CN114507720A - 结核杆菌耐药基因位点、引物组及其基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法 - Google Patents

结核杆菌耐药基因位点、引物组及其基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法 Download PDF

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赵开顺
徐军
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Abstract

本发明涉及结核杆菌的耐药点位及其检测方法。结核杆菌耐药基因位点、引物组及其基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法，包括设计覆盖如rpoB、inhA、katG、eis、rrs、gyrB及gyrA耐药位点的扩增引物和如rpoB、inhA、katG、eis、rrs、gyrB及gyrA耐药位点的延伸引物；制备核酸模板，配置对应的延伸混合反应液，进行PCR扩增反应，获得目的产物；SAP酶消化反应和延伸反应：得到的延伸扩增产物经脱盐处理后进行点样并使用质谱仪的分析软件进行分析。本发明通量较高，灵活性较好，易于实现，性价比高。

Description

结核杆菌耐药基因位点、引物组及其基于MassARRAY核酸质谱 平台的检测方法
技术领域
本发明涉及结核杆菌耐药性，尤其涉及结核杆菌的耐药点位及其检测方法。
背景技术
结核病是世界十大死亡原因之一，中国结核病患者数量高居世界第三，仅次于印度和印度尼西亚。结核病的耐药是指结核病原菌在生长中产生了对结核药物的对抗作用，使得部分患者在接受药物治疗的过程中产生了耐药性，陷入治疗的困境。虽然结核耐药的治疗在近些年有了较大的进步，但仍有大约5.7％的新发和25.6％的已治疗结核病病例患有多耐药(multi drug-resistant，MDR)结核病。
目前耐药结核病的诊断主要包含以下3种方法：
传统的培养药敏测试
此方法可信度较高，成本低，较易推广，被称为诊断结核耐药的“金标准”，但是需要数周的培养检测周期，时间较长，不能提供实时有效的结果，耽误患者的治疗时间。
Sanger测序技术
该方法准确度较高，但只能针对某个样本的部分序列进行检测，效率较低，成本较高。
二代测序技术
二代测序技术检测结核耐药具有灵敏度高，可重复利用测序数据分析等有点，但受限于成本较高，不易上手等因素，在一些资源有限的地区得不到推广。
发明内容
本发明旨在解决现有技术的缺陷，提供一种结核杆菌耐药基因位点、引物组及其基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法。本发明通量较高，灵活性较好，易于实现，性价比高。
本发明是这样实现的，一种用于检测结核杆菌耐药基因及位点，所述基因及位点如下：
rpoB：CAG-482-CAA、CTG-511-CCG、CAA-513-AAA、CAA-513-CTA、 CAA-513-CCA、CAA-513-CCT、CAA-513-CCC、GAC-516-TAC、GAC-516-GTC、 GAC-516-GGC、TCG-522-CCG、TCG-522-TTG、TCG-522-TAG、CAC-526-AAC、 CAC-526-TAC、CAC-526-GAC、CAC-526-CTC、CAC-526-CCC、CAC-526-CGC、 CAC-526-TGC、TCG-531-CCG、TCG-531-TAG、TCG-531-TTG、TCG-531-TGG、TCG-531-TCC、TCG-531-TCT、TCG-531-TTT、CTG-533-CCG、ATC-572-TTC、 ATC-572-CTC；
inhA：C(-15)T、T(-8)C、T(-8)A；
katG：AGC-315-ACC、AGC-315-AAC；
eis：C(-37)T、C(-14)T、G(-10)A；
rrs：C(1300)T、G(1321)A、A(1401)G；
gyrB：GAC-500-CAC、GAC-500-AAC、AAC-538-ACC、GAA-540-GAT；gyrA： GCC-74-TCC、GCG-90-GTG、TCG-91-CCG、GAC-94-AGC、GAC-94-TGC、 GAC-94-GGC、GAC-94-GCC、GAC-94-AAC、GAC-94-CAC、GAC-94-TAC。
基于所述的用于检测结核杆菌耐药基因位点的引物组，它包括：
rpoB基因533位点(rpoB-533)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:1 上游引物，SEQ ID NO:2下游引物和SEQ ID NO:67延伸引物；
gyrA基因90位点(gyrA-90)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:3 上游引物，SEQ ID NO:4下游引物和SEQ ID NO:68延伸引物；
rpoB基因511位点(rpoB-511)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:5 上游引物，SEQ ID NO:6下游引物和SEQ ID NO:69延伸引物；
rpoB基因513位点(rpoB-513-1)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:7 上游引物，SEQ ID NO:8下游引物和SEQ ID NO:70延伸引物；
rpoB基因482位点(rpoB-482)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:9 上游引物，SEQ ID NO:10下游引物和SEQ ID NO:71延伸引物；
rrs基因1321位点(rrs-1321)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:11 上游引物，SEQ ID NO:12下游引物和SEQ ID NO:72延伸引物；
gyrB基因538位点(gyrB-538)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:13 上游引物，SEQ ID NO:14下游引物和SEQ ID NO:73延伸引物；
rrs基因1401位点(rrs-1401)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:15 上游引物，SEQ ID NO:16下游引物和SEQ ID NO:74延伸引物；
gyrA基因74位点(gyrA-74)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:17 上游引物，SEQ ID NO:18下游引物和SEQ ID NO:75延伸引物；
rrs基因1300位点(rrs-1300)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:19 上游引物，SEQ ID NO:20下游引物和SEQ ID NO:76延伸引物；
rpoB基因522位点(rpoB-522)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:21 上游引物，SEQ ID NO:22下游引物和SEQ ID NO:77延伸引物；
katG基因315位点(katG-315)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:23 上游引物，SEQ ID NO:24下游引物和SEQ ID NO:78延伸引物；
rpoB基因526位点(rpoB-526-1)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:25 上游引物，SEQ ID NO:26下游引物和SEQ ID NO:79延伸引物；
gyrA基因94位点(gyrA-94)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:27 上游引物，SEQ ID NO:28下游引物和SEQ ID NO:80延伸引物；
gyrB基因500位点(gyrB-500)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:29 上游引物，SEQ ID NO:30下游引物和SEQ ID NO:81延伸引物；
ropB基因526位点(rpoB-526-2)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:31 上游引物，SEQ ID NO:32下游引物和SEQ ID NO:82延伸引物；
rpoB基因531位点(rpoB-531-1)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:33 上游引物，SEQ ID NO:34下游引物和SEQ ID NO:83延伸引物；
rpoB基因531位点(rpoB-531-2)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:35 上游引物，SEQ ID NO:36下游引物和SEQ ID NO:84延伸引物；
rpoB基因513位点(rpoB-513-2)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:37 上游引物，SEQ ID NO:38下游引物和SEQ ID NO:85延伸引物；
rpoB基因572位点(rpoB-572)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:39 上游引物，SEQ ID NO:40下游引物和SEQ ID NO:86延伸引物；
inhA基因(-15)位点(inhA-15)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:41 上游引物，SEQ ID NO:42下游引物和SEQ ID NO:87延伸引物；
gyrB基因540位点(gyrB-540)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:43 上游引物，SEQ ID NO:44下游引物和SEQ ID NO:88延伸引物；
rpoB基因522位点(rpoB-522)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:45 上游引物，SEQ ID NO:46下游引物和SEQ ID NO:89延伸引物；
gyrA基因94位点(gyrA-94)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:47 上游引物，SEQ ID NO:48下游引物和SEQ ID NO:90延伸引物；
rpoB基因513位点(rpoB-513-3)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:49 上游引物，SEQ ID NO:50下游引物和SEQ ID NO:91延伸引物；
rpoB基因516位点(rpoB-516)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:51 上游引物，SEQ ID NO:52下游引物和SEQ ID NO:92延伸引物；
eis基因启动子区域(-37)位点(eis-promoter-37)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:53上游引物，SEQ ID NO:54下游引物和SEQ ID NO:93延伸引物；
eis基因启动子区域(-10)位点(eis-promoter-10)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:55上游引物，SEQ ID NO:56下游引物和SEQ ID NO:94延伸引物；
eis基因启动子区域(-14)位点(eis-promoter-14)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:57上游引物，SEQ ID NO:58下游引物和SEQ ID NO:95延伸引物；
rpoB基因531位点(rpoB-531-3)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:59 上游引物，SEQ ID NO:60下游引物和SEQ ID NO:96延伸引物；
rpoB基因516位点(rpoB-516)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:61 上游引物，SEQ ID NO:62下游引物和SEQ ID NO:97延伸引物；
inhA基因(-8)位点(inhA-8)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:63 上游引物，SEQ ID NO:64下游引物和SEQ ID NO:98延伸引物；
gyrA基因91位点(gyrA-91)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:65 上游引物，SEQ ID NO:66下游引物和SEQ ID NO:99延伸引物。
所述的用于检测结核杆菌耐药基因位点的引物组，所述引物组分为3个Well：
Well 1：rpoB-533、gyrA-90、rpoB-511、rpoB-513-1、rpoB-482、rrs-1321、 gyrB-538、rrs-1401、gyrA-74、rrs-1300、rpoB-522、katG-315、rpoB-526-1、gyrA-94、 gyrB-500、rpoB-526-2；
Well 2：rpoB-531-1、rpoB-531-2、rpoB-513-2、rpoB-572、inhA-15、gyrB-540、rpoB-522、gyrA-94；
Well 3：rpoB-513-3、rpoB-516、eis-promoter-37、eis-promoter-10、 eis-promoter-14、rpoB-531-3、rpoB-516、inhA-8、gyrA-91。
所述的结核杆菌耐药位点的基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法，它包括：
挑选结核耐药相关基因及位点；
设计步骤(1)中对应基因位点的扩增引物和单碱基延伸引物
分别配制步骤(2)中的扩增引物混合液和延伸引物混合物；
以待测样本DNA为模板，用(3)中的扩增引物进行PCR扩增反应，得到目的序列；
用虾碱式磷酸酶(SAP)消化掉步骤(4)反应中多余的dNTP，减少对延伸反应的干扰；
用单碱基延伸引物对步骤(5)中消化产物进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；
对(6)中的延伸产物进行脱盐纯化，去除反应中盐离子；
利用核酸质谱分析软件对位点进行分型，判定是否有突变。
如权利要求4所述的结核杆菌耐药位点的基于MassARRAY核酸质谱平台检测的方法，其特征在于，步骤(4)PCR扩增反应条件为：95℃，2分钟，1个循环；(95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟)45个循环；72℃，5分钟，1 个循环。
所述的结核杆菌耐药位点的基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法，步骤(6)延伸反应条件为：95℃，30秒，1个循环；95℃，5秒，1个循环；(52℃， 5秒；80℃，5秒)5个循环；72℃，3分钟，1个循环。
所述的结核杆菌耐药位点的基于MssARRAY核酸质谱平台的检测方法，所述 PCR扩增反应液、SAP消化反应液和iPLEX反应液的体积比为5:2:2。
飞行质谱检测技术具有很好的性价比，特别是在检测数量有限，且信息已知的基因位点。本发明提供的结核耐药相关SNP位点的引物组，以3个well 检测结核耐药相关的7个基因的55种突变类型，全面覆盖常见的结核耐药位点，降低检测成本，实现个性化检测。
本发明提供的有效检测结核耐药位点信息，检测结果结合临床上的相关指标，可为临床医师提供合理的用药参考，实现患者个性化，精准化用药。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明：
图1-12是实施例2中部分样本的结果图，其中：
图1：样本S234 rpoB 526位点的质谱峰图；
图2：样本S234 rpoB 526位点的一代测序验证峰图；
图3：样本y11 rpoB 482位点的质谱峰图；
图4：样本y11 rpoB 482位点的一代测序验证峰图；
图5：样本y54 gyrA 90位点的质谱峰图；
图6：样本y54 gyrA 90位点的一代测序验证峰图；
图7：样本y81 rpoB 572位点的质谱峰图；
图8：样本y81 rpoB 572位点的一代测序验证峰图；
图9：样本y126 gyrA 94位点的质谱峰图；
图10：样本y126 gyrA 94位点的一代测序验证峰图；
图11：样本y252 rrs 1321位点的质谱峰图；
图12：样本y252 rrs 1321位点的一代测序验证峰图。
具体实施方式
为了更加清楚的描述本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明做进一步解说。各实施例中，所用试剂如未特殊说明，均为市售商品。引物序列由上海吉真生物科技有限公司合成，纯化方式为ePAGE。
实施例1：
一种用于检测结核耐药相关基因的试剂盒，包括用于结核耐药相关基因突变的引物组，结核耐药相关7个基因25个位点信息，如表1所示，引物组如表2所示；
PCR扩增引物
根据所选择的7个基因的55种基因突变类型，设计针对每种基因突变型的扩增引物，扩增引物可扩增区域是包含突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3’端具有与目的基因序列完全匹配的15个或以上碱基，在 5’端具有10个碱基(ACGTTGGATG)的通用标签序列。具体引物和延伸引物分别如表2所示：
表1耐药基因突变信息
Figure BDA0003494072350000071
表2 PCR扩增引物与延伸引物序(TERM：iPLEX)
Figure BDA0003494072350000072
Figure BDA0003494072350000081
Figure BDA0003494072350000091
反应仪器与试剂：
反应仪器：MassARRAY核酸质谱分析***(MassARRAY Analyzer 4 System,96Genotyping(Agena))。
反应试剂：Complete
Figure BDA0003494072350000092
Gold Genotyping Reagent Set 10x 96(Agena)检测试剂盒。
检测方法如下：
准备符合质量要求的DNA样本；
封膜离心后进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表3所示：
表3 PCR扩增反应体系
试剂 最后在5μl反应中的浓度 5μl中的试剂体积(μl)
Water HPLC grade N/A 0.8
10x PCR Buffer 20mM Mgcl2 2.0mM 0.5
25mM Mgcl2 2.0mM 0.4
25mM dNTP Mix 500μM 0.1
0.5μM Primer Mix 0.1μM 1.0
5U/μl聚合酶链反应酶(PCR Enzyme) 1.0U/rxn 0.2
DNA / 2.0
总体积(μl) N/A 5.0
注：N/A表示无意义。
PCR扩增条件如表4所示：
表4 PCR扩增条件
Figure BDA0003494072350000093
SAP酶消化反应：上一步PCR扩增产物使用表5反应体系进行消化，以此去除反应中多余的dNTP。反应条件为：37℃：40分钟，85℃：5分钟，4℃保存备用。
表5 SAP酶消化反应条件
试剂 最后在7μl反应中的浓度 2μl中试剂体积(ul)
Nanopure Water,Autoclaved N/A 1.53
SAP Buffer 0.243x 0.17
SAP Enzyme(1.7U/μl) 0.5U 0.3
上述获得PCR扩增产物 N/A 5.0
总体积(μl) N/A 7.0
单核苷酸碱基延伸反应：上述反应产物离心后使用表6反应体系进行延伸反应。反应条件如表7所示。
表6延伸反应体系
试剂 最后在7μl反应中的浓度 2μl中的试剂体积(μl)
Nanopure Water N/A 0.619
iPLEX Buffer 0.222X 0.2
iPLEX Termination mix 1X 0.2
Extend Primer Mix *0.94μM 0.94
iPLEX Enzyme 1X 0.041
上述获得产物 N/A 7.0
总体积(ul) N/A 9.0
表7延伸反应条件
Figure BDA0003494072350000102
最后将产物进行树脂进行脱盐纯化，点样到对应的芯片上，通过质谱仪的分析软件自动分析结果。根据产物分子量大小对应的峰位来确定对应位点的基因型。
实施例2：
采用实施例1中的试剂和方法，对已经过一代测序的60例临床样本进行检测，选取其中的6个样本(S234、y11、y54、y81、y126、y252)的部分位点，详见质谱分析峰图和对比一代测序峰图(图1-12)，可以看出，本发明的方法可快速准确的检测出目的位点的基因型，灵活性强，检测周期短。临床医生可依据检测结果，进行用药指导，本发明涉及的7种基因中，与利福平耐药相关的基因包括rpoB,与异烟肼耐药相关的基因包括katG和inhA, 与氟喹诺酮类耐药相关的基因包括gyrA和gyrB，与二线抗结核药物相关的基因eis和rrs。
根据上述解读，可以获得结核耐药的相关信息，从而提高药物合理使用率。本发明通量较高，灵活性较好，易于实现的结核耐药位点检测方法，进行常规式筛选，获得相应的耐药信息，选择最佳的治疗方案。

Claims (7)

1.一种用于检测结核杆菌耐药基因及位点，其特征在于，所述基因及位点如下：
rpoB：CAG-482-CAA、CTG-511-CCG、CAA-513-AAA、CAA-513-CTA、CAA-513-CCA、CAA-513-CCT、CAA-513-CCC、GAC-516-TAC、GAC-516-GTC、GAC-516-GGC、TCG-522-CCG、TCG-522-TTG、TCG-522-TAG、CAC-526-AAC、CAC-526-TAC、CAC-526-GAC、CAC-526-CTC、CAC-526-CCC、CAC-526-CGC、CAC-526-TGC、TCG-531-CCG、TCG-531-TAG、TCG-531-TTG、TCG-531-TGG、TCG-531-TCC、TCG-531-TCT、TCG-531-TTT、CTG-533-CCG、ATC-572-TTC、ATC-572-CTC；
inhA：C(-15)T、T(-8)C、T(-8)A；
katG：AGC-315-ACC、AGC-315-AAC；
eis：C(-37)T、C(-14)T、G(-10)A；
rrs：C(1300)T、G(1321)A、A(1401)G；
gyrB：GAC-500-CAC、GAC-500-AAC、AAC-538-ACC、GAA-540-GAT；
gyrA：GCC-74-TCC、GCG-90-GTG、TCG-91-CCG、GAC-94-AGC、GAC-94-TGC、GAC-94-GGC、GAC-94-GCC、GAC-94-AAC、GAC-94-CAC、GAC-94-TAC。
2.基于如权利要求1所述的用于检测结核杆菌耐药基因位点的引物组，其特征在于，包括：
rpoB基因533位点(rpoB-533)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:1上游引物，SEQ ID NO:2下游引物和SEQ ID NO:67延伸引物；
gyrA基因90位点(gyrA-90)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:3上游引物，SEQID NO:4下游引物和SEQ ID NO:68延伸引物；
rpoB基因511位点(rpoB-511)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:5上游引物，SEQ ID NO:6下游引物和SEQ ID NO:69延伸引物；
rpoB基因513位点(rpoB-513-1)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:7上游引物，SEQ ID NO:8下游引物和SEQ ID NO:70延伸引物；
rpoB基因482位点(rpoB-482)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:9上游引物，SEQ ID NO:10下游引物和SEQ ID NO:71延伸引物；
rrs基因1321位点(rrs-1321)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:11上游引物，SEQ ID NO:12下游引物和SEQ ID NO:72延伸引物；
gyrB基因538位点(gyrB-538)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:13上游引物，SEQ ID NO:14下游引物和SEQ ID NO:73延伸引物；
rrs基因1401位点(rrs-1401)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:15上游引物，SEQ ID NO:16下游引物和SEQ ID NO:74延伸引物；
gyrA基因74位点(gyrA-74)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:17上游引物，SEQ ID NO:18下游引物和SEQ ID NO:75延伸引物；
rrs基因1300位点(rrs-1300)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:19上游引物，SEQ ID NO:20下游引物和SEQ ID NO:76延伸引物；
rpoB基因522位点(rpoB-522)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:21上游引物，SEQ ID NO:22下游引物和SEQ ID NO:77延伸引物；
katG基因315位点(katG-315)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:23上游引物，SEQ ID NO:24下游引物和SEQ ID NO:78延伸引物；
rpoB基因526位点(rpoB-526-1)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:25上游引物，SEQ ID NO:26下游引物和SEQ ID NO:79延伸引物；
gyrA基因94位点(gyrA-94)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:27上游引物，SEQ ID NO:28下游引物和SEQ ID NO:80延伸引物；
gyrB基因500位点(gyrB-500)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:29上游引物，SEQ ID NO:30下游引物和SEQ ID NO:81延伸引物；
ropB基因526位点(rpoB-526-2)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:31上游引物，SEQ ID NO:32下游引物和SEQ ID NO:82延伸引物；
rpoB基因531位点(rpoB-531-1)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:33上游引物，SEQ ID NO:34下游引物和SEQ ID NO:83延伸引物；
rpoB基因531位点(rpoB-531-2)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:35上游引物，SEQ ID NO:36下游引物和SEQ ID NO:84延伸引物；
rpoB基因513位点(rpoB-513-2)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:37上游引物，SEQ ID NO:38下游引物和SEQ ID NO:85延伸引物；
rpoB基因572位点(rpoB-572)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:39上游引物，SEQ ID NO:40下游引物和SEQ ID NO:86延伸引物；
inhA基因(-15)位点(inhA-15)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:41上游引物，SEQ ID NO:42下游引物和SEQ ID NO:87延伸引物；
gyrB基因540位点(gyrB-540)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:43上游引物，SEQ ID NO:44下游引物和SEQ ID NO:88延伸引物；
rpoB基因522位点(rpoB-522)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:45上游引物，SEQ ID NO:46下游引物和SEQ ID NO:89延伸引物；
gyrA基因94位点(gyrA-94)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:47上游引物，SEQ ID NO:48下游引物和SEQ ID NO:90延伸引物；
rpoB基因513位点(rpoB-513-3)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:49上游引物，SEQ ID NO:50下游引物和SEQ ID NO:91延伸引物；
rpoB基因516位点(rpoB-516)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:51上游引物，SEQ ID NO:52下游引物和SEQ ID NO:92延伸引物；
eis基因启动子区域(-37)位点(eis-promoter-37)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQID NO:53上游引物，SEQ ID NO:54下游引物和SEQ ID NO:93延伸引物；
eis基因启动子区域(-10)位点(eis-promoter-10)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQID NO:55上游引物，SEQ ID NO:56下游引物和SEQ ID NO:94延伸引物；
eis基因启动子区域(-14)位点(eis-promoter-14)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQID NO:57上游引物，SEQ ID NO:58下游引物和SEQ ID NO:95延伸引物；
rpoB基因531位点(rpoB-531-3)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:59上游引物，SEQ ID NO:60下游引物和SEQ ID NO:96延伸引物；
rpoB基因516位点(rpoB-516)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:61上游引物，SEQ ID NO:62下游引物和SEQ ID NO:97延伸引物；
inhA基因(-8)位点(inhA-8)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:63上游引物，SEQ ID NO:64下游引物和SEQ ID NO:98延伸引物；
gyrA基因91位点(gyrA-91)扩增引物和延伸引物，具体包括SEQ ID NO:65上游引物，SEQ ID NO:66下游引物和SEQ ID NO:99延伸引物。
3.如权利要求2所述的用于检测结核杆菌耐药基因位点的引物组，其特征在于，所述引物组分为3个Well：
Well 1：rpoB-533、gyrA-90、rpoB-511、rpoB-513-1、rpoB-482、rrs-1321、gyrB-538、rrs-1401、gyrA-74、rrs-1300、rpoB-522、katG-315、rpoB-526-1、gyrA-94、gyrB-500、rpoB-526-2；
Well 2：rpoB-531-1、rpoB-531-2、rpoB-513-2、rpoB-572、inhA-15、gyrB-540、rpoB-522、gyrA-94；
Well 3：rpoB-513-3、rpoB-516、eis-promoter-37、eis-promoter-10、eis-promoter-14、rpoB-531-3、rpoB-516、inhA-8、gyrA-91。
4.如权利要求1、2或3所述的结核杆菌耐药位点的基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法，其特征在于，它包括：
(1)挑选结核耐药相关基因及位点；
(2)设计步骤(1)中对应基因位点的扩增引物和单碱基延伸引物；
(3)分别配制步骤(2)中的扩增引物混合液和延伸引物混合物；
(4)以待测样本DNA为模板，用(3)中的扩增引物进行PCR扩增反应，得到目的序列；
(5)用虾碱式磷酸酶(SAP)消化掉步骤(4)反应中多余的dNTP，减少对延伸反应的干扰；
(6)用单碱基延伸引物对步骤(5)中消化产物进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；
(7)对(6)中的延伸产物进行脱盐纯化，去除反应中盐离子；
(8)利用核酸质谱分析软件对位点进行分型，判定是否有突变。
5.如权利要求4所述的结核杆菌耐药位点的基于MassARRAY核酸质谱平台检测的方法，其特征在于，步骤(4)PCR扩增反应条件为：95℃，2分钟，1个循环；(95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟)45个循环；72℃，5分钟，1个循环。
6.如权利要求4所述的结核杆菌耐药位点的基于MassARRAY核酸质谱平台的检测方法，其特征在于，步骤(6)延伸反应条件为：95℃，30秒，1个循环；95℃，5秒，1个循环；(52℃，5秒；80℃，5秒)5个循环；72℃，3分钟，1个循环。
7.如权利要求4所述的结核杆菌耐药位点的基于MssARRAY核酸质谱平台的检测方法，其特征在于，所述所述PCR扩增反应液、SAP消化反应液和iPLEX反应液的体积比为5:2:2。
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