CN114512183B - 一种预测met基因扩增或多倍体的方法及装置 - Google Patents

一种预测met基因扩增或多倍体的方法及装置 Download PDF

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Abstract

一种预测MET基因扩增或多倍体的方法及装置，该方法包括：基因拷贝数变异分析步骤，包括对待测样本测序数据中的捕获区域和非捕获区域进行基因拷贝数变异分析，获得捕获区域、非捕获区域的拷贝数变异检测结果；捕获区域检测步骤；非捕获区域检测步骤；预测步骤，预测待测样本是否存在MET基因扩增或多倍体。本发明有效利测序数据中的低深度非捕获区域的信息，该方法与传统FISH检测在MET基因扩增与polysomy的鉴别上有良好的一致性。

Description

一种预测MET基因扩增或多倍体的方法及装置
技术领域
本发明涉及生物信息学领域，具体涉及一种预测MET基因扩增或多倍体的方法及装置。
背景技术
MET基因位于7号染色体长臂(7q21-q31)，长约125kb，包含21个外显。MET基因编码产生酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)，为肝细胞生长因子(HGF)受体，具有酪氨酸激酶活性，主要表达于上皮细胞。c-Met的配体HGF属于纤维蛋白溶酶原家族，主要表达于***，也可以在肿瘤细胞中表达，并通过自分泌发挥作用。c-Met广泛表达于多种人体正常组织中，在细胞代谢、分化及死亡的信号传导过程中起着重要的作用，其与配体结合，发生二聚化、磷酸化，继而激活下游，如PI3K-Akt、Ras-MAPK、STAT和Wnt/β-catenin等信号通路，进而促进细胞增殖、存活、迁移、运动、侵袭、血管生成及上皮细胞向***的转变，参与胚胎发育、组织损伤修复及肿瘤的发生和发展。
中国人群中肺癌高发，非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌种类，MET基因是癌症的驱动基因之一，HGF/c-Met信号通路异常再肿瘤的发生及转移中起着至关重要的作用。HG F/c-Met通路失调的机制包括：基因突变、扩增、重排和蛋白过表达。NSCLC中，MET基因异常主要表现为14号外显子跳跃和扩增，MET基因扩增也是EGFR抑制剂(TKIs)治疗继发性耐药机制之一。MET基因扩增通过激活EGFR非依赖性ErbB3磷酸化，进而激活PI3K/AKT通路，引起EGFR-TKI的旁路耐药。
MET基因的拷贝数增加的方式有两种：基因的局部扩增和染色体多倍体。染色体复制异常等原因，会导致肿瘤细胞中存在多个7号染色体拷贝，产生多倍体。真正的扩增是发生在基因局部区域，通过如断裂-融合-桥接(breakage-fusion-bridge)机制产生。不同于多倍体，扩增被认为才能真实反映自然选择下驱动肿瘤发生的c-Met激活状态1。
基于荧光原位杂交(FISH)的方法
MET基因扩增是肿瘤发生的驱动因素。由于入组条件、检测方法及阳性阈值的差异，NSCLC中原发性MET基因扩增的比例在1-5％1。2016年，Sinéad A.Noonan等为了准确地鉴别出MET基因扩增驱动发生的NSCLC，使用FISH方法评价NSCLC患者的MET基因状态，基于驱动突变的发生通常都是互斥这一事实，进行驱动癌症发生基因的重叠分析2。使用的MET基因状态的阳性阈值包括MET拷贝数低(≥5且<6)、中(≥6且<7)及高(≥7)，以及MET与7号染色体着丝粒(CEP7)拷贝数的比值(MET/CEP7)低(≥1.8且≤2.2)、中(>2.2且<5)及高(≥5)。NSCLC患者中，MET拷贝数≥5的患者比例为14％(99/686)，MET/CEP7比值≥1.8的患者比例为4.5％(52/1164)。56％的MET拷贝数≥5的患者及47％的MET/CEP7比值≥1.8的患者中，同时检出其他驱动突变，包括EGFR、KRAS、ALK、ERBB2、BRAF、NRAS、ROS1及RET变异，表明部分MET拷贝数≥5或MET/CEP7比值≥1.8患者并未发生MET基因扩增。同时检出其他驱动突变的比例，在MET拷贝数状态为低、中、高的患者中分别为62％(32/52)、63％(12/19)及41％(11/27)，MET/CEP7比值分类为低、中及高的患者中分别为52％(15/29)、50％(9/18)及0％(0/4)。
EGFR突变阳性的NSCLC中，MET激活能够介导EGFR-TKI的原发和继发性耐药。2019年，Gillianne G.Y.Lai等使用FISH方法检测200例EGFR突变阳性的初诊患者的MET基因状态，MET拷贝数≥5为MET拷贝数增加(MET-high)，同时MET/CEP7比值≥2为MET基因扩增，MET/CEP7比值<2为多倍体(polysomy)，通过Kaplan-Meier方法和log-rank te st检验比较MET-high和MET-low患者的EGFR-TIK失效时间(TTF)3。200例患者中，MET-high占比为26％，包括23％的多倍体和3％的扩增。MET-high与MET-low的中位TTF分别为12.2和13.1个月，无显著差异(p＝0.566)。3.2％的EGFR阳性且MET基因扩增的患者对EGFR-TKI反应不佳，TTF为1～6.4个月。
基于靶向捕获NGS的方法
TATTON(A Multi-arm,Phase Ib,Open-Label,Multicentre Study to Assessthe Safety,Tolerability,Pharmacokinetics and Preliminary Anti-tumour Activityof AZD9291 in Combinat ion With Ascending Doses of Novel Therapeutics inPatients With EGFRm+Advanced NS CLC Who Have Progressed Following TherapyWith an EGFR TKI)是一个开放性、多中心Ib期临床研究(NCT02143466)4。在该研究中，同时使用FISH和NGS的方法来检测MET状态，NGS方法使用的是Fundation Medicine的检测方法。FISH方法判读规则如下：MET/CE P7比值≥2为MET基因扩增，MET拷贝数≥2且MET/CEP7比值<2为polysomy。95例同时进行FISH和NGS检测的组织样本中，以FISH结果为基准，NGS鉴别为MET基因扩增的阳性符合率(PPA，Positive percent agreement)为88％，阳性预测值(PPV，Positive predictivevalue)为96％，阴性预测值(NPV，Negative predictivevalue)为94％，鉴别polysomy的PPA为4％，PPV为50％，NPV为68％。25例NGS结果为MET阴性样本，FISH结果为阳性，包括3例MET基因扩增和22例polysomy。1例FISH结果为阴性，NGS结果为阳性。
基于FISH的传统方法如下：使用FISH方法同时检测MET基因和7号染色体着丝粒的拷贝数，以7号染色体着丝粒拷贝数代表7号染色体的拷贝数。MET/CEP7比值较低时，表明MET拷贝数增加是染色体polysomy造成的。
基于靶向捕获NGS的方法如下：使用基于靶向捕获的方法检测MET基因及7号染色体上其它区域的CNV，进行扩增和polysomy的区分。
基于FISH的传统方法存在的缺陷包括：只能单独进行MET状态的判断，不适用于需要同时检测其它基因变异的应用场景。无论是驱动癌症发生，还是作为耐药机制，MET基因扩增都不是唯一的原因，因此在这些应用场景下进行MET基因扩增检测均伴随着其它基因突变类型的检测需求。
在TATTON临床研究中，Fundation Medicine方法对于polysomy鉴别的PPA为4％，PP V为50％，NPA为68％。
现有的基于靶向捕获NGS的方法存在的缺陷包括：只利用了捕获区域的数据，该区域只占7号染色体长臂的一小部分。并且，未提供多倍体鉴别的性能。polysomy的检测性能较低，PPA、PPV和NPV均较低。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种预测MET基因扩增或多倍体(polysomy)的方法，包括：
基因拷贝数变异分析步骤，包括对待测样本测序数据中的捕获区域和非捕获区域进行基因拷贝数变异分析，获得捕获区域、非捕获区域的拷贝数变异检测结果；
捕获区域检测步骤，包括根据捕获区域的拷贝数变异检测结果计算MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例；
非捕获区域检测步骤，包括根据非捕获区域的拷贝数变异检测结果，查找包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，获得查找到的所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例；
预测步骤，包括根据非捕获区域检测步骤获得的所述查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例，结合捕获区域检测步骤获得的MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例，预测待测样本是否存在MET基因扩增或多倍体。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种预测MET基因扩增或多倍体的装置，包括：
基因拷贝数变异分析模块，用于对待测样本测序数据中的捕获区域和非捕获区域进行基因拷贝数变异分析，获得捕获区域、非捕获区域的拷贝数变异检测结果；
捕获区域检测模块，用于根据捕获区域的拷贝数变异检测结果计算MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例；
非捕获区域检模块，用于根据非捕获区域的拷贝数变异检测结果，查找包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，获得查找到的所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例；
预测模块，用于根据非捕获区域检测模块获得的所述查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例，结合捕获区域检测模块的MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例，预测待测样本是否存在MET基因扩增或多倍体。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面所述的方法。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面所述的方法。
依据上述实施例的一种预测MET基因扩增或多倍体的方法及装置，本发明有效利测序数据中的低深度非捕获区域的信息，实现对MET基因扩增或多倍体的预测。
在一实施例中，本发明的方法与传统FISH检测在MET基因扩增与polysomy的鉴别上有良好的一致性。
附图说明
图1为一种实施例中基于靶向捕获NGS的MET基因扩增与polysomy鉴别流程图。
图2为一种实施例中MET基因扩增与polysomy鉴别算法流程图。
图3.1、图3.2、图3.3、图3.4为MET基因扩增与polysomy鉴别结果拷贝数变异(CNV)例图。
图4为155例EGFR阳性NSCLC初诊患者MET变异的检出情况。
图5为691例NSCLC患者MET基因扩增、泛MET基因扩增及polysomy的检出比例。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
如本文所用，“polysomy”(亦称多倍体)是指肿瘤细胞中存在多个7号染色体拷贝，产生多倍体。
如本文所用，CNV全称是Copy number variations，即基因拷贝数变异。
如本文所用，“7q”是指7号染色体长臂。
如本文所用，“7q32.1染色带”是指7号染色体长臂上编号为32.1的区域，32.1为染色带的编号。染色带为染色体上的一部分区域。
间质表皮转化因子(Mesenchymal to epithelial transition factor，简称MET)蛋白作为一种受体酪氨酸激酶，存在于上皮细胞中，能够参与很多生物学功能，位于人类第7条染色体(7q21～q31)区域，长约125kb，其中包含21个外显子以及20个内含子。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种预测MET基因扩增或多倍体(polysomy)的方法，包括：
基因拷贝数变异分析步骤，包括对待测样本测序数据中的捕获区域和非捕获区域进行基因拷贝数变异分析，获得捕获区域、非捕获区域的拷贝数变异检测结果；
捕获区域检测步骤，包括根据捕获区域的拷贝数变异检测结果计算MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例；
非捕获区域检测步骤，包括根据非捕获区域的拷贝数变异检测结果，查找包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，获得查找到的所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例；
预测步骤，包括根据非捕获区域检测步骤获得的所述查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例，结合捕获区域检测步骤获得的MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例，预测待测样本是否存在MET基因扩增或多倍体。
在一实施例中，捕获区域检测步骤中，如果MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数>第一阈值，且MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例>第二阈值，则预测存在MET基因拷贝数增加。
在一实施例中，捕获区域检测步骤中，所述比例包括但不限于百分比。
在一实施例中，捕获区域检测步骤中，第一阈值可以为3.2。
在一实施例中，捕获区域检测步骤中，第二阈值可以为90％。
在一实施例中，非捕获区域检测步骤包括：
t检验步骤，包括对7q上所有染色带两两进行非捕获区域拷贝数变异值的t检验，获得t检验结果；
合并步骤，包括根据t检验结果，合并相似连续染色带区域；
平均拷贝数及比例计算步骤，包括计算得到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例。
在一实施例中，合并步骤中，包括根据t检验结果，获得拷贝数值无显著差异的连续染色带集合，分析任意相邻两个连续染色带区域，如果较小的区域与较大区域中的染色带无显著差异的比例>第三阈值；或，较大区域染色带数目超过第四阈值，且较小的区域与较大区域中的染色带无显著差异的比例>第五阈值；此时，合并两个相邻区域，获得更大的区域。
在一实施例中，合并步骤中，所述比例包括但不限于百分比。
在一实施例中，合并步骤中，拷贝数值无显著差异的判断条件为：连续染色带中所有染色带两两之间p值≥第六阈值。
在一实施例中，合并步骤中，所述第三阈值可以为50％。
在一实施例中，合并步骤中，所述第四阈值可以为7。
在一实施例中，合并步骤中，所述第五阈值可以为30％。
在一实施例中，合并步骤中，所述第六阈值可以为0.1。
在一实施例中，平均拷贝数及比例计算步骤中，如果查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数>第七阈值，则预测存在包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域。
在一实施例中，平均拷贝数及比例计算步骤中，所述第七阈值可以为2.3。
在一实施例中，预测步骤中，如果MET基因拷贝数增加且未查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域；或，查找到的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例<第八阈值，则预测待测样本存在MET基因扩增(亦称MET扩增)；
如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，且包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例>第八阈值，则预测待测样本可能存在MET基因扩增或多倍体，即待测样本存在泛MET基因扩增(亦称泛MET扩增)；
如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，且包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例>第九阈值，则预测待测样本存在多倍体(亦称polysomy)。
在一实施例中，预测步骤中，所述第八阈值可以为10％。
在一实施例中，预测步骤中，所述第九阈值可以为80％。
在一实施例中，基因拷贝数变异分析步骤中，进行基因拷贝数变异分析时，使用对照样本测序数据构建基线。
在一实施例中，基因拷贝数变异分析步骤中，进行基因拷贝数变异分析时，使用参数为捕获区域平均bin大小为120bp，非捕获区域平均bin大小为150kb，其余参数为默认参数，进行MET基因拷贝数变异分析。
将所有的区域划分为等长的区间，1个区间称为1个bin。
在一实施例中，基因拷贝数变异分析步骤中，所述待测样本测序数据为捕获区间包含MET基因全CDS(Coding sequence，编码蛋白质产物的序列)区域的捕获测序数据。
在一实施例中，基因拷贝数变异分析步骤中，所述对照样本包括但不限于白细胞样本、癌症的正常组织样本中的至少一种。
在一实施例中，基因拷贝数变异分析步骤中，所述测序数据为二代测序(NGS，Next-ge neration sequencing technology)数据。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种预测MET基因扩增或多倍体的装置，包括：
基因拷贝数变异分析模块，用于对待测样本测序数据中的捕获区域和非捕获区域进行基因拷贝数变异分析，获得捕获区域、非捕获区域的拷贝数变异检测结果；
捕获区域检测模块，用于根据捕获区域的拷贝数变异检测结果计算MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例；
非捕获区域检模块，用于根据非捕获区域的拷贝数变异检测结果，查找包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，获得查找到的所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例；
预测模块，用于根据非捕获区域检测模块获得的所述查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例，结合捕获区域检测模块的MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例，预测待测样本是否存在MET基因扩增或多倍体。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面所述的方法。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面所述的方法。
在一实施例中，本发明旨在提供一种基于靶向捕获NGS技术进行MET基因扩增及METpolysomy鉴别的方法，该方法适用于现在MET基因扩增检测的癌症发生的驱动因素及耐药的应用场景，可以同时进行MET基因扩增与polysomy鉴别和其它基因突变的检测。
在一实施例中，如图1、图2所示，提供一种基于靶向捕获NGS鉴别MET基因扩增与polysomy的方法，该方法能够在检测MET拷贝数的情况下，进一步通过7号染色体长臂(7q)非捕获区域的拷贝数结果，鉴别是MET基因扩增还是polysomy。
在一实施例中，基于靶向捕获NGS鉴别MET基因扩增与polysomy的方法包括如下步骤：
(1)对靶向捕获测序的样本进行拷贝数变异(CNV)分析。对探针捕获区域及非捕获区域进行分析，捕获区域包含MET基因全编码(CDS)区，其它区域不做限制。
(2)对捕获区域的MET的CNV结果进行分析。使用一批样本同时进行靶向捕获NGS测序及FISH检测，根据FISH检测结果的MET拷贝数确定NGS的MET基因拷贝数增加的阳性条件。
(3)对非捕获区域的7q的CNV结果进行分析。对染色带之间的非捕获区域CNV结果进行统计学检验(t检验)，检验对象为染色带中包含的非捕获区域CNV值，基于染色带CNV差异p值的比较矩阵。根据比较矩阵寻找包含MET基因所在染色带(7q31.2)的CNV值无显著差异的最大区域，并计算该区域的CNV值及占7q的比例。使用一批样本同时进行靶向捕获NGS测序及FISH检测，根据FISH检测结果的CEP7拷贝数确定NGS的polysomy阳性条件。
(4)MET基因扩增与polysomy鉴别。使用一批样本同时进行靶向捕获NGS测序及FISH检测，根据FISH检测结果，结合MET基因及CEP7拷贝数，确定基于靶向捕获NGS的ME T基因扩增与polysomy的判断条件，结果示例拷贝数变异(CNV)图见图3。
在一实施例中，本发明在靶向捕获NGS的基础上进行MET基因扩增与polysomy的鉴别。
在一实施例中，本发明进行靶向捕获测序时只需要包括MET基因的区域，其余区域不做限定。
在一实施例中，本发明有效利用的是靶向捕获NGS中的低深度非捕获区域的信息。
在一实施例中，本发明的方法与传统FISH检测在MET基因扩增与polysomy的鉴别上有良好的一致性，详见实施例1。
在一实施例中，本发明的方法在EGFR阳性NSCLC初诊患者组中检出比例与文献报道一致，详见实施例2。
在一实施例中，本发明的方法适用于基于靶向捕获NGS的MET基因扩增相关的用药基因变异检测和耐药相关的疗效检测应用场景，详见实施例1和实施例2。
实施例1
本实施例提供FISH与靶向捕获NGS进行MET基因扩增与polysomy鉴别结果一致性比较。
采集42例NSCLC患者肿瘤组织，一部分组织进行MET基因和CEP7的FISH检测，一部分组织进行靶向捕获NGS测序。
靶向捕获NGS测序
1、DNA提取
按照QIAamp DNA Mini Kit提取试剂说明书，对肿瘤组织样本进行DNA的提取。然后采用Qubit定量，要求DNA大于100ng。
2、DNA片段化
2.1使用超声波打断将DNA片段化，片段化后使用倍磁珠对其进行纯化。用Qubit荧光定量仪(
Figure GDA0003597229300000081
dsDNA HS Assay Kit)对片段化纯化产物进行定量，使得产物浓度高于2ng/μL。如若得到的浓度低于2ng/μL，NC-PCR由10个循环改为12个循环；用Agilent2100Bioanalyzer检测产物的长度分布范围，DNA片段主带在200～250bp左右。
2.2DNA片段化后纯化：将接头连接后的样本使用磁珠进行纯化，具体如下：(1)提前30min取出磁珠置于室温，使用前充分振荡混匀；(2)吸取相应体积磁珠至1.5mL离心管中，再将产物转至磁珠中，用移液器轻轻吹打混匀，室温下孵育10min，使磁珠与DNA片段充分结合，孵育期间配制80％乙醇；(4)孵育结束后，将1.5mL离心管置于磁力架上，静置10～20min(视磁珠量而定)，直至液体澄清，弃上清；(5)保持1.5mL离心管固定于磁力架上，加入新鲜配制的80％乙醇，用量足够淹没磁珠即可(本实施例具体为500μL)，弃上清；(5)重复步骤(4)一次，尽量吸干管底液体；(6)将1.5mL离心管打开盖子置于37℃金属浴上加热烘干，至磁珠表面不反光后取下；(7)向1.5mL离心管中加入溶解液，移液器吹打混匀，室温下孵育5min，使DNA片段充分溶解在DNA 溶解液中；(8)将1.5mL离心管置于磁力架上至液体完全澄清；(9)吸取上清到新的1.5mL离心管中，弃去带磁珠的1.5mL离心管。
3、文库构建
3.1末端修复及加“A”：(1)向片段化产物中加入末端修复反应液和末端修复反应酶，振荡混匀并离心；(2)在恒温混匀仪或PCR仪上孵育：20℃，30min；65℃，30min；(3)孵育完成后，降至室温，使用掌式离心机短暂离心。
3.2接头连接：取出连接酶以及接头。将接头置于室温溶解，连接酶置于冰盒上。使用前将接头和连接酶反应液充分振荡混匀并短暂离心。
3.3接头连接后纯化：同DNA片段化后纯化步骤，即步骤2.2。
3.4杂交捕获前PCR富集(Non-C-PCR)：(1)取出对应编号的样本特异的条形码序列(In dex，用于区分样本)，置于室温溶解，充分振荡混匀并离心；(2)从冰箱中取出DNA聚合酶反应液，置于4℃冰箱溶解后，轻轻振荡混匀并离心，置于冰盒上；(3)在PCR管中加入反应组分振荡混匀并离心。(4)将上述PCR管置于PCR仪上进PCR。
3.5Non-C-PCR产物纯化：PCR后的样本使用磁珠进行纯化。
3.6DNA片段化后操作：同接头连接后纯化步骤，即步骤3.3。
3.7文库质控：用Qubit荧光定量仪(
Figure GDA0003597229300000091
dsDNA BR Assay Kit)对产物进行定量，并对产物的长度分布范围进行定量，使文库浓度总量≥20ng/μL，且无接头及大片段污染。
4、靶序列捕获
4.1杂交捕获：文库质控合格后，进行1021panel探针(探针覆盖的区域参见公开号为CN109427412A的中国专利《用于检测肿瘤突变负荷的序列组合和其设计方法》说明书第66～90段，公开日为2019年3月5日)捕获，该探针包含MET全CDS区域，参照探针制造商(IDT)提供的说明书进行杂交捕获。最后洗脱回溶20μL ddH2O带杂交洗脱磁珠。
4.2洗脱产物扩增富集(LM-PCR)：(1)从冰箱中取出DNA聚合酶反应液及引物，置于室温溶解后，充分振荡混匀并离心；(2)按照说明书加入PCR反应液，再加入全部带磁珠B的洗脱产物，吹打混匀；(3)将上述PCR管置于PCR仪上，进行扩增反应；(4)PCR后的样本使用磁珠进行纯化。
4.3洗脱文库质控：用Qubit荧光定量仪(
Figure GDA0003597229300000092
dsDNA BR Assay Kit)对产物进行定量，并对产物的长度分布范围进行定量，使文库浓度≥8ng/μL，且无接头及大片段污染。
5、上机测序：采用Gene+seq测序仪(亦可使用同原理的其他测序仪)进行上机PE100测序，上机数据量为5G。测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。
6、信息分析
如图1所示为基于靶向捕获NGS的MET基因扩增与polysomy鉴别流程图，信息分析流程的具体步骤如下：
6.1原始下机数据处理：将截取下机原始数据的接头，并过滤低质量reads。
6.2参考基因组比对：参考序列为GRCh37，使用bwa(版本号：0.7.17-r1188)进行序列比对，参数为默认参数。
6.3去掉PCR重复reads：使用Picard(版本号：1.98)去掉原始比对reads中的PCR重复reads。
6.4INDEL重比对和碱基质量矫正：使用GATK的RealignerTargetCreator进行INDEL附近序列的局部重新比对，降低INDEL附近的比对错误率。使用GATK的BaseRecalibrator和PrintReads对bam文件里reads的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件中reads中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率，并将质量矫正后的reads重新输出。
6.5样本质控：(1)测序深度≥200X；(2)≥98％exons的coverage≥100X；(3)Mapping rate≥95％。
6.6CNV分析：使用cnvkit(https://github.com/etal/cnvkit)进行样本捕获和非捕获区域的CNV分析。使用同批次测序的其他白细胞样本构建基线，使用参数为捕获区域平均bin大小为120bp，非捕获区域平均bin大小为150kb，其余参数为默认参数，进行CNV分析。
非捕获区域是指靶向捕获测序区间外的其他参考基因组区间。
将一个区域划分成多个等长的区间，其中每个区间称为bin。
6.7MET基因扩增与polysomy鉴别，图1所示为流程图，具体步骤如下：
(1)根据捕获区域的MET基因拷贝数变异检测结果，计算MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的百分比，如果MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数>3.2，且MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的百分比>90％时，则预测MET基因拷贝数增加。
(2)利用非捕获区域的拷贝数变异检测结果，查找包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，图2所示为MET基因扩增与polysomy鉴别算法流程图，具体步骤如下：
a.对7q上所有染色带两两进行非捕获区域CNV值的t检验。
b.根据t检验结果，获得拷贝数(CNV)值无显著差异的连续染色带集合，条件为连续染色带中所有染色带两两之间p值≥0.1；合并相似连续染色带区域，分析任意相邻两个连续染色带区域，当较小的区域与较大区域中的染色带无显著差异的占比>50％，或较大区域染色带超过7个且较小的区域与较大区域中的染色带无显著差异的占比>30％，此时，合并两个相邻区域为一个更大区域。以区域中包含的染色带数量来定义小，基本原则是小区域并入大区域。
c.根据非捕获区域的拷贝数变异检测结果，包括包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例，如果查找到的拷贝数值无显著差异，且包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数>2.3，则预测为区域拷贝数增加，即存在包含7q32.1染色带的拷贝数扩增区域。包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例用于后续步骤(3)，即用于鉴别MET基因扩增与pol ysomy。
(3)鉴别MET基因扩增与polysomy：如果MET基因拷贝数增加且未查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，或查找到拷贝数增加区域的长度占7q长度的百分比<10％，则预测为MET基因扩增；如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域且占7q长度的比例>10％，则可能为MET基因扩增，也可能为polysomy，即预测为泛MET基因扩增；如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，且包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例>80％，则预测为polysomy。
图3.1、图3.2、图3.3、图3.4为MET基因扩增与polysomy鉴别结果拷贝数变异(CNV)例图。
6.8进行42例样本的FISH检测。得到MET和CEP7的拷贝数，如果MET拷贝数≥5，同时MET/CEP7≥2，则预测为MET基因扩增；如果MET拷贝数≥5，同时MET/CEP7<2，则预测为polysomy。
6.9靶向捕获NGS与FISH检测结果比较：
(1)FISH检测结果，42例样本，12例MET基因扩增，7例polysomy，23例阴性。
FISH方法的原理参考如下文献：Florijn RJ,Bonden La Fau-Vrolijk H,VrolijkH Fau-Wiegant J,Wiegant J Fau-Vaandrager JW,Vaandrager Jw Fau-Baas F,Baas FFau-den Dunnen JT,et al.High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNAmapping and co lour bar-coding of large genes.Human Molecular Genetics.1995；4(5):831-6.
FISH检测MET基因扩增和polysomy的方法参见文末的参考文献3。
(2)靶向捕获NGS检测结果：12例FISH结果为MET基因扩增的样本中，2例的靶向捕获NGS检测结果为泛MET基因扩增，9例的靶向捕获NGS检测结果为MET基因扩增，1例为阴性；7例FISH结果为polysomy的样本中，1例的靶向捕获NGS检测结果为泛MET基因扩增，5例的靶向捕获NGS检测结果为polysomy，1例的靶向捕获NGS检测结果为阴性；23例FISH结果为阴性的样本中，22例的靶向捕获NGS检测结果为阴性，1例的靶向捕获NGS检测结果为polysomy。
(3)靶向捕获NGS与FISH检测结果一致性比较：以FISH检测结果为基准，靶向捕获NGS检测MET基因扩增的阳性符合率(PPA，Positive percent agreement)为92％，阳性预测值(PPV,Positive predictive value)为100％，阴性预测值(NPV,Negative predictivevalue)为96％，检测polysomy的PPA为86％，PPV为86％，NPV为96％。针对FISH结果为MET基因扩增或polysomy的样本，靶向捕获NGS检测为泛MET基因扩增时，认为FISH检测和靶向捕获NGS检测结果是一致的。
实施例2
初诊NSCLC初诊EGFR阳性患者EGFR-TKI用药指导
初诊NSCLC患者进行靶向捕获NGS测序，155例患者EGFR阳性，进一步进行MET基因扩增、泛MET基因扩增、polysomy和阴性的鉴别。
对155例患者的组织样本进行靶向捕获NGS检测：DNA提取、DNA片段化、文库构建、靶序列捕获、上机测序、信息分析同实施例1。
EGFR变异检测：(1)使用realDecaller5和Mutect2检测体细胞突变和造血克隆突变，使用GATK的SelectVariants检测胚系突变。(2)使用NCanno对原始变异检出突变进行注释，包括突变信息和外部数据库ESP、GAD、EXAC、1000Genomes和GenomesAD等。(2)过滤胚系突变，保留位于CDS区域，非同义，突变频率>3％的突变。
检测结果：结果见图4，155例EGFR阳性NSCLC患者在初诊时，MET基因扩增的检出比例为1％(1/155)，泛MET基因扩增检出比例为3％(4/155)，polysomy检出比例为19％(70/155)，结果符合文献报道数据2。
实施例3
NSCLC患者组的MET基因扩增、泛MET基因扩增、polysomy的检出情况
非小细胞肺癌患者，总计691例，进行靶向捕获NGS测序，进行基于靶向捕获NGS的MET基因扩增与polysomy鉴别。
对691例患者的组织样本进行靶向捕获NGS检测：DNA提取、DNA片段化、文库构建、靶序列捕获、上机测序、信息分析同实施例1。
检测结果：结果见图5，691例非小细胞肺癌患者人群中，MET基因扩增的检出比例为2％(15/691)，泛MET基因扩增检出比例为3％(20/691)，polysomy检出比例为19％(233/691)。可见，本实施例的方法在非小细胞肺癌的患者人群中的检出率和文献报道的检测结果基本一致，说明本实施例的方法可有效检测MET基因扩增和多倍体。
本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的***进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。
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以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (18)

1.一种预测MET基因扩增或多倍体的方法，其特征在于，包括：
基因拷贝数变异分析步骤，包括对待测样本测序数据中的捕获区域和非捕获区域进行基因拷贝数变异分析，获得捕获区域、非捕获区域的拷贝数变异检测结果；
捕获区域检测步骤，包括根据捕获区域的拷贝数变异检测结果计算MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例；如果MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数>第一阈值，且MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例>第二阈值，则预测存在MET基因拷贝数增加；
非捕获区域检测步骤，包括根据非捕获区域的拷贝数变异检测结果，查找包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，获得查找到的所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例；
预测步骤，包括根据非捕获区域检测步骤获得的所述查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例，结合捕获区域检测步骤获得的MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例，预测待测样本是否存在MET基因扩增或多倍体；
如果MET基因拷贝数增加且未查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域；或，查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例<第八阈值，则预测待测样本存在MET基因扩增；
如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，且包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例>第八阈值，则预测待测样本可能存在MET基因扩增或多倍体，即待测样本存在泛MET基因扩增；
如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，且所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例>第九阈值，则预测待测样本存在多倍体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，捕获区域检测步骤中，所述比例包括百分比；
捕获区域检测步骤中，所述第一阈值为3.2；
捕获区域检测步骤中，所述第二阈值为90%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，非捕获区域检测步骤包括：
t检验步骤，包括对7q上所有染色带两两进行非捕获区域拷贝数变异值的t检验，获得t检验结果；
合并步骤，包括根据t检验结果，合并相似连续染色带区域；具体包括根据t检验结果，获得拷贝数值无显著差异的连续染色带集合，分析任意相邻两个连续染色带区域，如果较小的区域与较大区域中的染色带无显著差异的比例>第三阈值；或，较大区域染色带数目超过第四阈值，且较小的区域与较大区域中的染色带无显著差异的比例>第五阈值；此时，合并两个相邻区域，获得更大的区域；
平均拷贝数及比例计算步骤，包括计算得到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，合并步骤中，所述比例包括百分比。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，合并步骤中，拷贝数值无显著差异的判断条件为：连续染色带中所有染色带两两之前间p值≥第六阈值。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，合并步骤中，所述第三阈值为50%；
合并步骤中，所述第四阈值为7；
合并步骤中，所述第五阈值为30%。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，合并步骤中，所述第六阈值为0.1。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，平均拷贝数及比例计算步骤中，如果查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数>第七阈值，则预测存在包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，平均拷贝数及比例计算步骤中，所述第七阈值为2.3。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，预测步骤中，所述第八阈值为10%；
预测步骤中，所述第九阈值为80%。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基因拷贝数变异分析步骤中，进行基因拷贝数变异分析时，使用对照样本测序数据构建基线。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基因拷贝数变异分析步骤中，进行基因拷贝数变异分析时，使用参数为捕获区域平均bin大小为120 bp，非捕获区域平均bin大小为150kb，其余参数为默认参数，进行MET基因拷贝数变异分析。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基因拷贝数变异分析步骤中，所述待测样本测序数据为捕获区间包含MET基因全CDS区域的靶向捕获测序数据。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，基因拷贝数变异分析步骤中，所述对照样本包括白细胞样本。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基因拷贝数变异分析步骤中，所述测序数据为二代测序数据。
16.一种预测MET基因扩增或多倍体的装置，其特征在于，包括：
基因拷贝数变异分析模块，用于对待测样本测序数据中的捕获区域和非捕获区域进行基因拷贝数变异分析，获得捕获区域、非捕获区域的拷贝数变异检测结果；
捕获区域检测模块，用于根据捕获区域的拷贝数变异检测结果计算MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例；如果MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数>第一阈值，且MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例>第二阈值，则预测存在MET基因拷贝数增加；
非捕获区域检模块，用于根据非捕获区域的拷贝数变异检测结果，查找包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，获得查找到的所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例；
预测模块，用于根据非捕获区域检测模块获得的所述查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例，结合捕获区域检测模块的MET基因拷贝数增加区域的平均拷贝数，以及MET基因拷贝数增加区域的长度占MET基因全CDS长度的比例，预测待测样本是否存在MET基因扩增或多倍体；
如果MET基因拷贝数增加且未查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域；或，查找到的包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例<第八阈值，则预测待测样本存在MET基因扩增；
如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，且包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例>第八阈值，则预测待测样本可能存在MET基因扩增或多倍体，即待测样本存在泛MET基因扩增；
如果查找到包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域，且所述包含7q32.1染色带的拷贝数增加区域的长度占7q长度的比例>第九阈值，则预测待测样本存在多倍体。
17.一种预测MET基因扩增或多倍体的装置，其特征在于，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如权利要求1~15任意一项所述的方法。
18.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如权利要求1~15任意一项所述的方法。
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