在其它3名患者中，甲基化范围为38％到51％，并且
报告“检测到”甲基化(即，>30％)(图2C)。值得注意的是，新鲜活检用于nCATS和焦磷酸测序，而***固定的石蜡包埋的样品用于
***。
关于检测IDH突变，nCATS显示所有患者样品中的与Sanger(经CLIA认证的实验室)和外显子测序(Illumina)数据一致的IDH突变。通过nCATS和Illumina检测到的等位基因频率类似(在±3％内)，P＝0.91892(卡方测试)(图2D)。
(iv)MGMT表达与MGMT外显子甲基化呈负相关，但与MGMT内含子甲基化呈正相关
接下来，确定4个细胞系和4个肿瘤样品中的MGMT基因表达与MGMT甲基化水平之间的关系。MGMT表达与TMZ临床应答呈负相关。考虑了差异甲基化区域2(DMR2，在本研究中，外显子1中的CpG 70-81)中的总共12个CpG，因为不仅可以比较nCATS和焦磷酸测序数据，而且这些CpG是临床相关的。如所预期的，qRT-PCR证明了TMZ耐药性细胞系中的高MGMT表达和TMZ敏感细胞系中的非常低的MGMT表达(图3A)。用nCATS和焦磷酸测序(r＝-0.72)两者示出了MGMT表达与甲基化之间的逆相关(图3B)，具有类似的显著性水平(P<0.05)(图3C)。这些数据表明，一般而言，nCATS产生的测序数据与常规方法产生的测序数据相当。
对每个样品进行进一步详细研究，这导致在T98G细胞系中鉴定出意想不到的结果。尽管观察到如先前研究[Moen EL等人,(2014)《分子癌症治疗学(Mol Cancer Ther)》13:1334-1344]的MGMT的高表达，但所观察到的甲基化水平和基因表达并不相反(图3A和图3B)。这一意想不到的结果导致对另外的CpG的甲基化用nCATS(CpG 99-219)进行的研究。通过聚类分析选择在MGMT表达与甲基化之间具有强相关性(r>0.7或r<-0.7)的CpG，包含外显子1中的12个CpG和内含子1中的34个CpG。根据CpG位点的层级聚类显示2个明显的位置依赖性聚类：外显子1中的CpG聚类在一起，并与内含子1中的CpG分离(图3D)。8个样品(4个细胞系和4个肿瘤)的层级聚类显示2个不同的聚类：具有类似甲基化谱的2个TMZ敏感细胞系聚类在一起，而2个TMZ耐药性细胞系和4个临床样品聚类在一起(图3D)。此外，发现内含子CpG甲基化与MGMT表达呈正相关(r＝0.78，P＝0.024)；而外显子CpG甲基化保持与MGMT表达呈负相关(r＝-0.77，P＝0.026)(图3E)。
为了测试另外的肿瘤等级，用qRT-PCR测定分类为原发性WHO III级或IV级(高级神经胶质瘤)的4个肿瘤样品的MGMT表达和nCATS的甲基化。这4个样品不仅在肿瘤分类方面与先前的临床样品不同，而且所述样品来自IDH野生型患者。MGMT表达(图4A)和MGMT甲基化模式(图4B)在样品之间变化。将这4个样品的数据与8个先前样品(包含细胞系)的数据组合进行相关性分析。对于12个样品，MGMT表达与外显子1中的甲基化之间存在负相关(r＝-0.51)，但在统计学上不显著(P＝0.093)。然而，MGMT表达和内含子1中的甲基化存在统计学上显著的正相关(r＝0.67，P＝0.016)(图4C)。对于这最后四个临床样品中的IDH基因分型，nCATS检测到IDH1和IDH2为野生型，这与Illumina和Sanger测序结果一致。
(v)nCATS鉴定出单核苷酸变体
最后，显示nCATS可以用于鉴定MGMT和IDH1/2基因座中的单核苷酸变体(SNV)(图4D)。将纳米孔测序与Illumina测序进行比较，并且还使用来自6名患者的Illumina测序的唾液样品(对于P785和P816没有可用的Illumina数据)验证生殖细胞DNA中病原性SNV的缺乏。nCATS和Illumina返回MGMT基因座1和2的类似基因型(图4D)。对于基因座2，两种方法均在来自患者712的肿瘤和唾液两者中检测到杂合等位基因(C/A)。对于基因座3，nCATS在所有样品中检测到杂合等位基因，而Illumina仅在1个样品中显示杂合等位基因。对于基因座4、5(IDH1)和6(IDH2)，nCATS和Illumina一致地检测到体细胞变体(在唾液样品中未鉴定出变体)。
讨论
在本实例中，纳米孔Cas9靶向长读测序(nCATS)用于同时评估弥漫性神经胶质瘤临床样品和细胞系中的2种预后分子标志物—MGMT甲基化和IDH1/2突变。nCATS使得能够在不扩增的情况下富集基因组区域、定量分析天然DNA上的甲基化以及鉴定单核苷酸变体。Gilpatrick等人在乳腺癌细胞系和1个患者肿瘤样品中用nCATS评估临床癌症生物标志物(例如，TP53、KRAS和BRAF)，证明其可行性[Gilpatrick T等人(2020),《自然生物技术：1-6]。在这里，证明了在若干个临床实体瘤样品上使用nCATS来评估临床相关的遗传和表观遗传预后生物标志物的可行性。
nCATS允许在简化的工作流程中同时评估IDH1/2突变状态和MGMT甲基化水平，从而导致36小时内的生物标志物评估(图1C)。纳米孔测序评估来自天然DNA序列的甲基化的能力避免了对亚硫酸氢盐修饰的需要，并且本实例即使在临床样品中也能够在没有扩增的情况下实现足够的深度覆盖。IDH突变状态的评估与临床使用的Sanger方法相关，并且进一步与Illumina测序进行比较(图4D)。
MGMT甲基化评估目前是高度可变的，因为所使用的方法和所评估的基因区域两者在临床医生之间是不一致的。另外，没有验证MGMT甲基化水平的截断值与MGMT表达相关；因此，不存在临床共识[Mansouri A等人(2018),《神经肿瘤学》；Christians A等人(2012),《公共科学图书馆·综合》7:e33449]。许多机构评估MGMT启动子和外显子1内的2个差异甲基化区域(DMR)，所述区域已显示与细胞系和患者群组中的MGMT表达相关；然后使用MGMT甲基化来预测对替莫唑胺(TMZ)疗法的应答性。机构使用
并且将患者分为3组：无甲基化(<10％)、低甲基化(10-30％)和高甲基化(>30％)。在本研究中，来自细胞系和患者样品两者的nCATS数据与
数据和焦磷酸测序两者相关(图2C和图4B)。然而，低于这个任意截断值(例如，10％)的一些患者确实对TMZ疗法作出应答[Dovek L等人(2019),《神经肿瘤学实践(Neuro-Oncology Pract)》6(3):194-202；Johannessen LE等人(2018),《癌症基因组蛋白质组学(Cancer Genomics Proteomics)》15:437-446；以及RadkeJ等人(2019),《神经病理学通讯学报(Acta Neuropathol Commun)》7:89]，将患者置于“灰色区域”并产生临床困境。考虑到这一点，Chai等人开发了用于焦磷酸测序数据的新型CpG平均模型，所述模型将MGMT启动子限定为当至少3个CpG超过其相应的截断值时被甲基化；这允许临床医生更好地对甲基化水平非常低(例如，<10％)的患者进行分层[Chai R-C等人(2019),《现代病理学(Mod Pathol)》32:4-15]。已经证明，nCATS可以用于定量MGMT基因的多个区域中的CpG甲基化，并且可以提供对治疗应答的变异性的进一步见解。
鉴于nCATS的长读测序能力，还能够定量沿着整个MGMT启动子、外显子1和内含子1的一部分的CpG甲基化。TMZ耐药性细胞系之一(T98G)在MGMT启动子甲基化水平与MGMT表达之间没有预期的逆相关。对于所有GBM细胞系、IDH突变体样品和野生型DG样品，在内含子CpG位点的甲基化与MGMT表达之间存在正相关(图3E和图4C)。这一发现表明测定基因体甲基化的潜在益处，因为内含子对于确定MGMT表达可能很重要。
最后，在MGMT的启动子区域中鉴定了2个SNV，并且其中一个(rs1625649)对MGMT甲基化胶质母细胞瘤患者具有预后影响[Hsu C-Yet等人,(2017)《公共科学图书馆·综合》12:e0186430；以及Xu M等人,(2014)《癌症发生(Carcinogenesis)》35:564-571]。在MGMT中，还观察到nCATS和Illumina结果之间的不一致性。在3号基因座(图4D)中，nCATS在所有患者中检测到2个等位基因，而Illumina仅在P568中显示出2个等位基因。然后考虑了这个区域中的DNA序列，并且在这个基因座中发现了6个连续的鸟嘌呤(均聚物)。对于当前版本的纳米孔，均聚物富集区域是误差的主要来源。因此，对于这个基因座，当使用这个版本的纳米孔(R9.4.1)时，nCATS无法提供准确的基因分型。正在开发结合较长传感器以克服均聚物富集区域中的误差的更新版本的纳米孔。
nCATS技术还鉴定了IDH1和IDH2中的突变变体(4-5号基因座(图4))。IDH1中的变体与患有急性髓性白血病的患者的存活相关，但所述变体在GBM中的预后价值是未知的。然而，随着新的IDH定向疗法的出现，IDH1/2中的变体可能在未来具有重要意义。这些见解可能导致SNV作为治疗决策中的另外的因素的并入，这可以与nCATS的生物标志物鉴定同时进行。
总之，nCATS技术提供了外科手术切除2天内的结果，潜在地以比传统方法更低的资金成本。证明了实体瘤样品在临床上的可行性并且将DG用作模型，假定在临床上使用遗传和表观遗传生物标志物两者。与当前使用的方法相比，nCATS方法还提供了对整个较大基因区域的MGMT甲基化的评估。在临床上使用nCATS来标准化DG中的分子标志物测试并且提供关于患者对治疗应答的变异性的见解具有很大的潜力。此外，纳米孔平台可以是有成本效益的和高通量的，使得纳米孔平台在具有有限资源的国家中是可使用的。nCAT需要>3μg的高质量DNA作为起始材料，从而使得测试***固定的样本不切实际。从新鲜样品中获得组织需要考虑选择具有低坏死和高肿瘤含量的区域，以便优化DNA提取。尽管如此，nCATS方法提供了用于增强癌症精密医学的具有同时评估多个分子靶标的潜力的有前景的工具。
等效物
尽管本文已经描述和展示了若干个发明实施例，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行本文所述的功能和/或获得结果和/或优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每个变化和/或修改被认为是在本文所述的发明实施例的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构型意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体本发明实施例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施例。本公开的本发明实施例涉及本文所述的每个单独的特征、***、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，两个或更多个这样的特征、***、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果这样的特征、***、物品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，被包含在本公开的发明范围内。
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请都相对于每个参考文献、专利和专利申请被引用的主题通过引用的方式并入，这在一些情况下可以涵盖文档的全部内容。
如本文在说明书中和权利要求中使用的，短语“和/或”应当理解为意指这样结合的要素中的“任一个或两个”，所述要素即在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体指明的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体指出的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当连同开放式语言如“包括”使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以指仅A(任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施例中指仅B(任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施例中指A和B两者(任选地包含其它要素)等。
如本文中在本说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”的含义相同的含义。例如，当将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个要素，但还包含多于一个要素以及任选地另外的未列出的项。仅仅明确地指示相反的术语，如“…中的仅一个”或“…中的恰好一个”或者在权利要求中使用时，“由…组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语，如“任一个”、“……之一”、“……中的仅一个”、或“……中的恰好一个”时，本文中使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代品(即，“一个或另一个而不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由…组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
如在本说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应当被理解为是指选自要素列表中的任一个或多个要素的至少一个要素、但不一定包含要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个要素并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素，而无论是否与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以是指至少一个、任选地包含多于一个A，而不存在B(并且任选地包含除了B的要素)；在另一个实施例中，可以指代至少一个、任选地包含多于一个B，而不存在A(并且任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施例中，可以指代至少一个、任选地包含多于一个A，以及至少一个、任选地包含多于一个B(并且任选地包含其它要素)等。
序列表
<110> 生物风险投资有限责任公司
Rodriguez, Analiz
Wongsurawat, Thidathip
<120> 使用同步标志物检测评估弥漫性神经胶质瘤和对治疗的应答性
<130> 052592-663400
<150> US 62/914,141
<151> 2019-10-11
<160> 6
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 1
atgaggggcc cactaattga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 2
acctgagtat agctccgtac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 3
acagtccatg aatcaacctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 4
ggcaccatac gaaatattct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 5
gctaggcgag gagctccagt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 6
gctgttgggg ccgctctcga 20
Claims (23)
1.一种用于检测受试者的弥漫性神经胶质瘤的方法，所述方法包括：
a)获得所述受试者的生物样品；
b)从所述样品中分离基因组DNA；
c)同时检测所述基因组DNA的一个或多个所关注区域中的突变的存在或不存在以及甲基化水平；
d)将所述一个或多个所关注区域的所述突变的存在或不存在以及所述甲基化水平与参考值进行比较；
e)当测得的突变的存在或不存在以及所述甲基化水平偏离所述参考值时，将所述受试者分类为患有弥漫性神经胶质瘤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在分离所述基因组DNA之后，对所述基因组DNA进行处理以使游离DNA末端去磷酸化。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA是用磷酸酶进行处理的。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA与核酸酶接触以产生靶向双链断裂，由此产生一个或多个所关注区域。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一个或多个所关注区域包含IDH1、IDH2和MGMT基因，包含所述基因的5'和3'侧接区域。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述双链断裂是用CRISPR产生的。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中用于MGMT的CRISPR crRNA包括SEQ IDNO:1-2，用于IDH1的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:3-4，并且用于IDH2的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:5-6。
8.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其包括修饰所述所关注区域的游离末端以辅助测序衔接子的连接。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括将一个或多个测序衔接子分子连接到所述一个或多个所关注区域；以及对所述所关注区域进行测序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用纳米孔测序。
11.一种用于评估患有或疑似患有弥漫性神经胶质瘤的受试者对治疗剂的应答性的方法，所述方法包括：
a)获得所述受试者的生物样品；
b)从所述样品中分离基因组DNA；
c)同时检测所述基因组DNA的一个或多个所关注区域中的突变的存在或不存在以及甲基化水平；
d)将所述一个或多个所关注区域的所述突变的存在或不存在以及所述甲基化水平与参考值进行比较；
e)基于所述突变的存在或不存在以及所述甲基化水平来评估疗法应答性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在分离所述基因组DNA之后，对所述基因组DNA进行处理以使游离DNA末端去磷酸化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因组DNA是用磷酸酶进行处理的。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述DNA与核酸酶接触以产生靶向双链断裂，由此产生一个或多个所关注区域。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一个或多个所关注区域包含IDH1、IDH2和MGMT基因，包含所述基因的5'和3'侧接区域。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述双链断裂是用CRISPR产生的。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中用于MGMT的CRISPR crRNA包括SEQID NO:1-2，用于IDH1的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:3-4，并且用于IDH2的CRISPR crRNA包括SEQ ID NO:5-6。
18.根据权利要求11到15中任一项所述的方法，其包括修饰所述所关注区域的游离末端以辅助测序衔接子的连接。
19.根据权利要求18所述的方法，其包括将一个或多个测序衔接子分子连接到所述一个或多个所关注区域；以及对所述所关注区域进行测序。
20.根据权利要求19所述的方法，其中使用纳米孔测序。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗剂是TMZ。
22.根据权利要求11所述的方法，其中确定所述受试者具有应答性。
23.根据权利要求22所述的方法，其中向所述受试者施用所述治疗剂。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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